專利名稱：蒲黃中異鼠李素－3－0－新橙皮糖苷的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于植物藥有效成分的提取分離方法，具體說是關(guān)于中藥蒲黃中的有效成分的提取分離方法。
背景技術(shù)：
蒲黃是一種常用中藥，對(duì)于蒲黃的研究已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，其中對(duì)蒲黃化學(xué)成分的研究，也有一些文獻(xiàn)記載將異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷作為蒲黃藥材和含蒲黃藥物的質(zhì)量控制指標(biāo)，為此，實(shí)際工作中需要提取分離純度高的異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷作為對(duì)照品。特別是在含蒲黃的藥物開發(fā)研究當(dāng)中，如何簡(jiǎn)化蒲黃有效成分異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的提取工藝，提高提取分離純度，是制劑工藝研究過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前一些提取分離方法的提取工藝路線復(fù)雜，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷收率較低，不適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，且因?yàn)殡y以進(jìn)一步提高異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的純度，使其用作質(zhì)量控制用對(duì)照品受到一定限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提取分離蒲黃中有效成分異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的新工藝。
本發(fā)明的工藝方法步驟如下A取蒲黃藥材醇提得稠膏，即總提取物；B總提取物硅膠拌樣后，另取硅膠活化、干柱層析，以5～10∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑為洗脫劑或展開劑，分段提取得8～12份，各份用甲醇、乙醇或丙酮洗脫，洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；合并其中第3份和第4份得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品；C以硅膠為吸附劑，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品用甲醇溶解后，干法上樣，以乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，梯度為100∶0-60∶40，分段提取得8～12份，減壓濃縮，把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品；D取異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品，加入甲醇或乙醇至溶解，浸泡、濕法裝柱，色譜柱的徑高比為3∶20-27，吸附劑為葡聚糖凝膠LH-20，用量為被分離樣品量的18-30倍，用甲醇或乙醇進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，共收集12～15份；把其中第8～10份分別濃縮，加入濃縮液20～25倍量的乙酸乙酯，靜置沉淀，過濾，沉淀用乙酸乙酯洗滌后，干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品。
上述方法中步驟A的方法為取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為60～90％的乙醇150～250體積份，浸泡24～48小時(shí)后，加熱回流提取0.5～1.5小時(shí)，靜置0.5-2小時(shí)，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取2～4次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度60～90℃，減壓濃縮至濃縮液無(wú)醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即總提取物2.5～3.0重量份。
上述方法中步驟A的優(yōu)選方法為取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為70％的乙醇200體積份，浸泡24小時(shí)后，加熱回流提取1小時(shí)，靜置1小時(shí)，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無(wú)醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.8重量份。
上述方法中步驟B的方法為取稠膏50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅膠，干燥，得到拌樣硅膠；另取1500～2000重量份的100～200目的硅膠，100～105℃活化1.5～2小時(shí)后，干法裝柱；將拌樣硅膠加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑1500-2500體積份為洗脫劑或展開劑，進(jìn)行干柱層析，放干溶劑，進(jìn)行等分切割或按色帶切割，共得到8～12份；各份用1500～2000體積份的甲醇、乙醇或丙酮洗脫，洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；收集其中第3份和第4份合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5-7重量份；上述方法中步驟B的優(yōu)選方法為取稠膏50重量份，拌入150重量份，160～200目硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠；另取160～200目硅膠1500重量份，100～105℃活化1.5小時(shí)后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000體積份為展開劑，下行法展開，進(jìn)行干柱層析，待展開劑前沿到達(dá)色譜柱底部時(shí)，放干溶劑，等分切割，共得到10份；各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1500體積份洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第3份和第4份合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9重量份。
上述方法中步驟C的方法為吸附劑為100～150重量份的200～300目的硅膠，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5-7.0重量份用50-150體積份甲醇溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶劑(乙酸乙酯、甲醇、乙醇均為分析純)進(jìn)行梯度洗脫；最佳梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每個(gè)梯度洗脫劑用量為100～300體積份，洗脫流速為每分鐘2～6體積份，分份收集，每份100～150體積份，減壓濃縮至10～20體積份；把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.5-3.0重量份；上述方法中步驟C的優(yōu)選方法為吸附劑為100重量份的200～300目的硅膠H，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9重量份用100體積份甲醇溶解后，加到4倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無(wú)水乙醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫；最佳梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每個(gè)梯度洗脫劑用量為200體積份，洗脫流速為每分鐘4體積份，洗脫劑總用量為2600體積份，分份收集，每份100體積份，減壓濃縮至10體積份；把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.8重量份；上述方法中步驟D的方法為異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.50-3.00重量份，加30-60體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小時(shí)后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50～80重量份，色譜柱徑高比為1∶20-26，用甲醇或乙醇100-200體積份進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每份5～10體積份，共收集12～15份；把其中第8～10份分別濃縮至2～3體積份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，靜置0.5-2小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用15-30體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.1-2.7重量份。
上述方法中步驟D的優(yōu)選方法為異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.80重量份，加50體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小時(shí)后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50重量份，色譜柱徑高比為1∶20，用甲醇或乙醇150體積份進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每份5體積份，共收集15份；把其中第8～10份分別濃縮至2體積份后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置0.5-2小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用20體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.58重量份。
采用本方法提取蒲黃有效成分異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷，提取工藝路線簡(jiǎn)單，提取分離純度提高，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷收率提高，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
下面實(shí)驗(yàn)例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的純度檢查用高效液相色譜法檢查純度。儀器美國(guó)惠普公司HP1050高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器(HP1050 DAD)，HP1050/WIN-3D化學(xué)工作站，Waters公司25μL可調(diào)進(jìn)樣器。色譜柱Bondclone 10 C18柱，3.9mm×300mm(美國(guó)Phenomenex公司)。流動(dòng)相乙腈-水(15～20∶85～80)；流速1.0～1.2mL/min；柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；衰減8；進(jìn)樣量20μg，保留時(shí)間(RT)異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷為8.5～9.5min；色譜圖記錄時(shí)間20min。歸一化法測(cè)定純度。異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品的純度為98.38％，大于98.00％，可作為對(duì)照品使用。
實(shí)驗(yàn)例2異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的結(jié)構(gòu)測(cè)定取上述方法所得的異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品黃色結(jié)晶性粉末(甲醇-乙酸乙酯)，熔點(diǎn)179～181℃，易溶于水、甲醇，溶于乙醇，微溶于丙酮、乙酸乙酯。紫外燈下呈黃棕色熒光，三氯化鋁顯色后呈黃綠色熒光。鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，Molish反應(yīng)陽(yáng)性，示為黃酮苷類化合物。UVλmax(nm)254，354(MeOH)，示3位為取代的黃酮醇；270，330，408(MeONa)，帶I紅移54nm，示4’位為游離羥基；273，322，365(NaOAc)，帶II紅移19nm，示7位為游離羥基；254，353(NaOAc+H3BO3)，示無(wú)鄰二羥基；269，301，367，404(AlCl3)，帶I紅移50nm；264，357，402(AlCl3/HCl)，峰位與AlCl3光譜比較基本不變，示5位為游離羥基。IRυmax(KBr，cm-1)3416.8(OH)，2976.8，2934.9，1659.5(C＝O)，1609.8，1506.4(苯環(huán))，1459.7，1429.6，1356.2，1286.1，1206.0，1132.6，1069.2，995.7，812.2。FAB-MS(m/z)647(M+Na)，625(M++1)，479(M+-鼠李糖基+H)，317(M+-鼠李糖基-葡萄糖基+H)，316(M+-鼠李糖基-葡萄糖基)。EI-MS(m/z)316(苷元)，315(苷元-1)，301(苷元-CH3)，287(苷元-CO-H)，273(M+-CH3-CO)，259(287-CO)，243，217，204，191，173，153(A1++H)，151(B2+)，144，128，97。1HNMR(CD3OD，TMS)δ0.86的雙峰示有一個(gè)鼠李糖，δ5.17的信號(hào)為鼠李糖基端基氫，仔細(xì)觀察，該信號(hào)為雙峰，偶合常數(shù)很小，推斷鼠李糖為α-構(gòu)型。δ5.88的雙峰歸于3位葡萄糖基的端基質(zhì)子，偶合常數(shù)為7.3Hz，推斷為β-構(gòu)型。13CNMR(CD3OD，TMS)δ81.1為葡萄糖基2位碳的信號(hào)，與對(duì)應(yīng)葡萄糖甲苷相比，此C-2信號(hào)向低場(chǎng)位移，而C-3信號(hào)向高場(chǎng)位移，這表明鼠李糖基與葡萄糖2位相連。該化合物用0.1mol/L鹽酸水解，水解液紙層析檢出L-鼠李糖和D-葡萄糖。綜合以上數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定為異鼠李素-3-O-α-L-鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷，即異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷(isorhamnetin-3-O-neohesperidoside)。分子式為C28H32O16。其UV、1HNMR、13CNMR數(shù)據(jù)見表1、2、3。
表1 異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的UV光譜數(shù)據(jù)(nm)

表2 異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的1HNMR數(shù)據(jù)(in CD3OD)

表3 異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的13CNMR數(shù)據(jù)(in CD3OD)

實(shí)驗(yàn)例3硅膠干柱色譜分離異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品試驗(yàn)取蒲黃藥材25kg，加入濃度為70％的乙醇200L，浸泡24h后，加熱回流提取1小時(shí)，靜置1小時(shí)，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無(wú)醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏50g，拌入150g粗硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn)，160～200目)，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取粗硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn)，160～200目)1.5kg，100～105℃活化1.5小時(shí)后，干法裝柱(直徑12cm，高60cm)。將拌樣硅膠加入柱中，以乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶1)混合溶劑為展開劑，下行法展開，進(jìn)行干柱層析，待展開劑前沿到達(dá)色譜柱底部時(shí)，放干溶劑，等分切割，共得到10份。各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1500mL洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物。各洗脫物用薄層色譜檢查。
薄層色譜條件吸附劑硅膠GF254預(yù)制薄層板；展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶劑。
其中第3份和第4份異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量較高，合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9g；異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品為棕黃色粉末。
實(shí)驗(yàn)例4減壓柱色譜分離異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品試驗(yàn)異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品的制備采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量100g)。取異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9g用少量甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無(wú)水乙醇混合溶劑，進(jìn)行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個(gè)梯度洗脫劑用量為150mL，洗脫流速為每分鐘3mL，洗脫劑總用量為1950mL，每份100mL，減壓濃縮至小體積(約10mL)后，用薄層色譜檢查，薄層色譜條件吸附劑硅膠GF254預(yù)制薄層板；展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶劑。其中第6-8份異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量較高，把第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末2.80g。
實(shí)驗(yàn)例5葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜分離異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品試驗(yàn)上述異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末2.80g以少量甲醇溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠50g，甲醇浸泡24h后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用甲醇進(jìn)行洗脫，待色帶到達(dá)柱底部時(shí)，開始收集洗脫液，每份5mL，共收集15份。用薄層色譜檢查，薄層色譜條件吸附劑硅膠GF254預(yù)制薄層板；展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶劑。其中第8-10份異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量較高，把其中第8～10份分別濃縮至小體積(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置，沉淀，過濾，沉淀用15mL乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.2克，為淡黃色粉末。
實(shí)施例1異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品的制備取蒲黃藥材25kg，加入濃度為70％的乙醇175L，浸泡30小時(shí)后，加熱回流提取1小時(shí)，靜置1.5小時(shí)，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度70℃，減壓濃縮至濃縮液至無(wú)醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.5kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取180目硅膠1600g，100～105℃活化1.5小時(shí)后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以10∶1∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000毫升為展開劑，下行法展開，進(jìn)行干柱層析，待展開劑前沿到達(dá)色譜柱底部時(shí)，放干溶劑，色帶切割，共得到10份。各份用甲醇1750ml洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第3份和第4份異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量較高，合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品7g。
異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品的制備采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用200目的硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量110g)。異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品7g用80毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無(wú)水乙醇混合溶劑，進(jìn)行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個(gè)梯度洗脫劑用量為200mL，洗脫流速為每分鐘4mL，洗脫劑總用量為2600mL，每份100mL，減壓濃縮至小體積(約18mL)后，把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末3.00g。
異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的純化上述異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末3.00g以40毫升甲醇溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠80g，乙醇浸泡30小時(shí)后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用甲醇150毫升進(jìn)行洗脫，待色帶到柱底部時(shí)，開始收集洗脫液，每份10mL，共收集10份。把其中第8～10份分別濃縮至小體積(2.8mL)后，加入25倍量乙酸乙酯，靜置1小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用25mL乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.65克，為淡黃色粉末。
實(shí)施例2異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品的制備取蒲黃藥材25kg，加入濃度為80％的乙醇200L，浸泡40小時(shí)后，加熱回流提取1.5小時(shí)，靜置2小時(shí)，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取4次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無(wú)醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.7kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取180目硅膠1600g，100～105℃活化1.5小時(shí)后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以乙7∶3∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2200毫升為展開劑，下行法展開，進(jìn)行干柱層析，待展開劑前沿到達(dá)色譜柱底部時(shí)，放干溶劑，色帶切割，共得到10份。各份用甲醇1900ml洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第3份和第4份異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量較高，合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.8g。
異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品的制備采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用250目的硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量130g)。異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.8g用75毫升甲醇溶解后，加到5倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無(wú)水乙醇混合溶劑，進(jìn)行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個(gè)梯度洗脫劑用量為220mL，洗脫流速為每分鐘5mL，洗脫劑總用量為2860mL，每份120mL，減壓濃縮至小體積(約16mL)后，把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末2.80g。
異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的純化上述異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末2.80g以50毫升溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠70g，甲醇浸泡26小時(shí)后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用甲醇180毫升進(jìn)行洗脫，待色帶到柱底部時(shí)，開始收集洗脫液，每份8mL，共收集12份。把其中第8～10份分別濃縮至小體積(2.4mL)后，加入24倍量乙酸乙酯，靜置1小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用20mL乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.58克，為淡黃色粉末。
實(shí)施例3異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品的制備取蒲黃藥材25kg，加入濃度為90％的乙醇225L，浸泡45小時(shí)后，加熱回流提取0.5小時(shí)，靜置1.5小時(shí)，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取2次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無(wú)醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.8kg。
取上述稠膏55g，拌入170g，160目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取160目硅膠1700g，100～105℃活化2小時(shí)后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以乙9∶1∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶劑1800毫升為展開劑，下行法展開，進(jìn)行干柱層析，待展開劑前沿到達(dá)色譜柱底部時(shí)，放干溶劑，等分切割，共得到10份。各份用丙酮1700ml洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第3份和第4份異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量較高，合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5g。
異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品的制備采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用300目的硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量140g)。異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5g用80毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無(wú)水乙醇混合溶劑，進(jìn)行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個(gè)梯度洗脫劑用量為200mL，洗脫流速為每分鐘4mL，洗脫劑總用量為2600mL，每份140mL，減壓濃縮至小體積(約12mL)后，把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末2.60g。
異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的純化上述異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末2.60g以50毫升乙醇溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠60g，乙醇浸泡28小時(shí)后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用乙醇150毫升進(jìn)行洗脫，待色帶到柱底部時(shí)，開始收集洗脫液，每份7mL，共收集14份。把其中第8～10份分別濃縮至小體積(3mL)后，加入22倍量乙酸乙酯，靜置0.5小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀20mL乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.38克，為淡黃色粉末。
實(shí)施例4異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品的制備取蒲黃藥材25kg，加入濃度為70％的乙醇200L，浸泡24h后，加熱回流提取1小時(shí)，靜置1小時(shí)，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無(wú)醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏58g，拌入160g，180目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取120目硅膠1900g，100～105℃活化1.5小時(shí)后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以乙8∶2∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000毫升為展開劑，下行法展開，進(jìn)行干柱層析，待展開劑前沿到達(dá)色譜柱底部時(shí)，放干溶劑，等分切割，共得到10份。各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1600ml洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第3份和第4份異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量較高，合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9g。異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品為棕黃色粉末。
異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的精制采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用250目的硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量150g)。異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9g用90毫升甲醇溶解后，加到3倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無(wú)水乙醇混合溶劑，進(jìn)行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個(gè)梯度洗脫劑用量為150mL，洗脫流速為每分鐘4mL，洗脫劑總用量為1950mL，每份150mL，減壓濃縮至小體積(約10mL)后，把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷黃色粉末2.50g。
異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的純化上述異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黃色粉末2.50g以50毫升甲醇溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠50g，甲醇浸泡24小時(shí)后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用乙醇120毫升進(jìn)行洗脫，待色帶到柱底部時(shí)，開始收集洗脫液，每份5mL，共收集15份。把其中第8～10份分別濃縮至小體積(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置1小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用25mL乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.37克，為淡黃色粉末。
權(quán)利要求
1.一種異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品的提取方法，其特征在于該方法包括如下步驟A取蒲黃藥材醇提得稠膏，即得總提取物；B總提取物硅膠拌樣后，另取硅膠活化、干柱層析，以5～10∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑為洗脫劑或展開劑，分段提取得8～12份，各份用甲醇、乙醇或丙酮洗脫，洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；合并其中第3份和第4份得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品；C以硅膠為吸附劑，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品用甲醇溶解后，干法上樣，以乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，梯度為100∶0-60∶40，分段提取得8～12份，減壓濃縮，把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品；D取異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品，加入甲醇或乙醇至溶解，浸泡、濕法裝柱，色譜柱的徑高比為3∶20-27，吸附劑為葡聚糖凝膠LH-20，用量為被分離樣品量的18-30倍，用甲醇或乙醇進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，共收集12～15份；把其中第8～10份分別濃縮，加入濃縮液20～25倍量的乙酸乙酯，靜置沉淀，過濾，沉淀用乙酸乙酯洗滌后，干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中A步驟為取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為60～90％的乙醇150～250體積份，浸泡24～48小時(shí)后，加熱回流提取0.5～1.5小時(shí)，靜置0.5-2小時(shí)，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取2～4次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度60～90℃，減壓濃縮至濃縮液無(wú)醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即總提取物2.5～3.0重量份。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中B步驟為取稠膏即蒲黃總提取物50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅膠，干燥，得到拌樣硅膠；另取1500～2000重量份的100～200目的硅膠，100～105℃活化1.5～2小時(shí)后，干法裝柱；將拌樣硅膠加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑1500-2500體積份為洗脫劑或展開劑，進(jìn)行干柱層析，放干溶劑，進(jìn)行等分切割或按色帶切割，共得到8～12份；各份用1500～2000體積份的甲醇、乙醇或丙酮洗脫，洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；收集其中第3份和第4份合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5-7重量份。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中C步驟為吸附劑為100～150重量份的200～300目的硅膠，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5-7.0重量份用50-150體積份甲醇溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫；梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60，每個(gè)梯度洗脫劑用量為100～300體積份，洗脫流速為每分鐘2～6體積份，分份收集，每份100～150體積份，減壓濃縮至10～20體積份；把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.5-3.0重量份。
5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中D步驟為異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.50-3.00重量份，加30-60體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小時(shí)后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50～80重量份，色譜柱徑高比為1∶20-26，用甲醇或乙醇100-200體積份進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每份5～10體積份，共收集12～15份；把其中第8～10份分別濃縮至2～3體積份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，靜置0.5-2小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用15-30體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.1-2.7重量份。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法包括如下步驟A取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為60～90％的乙醇150～250體積份，浸泡24～48小時(shí)后，加熱回流提取0.5～1.5小時(shí)，靜置0.5-2小時(shí)，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取2～4次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度60～90℃，減壓濃縮至濃縮液無(wú)醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即總提取物2.5～3.0重量份；B取稠膏即蒲黃總提取物50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅膠，干燥，得到拌樣硅膠；另取1500～2000重量份的100～200目的硅膠，100～105℃活化1.5～2小時(shí)后，干法裝柱；將拌樣硅膠加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑1500-2500體積份為洗脫劑或展開劑，進(jìn)行干柱層析，放干溶劑，進(jìn)行等分切割或按色帶切割，共得到8～12份；各份用1500～2000體積份的甲醇、乙醇或丙酮洗脫，洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；收集其中第3份和第4份合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5-7重量份；C吸附劑為100～150重量份的200～300目的硅膠，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5-7.0重量份用50-150體積份甲醇溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫；梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60，每個(gè)梯度洗脫劑用量為100～300體積份，洗脫流速為每分鐘2～6體積份；分份收集，每份100～150體積份，減壓濃縮至10～20體積份；把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.5-3.0重量份；D異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.50-3.00重量份，加30-60體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小時(shí)后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50～80重量份，色譜柱徑高比為1∶20-26，用甲醇或乙醇100-200體積份進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每份5～10體積份，共收集12～15份；把其中第8～10份分別濃縮至2～3體積份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，靜置0.5-2小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用15-30體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.1-2.7重量份。
7.如權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于該方法中A步驟為取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為70％的乙醇200體積份，浸泡24小時(shí)后，加熱回流提取1小時(shí)，靜置1小時(shí)，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無(wú)醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.8重量份。
8.如權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于該方法中B步驟為取稠膏即蒲黃總提取物50重量份，拌入150重量份，160～200目硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠；另取160～200目硅膠1500重量份，100～105℃活化1.5小時(shí)后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000體積份為展開劑，下行法展開，進(jìn)行干柱層析，待展開劑前沿到達(dá)色譜柱底部時(shí)，放干溶劑，等分切割，共得到10份；各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1500體積份洗脫；洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第3份和第4份合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9重量份。
9.如權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于該方法的C步驟為吸附劑為100重量份的200～300目的硅膠H，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9重量份用100體積份甲醇溶解后，加到4倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無(wú)水乙醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫；最佳梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60，每個(gè)梯度洗脫劑用量為200體積份，洗脫流速為每分鐘4體積份，洗脫劑總用量為2600體積份；分份收集，每份100體積份，減壓濃縮至10體積份；把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.8重量份。
10.如權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于該方法中D步驟為異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.80重量份，加50體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小時(shí)后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50重量份，色譜柱徑高比為1∶20，用甲醇或乙醇150體積份進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每份5體積份，共收集15份；把其中第8～10份分別濃縮至2體積份后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置0.5-2小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用20體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.58重量份。
11.如權(quán)利要求6所述的提取方法，其特征在于該方法包括如下步驟A、取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為70％的乙醇200體積份，浸泡24小時(shí)后，加熱回流提取1小時(shí)，靜置1小時(shí)，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無(wú)醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.8重量份；B、取稠膏即蒲黃總提取物50重量份，拌入150重量份，160～200目硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠；另取160～200目硅膠1500重量份，100～105℃活化1.5小時(shí)后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000體積份為展開劑，下行法展開，進(jìn)行干柱層析，待展開劑前沿到達(dá)色譜柱底部時(shí)，放干溶劑，等分切割，共得到10份；各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1500體積份洗脫；洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第3份和第4份合并，得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9重量份；C、吸附劑為100重量份的200～300目的硅膠H，異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9重量份用100體積份甲醇溶解后，加到4倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無(wú)水乙醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫；最佳梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60，每個(gè)梯度洗脫劑用量為200體積份，洗脫流速為每分鐘4體積份，洗脫劑總用量為2600體積份；分份收集，每份100體積份，減壓濃縮至10體積份；把其中第6～8份濃縮液合并，減壓抽干得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.8重量份；D、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.80重量份，加50體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小時(shí)后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50重量份，色譜柱徑高比為1∶20，用甲醇或乙醇150體積份進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每份5體積份，共收集15份；把其中第8～10份分別濃縮至2體積份后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置0.5-2小時(shí)，沉淀，過濾，沉淀用20體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷純品2.58重量份。
全文摘要
本發(fā)明公開一種提取分離蒲黃中有效成分異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷的新工藝。該工藝方法步驟如下A取蒲黃藥材醇提得稠膏，即總提取物；B總提取物硅膠拌樣，另取硅膠活化、干柱層析，洗脫或展開，提取，洗脫，減壓回收；合并其中第3份和第4份得到異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷粗品；C粗品用醇溶解后，干法上樣，梯度洗脫，減壓濃縮，把第6～8份合并，減壓抽干得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷精品；D精品醇溶解，濕法裝柱，洗脫，分段收集，把其中第8～10份濃縮，加乙酸乙酯，沉淀，過濾，干燥，即得到異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷純品。
文檔編號(hào)C07H17/07GK1657536SQ20041010178
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者劉斌, 石任兵, 鄧巧虹, 王偉, 陸蘊(yùn)如 申請(qǐng)人:北京中醫(yī)藥大學(xué)