專利名稱：蒲黃中香蒲新苷的提取分離方法
技術領域：
本發(fā)明是關于植物藥有效成分的提取分離方法，具體說是關于中藥蒲黃中的有效成分的提取分離方法。

背景技術：
蒲黃是一種常用中藥，對于蒲黃的研究已有許多文獻報道，其中對蒲黃化學成分的研究，也有一些文獻記載。但這些文獻記載的研究內容，并非以探討蒲黃中主要有效成分香蒲新苷的提取分離方法為主要目的。由于香蒲新苷是蒲黃的主要有效成分之一，常將香蒲新苷作為蒲黃藥材和含蒲黃藥物的質量控制指標，為此，實際工作中需要提取分離純度高的香蒲新苷作為對照品。特別是在含蒲黃的藥物開發(fā)研究當中，如何簡化蒲黃有效成分香蒲新苷的提取工藝，提高提取分離純度，是制劑工藝研究過程的關鍵環(huán)節(jié)之一。目前一些提取分離方法的提取工藝路線復雜，香蒲新苷收率較低，不適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，且因為難以進一步提高香蒲新苷的純度，使其用作質量控制用對照品受到一定限制。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種提取分離蒲黃中有效成分的新工藝，即提取分離蒲黃有效成分香蒲新苷的新工藝。
本發(fā)明的工藝方法步驟如下 A取蒲黃藥材醇提得稠膏，即總提取物； B總提取物硅膠拌樣后，另取硅膠活化、干柱層析，以5～10∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑為洗脫劑或展開劑，分段提取得8～12份，各份用甲醇、乙醇或丙酮洗脫，洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；合并其中第5份和第6份得到香蒲新苷粗品； C以硅膠為吸附劑，香蒲新苷粗品用甲醇溶解后，干法上樣，以乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為洗脫液進行梯度洗脫，梯度為100∶0-60∶40，分段提取得8～12份，減壓濃縮，把其中第8-10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品； D取香蒲新苷精品，加入甲醇或乙醇至溶解，浸泡、濕法裝柱，色譜柱的徑高比為3∶20-27，吸附劑為葡聚糖凝膠LH-20，用量為被分離樣品量的18-30倍，用甲醇或乙醇進行洗脫，分段收集洗脫液，共收集12～15份；把其中第8～10份分別濃縮，加入濃縮液20～25倍量的乙酸乙酯，靜置沉淀，過濾，沉淀用乙酸乙酯洗滌后，干燥，即得到香蒲新苷純品。
上述方法中步驟A的方法為取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為60～90％的乙醇150～250體積份，浸泡24～48小時后，加熱回流提取0.5～1.5小時，靜置1～2小時，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取2～4次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液和提取液合并，水浴加熱，水浴溫度60～90℃，減壓濃縮至濃縮液無醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即總提取物2.5～3.0重量份。
上述方法中步驟A的優(yōu)選方法為取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為70％的乙醇200體積份，浸泡24小時后，加熱回流提取1小時，靜置1小時，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.8重量份。
上述方法中步驟B的方法為取稠膏50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅膠，干燥，得到拌樣硅膠。另取1500～2000重量份的100～200目的硅膠，100～105℃活化1.5～2小時后，干法裝柱；將拌樣硅膠加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000～3000體積份為洗脫劑或展開劑，進行干柱層析，放干溶劑，進行等分切割或按色帶切割，共得到8～12份；各份用1500～2000體積份的甲醇、乙醇或丙酮洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物。收集其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.5-8重量份； 上述方法中步驟B的優(yōu)選方法為取稠膏50重量份，拌入150重量份，160～200目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠；另取160～200目硅膠1500重量份，100～105℃活化1.5小時后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2500體積份為展開劑，下行法展開，進行干柱層析，待展開劑前沿到達色譜柱底部時，放干溶劑，等分切割，共得到10份。各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1500體積份洗脫；洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.9重量份。
上述方法中步驟C的方法為吸附劑為100～150重量份的200～300目的硅膠，香蒲新苷粗品7.5～8.0重量份用甲醇100～200體積份溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑(乙酸乙酯、甲醇、乙醇均為分析純)進行梯度洗脫；洗脫梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每個梯度洗脫劑用量為100～300體積份，洗脫流速為每分鐘2～6體積份，分份收集，每份100～150體積份，減壓濃縮至10～20體積份；把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品2.5-3.0重量份； 上述方法中步驟C的優(yōu)選方法為吸附劑為100重量份的200～300目的硅膠H，香蒲新苷粗品7.9重量份用甲醇100體積份溶解后，加到4倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑進行梯度洗脫；最佳洗脫梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每個梯度洗脫劑用量為200體積份，洗脫流速為每分鐘4體積份，洗脫劑總用量為2600體積份，分份收集，每份100體積份，減壓濃縮至10體積份；把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品2.80重量份； 上述方法中步驟D的方法為香蒲新苷精品2.50～3.00重量份，加30～60體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小時后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50～80重量份，色譜柱徑高比為1∶20-26，用甲醇或乙醇60～150體積份進行洗脫，收集洗脫液，每份5～10體積份，共收集12～15份。把其中第6～9份分別濃縮至2～3體積份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，靜置0.5～2小時，沉淀，過濾，沉淀用15-30體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品1.80～2.80重量份。
上述方法中步驟D的優(yōu)選方法為香蒲新苷精品2.80重量份，加50體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小時后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50重量份，色譜柱徑高比為1∶20，用甲醇或乙醇150體積份進行洗脫，收集洗脫液，每份5體積份，共收集15份。把其中第6～9份分別濃縮至2體積份后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置0.5～2小時，沉淀，過濾，沉淀用20體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品2.70重量份。
采用本方法提取蒲黃有效成分香蒲新苷，提取工藝路線簡單，提取分離純度提高，香蒲新苷收率提高，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。下面實驗例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。
實驗例1香蒲新苷的純度檢查 用高效液相色譜法檢查純度。儀器美國惠普公司HP1050高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(HP1050 DAD)，HP1050/WIN-3D化學工作站，Waters公司25μL可調進樣器。色譜柱Bondclone 10 C18柱，3.9mm×300mm(美國Phenomenex公司)。流動相乙腈-水(15～20∶85～80)；流速1.0～1.2mL/min；柱溫室溫；檢測波長254nm；衰減8；進樣量20μg，保留時間(RT)香蒲新苷為6～7min，色譜圖記錄時間20min。歸一化法測定純度，香蒲新苷純品的純度為98.74％，大于98.00％，可作為對照品使用。實驗例2香蒲新苷的結構測定 熔點用Boetius THMK05型顯微熔點測定儀測定；紫外(UV)光譜用日本島津U-2000型紫外分光光度計測定；紅外光譜(IR)用Nicolet FTIR-5DX型紅外光譜儀測定，KBr壓片；核磁共振氫譜和碳譜(1HNMR和13CNMR)用JEOLGX-400型和VIRIAN GEMINI300型核磁共振儀測定，TMS為內標；質譜(MS)用VGZABSPEC型和VG-MM7070型質譜儀測定。
取上述精制方法所得的香蒲新苷純品為淡黃色無定形粉末(甲醇-乙酸乙酯)，熔點150～152℃，易溶于水、甲醇，溶于乙醇，微溶于丙酮、乙酸乙酯。紫外燈下呈黃棕色熒光，三氯化鋁顯色后呈黃綠色熒光。鹽酸鎂粉反應陽性，Molish反應陽性，示為黃酮苷類化合物。UVλmax(nm)254，354(MeOH)，示3位為取代的黃酮醇；269，329，407(MeONa)，帶I紅移53nm，示4’位為游離羥基；273，322，357(NaOAc)，帶II紅移19nm，示7位為游離羥基；254，354(NaOAc+H3BO3)，示無鄰二羥基；269，301，369sh，405(AlCl3)，帶I紅移51nm；268，361sh，402(AlCl3/HCl)，峰位與AlCl3光譜比較基本不變，示5位為游離羥基。IRυmax(KBr，cm-1)3407.9(OH)，2936.8，1659.4(C＝O)，1613.8，1517.7(苯環(huán))，1462.1，1358.8，1289.4，1205.2，1131.5，1061.3，984.1，918.1，812.1。FAB-MS(m/z)794(M++Na+H)，771(M-+H)，625(M+-鼠李糖基+H)，478(M+-鼠李糖基-鼠李糖基+H)，317(M+-鼠李糖基-鼠李糖基-葡萄糖基+H)。說明兩個鼠李糖基是末端的，即三糖部分是分支的。1HNMR(CD3OD，TMS)δ0.91和1.06出現(xiàn)的兩個雙峰，示有兩個鼠李糖。δ4.53和5.18的信號，示兩個鼠李糖基端基氫，若仔細觀察，每一信號實為雙峰，其偶合常數(shù)很小，推斷兩個糖均為α-構型；δ5.73處出現(xiàn)的雙峰信號，示為3位葡萄糖基的相應的端基質子，偶合常數(shù)為7.3Hz，推斷為β-構型。由此表明，該化合物的3位連有兩個鼠李糖基和一個葡萄糖基。13CNMR(CD3OD，TMS)δ68.9歸于葡萄糖基6位次甲基碳的信號，較對應的葡萄糖甲苷向低場位移，這是6位羥基苷化后而引起的位移效應，表明一個鼠李糖的端基與葡萄糖的6位相連。δ80.9為葡萄糖基2位碳的信號，與對應葡萄糖甲苷相比，此C-2信號向低場位移，而C-3信號向高場位移，這表明另一鼠李糖基與葡萄糖2位相連。該化合物用0.1mol/L鹽酸水解，水解液紙層析檢出L-鼠李糖和D-葡萄糖。綜合以上數(shù)據(jù)及實驗結果，確定為異鼠李素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-α-L-鼠李糖(1→6)-β-D-葡萄糖苷，即香蒲新苷(typhaneoside)，分子式為C34H42O2。其UV、1HNMR、13CNMR數(shù)據(jù)見表1、2、3。
表1 香蒲新苷的UV光譜數(shù)據(jù)(nm)測定溶劑香蒲新苷MeOHMeONaNaOAcNaOAc+H3BO3AlCl3AlCl3/HCl254，354269，329，407273，322，357254，354269，301，369sh，405268，361，402 表2香蒲新苷的1HNMR數(shù)據(jù)(in CD3OD)氫原子香蒲新苷682’5’6’-OCH31”11””6-CH36”” -CH3δ6.18，d，J＝1.8Hzδ6.38，d，J＝2.1Hzδ7.93，d，J＝2.1Hzδ6.91，d，J＝8.5Hzδ7.57，dd，J＝8.2Hz，2.0Hzoverlaidδ5.73，d，J＝7.3Hzδ4.53，d，J＝2.0Hzδ5.18，d，J＝2.0Hzδ0.91，d，J＝6.1Hzδ1.06，d，J＝6.4Hz 表3香蒲新苷的13CNMR數(shù)據(jù)(in CD3OD)碳原子香蒲新苷(δ)23456789101’2’3’4’5’6’OCH31”2”3”4”5”6”123456l””2””3””4””5””6””159.3135.1180.2164.0100.5166.595.5159.2106.7124.1116.9151.4149.1115.3124.557.7101.380.979.674.578.068.9103.573.172.974.770.718.6103.273.172.974.770.517.3 實驗例3硅膠干柱色譜分離香蒲新苷粗品試驗 取蒲黃藥材25kg，加入濃度為70％的乙醇200L，浸泡24h后，加熱回流提取1小時，靜置1小時，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上述上清液和提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏50g，拌入150g粗硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn)，160～200目)，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取粗硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn)，160～200目)1.5kg，100～105℃活化1.5小時后，干法裝柱(直徑12cm，高60cm)。將拌樣硅膠加入柱中，以乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶1)混合溶劑為展開劑，下行法展開，進行干柱層析，待展開劑前沿到達色譜柱底部時，放干溶劑，等分切割，共得到10份。各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1500mL洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物。各洗脫物用薄層色譜檢查。
薄層色譜條件吸附劑硅膠GF254預制薄層板；展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶劑。
其中第5份和第6份香蒲新苷含量較高，合并，得到香蒲新苷粗品7.9g；香蒲新苷粗品為棕黃色粉末。
實驗例4減壓柱色譜分離香蒲新苷精品試驗 香蒲新苷精品的制備采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量100g)。取上述實驗例所得香蒲新苷粗品7.9g用180毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑，進行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個梯度洗脫劑用量為150mL，洗脫流速為每分鐘3mL，洗脫劑總用量為1950mL，分份收集，每份100mL，減壓濃縮至小體積(約10mL)后，用薄層色譜檢查，薄層色譜條件吸附劑硅膠GF254預制薄層板；展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶劑。其中第8-10份香蒲新苷含量較高，把第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品黃色粉末2.83g。實驗例5葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜分離香蒲新苷純品試驗 上述香蒲新苷精品黃色粉末2.83g以40毫升甲醇溶解，上樣(SephadexLH-20凝膠50g，甲醇浸泡24h后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用120毫升甲醇進行洗脫，待色帶到達柱底部時，開始收集洗脫液，每份5mL，共收集15份。用薄層色譜檢查，薄層色譜條件吸附劑硅膠GF254預制薄層板；展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶劑。其中第6-9份香蒲新苷含量較高，把其中第8～10份分別濃縮至小體積(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置1小時，沉淀，過濾，沉淀用20毫升乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品2.61克，為淡黃色粉末。
實施例1香蒲新苷純品的制備 取蒲黃藥材25kg，加入濃度為70％的乙醇175L，浸泡30小時后，加熱回流提取1小時，靜置1小時，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度70℃，減壓濃縮至濃縮液至無醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.5kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取180目硅膠1600g，100～105℃活化1.5小時后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以10∶1∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000毫升為展開劑，下行法展開，進行干柱層析，待展開劑前沿到達色譜柱底部時，放干溶劑，色帶切割，共得到10份。各份用甲醇1750ml洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量較高，合并，得到香蒲新苷粗品8g。
香蒲新苷精品的制備采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用200目的硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量110g)。香蒲新苷粗品8g用100ml甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑，進行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個梯度洗脫劑用量為200mL，洗脫流速為每分鐘4mL，洗脫劑總用量為2600mL，每份100mL，減壓濃縮至小體積(約18mL)后，把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品黃色粉末3.00g。
香蒲新苷的純化上述香蒲新苷精品黃色粉末3.00g以60mL甲醇溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠80g，乙醇浸泡30小時后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用甲醇150毫升進行洗脫，待色帶到柱底部時，開始收集洗脫液，每份10mL，共收集10份。把其中第6～9份分別濃縮至小體積(2.8mL)后，加入25倍量乙酸乙酯，靜置1.5小時，沉淀，過濾，沉淀用30毫升乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品2.8克，為淡黃色粉末。
實施例2香蒲新苷純品的制備 取蒲黃藥材25kg，加入濃度為80％的乙醇200L，浸泡40小時后，加熱回流提取1.5小時，靜置1小時，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取4次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.7kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取180目硅膠1600g，100～105℃活化1.5小時后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以乙7∶3∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2200毫升為展開劑，下行法展開，進行干柱層析，待展開劑前沿到達色譜柱底部時，放干溶劑，色帶切割，共得到10份。各份用甲醇1900ml洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量較高，合并，得到香蒲新苷粗品7.8g。
香蒲新苷精品的制備采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用250目的硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量130g)。香蒲新苷粗品7.8g用150毫升甲醇溶解后，加到5倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑，進行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個梯度洗脫劑用量為220mL，洗脫流速為每分鐘5mL，洗脫劑總用量為2860mL，每份120mL，減壓濃縮至小體積(約16mL)后，把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品黃色粉末2.60g。
香蒲新苷的純化上述香蒲新苷精品黃色粉末2.60g以40毫升乙醇溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠70g，甲醇浸泡26小時后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用甲醇100毫升進行洗脫，待色帶到柱底部時，開始收集洗脫液，每份8mL，共收集12份。把其中第6～9份分別濃縮至小體積(2.4mL)后，加入24倍量乙酸乙酯，靜置1.5小時，沉淀，過濾，沉淀用30毫升乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品2.5克，為淡黃色粉末。
實施例3香蒲新苷純品的制備 取蒲黃藥材25kg，加入濃度為90％的乙醇225L，浸泡45小時后，加熱回流提取0.5小時，靜置1小時，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取2次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.8kg。
取上述稠膏55g，拌入170g，160目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取160目硅膠1700g，100～105℃活化2小時后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以乙9∶1∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶劑1800毫升為展開劑，下行法展開，進行干柱層析，待展開劑前沿到達色譜柱底部時，放干溶劑，等分切割，共得到10份。各份用丙酮1700ml洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量較高，合并，得到香蒲新苷粗品7.5g。
香蒲新苷精品的制備采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用300目的硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量140g)。香蒲新苷粗品7.5g用120毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑，進行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個梯度洗脫劑用量為200mL，洗脫流速為每分鐘4mL，洗脫劑總用量為2600mL，每份140mL，減壓濃縮至小體積(約12mL)后，把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品黃色粉末2.50g。
香蒲新苷的純化上述香蒲新苷精品黃色粉末2.50g以30毫升乙醇溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠60g，乙醇浸泡28小時后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用乙醇120毫升進行洗脫，待色帶到柱底部時，開始收集洗脫液，每份7mL，共收集14份。把其中第6～9份分別濃縮至小體積(3mL)后，加入22倍量乙酸乙酯，靜置1小時，沉淀，過濾，沉淀用20毫升乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品2.3克，為淡黃色粉末。
實施例4香蒲新苷純品的制備 取蒲黃藥材25kg，加入濃度為70％的乙醇200L，浸泡24h后，加熱回流提取1小時，靜置，吸取上清液。藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去。將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏58g，拌入160g，180目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠。另取120目硅膠1900g，100～105℃活化1.5小時后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以乙8∶2∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000毫升為展開劑，下行法展開，進行干柱層析，待展開劑前沿到達色譜柱底部時，放干溶劑，等分切割，共得到10份。各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1600ml洗脫。洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量較高，合并，得到香蒲新苷粗品7.9g。香蒲新苷粗品為棕黃色粉末。
香蒲新苷的精制采用減壓柱層析方法。吸附劑為薄層層析用250目的硅膠H(青島海洋化工廠生產(chǎn)，用量150g)。香蒲新苷粗品7.9g用150毫升甲醇溶解后，加到3倍量的粗硅膠(160～200目)中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣(色譜柱直徑12cm，高4cm)。洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑，進行梯度洗脫(梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每個梯度洗脫劑用量為150mL，洗脫流速為每分鐘4mL，洗脫劑總用量為1950mL，每份150mL，減壓濃縮至小體積(約10mL)后，把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷黃色粉末2.80g。
香蒲新苷的純化上述香蒲新苷精品黃色粉末2.80g以50毫升甲醇溶解，上樣(Sephadex LH-20凝膠50g，甲醇浸泡24小時后，濕法裝柱。色譜柱直徑3cm，高60cm)，用乙醇120毫升進行洗脫，待色帶到柱底部時，開始收集洗脫液，每份5mL，共收集15份。把其中第6～9份分別濃縮至小體積(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置1.5小時，沉淀，過濾，沉淀用20mL乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品2.70克，為淡黃色粉末。
權利要求
1、一種香蒲新苷純品的提取方法，其特征在于該方法包括如下步驟
A取蒲黃藥材醇提得稠膏，即總提取物；
B總提取物硅膠拌樣后，另取硅膠活化、干柱層析，以5～10∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑為洗脫劑或展開劑，分段提取得8～12份，各份用甲醇、乙醇或丙酮洗脫，洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；合并其中第5份和第6份得到香蒲新苷粗品；
C以硅膠為吸附劑，香蒲新苷粗品用甲醇溶解后，干法上樣，以乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為洗脫液進行梯度洗脫，梯度為100∶0-60∶40，分段提取得8～12份，減壓濃縮，把其中第8-10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品；
D取香蒲新苷精品，加入甲醇或乙醇至溶解，浸泡、濕法裝柱，色譜柱的徑高比為3∶20-27，吸附劑為葡聚糖凝膠LH-20，用量為被分離樣品量的18-30倍，用甲醇或乙醇進行洗脫，分段收集洗脫液，共收集12～15份；把其中第8～10份分別濃縮，加入濃縮液20～25倍量的乙酸乙酯，靜置沉淀，過濾，沉淀用乙酸乙酯洗滌后，干燥，即得到香蒲新苷純品。
2、如權利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中A步驟為
取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為60～90％的乙醇150～250體積份，浸泡24～48小時后，加熱回流提取0.5～1.5小時，靜置1～2小時，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取2～4次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液和提取液合并，水浴加熱，水浴溫度60～90℃，減壓濃縮至濃縮液無醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即總提取物2.5～3.0重量份。
3、如權利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中B步驟為
取稠膏50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅膠，干燥，得到拌樣硅膠；另取1500～2000重量份的100～200目的硅膠，100～105℃活化1.5～2小時后，干法裝柱；將拌樣硅膠加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000～3000體積份為洗脫劑或展開劑，進行干柱層析，放干溶劑，進行等分切割或按色帶切割，共得到8～12份；各份用1500～2000體積份的甲醇、乙醇或丙酮洗脫；洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；收集其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.5-8重量份。
4、如權利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中C步驟為
吸附劑為100～150重量份的200～300目的硅膠，香蒲新苷粗品7.5～8.0重量份用甲醇100～200體積份溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑(乙酸乙酯、甲醇、乙醇均為分析純)進行梯度洗脫；洗脫梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每個梯度洗脫劑用量為100～300體積份，洗脫流速為每分鐘2～6體積份，分份收集，每份100～150體積份，減壓濃縮至10～20體積份；把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品2.5-3.0重量份。
5、如權利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中D步驟為
香蒲新苷精品2.50～3.00重量份，加30～60體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小時后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50～80重量份，色譜柱徑高比為1∶20-26，用甲醇或乙醇60～150體積份進行洗脫，收集洗脫液，每份5～10體積份，共收集12～15份；把其中第6～9份分別濃縮至2～3體積份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，靜置0.5～2小時，沉淀，過濾，沉淀用15-30體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品1.80～2.80重量份。
6、如權利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法包括如下步驟
A、取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為60～90％的乙醇150～250體積份，浸泡24～48小時后，加熱回流提取0.5～1.5小時，靜置1～2小時，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取2～4次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液和提取液合并，水浴加熱，水浴溫度60～90℃，減壓濃縮至濃縮液無醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即總提取物2.5～3.0重量份；
B、取稠膏50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅膠，干燥，得到拌樣硅膠；另取1500～2000重量份的100～200目的硅膠，100～105℃活化1.5～2小時后，干法裝柱；將拌樣硅膠加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2000～3000體積份為洗脫劑或展開劑，進行干柱層析，放干溶劑，進行等分切割或按色帶切割，共得到8～12份；各份用1500～2000體積份的甲醇、乙醇或丙酮洗脫；洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；收集其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.5-8重量份；
C、吸附劑為100～150重量份的200～300目的硅膠，香蒲新苷粗品7.5～8.0重量份用甲醇100～200體積份溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑進行梯度洗脫；洗脫梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每個梯度洗脫劑用量為100～300體積份，洗脫流速為每分鐘2～6體積份，洗脫劑總用量為1500～3000體積份；分份收集，每份100～150體積份，減壓濃縮至10～20體積份；把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品2.5-3.0重量份；
D、香蒲新苷精品2.50～3.00重量份，加30～60體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小時后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50～80重量份，色譜柱徑高比為1∶20-26，用甲醇或乙醇60～150體積份進行洗脫，收集洗脫液，每份5～10體積份，共收集12～15份；把其中第6～9份分別濃縮至2～3體積份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，靜置0.5～2小時，沉淀，過濾，沉淀用15-30體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品1.80～2.80重量份。
7、如權利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于該方法中A步驟為取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為70％的乙醇200體積份，浸泡24小時后，加熱回流提取1小時，靜置1小時，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.8重量份。
8、如權利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于該方法中B步驟為
取稠膏50重量份，拌入150重量份，160～200目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠；另取160～200目硅膠1500重量份，100～105℃活化1.5小時后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2500體積份為展開劑，下行法展開，進行干柱層析，待展開劑前沿到達色譜柱底部時，放干溶劑，等分切割，共得到10份；各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1500體積份洗脫；洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.9重量份。
9、如權利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于該方法的C步驟為吸附劑為100重量份的200～300目的硅膠H，香蒲新苷粗品7.9重量份用甲醇100體積份溶解后，加到4倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑進行梯度洗脫；洗脫梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每個梯度洗脫劑用量為200體積份，洗脫流速為每分鐘4體積份，洗脫劑總用量為2600體積份，分份收集，每份100體積份，減壓濃縮至10體積份；把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品2.80重量份。
10、如權利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于該方法中D步驟為香蒲新苷精品2.80重量份，加50體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小時后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50重量份，色譜柱徑高比為1∶20，用甲醇或乙醇150體積份進行洗脫，收集洗脫液，每份5體積份，共收集15份；把其中第6～9份分別濃縮至2體積份后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置0.5～2小時，沉淀，過濾，沉淀用20體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品2.70重量份。
11、如權利要求6所述的提取方法，其特征在于該方法包括如下步驟
A、取蒲黃藥材25重量份，加入濃度為70％的乙醇200體積份，浸泡24小時后，加熱回流提取1小時，靜置1小時，吸取上清液；藥渣用同樣的方法先后提取3次，提取藥液合并，藥渣棄去；將上清液與提取液合并，水浴加熱，水浴溫度80℃，減壓濃縮至濃縮液至無醇味，得稠膏即蒲黃總提取物2.8重量份；
B、取稠膏50重量份，拌入150重量份，160～200目粗硅膠，自然干燥，得到拌樣硅膠；另取160～200目硅膠1500重量份，100～105℃活化1.5小時后，干法裝柱，徑高比為1∶5；將拌樣硅膠加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶劑2500體積份為展開劑，下行法展開，進行干柱層析，待展開劑前沿到達色譜柱底部時，放干溶劑，等分切割，共得到10份；各份用溫度為80℃的70％的熱乙醇1500體積份洗脫；洗脫液減壓回收溶劑后，得各洗脫物；其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.9重量份；
C、吸附劑為100重量份的200～300目的硅膠H，香蒲新苷粗品7.9重量份用甲醇100體積份溶解后，加到4倍量的160～200目硅膠中，拌勻，揮干溶劑，干法上樣；洗脫劑依次采用不同比例的乙酸乙酯-無水乙醇混合溶劑進行梯度洗脫；最佳洗脫梯度為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每個梯度洗脫劑用量為200體積份，洗脫流速為每分鐘4體積份，洗脫劑總用量為2600體積份；分份收集，每份100體積份，減壓濃縮至10體積份；把其中第8～10份濃縮液合并，減壓抽干得到香蒲新苷精品2.80重量份；
D、香蒲新苷精品2.80重量份，加50體積份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小時后，濕法裝柱葡聚糖凝膠LH-20 50重量份，色譜柱徑高比為1∶20，用甲醇或乙醇150體積份進行洗脫，收集洗脫液，每份5體積份，共收集15份；把其中第6～9份分別濃縮至2體積份后，加入20倍量乙酸乙酯，靜置0.5～2小時，沉淀，過濾，沉淀用20體積份乙酸乙酯洗滌后，自然干燥，即得到香蒲新苷純品2.70重量份。
全文摘要
本發(fā)明公開了提取分離蒲黃有效成分香蒲新苷的新工藝。本發(fā)明的工藝方法步驟如下A取蒲黃藥材醇提得稠膏，得總提取物；B總提取物硅膠拌樣后，另取硅膠活化、干柱層析，洗脫或展開，分段提取、洗脫，減壓回收后；合并第5份和第6份得到香蒲新苷粗品；C香蒲新苷粗品溶解，干法上樣，梯度洗脫，分段提取，把其中第8－10份濃縮液合并，減壓抽干得香蒲新苷精品；D香蒲新苷精品，加入醇溶解，浸泡、濕法裝柱，洗脫，分段收集，把其中第8～10份濃縮，沉淀，過濾，洗滌、干燥，得香蒲新苷純品。
文檔編號C07H17/07GK1651446SQ20041010178
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權日2004年12月24日
發(fā)明者劉斌, 石任兵, 鄧巧虹, 王偉, 陸蘊如 申請人:北京中醫(yī)藥大學