專利名稱：源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物，特別是涉及從羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)的葉所獲得并且兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物，該萃取產(chǎn)物的制備方法以及將該萃取產(chǎn)物用于制造皮膚美白用以及皮膚抗皺用產(chǎn)品的應(yīng)用。依據(jù)本發(fā)明，可從羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)的葉純化出具有皮膚美白效用以及皮膚抗皺效用的槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)。
背景技術(shù)：
皮膚老化是必經(jīng)的過程，老化的皮膚會產(chǎn)生各種組織形態(tài)與生理功能的變化，例如皮膚萎縮、松弛、失去彈性和光澤、產(chǎn)生皺紋、色素變化、皮膚傷口愈合能力及免疫力降低等。除了因增齡而造成的內(nèi)因性老化之外，皮膚尚受到環(huán)境諸多不利的影響，而加速或提前老化。這些外因性老化的原因例如，長期暴露于陽光或高能量放射線下、組織受損、微生物感染、生活壓力過大、疲勞過度、或過多的油脂攝取等，也會增加自由基及黑色素的產(chǎn)生或是代謝因子喪失。過量的自由基累積于皮膚中，會造成表皮、真皮結(jié)締組織中的DNA受到破壞、脂質(zhì)過氧化(Lipid Peroxidation)以及各種膠原蛋白質(zhì)變性，使得結(jié)締組織失去原有功能，而產(chǎn)生皮膚老化的現(xiàn)象，例如皺紋(Wrinkle)、失去彈性(Loss of Tone)以及干燥等。近年來，很多研究報告指出反應(yīng)性氧族(ROS)不但能直接破壞組織間隙的膠原蛋白，還能讓基質(zhì)蛋白酶組織抑制物(Tissue Inhibitors of Metalloproteinases；TIMPs)去活性化，誘使另一類與皮膚老化相關(guān)的酵素，即基質(zhì)金屬蛋白酶(MatixMetalloproteinases；MMPs)活化與表現(xiàn)。
基質(zhì)金屬蛋白酶涵蓋了一整個大家族，大部分功用都是切除細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix)的蛋白質(zhì)，至今已被發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)金屬蛋白酶至少有26種，它們都具有很多結(jié)構(gòu)上的共同點，例如具有鋅離子的結(jié)構(gòu)及某些相同序列的勝月太鏈。一般而言，基質(zhì)金屬蛋白酶在正常、健康或休止的組織中幾乎都不被表現(xiàn)出來，或是維持在非常微量的狀態(tài)。在正常情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶切除結(jié)締組織，有利于傷口的修復(fù)以及組織的重組。但當(dāng)細胞或組織處于修復(fù)(Repair)或重組(Remodeling)的狀態(tài)時，例如遭逢組織受傷、發(fā)炎反應(yīng)、皮膚日曬、或各類疾病及癌細胞等，各類型的基質(zhì)金屬蛋白酶就會被大量的分泌出來。
當(dāng)皮膚基質(zhì)金屬蛋白酶分泌不正常時，反而會造成結(jié)締組織的損害。舉例而言，在光老化(Photoageing)現(xiàn)象中，皮膚受到陽光中能量最高且波長介于320nm至400nm之間的UVA(Ultraviolet A)、以及能量次之且波長介于280nm至320nm之間的UVB(Ultraviolet B)曝曬后，一方面皮膚結(jié)締組織中的DNA吸收光子后引起結(jié)構(gòu)上的改變而失去作用，另一方面表皮上一些光敏感性物質(zhì)(Photosensitizer)，諸如反式尿刊酸(Trans-Urocanic Acid)吸收光子后會進一步和氧分子反應(yīng)，而形成例如單旋氧(Singlet Oxygen)、超氧陰離子自由基(Superoxide Anion Radical)等反應(yīng)性氧族。反應(yīng)性氧族會進一步破壞組織結(jié)構(gòu)，也會去活化基質(zhì)蛋白酶組織抑制物(TIMPs)，使得皮膚基質(zhì)金屬蛋白酶分泌不正常，而引起結(jié)締組織異常的損害。
當(dāng)皮膚上出現(xiàn)的膚色黯沉或是色素沉淀時，可藉由使用一些皮膚美白用品(skin whiting products)來淡化或去除累積于皮膚上色素或黑斑。根據(jù)目前所知的「美白」原理，可藉由阻斷UV輻射(block of ultravioletirradiation)、自由基的清除(removal of free radicals)、抑制酪胺酸酶的合成(inhibition of tyrosinase synthesis)、抑制酪胺酸酶的活性(inhibition of tyrosinase activity)(Sachiko Shirota et al.(1994)，Biol.Pharm.Bull.，17(2)266-269)，或是藉由阻礙黑色素(melanin)的生成或促進其代謝等方面，來達致所欲的皮膚美白目的。
Koichi Lida曾就所得到的中草藥萃取產(chǎn)物來進行抑制酪胺酸酶活性的測試，其中以衍生自傳統(tǒng)中藥中慣用的大黃(Rheum officinale Bail1on)的萃取產(chǎn)物的抑制率達58.5％為最高(Koichi Lida.(1995)，P1.Med.，61425-428)。另外，Dong-I1 Jang等人也發(fā)現(xiàn)，在以95％乙醇來萃取構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera)的干燥根時可得到一種天然化合物，也就是5-(3-(2，4-二羥基-酚)丙基)-3，4-雙(3-甲基-2-丁烯基)-1，2-苯二醇[5-(3-(2，4-dihydroxy-phenol)propyl)-3，4-bis(3-methyl-2-butenyl)-1，2-benzenediol]，該化合物對于酪胺酸酶的活性具有極強的抑制作用(Dong-I1 Jang et al.(1997)，Cos.&Toil.112(1)59-62)。此外，也有人分別從下列的生物來源分離出酪胺酸酶抑制劑藍綠藻(Tomoharu Sano and Kunimitsu Kaya(1996)，J.Nat.Prod.，5990-92)、苔蘚(Masako Higuchi et al.(1993)，P1.Med.，59253-255)以及真菌(Senji Takahashi et al.(1996)，TheJ.Antibiotics 49(6)513-518；Mireille Goetghebeur and SelimKermasha(1996)，PHytochemistry，42935-940)。
在后續(xù)的研究中也得知有相當(dāng)多的萃取產(chǎn)物與化合物可以抑制酪胺酸酶活性，例如，Matsuda等人由楊梅(Myrica rubra)的莖葉所得到的萃取產(chǎn)物以及從該萃取產(chǎn)物進一步分離純化出的槲皮酮(quercetin)皆具有抑制酪胺酸酶活性的能力(Matsuda et al.(1995)，Biol.Pharm Bull.，18(8)1148-1150)。
在有關(guān)皮膚美白用的醫(yī)藥品與化妝品的研發(fā)上，醫(yī)藥界以及化妝品工業(yè)中的研究者已認知抑制酪胺酸酶活性與防止皮膚產(chǎn)生非所欲的色素沉淀間的關(guān)聯(lián)性，因此，抑制酪胺酸酶活性的試驗常被用來評估一待測物質(zhì)的皮膚美白效用。例如，在臺灣的專利核準公告案第505520號中即揭示藉由抑制酪胺酸酶活性試驗來評估該案中所獲得的居魯貝巴·派茲(jurubeba)萃取產(chǎn)物的美白效用。
羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)是屬于常綠喬木，且此屬的植物常做為造林用樹種。在臺灣，羅漢松屬植物廣布于中低海拔地區(qū)，且主要包含有四個物種大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis presl)、桃實百日青(Podocarpus nakaiiHayata)以及叢花百日青(Podocarpus fasciculus de Laubenfels)。而就申請人所知，迄今并無任何文獻資料或?qū)＠鞍冈?jīng)揭示，可以從羅漢松屬物種得到具有抑制酪胺酸酶活性的效用的萃取產(chǎn)物或經(jīng)純化的化合物，以供用于制造皮膚美白用的產(chǎn)品，包括化妝品與醫(yī)藥品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種新的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，所要解決的技術(shù)問題是使其可以從羅漢松屬物種得到具有抑制酪胺酸酶活性的效用的萃取產(chǎn)物或經(jīng)純化的化合物，從而更加適于實用。
本發(fā)明的另一目的在于，提供一種羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物用于皮膚美白以及皮膚抗皺的應(yīng)用，所要解決的技術(shù)問題是使其用于制造皮膚美白用的產(chǎn)品，從而更加適于實用。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，該方法包含下列步驟(a)以一選自于下列群組中的溶劑來萃取一適量的羅漢松屬物種的葉水、醇或是此二者的一個組合；(b)將步驟(a)所形成的混合物內(nèi)的羅漢松屬物種的葉移除而得到一第一萃取溶液；(c)移除該第一萃取溶液內(nèi)的溶劑而得到一含有槲皮酮與兒茶素的第一萃取產(chǎn)物。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施進一步實現(xiàn)。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的被使用在步驟(a)中的羅漢松屬物種的葉是取自在下列羅漢松屬植物的至少一種大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis presl)、桃實百日青(Podocarpus nakaiiHayata)以及叢花百日青(Podocarpus fasciculus de Laubenfels)。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的被使用于步驟(a)中的羅漢松屬物種的葉有先經(jīng)過切碎處理并被浸泡于該溶劑內(nèi)歷時一段充分的時間以容許萃取。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的被使用于步驟(a)中的萃取溶劑是水。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的被使用于步驟(a)中的萃取溶劑是一選自于下列群組中的醇甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的被使用于步驟(a)中的萃取溶劑是一由水與一選自于下列群組中的醇所構(gòu)成的混合物甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的被使用于步驟(a)中的萃取溶劑是一50％甲醇或乙醇溶液。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的于步驟(c)中所得到的該第一萃取產(chǎn)物被進一步進行下列分配處理(d)令該第一萃取產(chǎn)物與一由水與醇所構(gòu)成的溶劑相混合；(e)以一適量的乙酸乙酯溶劑來分配步驟(d)所形成的混合物，藉此而形成一乙酸乙酯層以及一乙酸乙酯不溶層；(f)將步驟(e)所形成的該乙酸乙酯層內(nèi)的溶劑移除而得到一第二萃取產(chǎn)物；以及(g)將步驟(e)所形成的該乙酸乙酯不溶層內(nèi)的溶劑移除而得到一第三萃取產(chǎn)物。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的被使用于步驟(d)中的該由水與醇所構(gòu)成的溶劑是一由水與一選自于下列群組中的醇所構(gòu)成的混合物甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的于步驟(d)中，該第一萃取產(chǎn)物與一50％甲醇或乙醇溶液相混合。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的于步驟(g)中所得到的該第三萃取產(chǎn)物可被進一步進行使用具一預(yù)定的水醇比值的水/醇洗提溶劑的第一凝膠層析，藉此而獲得兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的該第一凝膠層析是使用Diaion HP 20管柱來進行。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的該第一凝膠層析是藉由依序地使用水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑而被進行，藉此而在使用各個該等洗提溶劑的洗提階段中收集到兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的該第一凝膠層析在以100％甲醇洗提之后，接著以70％丙酮來作洗提，藉此而得到一間具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的丙酮萃取產(chǎn)物。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的在使用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑的各個洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的各別萃取產(chǎn)物可被進一步進行使用具一預(yù)定的水醇比值的水/醇洗提溶劑的第二凝膠層析，藉此而獲得兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的在使用40％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物可被進一步進行依序地使用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑的第二凝膠層析，藉此而在使用各個該等洗提溶劑的洗提階段中收集到兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的該第二凝膠層析是使用Sephadex LH 20管柱來進行。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的在使用40％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物被進一步進行制備型HPLC，藉此而得到被純化的兒茶素。
前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其中所述的在使用100％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物被進一步進行制備型HPLC，藉此而得到被純化的槲皮酮。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物，該萃取產(chǎn)物是藉由前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法而被制得。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施進一步實現(xiàn)。
前述的源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物，該萃取產(chǎn)物是下列的至少一種(i)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法的步驟(c)所得到的第一萃取產(chǎn)物；(ii)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法的步驟(f)所得到的第二萃取產(chǎn)物；(iii)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法的步驟(g)所得到的第三萃取產(chǎn)物；(iv)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(v)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(vi)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(vii)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(viii)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物；以及(ix)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種組成物，其包含有一藉由一根據(jù)前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法而被制得的源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物。
前述的組成物，其中所述的組成物兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用。
前所述的組成物，該組成物兼具有抑制黑色素形成以及皮膚抗皺的效用。
前所述的組成物，該組成物包含有下列的至少一種(i)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法的步驟(c)所得到的第一萃取產(chǎn)物；(ii)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法的步驟(f)所得到的第二萃取產(chǎn)物；(iii)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法的步驟(g)所得到的第三萃取產(chǎn)物；(iv)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(v)一從前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(vi)一前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(vii)一前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(viii)一前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物；以及(ix)一前述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
前的組成物，該組成物可被應(yīng)用于制造下列任一種產(chǎn)品皮膚美白用化妝品、皮膚美白用醫(yī)藥品、皮膚抗皺用化妝品以及皮膚抗皺用醫(yī)藥品。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種用于皮膚美白的組成物，該組成物包含有從羅漢松屬物種的葉所純化出的槲皮酮與兒茶素。
前述的組成物，其中所述的槲皮酮與兒茶素是從下列羅漢松屬植物中的至少一種的葉被純化而得大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis pres1)、桃實百日青(Podocarpus nakaii Hayata)以及叢花百日青(Podocarpus fasciculus deLaubenfels)。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種用于皮膚抗皺的組成物，其包含有從羅漢松屬物種的葉所純化出的槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的根據(jù)權(quán)利要求29所述的組成物，其中槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)是從下列羅漢松屬植物中的至少一種的葉被純化而得大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis presl)、桃實百日青(Podocarpus nakaii Hayata)以及叢花百日青(Podocarpus fasciculus de Laubenfels)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點和有益效果。由以上技術(shù)方案可知，為了達到前述發(fā)明目的，本發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容如下因此，在第一個方面，本發(fā)明提供一種用于制備一源自于羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)葉的萃取產(chǎn)物的方法，其包含下列步驟(a)以一選自于下列群組中的溶劑來萃取一適量的羅漢松屬物種的葉水、醇或是此二者的一個組合；(b)將步驟(a)所形成的混合物內(nèi)的羅漢松屬物種的葉移除而得到一第一萃取溶液；(c)移除該第一萃取溶液內(nèi)的溶劑而得到一含有槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)的第一萃取產(chǎn)物。
該第一萃取產(chǎn)物可被進一步進行下列分配處理(partitioningtreatment)(d)令該第一萃取產(chǎn)物與一由水與醇所構(gòu)成的溶劑相混合；(e)以一適量的乙酸乙酯溶劑來分配(partitioning)步驟(d)所形成的混合物，藉此而形成一乙酸乙酯層以及一乙酸乙酯不溶層(ethylacetate-immiscible layer)；(f)將步驟(e)所形成的該乙酸乙酯層內(nèi)的溶劑移除而得到一第二萃取產(chǎn)物；以及(g)將步驟(e)所形成的該乙酸乙酯不溶層內(nèi)的溶劑移除而得到一第三萃取產(chǎn)物。
該第一萃取產(chǎn)物、第二萃取產(chǎn)物與第三萃取產(chǎn)物都被證實兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用。
該第三萃取產(chǎn)物可被進一步進行使用具一預(yù)定的水醇比值的水/醇洗提溶劑的第一凝膠層析，藉此而獲得兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。而從該第一凝膠層析所得到的萃取產(chǎn)物可被進一步地進行使用具一預(yù)定的水醇比值的水/醇洗提溶劑的第二凝膠層析，藉此而獲得兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。從該第一凝膠層析與該第二凝膠層析分別被獲得的萃取產(chǎn)物已被證實兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用。
此外，從該第二凝膠層析所得到的萃取產(chǎn)物可被進一步進行制備型HPLC，藉此而得到被純化的槲皮酮(quercetin)或兒茶素(catechin)。
借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物及其制備方法以及該萃取產(chǎn)物用于皮膚美白以及皮膚抗皺的應(yīng)用至少具有下列優(yōu)點使用一選自于下列群組中的溶劑來萃取一適量的羅漢松屬物種的葉水、醇或是此二者的一個組合。在經(jīng)過一段時間后，將羅漢松屬物種的葉移除，并將萃取溶劑移除，即可得到兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。如后文所述，該萃取產(chǎn)物經(jīng)進一步的純化處理后，被證實里面含有至少槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)這兩種具有皮膚美白效用以及皮膚抗皺效用的化合物。
上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實施，并為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，以下特舉出多個較佳實施例，并配合附圖，詳細說明如下。


圖1是一HPLC圖譜(HPLC profile)，其顯示一依據(jù)本發(fā)明的一個較佳具體例而從大葉羅漢松葉所得到的萃取產(chǎn)物，也即實施例4中所得到的“Me-50”，的HPLC分析結(jié)果。
圖2是一HPLC圖譜，其顯示一依據(jù)本發(fā)明的另一個較佳具體例而從大葉羅漢松葉所得到的萃取產(chǎn)物，也即實施例7中以40％甲醇作為洗提溶劑而從Sephadex LH 20管柱層析所得到的洗提產(chǎn)物“Me-40-2”的HPLC分析結(jié)果。
圖3是一HPLC圖譜，其顯示一依據(jù)本發(fā)明的另一個較佳具體例而從大葉羅漢松葉所得到的萃取產(chǎn)物，即實施例7中以100％甲醇作為洗提溶劑而從Sephadex LH 20管柱層析所得到的洗提產(chǎn)物“Me-100-2”，的HPLC分析結(jié)果。
圖4顯示實施例7中所得到的洗提產(chǎn)物“Me40-2”的1H-NMR圖譜。
圖5顯示實施例7中所得到的洗提產(chǎn)物“Me40-2”的13C-NMR圖譜。
圖6顯示實施例7中所得到的洗提產(chǎn)物“Me100-2”的1H-NMR圖譜。
圖7是一凝膠電泳分析結(jié)果，其顯示一依據(jù)本發(fā)明的另一個較佳具體例而從大葉羅漢松葉所得到的萃取產(chǎn)物，亦即實施例7中所得到的洗提產(chǎn)物“Me40-2”與“Me100-2”于實施例12的凝膠電泳分析結(jié)果。
具體實施例方式
為了開發(fā)兼具有皮膚美白效用以及皮膚抗皺效用的新產(chǎn)品，申請人嘗試從臺灣本土植物來獲取兼具有皮膚美白以及皮膚抗皺效用效用的物質(zhì)，而成功地由羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)的葉萃取出兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
就申請人所知，并無任何文獻資料或?qū)＠鞍冈沂?，可以使用何種溶劑來萃取羅漢松屬物種的葉而得到兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的物質(zhì)。
而申請人經(jīng)過多種嘗試后發(fā)現(xiàn)，可以使用一選自于下列群組中的溶劑來萃取一適量的羅漢松屬物種的葉水、醇或是此二者的一個組合。在經(jīng)過一段時間后，將羅漢松屬物種的葉移除，并將萃取溶劑移除，即可得到兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。如后文所述，該萃取產(chǎn)物經(jīng)進一步的純化處理后，被證實里面含有至少槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)這兩種具有皮膚美白效用以及皮膚抗皺效用的化合物。
于是，本發(fā)明提供一種用于制備一源自于羅漢松屬物種(Podocarpussp.)葉的萃取產(chǎn)物的方法，其包含下列步驟(a)以一選自于下列群組中的溶劑來萃取一適量的羅漢松屬物種的葉水、醇或是此二者的一個組合；(b)將步驟(a)所形成的混合物內(nèi)的羅漢松屬物種的葉移除而得到一第一萃取溶液；(c)移除該第一萃取溶液內(nèi)的溶劑而得到一含有槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)的第一萃取產(chǎn)物。
依據(jù)本發(fā)明，步驟(b)可藉由過濾來進行，以以移除不溶性物質(zhì)，而適用的過濾用具可選自于下列濾紙、紗布、棉花、一具選定篩孔大小的濾網(wǎng)，以及此等的一個組合。在本發(fā)明的一個較佳具體例中，該第一萃取溶液是使用濾紙(Whatman No.5)來進行過濾后所得到的萃取液。
可被使用于本案方法的步驟(a)中的羅漢松屬物種的葉是取自于下列羅漢松屬植物的至少一者大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis presl)、桃實百日青(Podocarpus nakaii Hayata)以及叢花百日青(Podocarpus fasciculus deLaubenfels)。
較佳地，被使用于本案方法的步驟(a)中的羅漢松屬物種的葉有先經(jīng)過切碎處理并被浸泡于該萃取溶劑內(nèi)歷時一段充分的時間以容許萃取。較佳地，經(jīng)切碎的羅漢松屬物種的葉被浸泡于所選用的萃取溶劑內(nèi)歷時一為大約一個星期或更長的期間。
較佳地，本案方法是在一溫度不會太高的環(huán)境下被進行，更佳是在環(huán)溫或是一比環(huán)溫為低的溫度下被進行，以以確保從羅漢松屬物種的葉內(nèi)被萃取出的活性物質(zhì)不會受到非所欲的破壞。
依據(jù)本發(fā)明的一個較佳具體例，被使用于本案方法的步驟(a)中的萃取溶劑是水。
依據(jù)本發(fā)明的另一個較佳具體例，被使用于本案方法的步驟(a)中的萃取溶劑是一選自于下列群組中的醇甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。
依據(jù)本發(fā)明的又另一個較佳具體例，被使用于本案方法的步驟(a)中的萃取溶劑是一由水與一選自于下列群組中的醇所構(gòu)成的混合物甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。在本發(fā)明的一個更佳具體例中，被使用于本案方法的步驟(a)中的萃取溶劑是一50％甲醇或乙醇溶液。
依據(jù)本發(fā)明，在本案方法的步驟(c)中被用來移除萃取溶劑的方式可為減壓濃縮、冷凍干燥處理(lyophilization)、低溫噴霧干燥處理(spray-drying)、低溫蒸發(fā)處理(evaporation)等。在本發(fā)明的一個較佳具體例中，該第一萃取溶液內(nèi)的溶劑是藉由減壓濃縮處理而被移除，藉此而得到該第一萃取產(chǎn)物。
為找出兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的活性組份，申請人進一步將本案方法的步驟(c)中所得到的該第一萃取產(chǎn)物作下列分配處理(partitioning treatment)(d)令該第一萃取產(chǎn)物與一由水與醇所構(gòu)成的溶劑相混合；(e)以一適量的乙酸乙酯溶劑來分配(partitioning)步驟(d)所形成的混合物，藉此而形成一乙酸乙酯層以及一乙酸乙酯不溶層(ethylacetate-immiscible layer)；(f)將步驟(e)所形成的該乙酸乙酯層內(nèi)的溶劑移除而得到一第二萃取產(chǎn)物；以及(g)將步驟(e)所形成的該乙酸乙酯不溶層內(nèi)的溶劑移除而得到一第三萃取產(chǎn)物。
依據(jù)本發(fā)明的一個較佳具體例，被使用于上述步驟(d)中的該由水與醇所構(gòu)成的溶劑是一由水與一選自于下列群組中的醇所構(gòu)成的混合物甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。在本發(fā)明的一個更佳具體例中，在上述步驟(d)中，該第一萃取產(chǎn)物被混合以一50％甲醇或乙醇溶液。
中請人又將上述步驟(g)中所得到的該第三萃取產(chǎn)物拿來進行一使用具一預(yù)定的水醇比值的水/醇洗提溶劑的凝膠層析，以以獲得兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-l活性的效用的萃取產(chǎn)物。
依據(jù)申請人的試驗，該凝膠層析可以本技藝所慣用的技術(shù)來進行，此包括，例如大小區(qū)別層析(size exclusion chromatography)、分子篩層析(molecular sieve chromatography)、凝膠過濾層析(gel filtrationchromatography)、凝膠排阻層析(gel exclusion chromatography)以及凝膠滲透分析(gel permeation chromatography)等。
此外，適用于本案的層析管柱填料可為那些于本技藝中所慣用者，此包括，但不限于，葡聚糖凝膠(Dextran gel)、聚丙烯酰胺凝膠(polyacryamide gel)、瓊脂糖凝膠(agarose gel)以及聚丙烯酰胺凝膠與瓊脂糖凝膠的交聯(lián)物等。較佳地，在本案方法的凝膠層析處理中所使用的是一選自于下列的層析管柱填料Diaion、ODS-C18、MCI CHP20P以及葡聚糖LH20(Sephadex)。
而且，依據(jù)本發(fā)明，該凝膠層析可以依序地使用不同層析管柱來進行，例如先使用Diaion HP 20管柱來進行第一次的凝膠層析，而后使用SephadexLH 20管柱來進行第二次凝膠層析。
依據(jù)本發(fā)明的一個較佳具體例，上述步驟(g)中所得到的該第三萃取產(chǎn)物被進一步進行使用Diaion HP 20管柱的第一次凝膠層析。在本發(fā)明的一個更佳具體例中，該第一次凝膠層析是藉由依序地使用水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑而被進行，并在使用各個該等洗提溶劑的洗提階段中收集兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物。
此外，該第一次凝膠層析在以100％甲醇洗提之后，可接著以70％丙酮來作洗提，而得到一兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的丙酮萃取產(chǎn)物。
依據(jù)本發(fā)明的一個較佳具體例，在該第一次凝膠層析中使用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑的各個洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的各別萃取產(chǎn)物可被進一步進行使用具一預(yù)定的水醇比值的水/醇洗提溶劑的第二次凝膠層析，藉此而獲得兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個更佳具體例中，在該第一次凝膠層析中使用40％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物可被進一步進行依序地使用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑的第二次凝膠層析，藉此而在使用各個該等洗提溶劑的洗提階段中收集到兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物。更佳地，該第二次凝膠層析是使用Sephadex LH 20管柱來進行。
在本發(fā)明的一個較佳具體例中，在該第二次凝膠層析使用40％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物被進一步進行制備型HPLC，藉此而得到被純化的兒茶素(catechin)。
在本發(fā)明的另一個較佳具體例中，在該第二次凝膠層析使用100％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物被進一步進行制備型HPLC，藉此而得到被純化的槲皮酮(quercetin)。
依據(jù)本發(fā)明，在上述各個不同萃取階段被獲得的萃取產(chǎn)物或經(jīng)純化的化合物被進行酪胺酸酶活性抑制試驗以及基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性抑制試驗，并被證實能對酪胺酸酶以及基質(zhì)金屬蛋白酶-1展現(xiàn)出良好的抑制能力，而且這些萃取產(chǎn)物的制備過程是經(jīng)濟、安全且容易進行的，因而這些源自于羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)葉的萃取產(chǎn)物或經(jīng)純化的化合物具有發(fā)展成為用于皮膚美白以及皮膚抗皺的化妝品或醫(yī)藥品的高度潛力。
因此，本發(fā)明也預(yù)期該等萃取產(chǎn)物或經(jīng)純化的化合物在制造用于皮膚美白以及皮膚抗皺的化妝品或醫(yī)藥品上的應(yīng)用。
于是，本發(fā)明也提供一種組成物，其包含有一依據(jù)本發(fā)明的方法而被制得的源自于羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)葉的萃取產(chǎn)物。
依據(jù)本發(fā)明的組成物兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用，同時也會具有抑制黑色素形成以及皮膚抗皺的效用。
依據(jù)本發(fā)明的組成物可以包含有下列的至少一者(i)一從本案方法的步驟(c)所得到的第一萃取產(chǎn)物；(ii)一從本案方法的步驟(f)所得到的第二萃取產(chǎn)物；(iii)一從本案方法的步驟(g)所得到的第三萃取產(chǎn)物；(iv)從本案方法的第一次凝膠層析處理所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物的任一者；(v)從本案方法的第二次凝膠層析處理所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物的任一者；(vi)從本案方法的第二次凝膠層析處理后，接著進行預(yù)備型HPLC而得到的產(chǎn)物的任一者。
依據(jù)本發(fā)明的組成物可被應(yīng)用于制造下列任一種產(chǎn)品皮膚美白用化妝品、皮膚美白用醫(yī)藥品、皮膚抗皺用化妝品以及皮膚抗皺用醫(yī)藥品。
本發(fā)明也提供一種用于皮膚美白的組成物，其包含有從羅漢松屬物種的葉所純化出的槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)。
依據(jù)本發(fā)明所得到的源自于羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)葉的萃取產(chǎn)物或經(jīng)純化的化合物可與一皮膚外用劑合并使用。如本文中所用的，“皮膚外用劑”此術(shù)語意指一通常在化妝品或醫(yī)藥品中被使用的外用成份，包括，但不限于，其他的美白劑、保濕劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、介面活性劑、增稠劑、色料、皮膚營養(yǎng)劑等等。
根據(jù)本發(fā)明的組成物也可包含在化妝品與皮膚科領(lǐng)域中常使用的佐劑，例如親水性或親脂性的膠凝劑(gelling agents)、親水性或親脂性的活性劑(active agents)、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、溶劑、香料(fragrances)、填料(fillers)、遮蔽劑(screening agents)、色料、螯合劑(chelating agents)、氣味吸收劑(odorabsorbers)以及染料。各種佐劑是以該領(lǐng)域照慣例所考慮的數(shù)量而被使用。
依據(jù)本發(fā)明的組成物也可包含，例如，諸如乳糖與葡萄糖的醣類，諸如葡聚糖、纖維素、硅酸鹽與碳酸鈣的賦形劑，諸如纖維素、淀粉、明膠、醣類的粘結(jié)劑，以及諸如瓊脂粉末、明膠粉末、藻酸鈉、纖維素衍生物以及碳酸鈣的崩解劑來一起形成于所欲的藥學(xué)制備物中。
依據(jù)本發(fā)明的組成物可以被制造成任一種可接受的藥物或化妝品形式，此包括，但不限于，水性溶液、水-醇溶液或油性溶液、呈水包油型(oil-in-water)或油包水型(water-in-oil)或復(fù)合型的乳劑(emulsions)、水性或油性凝膠、乳霜(cream)、油膏(ointment)、乳(milk)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、軟膏(paste)、泡沫(foam)或分散液(dispersion)等等。
特別地，依據(jù)本發(fā)明的組成物可以被制成下列任一種化妝品形式化妝水(tonic water)、唇彩(lip colors)、粉底(foundations)、膚乳(milk)、面霜(cream)、面膜(masks)、凝膠(gel)、氣霧(aerosol)、乳狀的乳液(milkylotions)、慕斯(mousse)、分散液(dispersions)、乳霜(cream)、衛(wèi)浴用水液(toilet waters)、貼布(packs)與清潔劑(cleansings)，以及卸妝用的清潔乳、洗面皂(wash soap)等等。
依據(jù)本發(fā)明的組成物也可包含其他已知對于美白有幫助的美白作用劑以及其他活性成分，例如，諸如本案所知的維生素C、熊果素、曲酸、槲皮酮與兒茶素等酪胺酸酵素抑制劑，抗痘劑、抗菌劑、鎮(zhèn)痛劑、麻醉劑、抗皮膚發(fā)炎劑、止癢劑、抗發(fā)炎劑、抗過角化劑(antihyperkeratolyticagents)、抗干皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriaticagents)、抗老化劑、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、美黑劑(self-tanning agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質(zhì)類固醇(corticosteroids)或激素(hormones)等等。
本發(fā)明將就下面實施例來作進一步說明，但應(yīng)了解的是，該等實施例僅為例示說明用，而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明實施上的限制。
實施例酪胺酸酶活性測定有關(guān)酪胺酸酶活性的抑制試驗可參考Sachiko Shirota et al.(1994)，Biol.Pharm.Bull.，17(2)266-269中所揭示的方法。在本發(fā)明中所進行的酪胺酸酶活性抑制試驗簡述如下。
以25％二甲亞砜(DMSO)來溶解要予以測試的待測物(最終濃度10mg/ml)。進行測試時是取25μl的待測物并置于一測試管內(nèi)，予以加入以75μl(2.5mM)的L-酪胺酸溶液(Sigma，T-8909)，并于25℃下培育歷時10分鐘。之后，加入25μl(2000U/ml)的蘑菇酪胺酸酶(Sigma，T-7755)溶液、75μl HEPES緩沖液(0.4M，pH6.8)以及50μl 100％甲醇，并于25℃下培育歷時30分鐘。最后，藉由將該測試管置于冰上來停止反應(yīng)。
使用分光光度計來量測該測試管內(nèi)的反應(yīng)混合物于475nm下的吸光值。待測物對于酪胺酸酶的抑制率是藉由下列方程式來計算酪胺酸酶活性的抑制率(％)＝[(D-C)-(B-A)]/(D-C)×100其中
A含有待測物的實驗組加入酪胺酸酶后，立即于475nm下所測得的吸光值；B含有待測物的實驗組加入酪胺酸酶來進行反應(yīng)，并于25℃下經(jīng)過30分鐘的培育后，在475nm下所測得的吸光值；C含有HEPES緩沖液的對照組加入酪胺酸酶后，立即于475nm下所測得的吸光值；以及D含有HEPES緩沖液的對照組加入酪胺酸酶來進行反應(yīng)，并于25℃下經(jīng)過30分鐘的培育后，在475nm下所測得的吸光值。
要說明的是，在一可能情形下，若所欲測定的待測物的濃度太低而無法制備出終濃度為10mg/ml的待測樣本時，本發(fā)明是以增加待測物體積的方式來提高待測樣本的濃度。如此一來，會將后續(xù)所加入的HEPES緩沖液的使用量減少，但是L-酪胺酸溶液與蘑菇酪胺酸酶的使用量仍不變?；|(zhì)金屬蛋白酶-1(Matrix Metalloproteinase-1；MMP-1)活性測定于本發(fā)明中所進行的基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性抑制試驗簡述如下。
將基質(zhì)金屬蛋白酶-1(終濃度5μg/ml)加或不加待測物(終濃度10μg/ml)并混合后，在37℃下培育歷時12小時。進行凝膠電泳分析時，先制備含0.1％明膠(gelatin)的硫酸十二酯鈉-聚丙烯胺凝膠(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)為分離膠體(separating gel)，并于其上覆蓋焦集膠體(stacking gel)后，將待測物與染劑[溴酚藍(bromophenol blue)與甘油混合溶液]以7∶1的比例混合，取8μl混合液加入上述凝膠中，以80V電壓進行電泳分析約2小時。上述各凝膠的配制已為此技術(shù)領(lǐng)域中任何具有通常知識者所熟知，故不另贅述。待染劑移動到凝膠底部邊緣后，取出膠片，以25％異丙醇(Isopropanol)溶液沖洗三次，再浸于0.5mM的氯化鈣(CaCl2)溶液中。接著，在37℃下經(jīng)過18小時的培育后，以另一染劑(commassie brilliant blue)染色約20分鐘后，以水沖洗膠片脫色后即可分析。
實施例1.使用水來萃取大葉羅漢松的葉(Extraction of the leaves ofPodocarpus macrophyllus var.macrophyllus with water)于環(huán)溫下，取大葉羅漢松葉片大約1公斤并將葉片切碎，予以加入10公升的水并浸泡一個星期。之后，以濾紙(Whatman R，No.5)來進行過濾，將所得到的濾液置于一水浴鍋內(nèi)，并在大約40℃的環(huán)境下進行減壓濃縮(Eyela SB650，Japan)。由此而得到的水萃取產(chǎn)物(于后文中以Aq1稱之)被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。Aq1所測得的酪胺酸酶活性抑制％如下表所示，其中Aq1的IC50大約為22mg/mL。
表1.大葉羅漢松葉的萃取產(chǎn)物“Aq1”的酪胺酸酶活性抑制％

實施例2.使用乙醇來萃取大葉羅漢松的葉(Extraction of the leaves ofPodocarpus macrophyllus var.macrophyllus with ethanol)本實施例是依照實施例1中所述方式來進行，但是使用乙醇(95％)來萃取大葉羅漢松葉片，其中葉片相對于乙醇的用量比例被維持在1公克的葉片使用大約10ml的乙醇。由此而得到的乙醇萃取產(chǎn)物被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果如下面表2所示，其中被推算出的IC50大約為4.4mg/mL。
表2.大葉羅漢松葉的乙醇萃取產(chǎn)物的酪胺酸酶活性抑制％

實施例3.使用甲醇來萃取大葉羅漢松的葉(Extraction of the leaves ofPodocarpus macrophyllus var.macrophyllus with methanol)本實施例是依照實施例1中所述方式來進行，但是使用100％甲醇來萃取大葉羅漢松葉片，其中葉片相對于乙醇的用量比例同于實施例2中所述。
由此而得到的甲醇萃取產(chǎn)物被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果如下面表3所示，其中被推算出的IC50大約為6.0mg/mL。
表3.大葉羅漢松葉的100％甲醇萃取產(chǎn)物的酪胺酸酶活性抑制％

實施例4.使用50％甲醇來萃取大葉羅漢松的葉(Extraction of the leavesof Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus wih 50％methanol)本實施例使用50％甲醇來萃取大葉羅漢松葉片，其中葉片相對于乙醇的用量比例同于實施例2中所述。于本實施例中，大葉羅漢松葉片以50％甲醇予以萃取兩次，并將兩次的50％甲醇萃取溶液合并，接而進行減壓濃縮，而得到一萃取產(chǎn)物被稱為“Me-50”。
萃取產(chǎn)物“Me-50”被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果如下面表4所示，其中被推算出的IC50大約為4.0mg/mL。
表4.大葉羅漢松葉的萃取產(chǎn)物“Me-50”的酪胺酸酶活性抑制％

于本實施例中所得到的萃取產(chǎn)物“Me-50”被進行HPLC分析，所使用的高壓液相層析儀為Shimadzu LC-6A，LC-9A，C-R6A，SPD-6A，使用Biosil5ODS-W管柱(10mm×250mm)，溶媒系統(tǒng)CH3CN-H2O 10％至100％，在30分鐘內(nèi)；100％CH3CN，在30分鐘至45分鐘內(nèi)；偵測波長為UV 254nm，流速控制在3ml/min。所得結(jié)果如圖1所示。
實施例5.
將實施例4中所得到的萃取產(chǎn)物“Me-50”拿來做進一步的分離處理。取萃取產(chǎn)物“Me-50”來與等量的乙酸乙酯(etheyl acetate)混合，并一使用分液漏斗來進行部分劃分(partial partition)，而得到一乙酸乙酯層及一乙酸乙酯不溶層。繼而將溶劑移除，而得到一乙酸乙酯層萃取產(chǎn)物以及一乙酸乙酯不溶層萃取產(chǎn)物(于后文中被稱為“Aq2”)。
于此所得到的乙酸乙酯層萃取產(chǎn)物與乙酸乙酯不溶層萃取產(chǎn)物“Aq2”被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果分別如下面表5與表6所示，其中該乙酸乙酯層萃取產(chǎn)物被推算出的IC50大約為72mg/mL，而乙酸乙酯不溶層萃取產(chǎn)物“Aq2”被推算出的IC50大約為2.4mg/mL。
表5.源自于大葉羅漢松葉的乙酸乙酯層萃取產(chǎn)物的酪胺酸酶活性抑制％

表6.源自于大葉羅漢松葉的乙酸乙酯不溶層萃取產(chǎn)物“Aq2”的酪胺酸酶活性抑制％

實施例6.
取實施例5中所得到的乙酸乙酯不溶層萃取產(chǎn)物“Aq2”(50g)來進行凝膠層析。使用Diaion HP 20(Supelco Park，Bellefonte，PA)作為管柱填料，并依序地使用水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、100％甲醇來進行洗提。而在完成100％甲醇洗提后，使用70％丙酮來作進一步的洗提。于上述各個洗提溶劑的洗提階段所收集的洗提液被冷凍干燥(Eyela，F(xiàn)D-1，Japen)，而分別得到水洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Aq3”)、1.3g的20％甲醇洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Me-20-1”)、9g的40％甲醇洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Me-40-1”)、9g的60％甲醇洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Me-60-1”)、0.4g的100％甲醇洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Me-100-1”)以及0.2g的70％丙酮洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Ac-70”)。
于本實施例中所獲得的各個萃取產(chǎn)物被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果如下面表7所示。
表7.第一次凝膠層析后的洗提產(chǎn)物Aq3、Me-20-1、Me-40-1、Me-60-1、Me-100-1以及Ac-70的酪胺酸酶活性抑制％

實施例7.
取實施例6中所得到的洗提產(chǎn)物“Me-40-1”來進行第二次凝膠層析，其中使用Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech)作為管柱填料，并依序地使用水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、100％甲醇來進行洗提，而分別得到一水洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Aq4”)、20％甲醇洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Me-20-2”)、40％甲醇洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Me-40-2”)、60％甲醇洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Me-60-2”)以及100％甲醇洗提產(chǎn)物(于后文中被稱為“Me-100-2”)。
于本實施例中所獲得的各個洗提產(chǎn)物被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果如下面表8所示。
表8.第二次凝膠層析后的洗提產(chǎn)物Aq4、Me-20-2、Me-40-2、Me-60-2以及Me-100-2的酪胺酸酶活性抑制％

上面所獲得的洗提產(chǎn)物“Me-40-2”及“Me-100-2”被進一步進行HPLC分析，操作條件如實施例4中所述。洗提產(chǎn)物“Me-40-2”及“Me-100-2”的HPLC圖譜各如圖2與圖3所示。此外，該洗提產(chǎn)物“Me-40-2”與“Me-100-2”分別被進行1H-NMR與13C-NMR分析。
該洗提產(chǎn)物“Me-40-2”的1H-NMR與13C-NMR(Burker，DRX-500MHz)結(jié)果被分別地顯示于圖4與5中。另外，根據(jù)FAB-MS質(zhì)譜分析的結(jié)果，該洗提產(chǎn)物“Me-40-2”的分子離子峰位在m/z 291[M+H]+，熔點為175℃。該洗提產(chǎn)物“Me-40-2”的分子離子峰位在m/z 291[M+H]+，熔點為175℃。該洗提產(chǎn)物“Me-40-2”的氫譜(甲醇-d4)顯示在芳香區(qū)域有3個氫以ABX偶合型態(tài)出現(xiàn)，吸收峰分別在δ6.83(d，J＝1.8Hz，H-2’)、δ6.75(d，J＝8.1Hz，H-5’)與δ6.71(dd，J＝1.8，8.1Hz，H-6’)，以及有一組AX間位偶合的訊號5.84(1H，d，J＝2.3Hz，H-8)與5.92(1H，d，J＝2.3Hz，H-6)；在脂氫區(qū)域有3個氫以AMX偶合型態(tài)出現(xiàn)，吸收峰分別在δ3.96(m，H-3)、δ2.49(dd，J＝8.1，16.1Hz，H-4α)、δ2.84(dd，J＝5.4，16.1Hz，H-4β)，而δ4.55(d，J＝7.5Hz，H-2)與δ3.96(m，H-3)為H-2與H-3訊號。將上述資料來與文獻比對，而確認該洗提產(chǎn)物“Me-40-2”是兒茶素(catechin，C15H1406)。
該洗提產(chǎn)物“Me-100-2”的1H-NMR分析結(jié)果如圖6所示。另外，根據(jù)FAB-MS質(zhì)譜分析的結(jié)果，該洗提產(chǎn)物“Me-100-2”的分子離子峰位在m/z303[M+H]+，UV max(alc)258，375nm(log 2.75，2.75)，熔點為315℃。該洗提產(chǎn)物“Me-100-2”的氫譜(甲醇-d4)顯示在芳香區(qū)域有一組3個氫吸收峰分別在δ7.72(d，J＝2.0Hz，H-2’)、δ7.62(d，J＝8.5Hz，H-5’)與δ6.87(dd，J＝2.0，8.5Hz，H-6’)，以及另一組訊號6.37(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)與6.17(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)。將上述資料來與文獻比對，而確認該洗提產(chǎn)物“Me-100-2”為槲皮酮(quercetin，C15H10O7)。
實施例8本實施例是依照實施例4中所述方式來進行，但是使用50％甲醇來萃取蘭嶼羅漢松葉。由此而得到的50％甲醇萃取產(chǎn)物被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果如下面表9所示，其中被推算出的IC50大約為4.8mg/mL。
表9.蘭嶼羅漢松葉的50％甲醇萃取產(chǎn)物的酪胺酸酶活性抑制％

實施例9本實施例是依照實施例4中所述方式來進行，但是使用50％甲醇來萃取桃實百日青。由此而得到的50％甲醇萃取產(chǎn)物被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果如下面表10所示，其中被推算出的IC50大約為3.2mg/mL。
表10.桃實百日青葉的50％甲醇萃取產(chǎn)物的酪胺酸酶活性抑制％

實施例10叢花百日青葉片的萃取產(chǎn)物的制備本實施例是依照實施例4中所述方式來進行，但是使用50％甲醇來萃取叢花百日青。由此而得到的50％甲醇萃取產(chǎn)物被進行酪胺酸酶活性抑制試驗。所得結(jié)果如下面表11所示，其中被推算出的IC50大約為5.2mg/mL。
表11.叢花百日青葉的50％甲醇萃取產(chǎn)物的酪胺酸酶活性抑制％

實施例11本實施例進一步比較依據(jù)本發(fā)明的源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物與其他市售美白產(chǎn)品的美白效用，其中實驗是以酪胺酸酶活性抑制試驗來進行，而各個試驗品所得到的IC50值被列示于表12中。
表12.源自羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物與其他市售美白產(chǎn)品的比較[IC50值]

*美白濃縮商品為購自于甲登公司(CHEM GARDAN ENTERPRISE INC.)，表中所示“原液稀釋450倍”是指以該美白濃縮商品的450倍稀釋物來進行酪胺酸酶活性抑制試驗，而測得抑制活性達到50％抑制；**美白水商品(WHITIA LOTION)是法徠麗公司(Flelis Inc.Co.)所出品，表中所示“商品原液25μl”是指以25μl的該美白水商品來進行酪胺酸酶活性抑制試驗，而測得抑制活性達50％抑制；***膠原蛋白面膜商品(綠迷雅)是臺鹽公司所出品。表中所示“原液僅達IC47”是指所測得的抑制活性僅達到對照組的47％。
由表12所示結(jié)果，本發(fā)明所得到的源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物除是如熊果素、維生素C、曲酸以及市售美白產(chǎn)品等皆具有良好美白效用。
實施例12取實施例7中所獲得的洗提產(chǎn)物“Me-40-2”(主要為兒茶素)及“Me-100-2”(主要為槲皮酮)于含有明膠的SDS凝膠中來進行基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性抑制試驗。由于基質(zhì)金屬蛋白酶-1會分解明膠，因此被分解的明膠就無法經(jīng)由另一染劑(commassie brilliant blue)染色，經(jīng)脫色后于約51kDa處會呈現(xiàn)透明帶狀，而當(dāng)待測物越能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性時，透明帶狀則越不明顯。所得到的凝膠電泳分析結(jié)果如圖7所示。
就保護皮膚觀點而言，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1會有皮膚抗皺效用，目前已知維生素A酸(retinoic acid)、(tissue inhibitor of MMP-1，TIMP-1)等具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1的效用。請參閱圖7，由左至右依序分別為未加待測物的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即A行)、加入維生素A酸的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即B行)、加入洗提產(chǎn)物“Me-40-2”的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即C行)以及加入洗提產(chǎn)物“Me-100-2”的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即D行)的凝膠電泳分析結(jié)果。由圖7得知，本發(fā)明的洗提產(chǎn)物“Me-40-2”以及“Me-100-2”均有相當(dāng)顯著抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1的效果。
于本說明書中被引述的所有文獻資料與專利案以其整體被并入本案作為參考資料。若有所沖突時，本案的詳細說明(包含界定在內(nèi))將占上風(fēng)。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的方法及技術(shù)內(nèi)容作出些許的更動或修飾為等同變化的等效實施例，但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于該方法包含下列步驟(a)以一選自于下列群組中的溶劑來萃取一適量的羅漢松屬物種的葉水、醇或是此二者的一個組合；(b)將步驟(a)所形成的混合物內(nèi)的羅漢松屬物種的葉移除而得到一第一萃取溶液；(c)移除該第一萃取溶液內(nèi)的溶劑而得到一含有槲皮酮與兒茶素的第一萃取產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于被使用于步驟(a)中的羅漢松屬物種的葉是取自于下列羅漢松屬植物的至少一種大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis presl)、桃實百日青(Podocarpus nakaiiHayata)以及叢花百日青(Podocarpus fasciculus de Laubenfels)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于被使用于步驟(a)中的羅漢松屬物種的葉有先經(jīng)過切碎處理并被浸泡于該溶劑內(nèi)歷時一段充分的時間以容許萃取。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于被使用于步驟(a)中的萃取溶劑是水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于被使用于步驟(a)中的萃取溶劑是一選自于下列群組中的醇甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于被使用于步驟(a)中的萃取溶劑是一由水與一選自于下列群組中的醇所構(gòu)成的混合物甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于被使用于步驟(a)中的萃取溶劑是一50％甲醇或乙醇溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于在步驟(c)中所得到的該第一萃取產(chǎn)物被進一步進行下列分配處理(d)令該第一萃取產(chǎn)物與一由水與醇所構(gòu)成的溶劑相混合；(e)以一適量的乙酸乙酯溶劑來分配步驟(d)所形成的混合物，藉此而形成一乙酸乙酯層以及一乙酸乙酯不溶層；(f)將步驟(e)所形成的該乙酸乙酯層內(nèi)的溶劑移除而得到一第二萃取產(chǎn)物；以及(g)將步驟(e)所形成的該乙酸乙酯不溶層內(nèi)的溶劑移除而得到一第三萃取產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于被使用于步驟(d)中的該由水與醇所構(gòu)成的溶劑是一由水與一選自于下列群組中的醇所構(gòu)成的混合物甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇，以及此等的一個組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于在步驟(d)中，該第一萃取產(chǎn)物與一50％甲醇或乙醇溶液相混合。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于在步驟(g)中所得到的該第三萃取產(chǎn)物可被進一步進行使用具一預(yù)定的水醇比值的水/醇洗提溶劑的第一凝膠層析，藉此而獲得兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于該第一凝膠層析是使用Diaion HP 20管柱來進行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于該第一凝膠層析是藉由依序地使用水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑而被進行，藉此而在使用各個該等洗提溶劑的洗提階段中收集到兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于該第一凝膠層析在以100％甲醇洗提之后，接著以70％丙酮來作洗提，藉此而得到一間具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的丙酮萃取產(chǎn)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于在使用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑的各個洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的各別萃取產(chǎn)物可被進一步進行使用具一預(yù)定的水醇比值的水/醇洗提溶劑的第二凝膠層析，藉此而獲得兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于在使用40％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物可被進一步進行依序地使用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇以及100％甲醇作為洗提溶劑的第二凝膠層析，藉此而在使用各個該等洗提溶劑的洗提階段中收集到兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于該第二凝膠層析是使用Sephadex LH 20管柱來進行。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于在使用40％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物被進一步進行制備型HPLC，藉此而得到被純化的兒茶素。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法，其特征在于在使用100％甲醇作為洗提溶劑的洗提階段中所收集到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物被進一步進行制備型HPLC，藉此而得到被純化的槲皮酮。
20.一種源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物，其特征在于該萃取產(chǎn)物是藉由一如權(quán)利要求第1至19項中任一項的方法而被制得。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物，其特征在于該萃取產(chǎn)物是下列的至少一種(i)一從權(quán)利要求1的方法的步驟(c)所得到的第一萃取產(chǎn)物；(ii)一從權(quán)利要求8的方法的步驟(f)所得到的第二萃取產(chǎn)物；(iii)一從權(quán)利要求8的方法的步驟(g)所得到的第三萃取產(chǎn)物；(iv)一從權(quán)利要求11的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(v)一從權(quán)利要求13的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(vi)一從權(quán)利要求15的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(vii)一從權(quán)利要求16的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(viii)一從權(quán)利要求18的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物；以及(ix)一從權(quán)利要求19的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
22.一種組成物，其包含有一藉由一如權(quán)利要求第1至19中任一權(quán)利要求所述的制備一源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物的方法而被制得的源自于羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組成物，其特征在于其中所述的組成物兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組成物，其特征在于該組成物兼具有抑制黑色素形成以及皮膚抗皺的效用。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組成物，其特征在于該組成物包含有下列的至少一種(i)一從權(quán)利要求1的方法的步驟(c)所得到的第一萃取產(chǎn)物；(ii)一從權(quán)利要求8的方法的步驟(f)所得到的第二萃取產(chǎn)物；(iii)一從權(quán)利要求8的方法的步驟(g)所得到的第三萃取產(chǎn)物；(iv)一從權(quán)利要求11的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(v)一從權(quán)利要求13的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(vi)一權(quán)利要求15的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(vii)一從權(quán)利要求16的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的各別萃取產(chǎn)物；(viii)一從權(quán)利要求18的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物；以及(ix)一從權(quán)利要求19的方法所得到的兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性的效用的萃取產(chǎn)物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的組成物，其特征在于該組成物可被應(yīng)用于制造下列任一種產(chǎn)品皮膚美白用化妝品、皮膚美白用醫(yī)藥品、皮膚抗皺用化妝品以及皮膚抗皺用醫(yī)藥品。
27.一種用于皮膚美白的組成物，其特征在于該組成物包含有從羅漢松屬物種的葉所純化出的槲皮酮與兒茶素。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組成物，其特征在于槲皮酮與兒茶素是從下列羅漢松屬植物中的至少一種的葉被純化而得大葉羅漢松、蘭嶼羅漢松、桃實百日青以及叢花百日青。
29.一種用于皮膚抗皺的組成物，其包含有從羅漢松屬物種的葉所純化出的槲皮酮與兒茶素。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組成物，其中槲皮酮與兒茶素是從下列羅漢松屬植物中的至少一種的葉被純化而得大葉羅漢松、蘭嶼羅漢松、桃實百日青以及叢花百日青。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種羅漢松屬物種葉的萃取產(chǎn)物及其制備方法以及該萃取產(chǎn)物用于皮膚美白以及皮膚抗皺的應(yīng)用，本發(fā)明揭示從羅漢松屬物種(Pldocarpus sp.)的葉所獲得并且兼具有抑制酪胺酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶－1活性的效用的萃取產(chǎn)物，該萃取產(chǎn)物的制備方法以及將該萃取產(chǎn)物用于制造皮膚美白用產(chǎn)品的應(yīng)用。依據(jù)本發(fā)明，可從羅漢松屬物種(Podocarpus sp.)的葉純化出具有皮膚美白效用以及皮膚抗皺效用的槲皮酮(quercetin)與兒茶素(catechin)。
文檔編號C07D311/00GK1709884SQ200410081798
公開日2005年12月21日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日
發(fā)明者李美賢, 鄭可大, 陳世輝, 呂思潔 申請人:臺鹽實業(yè)股份有限公司