專利名稱：作為免疫抑制劑的紫草素衍生物及其金屬絡合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種紫草素衍生物及其金屬絡合物，具體是一種作為免疫抑制劑的紫草素衍生物及其金屬絡合物。屬于藥物領域。
背景技術：
紫草(Lishopermum eryhrorhizon)為傳統(tǒng)中藥，藥用其根部。味甘，性寒，歸肝經(jīng)，功能涼血活血，解毒透疹。適用于麻疹或溫熱病發(fā)斑疹。近代藥理學研究證明紫草具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用。其主要成分有紫草素(shikoin I)，乙酰紫草素(Acetyl shikonin II)等。
經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Xin Chen等在《International Immunopharmacology》第2001年第1期P229-236上發(fā)表的Shikonin，a component of antiinflammatoryChinese herbal medicine，selectively blocks chemokine binding to CC chemokinereceptor-1(一種傳統(tǒng)中藥抗炎成分紫草素選擇性地阻抗趨化因子與CC趨化因子受體-1)和在《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》2003年第47卷第9期P2810-2816上發(fā)表的Shikonin，a component of Chinese herbal medicine，inhibits chemokine receptot function and suppresses human immunodeficiencyvirus type-1(一種傳統(tǒng)中藥成分紫草素抑制趨化因子受體功能和抑制I型人自身免役缺陷病毒)，文中報道了紫草素具有選擇性的趨化因子(Chemokine)受體-I抑制活性?？赡苡糜谀承┳陨砻庖咝匝装Y疾病及自身免役缺陷病毒的治療。趨化因子是一類具有趨化作用的細胞因子，它們能引導白細胞遷移、誘導其活性，在人體免疫反應中起重要作用。趨化因子的過度表達或以正常健康組織為攻擊的靶時，則引起某些自身免疫性疾病，如類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、紅斑狼瘡、器官移植排斥反應等。趨化因子還與腫瘤轉(zhuǎn)移和HIV感染有關。因此，趨化因子抑制劑可能用于上述與自身免疫有關疾病的治療。該文作者首次提出了紫草素對趨化因子受體的抑制作用并預測了紫草素用于自身免疫相關疾病的可能性。但沒有報道紫草素衍生物及其絡合物的生物活性，也沒有報道它們對免疫細胞的抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有發(fā)明的不足和缺陷，提供一種作為免疫抑制劑的紫草素衍生物及其金屬絡合物，使其解決了活性更強和毒性更低的免疫抑制劑，合成了一些紫草素的衍生物和金屬離子絡合物，測定了其對免疫細胞的抑制作用和細胞毒作用本發(fā)明是通過如下技術方案實施的，本發(fā)明以遼寧紫草為原料，取其根，通過CO2臨界萃取，得到總紫草色素，然后，將CO2臨界萃取物用堿水解，得到紫草素(I)。
將紫草素與各種有機酸(如乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、α-甲基丙烯酸、β-甲基丙烯酸、β，β-二甲基丙烯酸、苯甲酸、對硝基苯甲酸)在DCC和DMAP催化下進行縮合，得到以分子式(III)為代表的紫草素酯類衍生物。
將紫草素及其酯類衍生物與金屬離子(如Cu++、Zn++、Ca++)絡合，得到以分子式(IV)為代表的絡合物。
以免疫細胞增殖法(H3法)和細胞毒法(MTT法)實驗測定了所合成化合物的免疫抑制作用及細胞毒作用，結(jié)果列于表1中。
結(jié)果表明紫草的衍生物通式III所代表的化合物在實驗的濃度范圍內(nèi)(0.1-100μg/ml)時具有很強的免疫抑制作用，但具有細胞毒作用。通式IV代表的化合物在較低濃度時仍保留較強的免疫抑制活性而沒有細胞毒作用。可用于與自身免疫有關疾病的治療。
本發(fā)明提到的紫草的衍生物化學結(jié)構(gòu)式(III)及其金屬絡合物化學結(jié)構(gòu)式(IV)為 式III中，R代表1-6個碳原子的飽和、不飽和及芳香族的酰基，如R為乙酰基(II)、丙酰基(III-1)、丁酰基(III-2)、異丁酰基(III-3)、α-甲基丙烯酰基(III-4)、β-甲基丙烯酰(III-5)、β，β-二甲基丙烯酰基(III-6)、苯甲?；?III-7)、對硝基苯甲?；?III-8)。
式IV中，R代表氫，1-6個碳原子的飽和、不飽和及芳香族的?；?，M代表金屬Cu、Ca、Zn。如R＝H，M＝Cu(IV-1)、R＝H，M＝Ca(IV-2)、R＝H，M＝Zn(IV-3)、R＝Ac，M＝Cu(IV-4)、R＝Ac，M＝Ca(IV-5)、R＝Ac，M＝Zn(IV-6)。
表1部分化合物的免疫抑制及細胞毒試驗結(jié)果



本發(fā)明具有實質(zhì)性特點和顯著進步，這些化合物具有免疫抑制作用，可用于與人體自身免疫有關的疾病，包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化病、紅斑狼瘡、HIV感染、惡性腫瘤。
具體實施例方式
實驗部分1、紫草素的制備取遼寧硬紫草原藥材的CO2超臨界提取物10克，溶于500ml的0.2mol/l的NaOH溶液中，室溫攪拌24小時，離心除去不溶物，合并上清液，加入0.5mol/l的H2SO4溶液，直至溶液變成紅色，放置2小時，離心，得紅色沉淀物，水洗，干燥，得紫草素粗品5g，石油醚重結(jié)晶，得紅褐色有金屬光澤的晶體2.5g，收率25％。熔點148-149℃，H-NMR(CDCl3)δ1.651，1.755(s，各3H，2CH3)，2.311-2.387(1H，m，-CHa)，2.623-2.660(1H，m，-CHb)，4.911(1H，d，J＝7.2，4.0，-OCH-)，5.202(1H，dd，J＝8.0，6.8，＝CH-)，7.165(s，1H，Quin-H)，7.192(2H，2Ar-H)，12.494，12.598(各1H，s，2Ar-OH)，與文獻報道一致(植物學報，1989，31(7)，549-553)。
2、紫草素酯類衍生物的制備通法取紫草素粗品若干克，溶于干燥的CH2Cl2中，待全部溶解后，加入1-2倍摩爾量的有機酸(脂肪酸，不飽和酸，芳香酸)，以及2-3倍摩爾量的DCC和DMAP，室溫-30℃攪拌1-12小時，停止反應。濾除不溶物，濾液水洗3次，加無水Na2SO4干燥，減壓蒸出溶媒，粗品經(jīng)層析分離，用適當溶劑重結(jié)晶，可得紫草素的酯類衍生物。
(1)乙酰紫草素取紫草素1.44g，溶于干燥的CH2Cl2中，待全部溶解后，加入1g冰醋酸，以及2g DCC和0.3g DMAP，室溫攪拌1小時，停止反應。濾除不溶物，濾液水洗3次，加無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶媒，得粗品，用石油醚重結(jié)晶，得到黑紅色有金屬光澤的晶體1.15g，收率70％。熔點106-107℃。1H-NMR(CDCl3)δ1.579，1.694(各3H，S，2CH3)，2.142(3H，S，CH3C＝O)，2.444-2.518(m，1H，-CHa)，2.580-2.650(1H，m，-CHb)，5.122(1H，t，J＝9.6，-CH＝)，6.021(1H，dd，J＝9.2，6.2，-OCH-)，6.991(1H，s，Quin-H)，7.186(2H，s，2Ar-H)，12.433，12.589(各1H，s，2Ar-OH)，與文獻報道一致(植物學報，1989，31(7)，549-553)。
(2)α-甲基丙烯酰紫草素取紫草素2.88g，溶于干燥的CH2Cl2中，待全部溶解后，加入2g α-甲基丙烯酸，以及4g DCC和0.6g DMAP，30℃攪拌5小時，停止反應。濾除不溶物，濾液水洗3次，加無水Na2SO4干燥，50℃以下，減壓蒸除溶媒，硅膠柱層析分離，用石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1的流動相洗脫，得產(chǎn)物1.76g，收率49.4％。用甲醇重結(jié)晶，得到紅色有金屬光澤的晶體，熔點83-84℃。1H-NMR(CDCl3)δ1.563，1.580[各3H，s，＝C(CH3)2]，1.976(3H，s，＝C-CH3)，2.505-2.541(1H，m，-CHa)，2.646(1H，m，-CHb)，5.118(1H，t，J＝7.2，-CH＝)，5.659，6.208(各1H，s，＝CH2)，6.062(1H，dd.J＝7.2，4.8，-OCH-)，6.967(1H，s，Quin-H)，7.187(2H，s，2Ar-H)，12.431，12.601(各1H，s，2Ar-OH)。
(3)對硝基苯甲酰紫草素取紫草素1g，溶于干燥的CH2Cl2中，待全部溶解后，加入0.5g對硝基苯甲酸，以及2g DCC和0.3g DMAP，30℃攪拌12小時，停止反應。濾除不溶物，濾液水洗3次，加無水Na2SO4干燥，50℃以下減壓蒸除溶媒，硅膠柱層析分離，用石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1的流動相洗脫，得產(chǎn)物0.83g，收率58.5％，用石油醚重結(jié)晶，得到黑紅色有金屬光澤的晶體，熔點143-144℃，1H-NMR(CDCl3)δ1.611，1.689(各3H，s，2CH3)，2.644-2.699(1H，m，-CHa)，2.751-2.780(1H，m，-CHb)，5.191(1H，t，J＝7.2，-CH＝)，6.294(1H，dd，J＝6.8，5.2，-OCH-)，7.06(1H，s，Quin-H)，7.187(2H，s，2Ar-H)，8.247(2H，d，J＝9.2，2’6’-Ar-H)，8.339(2H，d，J＝9.2，3’5’-Ar-H)，12.386，12.629(各1H，s，2Ar-OH)。
3、紫草素及其酯的金屬絡和物的制備通法用最少量的丙酮溶解若干克紫草素或紫草素酯；另用最少量的水溶解2倍摩爾量的Cu(Ac)2，Zn(Ac)2，Ca(Ac)2。將兩者混合，產(chǎn)生沉淀，過濾，干燥即得金屬絡合物。
實例(1)乙酰紫草素銅絡合物取乙酰紫草素176mg，溶于3ml丙酮中，另取醋酸銅194mg溶于5ml水中，將二者混合，放置，析出沉淀，過濾，少量水洗，干燥，得絡合物229mg，收率94.2％。
(2)乙酰紫草素鋅絡合物取乙酰紫草素236mg，溶于5ml丙酮中，另取醋酸鋅263mg溶于5ml水中，將二者混合，放置，析出沉淀，過濾，少量水洗，干燥，得絡合物309mg，收率93.8％。
(3)乙酰紫草素鈣絡合物取乙酰紫草素250mg，溶于5ml丙酮中，另取醋酸鈣240mg溶于8ml水中，將二者混合，放置，析出沉淀，過濾，少量水洗，干燥，得絡合物298mg，收率96.4％。
4、細胞增殖抑制實驗1)、細胞增殖法(H3法)(1)脫脊椎處死小鼠，無菌取其脾臟。將脾臟用玻璃片磨碎，過膜，于1200rpm離心5分鐘。棄去上清。沉淀加入紅細胞裂解液每個脾臟約1ml，混勻，靜置1分鐘，加入PBS，離心。再加入PBS，過膜，離心。將所剩細胞洗滌1-2次后，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)成4×106/ml。
(2)于96孔板中每孔加入100μl的細胞懸液，50μl的樣品，(對照加50μl的培養(yǎng)液)和50μl的ConA或LPS，總體積200μl。每實驗組設3個復孔，另設3孔不加有絲分裂原作為細胞增殖的本底對照。
(3)細胞于含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束前12小時每孔加入25μl3H-胸腺嘧啶核苷酸。
(4)繼續(xù)培養(yǎng)至實驗結(jié)束，然后將培養(yǎng)板凍存于-20℃冰箱；測定時將凍融的細胞用細胞收集儀收集至玻璃纖維膜上，加入閃爍液后于Beta計數(shù)儀上讀取摻入細胞DNA的3H-胸腺嘧啶核苷酸量，以cpm值代表細胞增殖的情況。
2)、細胞毒法(MTT法)(1)取ICR小鼠脫脊椎處死，消毒后取脾臟。將脾臟用玻璃片磨碎，過膜，于1200rpm離心5分鐘。棄去上清。沉淀加入紅細胞裂解液2-4ml，混勻，靜置1分，加入PBS，離心。再加入PBS，過膜，。將所剩細胞洗滌1-2次后，將細胞濃度調(diào)至5×106個/ml。(5×105個/well)(2)于96孔板中每孔加入90μl的細胞懸液，45μl的樣品(對照加45μl的培養(yǎng)液)和45μl的ConA或LPS，總體積180μ。每實驗組設3個復孔，另設3孔不加有絲分裂原作為細胞增殖的本底對照。
(3)37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)48小時，結(jié)束培養(yǎng)前4-5小時每孔加入MTT 18μl。
(4)培養(yǎng)結(jié)束時，加入溶解液90μl，放置6-7小時左右，用酶標儀(Bio-Rad Model550，Japan)于570nm處測OD值。
權(quán)利要求
1.一種作為免疫抑制劑的紫草素衍生物及其金屬絡合物，其特征在于，紫草的衍生物化學結(jié)構(gòu)式III及其金屬絡合物化學結(jié)構(gòu)式IV為 式III中R代表1-6個碳原子的飽和、不飽和及芳香族的酰基；式IV中R代表氫，1-6個碳原子的飽和、不飽和及芳香族的?；琈代表金屬Cu、Ca、Zn。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作為免疫抑制劑的紫草素衍生物及其金屬絡合物，其特征是，將紫草素與乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、α-甲基丙烯酸、β-甲基丙烯酸、β，β-二甲基丙烯酸、苯甲酸、對硝基苯甲酸各種有機酸在DCC和DMAP催化下進行縮合，得到以分子式III為代表的紫草素酯類衍生物；將紫草素及其酯類衍生物與Cu++、Zn++、Ca++金屬離子絡合，得到以分子式IV為代表的絡合物。
全文摘要
一種作為免疫抑制劑的紫草素衍生物及其金屬絡合物，屬于藥物領域。紫草的衍生物化學結(jié)構(gòu)式III及其金屬絡合物化學結(jié)構(gòu)式IV為式III中，R代表1－6個碳原子的飽和、不飽和及芳香族的?；?；式IV中，R代表氫，1－6個碳原子的飽和、不飽和及芳香族的?；?，M代表金屬Cu、Ca、Zn。本發(fā)明具有免疫抑制作用，可用于與人體自身免疫有關的疾病，包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化病、紅斑狼瘡、HIV感染、惡性腫瘤。
文檔編號C07F3/04GK1546450SQ20031010905
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者李紹順, 胡昆 申請人:上海交通大學