專利名稱：Nogo受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)。更為具體的是，本發(fā)明涉及具有免疫原性的Nogo受體-1多肽，Nogo受體-1抗體及其抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體及其融合蛋白以及編碼上述多肽/蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及組合物，其包含這些Nogo受體抗體及其抗原結(jié)合片段、具有免疫原性的Nogo受體-1多肽、可溶性Nogo受體及其融合蛋白以及編碼上述多肽/蛋白質(zhì)的核酸，以及制備和使用上述多肽/蛋白質(zhì)和核酸的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)元的軸突和樹突是自神經(jīng)元發(fā)出的長(zhǎng)的細(xì)胞延伸。延伸的軸突或者神經(jīng)突末端包含特化的區(qū)域，稱為生長(zhǎng)錐。生長(zhǎng)椎感受局部環(huán)境并且指導(dǎo)軸突向神經(jīng)元的目標(biāo)細(xì)胞生長(zhǎng)。生長(zhǎng)椎對(duì)許多環(huán)境信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答，例如表面黏連性、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和電場(chǎng)。在生長(zhǎng)椎處對(duì)生長(zhǎng)的指導(dǎo)涉及了多種不同類型的黏連分子、細(xì)胞間信號(hào)以及刺激和抑制生長(zhǎng)椎的因子。正在生長(zhǎng)的神經(jīng)突其生長(zhǎng)椎以不同的速率生長(zhǎng)，但通常是每天一到兩毫米。生長(zhǎng)椎具有手的形狀，具有寬而扁平的突出(微刺突或者絲狀偽足)，以不同方式黏附到胚胎的表面。絲狀偽足一直是有活性的，有一些絲狀偽足縮回到生長(zhǎng)椎內(nèi)，而其他絲狀偽足繼續(xù)伸長(zhǎng)，通過基質(zhì)。不同絲狀偽足之間的延伸形成層形足板。生長(zhǎng)椎用其層形足板和絲狀偽足探查其前方及兩側(cè)的區(qū)域。當(dāng)伸長(zhǎng)接觸到一個(gè)不適于生長(zhǎng)的表面時(shí)，就會(huì)縮回。當(dāng)伸長(zhǎng)接觸到一個(gè)適于生長(zhǎng)的表面時(shí)，它就會(huì)繼續(xù)延伸并且指引生長(zhǎng)椎朝這個(gè)方向生長(zhǎng)。生長(zhǎng)椎可以被基質(zhì)表面特性的微小變化所指引。當(dāng)生長(zhǎng)椎到達(dá)一個(gè)適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)細(xì)胞時(shí)就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)突觸連接。神經(jīng)細(xì)胞的功能受到其臨近環(huán)境中神經(jīng)元和其他細(xì)胞之間接觸的巨大影響(U.Rutishauser，T.M.Jessell，Physiol.Rev.1988，68，p.819)。這些細(xì)胞包括特化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的施旺細(xì)胞，該細(xì)胞用髓鞘(一種多層膜組成的絕緣結(jié)構(gòu))將神經(jīng)元的軸突包住(G.Lemke，in AnIntroduction to Molecular Neurobiology，Z.Hall，Ed.[Sinauer，Sunderland，Mass.，1992]，p.281)。盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元具有損傷之后再生的能力，但是由于在髓鞘中存在抑制蛋白并且很可能由于這些細(xì)胞所處的局部環(huán)境中通常具有其他類型的分子，神經(jīng)元的再生受到抑制(Brittis andFlanagan，Neuron 2001，30，pp.11-14；Jones et al.，J.Neurosci.2002，22，pp.2792-2803；Grimpe et al.，J.Neurosci.2002，22，pp.3144-3160)。在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中已經(jīng)鑒別出了許多髓鞘抑制蛋白，例如NogoA(Chen et al.，Nature，2000，403，434-4 39；Grandpreetal.，Nature 2000，403，439-444)，髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG，McKerracher et al，Neuron 1994，13，805-811；Mukhopadhyay et al，Neuron 1994，13，757-767)以及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(OM-gp，Mikol and Stefans son，J.Cell.Biol.1988，106，1273-1279)。在分別的研究中，發(fā)現(xiàn)這些蛋白中每一種都是神經(jīng)元Nogo受體-1的配基(Wang et al.，Nature 2002，417，941-944；Liu et al.，Science，2002，297，1190-93；Grandpre et al.，Nature 2000，403，439-444；Chenet al.，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi et al.，Neuron，2002，35，283-90)。Nogo受體1是一種糖磷脂酰肌醇(GPI)錨定的膜蛋白，它含有8個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)(Fournier et al.，Nature 2001，409，341-346)。在與抑制蛋白(例如NogoA，MAG和OM-gp)發(fā)生相互作用時(shí)，Nogo受體1復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，導(dǎo)致生長(zhǎng)椎萎陷且神經(jīng)突向外生長(zhǎng)受到抑制?，F(xiàn)在迫切需要抑制Nogo受體1與其配基結(jié)合且減弱髓鞘介導(dǎo)的生長(zhǎng)椎萎陷及對(duì)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的抑制的分子。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可溶性Nogo受體1多肽和含有這些多肽的融合蛋白，以及針對(duì)Nogo受體1的特異免疫原性區(qū)域的抗體及其抗原性片段。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明抗體結(jié)合的免疫原性的Nogo受體1多肽。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明中多肽的核酸、載體和包含這些核酸的宿主細(xì)胞，以及制備這些多肽的方法。本發(fā)明中的抗體、可溶性受體和受體融合蛋白拮抗或者阻斷Nogo受體1，并且用于抑制Nogo受體1與其配基的結(jié)合、抑制神經(jīng)元中生長(zhǎng)椎的萎陷以及降低神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或者出芽的抑制。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供免疫原性的多肽，該多肽選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼所述免疫原性多肽的核酸、包含所述核酸的載體和包含所述核酸或者載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，核酸與一段表達(dá)調(diào)控序列操作性地相連接。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備免疫原性多肽的方法，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)包含編碼免疫原性多肽的核酸或者含上述核酸的載體的宿主細(xì)胞；以及(b)從宿主細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備與Nogo受體1特異結(jié)合的抗體的方法，該方法包括以下步驟(a)用選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的多肽或表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞免疫宿主；和(b)收獲抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體或者其抗原結(jié)合片段是通過這種方法制備的。在一些實(shí)施方案中，抗體或者其抗原結(jié)合片段與選自下面的多肽發(fā)生特異結(jié)合SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5。在一些實(shí)施方案中，抗體或者抗原結(jié)合片段(a)抑制神經(jīng)元生長(zhǎng)椎的萎陷；(b)降低神經(jīng)元內(nèi)對(duì)于神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和出芽的抑制；以及(c)抑制Nogo受體1與配基結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，抗體或者抗原結(jié)合片段促進(jìn)瀕臨死亡的神經(jīng)元存活。在一些實(shí)施方案中，瀕臨死亡的神經(jīng)元是動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和出芽是軸突生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，抗體或者抗原結(jié)合片段是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體或者抗原結(jié)合片段是小鼠抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體、嵌合抗體或者是單鏈抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系選自HB 7E11(ATCC登錄編號(hào)PTA-4587)，HB 1H2(ATCC登錄編號(hào)PTA-4584)，HB 3G5(ATCC登錄編號(hào)PTA-4586)，HB 5B10(ATCC登錄編號(hào)PTA-4588)和HB 2F7(ATCC登錄編號(hào)PTA-4585)。在一些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段由該雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)。在一些實(shí)施方案中，抗體或者其抗原結(jié)合片段包含輕鏈，該輕鏈的氨基酸序列選自(a)SEQ ID NO15的氨基酸序列；(b)SEQID NO16的氨基酸序列和(c)包含SEQ ID NO22，23和24的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，抗體或者其抗原結(jié)合片段包含重鏈，該重鏈的氨基酸序列選自(a)SEQ ID NO17的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO18的氨基酸序列和(c)包含SEQ ID NO19，20和21的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼所述抗體或者其抗原結(jié)合片段的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸與表達(dá)調(diào)控序列操作性相連接。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含所述核酸的載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含所述核酸的宿主細(xì)胞或者包含含所述核酸的載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，抗體或者其抗原結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)性抑制由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體與Nogo受體1結(jié)合或者與選自以下的免疫原性多肽結(jié)合SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制Nogo受體1與配基結(jié)合的方法，該方法包含下面的步驟使Nogo受體1與本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合片段結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，配基選自NogoA、NogoB、NogoC、MAG和OM-gp。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)椎萎陷的方法，該方法包含下面的步驟使神經(jīng)元與本發(fā)明中的抗體或者其抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供降低對(duì)神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或出芽抑制的方法，該方法包含下面的步驟使神經(jīng)元與本發(fā)明中的抗體或者抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在這些方法中的一些中，神經(jīng)突的生長(zhǎng)或者出芽是軸突生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的方法，該方法包含以下步驟使神經(jīng)元與有效量的(a)抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段或者(b)可溶性Nogo受體1多肽接觸。在一些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體1多肽是融合蛋白，例如Fc融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白是sNogoR344-Fc蛋白。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元是體外神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，該哺乳動(dòng)物表現(xiàn)例如多發(fā)性硬化癥、ALS(肌萎縮性側(cè)索硬化癥)、亨丁頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森氏癥、糖尿病性神經(jīng)病、中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷等疾病的征兆或者癥狀。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)瀕臨死亡的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元存活的方法，該方法包括(a)提供表達(dá)(i)抗Nogo受體1的抗體或其抗原結(jié)合片段；或(ii)可溶性Nogo受體1多肽的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；以及(b)在哺乳動(dòng)物神經(jīng)元所在位置或其附近引入該宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)瀕臨死亡的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元存活的基因治療方法，該方法包括在神經(jīng)元或其附近位置施用病毒載體，此載體包含編碼(a)抗Nogo受體1抗體或抗原結(jié)合片段；或(b)可溶性Nogo受體1多肽的核苷酸序列，其中的抗Nogo受體1抗體、抗原結(jié)合片段或者可溶性Nogo受體1多肽表達(dá)自哺乳動(dòng)物體內(nèi)的核苷酸序列，其表達(dá)量足以促進(jìn)神經(jīng)元的存活。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供基本上由Nogo受體1的N端結(jié)構(gòu)域(NT)、8個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)和LRR C端結(jié)構(gòu)域(LRRCT)組成的可溶性Nogo受體1多肽。在一些實(shí)施方案中，所述的可溶性Nogo受體1多肽與一段信號(hào)序列相連接。在一些實(shí)施方案中，LRR包含異源LRR。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的可溶性Nogo受體1多肽選自SEQ ID NO6的26-344氨基酸殘基，SEQ ID NO7的26-310氨基酸殘基，SEQ ID NO8的26-344氨基酸殘基，SEQ ID NO9的26-310殘基，SEQ ID NO8的27-344殘基，以及SEQ ID NO9的27-310殘基。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼所述可溶性Nogo受體1多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸與表達(dá)調(diào)控序列操作性相連接。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含所述核酸的載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含所述核酸的宿主細(xì)胞或者含有所述核酸的載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備本發(fā)明中可溶性Nogo受體1多肽的方法，包括以下步驟(a)培養(yǎng)包含編碼可溶性Nogo受體1多肽的核酸的宿主細(xì)胞或者包含含有所述核酸的載體的宿主細(xì)胞；和(b)從宿主細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可溶性Nogo受體1和異源多肽的Nogo受體1融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體1多肽基本上是由Nogo受體1的N端結(jié)構(gòu)域(NT)、8個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)和LRR C端結(jié)構(gòu)域(LRRCT)組成。在一些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體1多肽與一段信號(hào)序列相連接。在一些實(shí)施方案中，LRR包含異源LRR。在一些實(shí)施方案中，Nogo受體1融合蛋白包含的多肽選自SEQ ID NO6的2 6-344氨基酸殘基，SEQ ID NO7的26-310氨基酸殘基，SEQ ID NO8的26-344氨基酸殘基，SEQ ID NO9的26-310殘基，SEQ ID NO8的27-344殘基，以及SEQ ID NO9的27-310殘基。在一些實(shí)施方案中，異源多肽包含免疫球蛋白的恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)是IgG重鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，異源多肽是Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，Nogo受體1融合蛋白是一個(gè)二聚體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼Nogo受體1融合蛋白的核酸。在一些實(shí)施方案中，將編碼Nogo受體1融合蛋白的核酸與一段表達(dá)調(diào)控序列操作性相連接。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼Nogo受體1融合蛋白的核酸的載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含編碼Nogo受體1融合蛋白的核酸或者包含一個(gè)載體，此載體含有編碼Nogo受體1融合蛋白的核酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備Nogo受體1融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)包含編碼Nogo受體1融合蛋白的核酸的宿主細(xì)胞或者包含含有上述核酸的載體的宿主細(xì)胞；以及(b)從宿主細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收Nogo受體1融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制Nogo受體1與配基結(jié)合的方法，包含下面的步驟使配基與可溶性Nogo受體1多肽或者與本發(fā)明中的Nogo受體1融合蛋白相接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)Nogo受體1配基的活性的方法，包括下面的步驟使Nogo受體1的配基與本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽或者與Nogo受體1融合蛋白相接觸。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制神經(jīng)元中生長(zhǎng)椎萎陷的方法，包括下面的步驟使Nogo受體1配基與本發(fā)明中的可溶性Nogo受體1多肽或者與Nogo受體1融合蛋白相接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或者出芽的抑制的方法，包括下面的步驟使Nogo受體1配基與本發(fā)明中的可溶性Nogo受體1多肽或者Nogo受體1融合蛋白相接觸。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在一些實(shí)施例中，配基選自NogoA、NogoB、NogoC、MAG和OM-gp。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或者出芽是軸突生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，它包含藥物上可以接受的載體以及選自以下(a)至(c)的組分(a)根據(jù)本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合片段；(b)根據(jù)本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽；以及(c)根據(jù)本發(fā)明的Nogo受體1融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，組合物還包括一種或者多種額外的治療劑。
附圖概述

圖1是Nogo受體1結(jié)構(gòu)的示意圖。人sNogoR310包含殘基26-310，而sNogoR344包含26-344殘基。大鼠sNogoR310包含殘基27-310，而sNogoR344包含27-344殘基。圖2是利用Vector NtiTM軟件描繪的Nogo受體1蛋白的抗原性曲線。大鼠P-617是SEQ ID NO10，而大鼠P-618是SEQ IDNO11。圖3A描繪的是抗Nogo受體1抗體，7E11的結(jié)合活性。該圖給出了7E11的濃度對(duì)于Nogo66與Nogo受體1結(jié)合的影響。圖3B描繪的是抗Nogo受體1抗體，1H2的結(jié)合活性。該圖給出了1H2的濃度對(duì)于Nogo66與sNogoR344-Fc(在此以及在美國(guó)專利申請(qǐng)60/402,866中也被稱為Fc-sNogoR344或者Ig-sNogoR344)。Fc-MAG不與Nogo66競(jìng)爭(zhēng)同sNogoR344-Fc的結(jié)合。圖4描繪的是抗Nogo受體1抗體1H2、3G5和2F7的ELISA結(jié)果。實(shí)驗(yàn)確定了在固定化抗原的存在下抗體對(duì)OD450的影響。固定化抗原是sNogoR310-Fc(在此以及在美國(guó)專利申請(qǐng)60/402,866中也被稱為Fc-sNogoR310或者Ig-sNogoR310)，sNogoR344-Fc，p-617，p-618，p-4，p-5以及卵清蛋白和BSA。圖5描繪的是在不同含量的髓鞘存在的條件下，單克隆抗體7E11對(duì)于大鼠DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的影響。圖6A描繪了在以下競(jìng)爭(zhēng)劑Nogo66，Nogo40和抗Nogo受體1單克隆抗體上清存在的條件下對(duì)sNogoR310與125I-Nogo66和125I-Nogo40結(jié)合的影響。圖6B描繪了125I-Nogo66與sNogoR310的結(jié)合活性。圖7描繪了sNogoR310-Fc對(duì)于125I-Nogo40與sNogoR310結(jié)合的影響。圖8描繪了sNogoR310-Fc與125I-Nogo40的結(jié)合活性。圖9A給出了在髓鞘存在或者不存在的情況下sNogoR310對(duì)于每個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的影響。圖9B給出了在髓鞘存在或者不存在的情況下sNogoR310對(duì)于神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的影響。圖10A描繪了存在或者不存在髓鞘含量增加的情況下sNogoR310-Fc對(duì)于P4大鼠DRG(背根神經(jīng)節(jié))神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的影響。圖10B描繪了在使用PBS、PBS+sNogoR310-Fc，20納克髓鞘以及髓鞘+sNogoR310-Fc處理之后每個(gè)細(xì)胞中神經(jīng)突的數(shù)目。圖11描述了在髓鞘含量增加的情況下單克隆抗體5B10對(duì)于每個(gè)細(xì)胞的DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的影響。圖12描繪了在大鼠脊髓模切模型中誘導(dǎo)損傷之后直至30天時(shí)sNogoR310-Fc對(duì)于BBB評(píng)分的影響。圖13A和13B給出的是在野生型或者轉(zhuǎn)基因小鼠08或者01品系中進(jìn)行背部半切斷之后運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分作為時(shí)間的函數(shù)。圖13C表示了在野生型或者轉(zhuǎn)基因小鼠損傷之后最大可承受的斜板角度作為時(shí)間的函數(shù)。圖13D顯示了在傾斜格柵爬行試驗(yàn)中后肢錯(cuò)誤作為損傷后時(shí)間的函數(shù)。在所有的圖中給出的數(shù)據(jù)是每組7-9只小鼠的平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。轉(zhuǎn)基因組的數(shù)值與野生型小鼠的數(shù)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(兩個(gè)星號(hào)，P＜0.01；Student’s t-檢驗(yàn))。圖14A顯示了在使用載體或者sNogoR310-Fc處理的動(dòng)物中進(jìn)行背部半切斷之后，運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分作為時(shí)間的函數(shù)。圖14B顯示了損傷之后在格柵行走中后肢錯(cuò)誤作為時(shí)間的函數(shù)。圖14C顯示了腳印分析，揭示了與未受損傷的小鼠或者受到損傷的且給予sNogoR310-Fc的大鼠相比，在對(duì)照小鼠中，步幅的長(zhǎng)度縮短，寬度變長(zhǎng)。在所有的圖中給出的數(shù)據(jù)是每組7-9只大鼠的平均值±s.e.m.。sNogoR310-Fc組的數(shù)值與對(duì)照的數(shù)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖14A-B)。對(duì)照數(shù)值與沒有脊髓損傷或者脊髓損傷且給予sNogoR310-Fc小鼠的數(shù)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖14C)。(星號(hào)，p＜0.05；兩個(gè)星號(hào)，P＜0.01；Student’st-檢驗(yàn))。
本發(fā)明詳述定義以及一般技術(shù)除了不同的定義以外，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員通常理解的含義相同。如果有沖突，以包含定義在內(nèi)的本申請(qǐng)為準(zhǔn)。而且，除非上下文有特別的要求，單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語也包括單數(shù)。一切出版物、專利和這里提到的其他參考文獻(xiàn)被完整引用作為參考，用于所有的目的。盡管可以在實(shí)踐中或者試驗(yàn)本發(fā)明時(shí)使用與這里的描述相似或相同的材料和方法，下面仍然描述適宜的方法和材料。材料、方法和實(shí)例僅僅是例證性的，其目的不是要給出限制。本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)在詳述和權(quán)利要求中顯現(xiàn)出來。在本說明書和權(quán)利要求中，“包含”一詞其含義應(yīng)該被理解為要包括所述的一個(gè)整體或者整體的組，而不是不包括其他的任何整體或者整體組。這里提供以下的術(shù)語和定義，以更詳細(xì)地闡述本發(fā)明。正如在這里所使用的，“抗體”的含義是完好的免疫球蛋白，或者是其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體可以是任何同種型或者類(例如M，D，G，E和A)或者是任何亞類(例如G1-4，A1-2)，并且可以具有κ或λ輕鏈。正如在這里所使用的，″Fc″的含義是通過木瓜蛋白酶降解可以得到的抗體重鏈恒定區(qū)的那一部分。正如在這里所使用的，“NogoR融合蛋白”的含義是包含與異源多肽融合的Nogo受體1的可溶性部分的蛋白質(zhì)。正如在這里所使用的，“人源化抗體”的含義是指抗體中至少一部分的非人序列被人的序列所代替。如何制備人源化抗體的例子可以在美國(guó)專利6,054,297，5,886,152和5,877,293中找到。正如在這里所使用的，“嵌合抗體”的含義是抗體中含有第一抗體的一個(gè)或者更多區(qū)域以及至少另外一個(gè)抗體的一或者更多區(qū)域。第一個(gè)抗體和另外的抗體可以來源于相同或者不同的物種。正如在這里以及在美國(guó)專利申請(qǐng)60/402,866中所使用的，″Nogo受體，″″NogoR，″“NogoR-1，”“NgR，”和“NgR-1”的含義都是Nogo受體1。
免疫原性的Nogo受體1多肽一方面本發(fā)明涉及免疫原性的Nogo受體1多肽。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，具有免疫原性的多肽基本上由選自下列的氨基酸序列構(gòu)成LDLSDNAQLRVVDPTT(大鼠)(SEQ ID NO1)；LDLSDNAQLRSVDPAT(人)(SEQ ID NO2)；AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(大鼠)(SEQ ID NO3)；AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(人)(SEQ ID NO4)；和CRLGQAGSGA(小鼠)(SEQ ID NO5).在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及核酸，該核酸編碼SEQID NO1-5中的多肽。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，核酸分子與表達(dá)調(diào)控序列(例如pCDNA(I))相連。本發(fā)明還涉及載體，該載體包含編碼本發(fā)明的免疫原性多肽的核酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，載體是克隆載體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，載體是表達(dá)載體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，載體含有至少一個(gè)選擇性標(biāo)記。本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞包含以上描述核酸或載體。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明的免疫原性多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是酵母。
抗體本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的免疫原性Nogo受體1多肽特異結(jié)合的抗體或者其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，抗體或者抗原結(jié)合片段與多肽結(jié)合，該多肽基本上由選自SEQ ID NO1-5的氨基酸序列構(gòu)成。本發(fā)明中的抗體或者抗原結(jié)合片段可以在體內(nèi)或者體外制備。以下討論抗體或者抗原結(jié)合片段的制備。本發(fā)明的抗體或者其抗原結(jié)合片段抑制Nogo受體1與配基(例如NogoA，NogoB，NogoC，MAG，OM-gp)的結(jié)合并降低髓鞘介導(dǎo)的對(duì)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和出芽(特別是軸突生長(zhǎng))的抑制，且減弱髓鞘介導(dǎo)的生長(zhǎng)椎萎陷。在一些實(shí)施方案中，抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段是鼠的。在一些實(shí)施方案中，Nogo受體1來自大鼠。在另一些實(shí)施方案中Nogo受體1是人的。在一些實(shí)施方案中抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段是重組的、工程化的、人源化的和/或嵌合的。在一些實(shí)施方案中，抗體選自單克隆抗體7E11(ATCC登錄號(hào)PTA-4587)；單克隆抗體1H2(ATCC登錄號(hào)PTA-4584)；單克隆抗體2F7(ATCC登錄號(hào)PTA-4585)；單克隆抗體3G5(ATCC登錄號(hào)PTA-4586)；以及單克隆抗體5B10(ATCC登錄號(hào)PTA-4588)。在一些實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體46。有代表性的抗原結(jié)合片段是Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v，F(xiàn)d，dAb以及含有互補(bǔ)決定區(qū)片段的片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體和含有至少部分免疫球蛋白的多肽，這部分免疫球蛋白足以使得多肽具有特異的抗原結(jié)合(例如免疫粘合素)。正如在這里所使用的，F(xiàn)d是指由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的片段；Fv是指由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的片段。dAb是指是由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的片段(Ward et al.，Nature 341544-546，1989)。正如在這里所使用的，單鏈抗體(scFv)的含義是指其中VL區(qū)和VH區(qū)通過合成的連接物配對(duì)形成單價(jià)分子的抗體，該連接物使得VH區(qū)和VL區(qū)成為一個(gè)蛋白單鏈(Bird et al.，Science 242423-426，1988和Hustonet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883，1988)。正如在這里所使用的，雙抗體的含義是指雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在一個(gè)多肽單鏈上表達(dá)，但是使用的連接物很短，不能使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在同一條鏈上配對(duì)，這樣就迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參加例如Holliger，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993，以及Poljak，R.J.，et al.，Structure 21121-1123，1994)。正如在這里所使用的，與目的抗原特異結(jié)合的免疫粘合素是指其中可以共價(jià)或者非共價(jià)地結(jié)合一或者多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的Nogo受體1抗體的一個(gè)亞基多肽，其中的亞基多肽選自(a)重鏈或者其可變區(qū)；和(b)輕鏈或者其可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供核酸，該核酸編碼屬于本發(fā)明中Nogo受體1抗體的一個(gè)亞基多肽的重鏈或其可變區(qū)，或者此亞基多肽的輕鏈或其可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一個(gè)本發(fā)明中的Nogo受體1抗體高變區(qū)(CDR)或者編碼CDR的核酸。
免疫接種本發(fā)明的抗體可以通過免疫接種合適的宿主(例如脊椎動(dòng)物，包括人、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛、馬、爬行動(dòng)物、魚、兩棲動(dòng)物以及在禽類、爬行動(dòng)物和魚的卵中)而產(chǎn)生。這樣的抗體可以是多克隆或者單克隆的。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明中具有免疫原性的Nogo受體1多肽免疫宿主。在另一些實(shí)施方案中，使用與完好或者破裂細(xì)胞的細(xì)胞膜相聯(lián)的Nogo受體1免疫宿主，通過與本發(fā)明的免疫原性的Nogo受體1多肽的結(jié)合來鑒別本發(fā)明的抗體。在一些實(shí)施方案中，Nogo受體1抗原與佐劑一起施用以刺激免疫應(yīng)答。通常除了抗原之外還需要施用佐劑以誘導(dǎo)對(duì)于抗原的免疫應(yīng)答。這些佐劑通常是不溶的或者是不能降解的物質(zhì)，可以引起非特異的炎癥，吸引單核巨噬細(xì)胞到達(dá)免疫接種位置。佐劑的實(shí)例包括，但是不止限于，弗氏佐劑，RIBI(胞壁酰二肽)、ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)或者其片段。參見例如Harlow和Lane(1988)，Antibodies，ALaboratory Manual，Yelton，D.E.et al.(1981)；Ann.Rev.ofBiochem.，50，pp.657-80.，和Ausubel et al.(1989)；CurrentProtocols in Molecular Biology(New YorkJohn Wiley & Sons)綜述的制備抗體的方法。確定與本發(fā)明的免疫原性Nogo受體1多肽發(fā)生反應(yīng)的免疫反應(yīng)性，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的許多方法，包括例如，免疫印跡檢測(cè)和ELISA。
抗體的制備和產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系本發(fā)明的單克隆抗體可以通過如Harlow和Lane(1988)，(在前)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。概括的講，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間處死動(dòng)物，通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的一種方法使淋巴結(jié)和/或脾臟B細(xì)胞無限增殖，這些方法包括，但是不限于，轉(zhuǎn)化例如使用EBV或者與無限增殖細(xì)胞系例如骨髓瘤細(xì)胞融合。之后將細(xì)胞分為單個(gè)的克隆，檢測(cè)每一個(gè)克隆的上清是否產(chǎn)生了對(duì)于本發(fā)明免疫原性的Nogo受體1多肽特異的抗體。篩選、克隆和雜交瘤的擴(kuò)增是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。類似的，鑒定免疫球蛋白核苷酸和氨基酸序列的方法也是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。其他制備本發(fā)明中抗體的適宜方法包括在體外使淋巴細(xì)胞與Nogo受體1接觸或者與本發(fā)明的免疫原性多肽接觸。另一種方法是在噬菌體或者類似載體中篩選抗體庫。參見Huse et al.，Science，246，pp.1275-81(1989).用于本發(fā)明中的抗體可以經(jīng)過修飾或者無需修飾而使用。可以將抗原(這里是指Nogo受體1或者本發(fā)明中的免疫原性多肽)和抗體與可以提供可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)進(jìn)行共價(jià)或者非共價(jià)連接而對(duì)抗原和抗體進(jìn)行標(biāo)記。本領(lǐng)域內(nèi)已有多種不同的標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)，可以在實(shí)施本發(fā)明的實(shí)踐中使用。適宜的標(biāo)記包括，但是不只限于，放射性核苷酸、酶、底物、輔酶、抑制劑、熒光試劑、化學(xué)發(fā)光試劑、磁性粒子等等。教導(dǎo)如何使用這些標(biāo)記的專利包括美國(guó)專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。而且還可以制備重組免疫球蛋白(參見美國(guó)專利4,816,567)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抗體有多種結(jié)合特異性，例如雙功能抗體，它可以使用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員知道的眾多技術(shù)(包括制備雜交瘤、二硫交換、化學(xué)交聯(lián)、在兩個(gè)單克隆抗體之間添加多肽連接物、向某一個(gè)細(xì)胞系中引入兩組免疫球蛋白的重鏈和輕鏈，等等，參見下面更詳細(xì)的討論)來制備。本發(fā)明的抗體還可以是人單克隆抗體，例如那些由無限增殖的人細(xì)胞系產(chǎn)生的、由SCID-hu小鼠或者其他能夠產(chǎn)生“人”抗體的非人動(dòng)物產(chǎn)生。
噬菌體展示文庫本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體可以通過篩選重組聯(lián)合抗體文庫篩選出來。例證性的聯(lián)合文庫用于與本發(fā)明的免疫原性Nogo受體1多肽相結(jié)合，例如使用VL和VHcDNA(cDNA來自免疫接種了本發(fā)明的Nogo受體1多肽的動(dòng)物的mRNA)制備的scFv噬菌體展示文庫。制備和篩選這種文庫的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。有商品化的用于制備噬菌體展示文庫的材料和方法。(例如the Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，目錄號(hào)27-9400-01；the Stratagene SurfZAPTMphage display試劑盒，目錄號(hào)240612；以及其他來自MorphoSys的試劑盒)。還有其他可以用于制備和篩選抗體展示文庫的方法和試劑(參見例如Ladner et al.美國(guó)專利5,223,409；Kang et al.PCT公開文本W(wǎng)O 92/18619；Dower et al.PCT公開文本W(wǎng)O 91/17271；Winteret al.PCT公開文本W(wǎng)O 92/20791；Markland et al.PCT公開文本W(wǎng)O 92/15679；Breitling et al.PCT公開文本W(wǎng)O 93/01288；McCaffertyet al.PCT公開文本W(wǎng)O 92/01047；Garrard et al.PCT公開文本W(wǎng)O92/09690；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay etal.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 381-85；Huse et al.(1989)Science 2461275-1281；McCafferty et al.，Nature(1990)348552-554；Griffiths et al.(1993)EMBO J.12725-734；Hawkinset al.(1992)J.Mol.Biol.226889-896；Clackson et al.(1991)Nature 352624-628；Gram et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA893576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 91373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nucl.Acids Res.194133-4137；andBarbas et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887978-7982.)。從重組免疫球蛋白展示文庫中篩選和分離出本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體之后，可以從展示的噬菌體中(例如從噬菌體基因組中)回收編碼所選抗體的核酸，并通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)將其亞克隆到其他表達(dá)載體中。如果需要的話，還可以進(jìn)一步對(duì)核酸進(jìn)行處理，以制備本發(fā)明中的其他抗體形式，如下所述。為了表達(dá)通過篩選聯(lián)合文庫分離出的抗體，將編碼該抗體重鏈和輕鏈或者輕鏈和重鏈的可變區(qū)的DNA克隆入重組表達(dá)載體，并將該載體引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，如上所述。
類別轉(zhuǎn)換本發(fā)明中的抗Nogo受體1抗體可以是任何同種型。通過類別轉(zhuǎn)換可以得到任何所需要的抗體同種型。使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法分離出編碼VL或者VH的核酸，其不包括任何編碼CL和CH的序列，用于類別轉(zhuǎn)換。將編碼VL或者VH的核酸與編碼來自所需類別免疫球蛋白分子的CL或者CH的核苷酸序列操作性連在一起?？梢酝ㄟ^使用包含CL或CH鏈的載體或者核酸來實(shí)現(xiàn)這種連接，如上所述。例如，本發(fā)明中原來是IgM的抗Nogo受體1抗體可以通過類別轉(zhuǎn)換變?yōu)镮gG抗體。而且，還可以利用類別轉(zhuǎn)換將一個(gè)IgG亞類變?yōu)榱硪粋€(gè)IgG亞類，如從IgG1轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2。
突變的抗體在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以在重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，以改變抗體的結(jié)合特性。例如，可以在一個(gè)或者更多CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行突變，以升高或者降低抗體對(duì)Nogo受體1的Kd值，升高或降低Koff值，或者改變抗體的結(jié)合特異性。位點(diǎn)特異突變技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。參見例如Sambrook et al.和Ausubel et al.，在前。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在一個(gè)氨基酸殘基上進(jìn)行突變，已知該殘基與生殖系相比，在本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體的可變區(qū)中發(fā)生了改變。在一些實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上進(jìn)行突變，已知這些殘基與生殖系相比，在本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體的可變區(qū)相比發(fā)生了改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)或者多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)編碼抗體重鏈或者輕鏈可變區(qū)的核酸發(fā)生突變。可以在構(gòu)架區(qū)或者恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行突變以提高半衰期。在構(gòu)架區(qū)或者恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變還可以改變抗體的免疫原性，為抗體共價(jià)或者非共價(jià)結(jié)合另一個(gè)分子提供一個(gè)位點(diǎn)，或者改變例如補(bǔ)體結(jié)合的特性。在單突變抗體中的每一個(gè)構(gòu)架區(qū)、恒定結(jié)構(gòu)域和可變區(qū)都可以進(jìn)行突變。突變也可以僅出現(xiàn)在單突變抗體中構(gòu)架區(qū)、恒定結(jié)構(gòu)域和可變區(qū)中的一個(gè)上。
融合抗體和免疫粘合素在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備融合抗體或者免疫粘合素，它包含與另一個(gè)多肽相連的本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體的全部或者一部分。在一些實(shí)施方案中，只有抗Nogo受體1抗體的可變區(qū)與多肽相連。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體的VH結(jié)構(gòu)域與第一個(gè)多肽相連，而該抗體的VL結(jié)構(gòu)域與第二個(gè)多肽相連，這個(gè)多肽與第一個(gè)多肽相結(jié)合，其結(jié)合方式使得VH和VL結(jié)構(gòu)域相互作用形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。在其他實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域被一個(gè)連接物分開，該連接物使得VH和VL結(jié)構(gòu)域相互作用(參見下面的單鏈抗體部分)。然后將VH-連接物-VL抗體與目標(biāo)多肽相連。融合抗體用于指導(dǎo)多肽進(jìn)入表達(dá)Nogo受體1配基的細(xì)胞或者組織中。目標(biāo)多肽可以是治療劑，例如毒素，或者是診斷劑，例如可以很容易顯現(xiàn)的酶，如辣根過氧化物酶。此外，融合抗體還可以利用兩條(或者更多)單鏈抗體相互連接而產(chǎn)生。如果需要在一個(gè)單多肽鏈上產(chǎn)生一個(gè)二價(jià)或者多價(jià)抗體，或者制備一個(gè)雙特異性抗體，上述方法是有用的。
單鏈抗體本發(fā)明包括與本發(fā)明的免疫原性Nogo受體1多肽結(jié)合的單鏈抗體(scFv)。制備scFv時(shí)，將編碼VH和VL的DNA與編碼柔性連接物例如氨基酸序列(Gly4-Ser)3的DNA操作性相連，這樣VH和VL序列可以被表達(dá)為一個(gè)不間斷的單鏈蛋白，其中VL和VH區(qū)由一個(gè)柔性連接物連接(參見例如Bird et al.(1988)Science 242423-426；Hustonet al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；McCaffertyet al.，Nature(1990)348552-554)。如果僅僅使用一個(gè)VH和一個(gè)VL則單鏈抗體可以是單價(jià)的；如果使用兩個(gè)VH和兩個(gè)VL則單鏈抗體可以是二價(jià)的；如果使用了兩個(gè)以上的VH和VL，則單鏈抗體可以是多價(jià)的。
嵌合抗體本發(fā)明還包括雙特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段，其中一種特異性是針對(duì)本發(fā)明中的免疫原性Nogo受體1多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生一個(gè)嵌合抗體，該抗體通過一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的免疫原性Nogo受體1多肽特異性地結(jié)合，而通過第二個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)分子結(jié)合。嵌合抗體可以通過重組分子生物學(xué)技術(shù)制備，也可以物理地偶聯(lián)在一起。此外，可以制備一個(gè)含有一個(gè)以上VH和VL的單鏈抗體，該抗體與一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的免疫原性多肽特異性地結(jié)合，還與另一個(gè)分子結(jié)合，這個(gè)分子與減弱髓鞘介導(dǎo)的生長(zhǎng)椎萎陷和降低對(duì)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和出芽的抑制有關(guān)。這種雙特異性抗體可以使用眾所周知的技術(shù)來制備，例如Fanger et al.Immunol Methods 472-81(1994)和Wright和Harris，在前，并且連同(iii)參見例如Traunecker etal.Int.J.Cancer(Suppl.)751-52(1992).在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明抗體的一個(gè)或者更多可變區(qū)制備嵌合抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述抗體的一個(gè)或者更多CDR區(qū)制備嵌合抗體。
衍生化的和標(biāo)記的抗體可以對(duì)本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)行衍生化，或者將其與另一個(gè)分子(例如另一個(gè)多肽或者蛋白質(zhì))相連。一般來說，抗體和抗原結(jié)合片段衍生化的結(jié)果不能使與本發(fā)明的免疫原性多肽的結(jié)合受到衍生化或者標(biāo)記的負(fù)面影響。例如，本發(fā)明的一個(gè)抗體或者抗體部分可以在功能上與一個(gè)或者更多其他的分子實(shí)體相連，例如另一個(gè)抗體(如一個(gè)雙特異性抗體或者雙抗體)、一種檢測(cè)試劑、一種細(xì)胞毒性劑、一種藥劑和/或能夠介導(dǎo)抗體或抗原結(jié)合片段與另一個(gè)分子(例如抗生物素蛋白鏈菌素核心區(qū)或者多聚組氨酸標(biāo)簽)相結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽(例如通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)聯(lián)合或者其他方法)。在一些實(shí)施方案中，通過交聯(lián)兩個(gè)或者多個(gè)抗體(屬于同一個(gè)類別或者不同類別，例如以制備雙特異性抗體時(shí))產(chǎn)生衍生化抗體。適宜的交聯(lián)連接物包括那些異雙功能試劑，即具有由適當(dāng)?shù)拈g隔物分開的兩種顯著不同的反應(yīng)基團(tuán)的物質(zhì)(例如鄰-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或者同雙功能試劑(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸)。這種連接物可以從Pierce Chemical Company，Rockford，Ill獲得。在一些實(shí)施方案中，衍生的抗體是標(biāo)記的抗體。例如，用于衍生本發(fā)明中抗體或者抗體部分的檢測(cè)劑就是熒光化合物，包括熒光素，異硫氰酸熒光素，羅達(dá)明，5-二甲氨基-1-萘磺酰氯，藻紅素，鑭系磷光物等。也可以將用于檢測(cè)的酶用來標(biāo)記抗體，例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。在使用了可以檢測(cè)的酶的實(shí)施方案中，檢測(cè)抗體要使用額外的試劑，酶利用這些試劑產(chǎn)生可以被檢測(cè)到的反應(yīng)產(chǎn)物。例如使用過氧化氫和二氨基聯(lián)苯，用于辣根過氧化物酶。還可以使用生物素標(biāo)記抗體，通過間接測(cè)量親和素和抗生物素蛋白鏈菌素的結(jié)合來檢測(cè)。還可以使用被第二報(bào)告分子(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、二抗的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)識(shí)別的、事先確定的多肽表位來標(biāo)記抗體。還可以使用放射性標(biāo)記氨基酸標(biāo)記抗Nogo受體1抗體或者其抗原片段。放射性標(biāo)記可以用于診斷或者治療的目的。放射性標(biāo)記的抗Nogo受體1抗體可以在診斷中使用，例如用于確定在對(duì)象中Nogo受體1的水平。而且，放射性標(biāo)記的抗Nogo受體1抗體還可以在治療中使用，用于治療脊髓損傷。用于多肽的標(biāo)記有，但不止限于，以下的放射性同位素或放射性核苷酸--3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I抗Nogo受體1抗體或者其抗原片段還可以通過化學(xué)基團(tuán)，例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或者糖基被衍生化。這些基團(tuán)對(duì)于增強(qiáng)抗體的生物學(xué)性質(zhì)是有用的，例如增加血清的半衰期或者增加對(duì)組織的結(jié)合。
抗Nogo受體1抗體的性質(zhì)抗Nogo受體1抗體的類別和亞類可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來確定抗Nogo受體1抗體的類別和亞類。一般來說，可以使用對(duì)于某個(gè)特定抗體類和亞類特異的抗體來確定某個(gè)抗體的類和亞類。這種抗體是商品化的?？梢允褂肊LISA、蛋白質(zhì)印跡以及其他的技術(shù)來確定類和亞類?；蛘呖梢詼y(cè)定抗體重鏈和/或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的部分或者全部的序列，將它們的氨基酸序列與多種不同類和亞類的免疫球蛋白的已知氨基酸序列進(jìn)行比較，來確定抗體的類和亞類。
抗Nogo受體1抗體與Nogo受體1的結(jié)合親和性本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體與本發(fā)明的免疫原性Nogo受體1多肽的結(jié)合親和性與解離速率可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來確定。例如可以通過競(jìng)爭(zhēng)ELISA、RIA、BIAcore或者KinExA技術(shù)來測(cè)量結(jié)合親和性。也可以用BIAcore或者KinExA技術(shù)測(cè)量解離速率。通過表面胞質(zhì)共振，使用例如BIAcore來測(cè)量結(jié)合親和性和解離速率。7E11和1H2的Kd被分別確定為1×10-7M和2×10-8M。
抗Nogo受體1抗體對(duì)Nogo受體1的抑制在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段抑制了Nogo受體1與配基的結(jié)合。可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法例如ELISA、RIA或者功能性拮抗來測(cè)量這種抑制的IC50。在一些實(shí)施方案中，IC50介于0.1和500nM之間。在一些實(shí)施方案中，IC50介于10和400nM之間。在另一些實(shí)施方案中，抗體或者其部分的IC50介于60和400nM之間。在一次結(jié)合試驗(yàn)中確定7E11和1H2的IC50分別為400nM和60nM。參見表3，在后面。總之，如果為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，有許多不同的方法，可以用來改變本發(fā)明抗體的生物學(xué)特性，這些方法包括提高或者降低給定抗體分子的穩(wěn)定性或半衰期、免疫原性、毒性、親和性或產(chǎn)量的方法，或者以任何其他方式改變抗體使其更加適合于某一個(gè)特別的應(yīng)用。下面描述包含本發(fā)明抗體的組合物以及本發(fā)明抗體的應(yīng)用可溶性Nogo受體1多肽蛋白質(zhì)全長(zhǎng)的Nogo受體1由信號(hào)序列、N端區(qū)域(NT)、8個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)(LRR)，LRRCT區(qū)(8個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)的富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域C端)、C端區(qū)(CT)和GPI錨定物組成(參見圖1)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供可溶性的Nogo受體1多肽。本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽包含NT結(jié)構(gòu)域、8個(gè)LRR和一個(gè)LRRCT結(jié)構(gòu)域但是沒有信號(hào)序列和功能性的GPI錨定物(即沒有GPI錨定物，或者有一個(gè)不能有效與細(xì)胞膜結(jié)合的GPI錨定物)。在一些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體1多肽包含異源的LRR。在一些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體1多肽包含2，3，4，5，6，7或者8個(gè)異源的LRR。異源LRR是指來自于Nogo受體1以外的另一個(gè)蛋白的LRR。異源LRR的來源蛋白質(zhì)的示例有toll樣受體(TLR1.2)；T細(xì)胞活化富含亮氨酸重復(fù)的蛋白；deceorin；OM-gp；胰島素樣的生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白酸性不穩(wěn)定亞基slit和robo；以及toll樣受體4。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供319氨基酸長(zhǎng)的可溶性Nogo受體1多肽(可溶性Nogo受體1344，sNogoR1-344，或sNogoR344)(SEQ ID NO6和8的26-344殘基或者SEQ ID NO8的27-344殘基)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供285氨基酸長(zhǎng)的可溶性Nogo受體1多肽(可溶性Nogo受體1310，sNogoR1-310，或sNogoR310)(SEQ IDNO7和9的26-310殘基或者SEQ ID NO9的27-310殘基)。見圖1。
實(shí)施例15CAB-O-SILoTS-610對(duì)NXT化合物硬度的影響
〔我們是否應(yīng)該在這個(gè)表格中加上全長(zhǎng)的和1-310氨基酸的小鼠序列？〕在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽抑制配基與Nogo受體1的結(jié)合，可溶性Nogo受體1多肽作為Nogo受體1配基的拮抗劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽來降低對(duì)神經(jīng)元內(nèi)部神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和出芽(例如軸突生長(zhǎng))的抑制，用來抑制髓鞘介導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi)的生長(zhǎng)椎萎陷。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。令人驚奇的是，sNogoR310和sNogoR344阻礙NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp與Nogo受體1的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽是融合蛋白的組分，該融合蛋白還包括異源多肽。在一些實(shí)施方案中，異源多肽是免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，異源多肽是Fc片段。在一些實(shí)施中，F(xiàn)c與本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽的C末端連接。在一些實(shí)施中，融合的Nogo受體1蛋白是一個(gè)二聚體。
本發(fā)明的核酸分子本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明中多肽的核酸，該多肽包括SEQ ID NO1-9中任何一個(gè)多肽。在一些實(shí)施方案中，核酸編碼的多肽選自SEQ ID NO6和8所示的Nogo受體1的26-344氨基酸殘基，SEQID NO8所示的Nogo受體1的27-344氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，核酸分子編碼的多肽選自SEQ ID NO7和9所示的Nogo受體1的26-310殘基或SEQ ID NO9所示的Nogo受體1的27-310殘基。正如這里所使用的，“核酸”指的是基因組DNA、cDNA、mRNA和反義分子，以及以另一條主鏈為基礎(chǔ)的核酸或者包括了來自天然或者合成的其他堿基。在一些實(shí)施方案中，核酸還包括了轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，及可選的信號(hào)序列，其操作性地與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列相連。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明中Nogo受體1融合蛋白的核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸編碼本發(fā)明的Nogo受體1融合蛋白，其包括包含選自以下的多肽的融合蛋白SEQ ID NO6和8所示的Nogo所體1的26-344氨基酸殘基或SEQ ID NO8所示的Nogo受體1的27-344氨基酸殘基和SEQ ID NO7和9所示的Nogo受體1的26-310殘基或SEQ ID NO9顯示的Nogo受體1的27-310殘基。在一些實(shí)施方案中，編碼Nogo受體1融合蛋白的核酸還包括了轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，及可選的信號(hào)序列。在一些實(shí)施方案中，核苷酸序列還編碼免疫球蛋白恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)是重鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，核苷酸序列還編碼與鉸鏈區(qū)相連的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，核酸還編碼Fc。在一些實(shí)施方案中，Nogo受體1融合蛋白包含F(xiàn)c片段。本發(fā)明的編碼核酸還可以被進(jìn)一步修飾使其包含用于診斷和探針目的的可檢測(cè)標(biāo)記。在本領(lǐng)域內(nèi)已知有多種這樣的標(biāo)記，并且可以很容易地用于這里描述的編碼分子。適宜的標(biāo)記包括，但不止限于，生物素、放射性標(biāo)記核苷酸等。一個(gè)熟練的技術(shù)人員可以運(yùn)用本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的標(biāo)記得到標(biāo)記的編碼核酸分子。
組合物在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，該組合物包含選自以下序列的免疫原性多肽SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5.在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，它們包含本發(fā)明中的抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段，或者可溶性Nogo受體1多肽或者融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以含有適宜的藥物上可被接受的載體，載體包含賦形劑和輔助物，它們的作用是促進(jìn)活性化合物被加工成為可以被作為藥物使用運(yùn)輸?shù)阶饔梦稽c(diǎn)的制劑。適宜的腸胃外給藥制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液，如可溶于水的鹽。此外，還可以施用活性化合物的懸液，如適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺乙?。適宜的親脂溶劑或賦形劑包括脂肪油，如芝麻油或者合成的脂肪酸的酯，如乙基油酸酯或甘油三酯。含水注射懸液可以含有提高懸液黏性的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖。可選，懸液中還可以包含穩(wěn)定劑。還可以使用脂質(zhì)體包裹本發(fā)明的分子用于向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。示例性的“藥物可接受載體”是任何及全部的溶劑、分散介質(zhì)、包被物、抗菌和抗真菌劑、等滲和延遲吸收劑、以及生理上相容的類似物質(zhì)、水、鹽水、磷酸鹽緩沖液、右旋葡萄糖、甘油、乙醇等以及上述物質(zhì)的組合。在一些實(shí)施方案中，組合物包含等滲劑，例如糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇或者氯化鈉。在一些實(shí)施方案中，組合物包含藥物上可接受的物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或者少量的輔助物，例如潤(rùn)濕劑、乳化劑，防腐劑或緩沖劑，這些物質(zhì)延長(zhǎng)了保存期或者提高了本發(fā)明中的抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體或者融合蛋白的效力。本發(fā)明的組合物可以以多種不同形式存在，包括例如液態(tài)、半固態(tài)以及固態(tài)劑型，例如液態(tài)溶液(如可注射和可灌注的溶液)、分散體或者懸液。優(yōu)選的劑型取決于要采用的給藥方式和治療應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，組合物的劑型是可注射和可灌輸溶液，與其他抗體對(duì)人進(jìn)行被動(dòng)免疫所用的組合物類似。組合物可以配制為溶液、微乳劑、分散體、脂質(zhì)體或其他適于高藥物濃度的規(guī)則結(jié)構(gòu)。將抗Nogo受體1抗體按照要求混于所需量的適當(dāng)溶劑(溶劑中含有以上列舉的成分中的一種或組合)中，過濾除菌，制備成為無菌的注射用溶液。一般來說，將活性化合物與無菌的載體混和(該載體中含有堿性的分散介質(zhì)，以及其他所需的以上列舉的成分)制備成分散體。至于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，得到活性成分的粉末以及任何額外的成分，這些成分來自于事先無菌過濾制備好的該成分的溶液。可以通過使用包被物例如卵磷脂，通過維持所需的顆粒大小(對(duì)于分散體而言)，以及通過使用表面活性劑來維持溶液適宜的流動(dòng)性。通過在組合物中加入延緩吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠來延長(zhǎng)注射組合物的吸收。在一些實(shí)施方案中，可以在制備活性化合物時(shí)加入載體，此載體能夠防止化合物迅速釋放，例如可控的釋放配方，包括植入體、透皮貼劑和微膠囊運(yùn)輸系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾摹⑸镉H和的多聚物，例如乙烯乙酸樹脂、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原磷酯和聚乳酸。許多制備這種配方的方法被專利保護(hù)并且一般是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所知道的。參見例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1978.還可以在組合物中混入補(bǔ)充活性化合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的Nogo受體1抗體或其抗原結(jié)合片段、或可溶性Nogo受體1多肽或融合蛋白可以與一種或多種額外的治療劑共同配制和/或共同給藥。本發(fā)明的藥物組合物可以包括“治療有效量”或者“預(yù)防有效量”的本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合片段、多肽或融合蛋白。“治療有效量”是指在必要的劑量和時(shí)間內(nèi)取得所需治療效果的有效量。Nogo受體1抗體或其抗原結(jié)合片段、或可溶性Nogo受體1多肽或融合蛋白的治療有效量可能根據(jù)個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重等因素而有所不同。治療有效量還指其中抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽或者Nogo受體融合蛋白在治療上的有益效果超出了任何毒性或有害作用的量?！邦A(yù)防有效量”是指在必要的劑量和時(shí)間內(nèi)取得所需預(yù)防效果的有效量。通常因?yàn)榻o對(duì)象使用預(yù)防劑量是在發(fā)病以前或者發(fā)病的早期，所以預(yù)防有效量要低于治療有效量。可以調(diào)整給藥劑量以提供最佳的所需應(yīng)答(例如治療或者預(yù)防應(yīng)答)。例如可以給服單個(gè)大藥丸，或隨時(shí)間給服數(shù)個(gè)小的劑量，或者可以根據(jù)治療情況的迫切程度成比例地降低或者提高劑量。將腸胃外組合物配制為劑量單位形式是非常有利的，使藥物的給服變得不費(fèi)力。正如這里所用到的，劑量單位形式的一致性是指在物理上獨(dú)立的單位，適于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象的單位劑量，每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)過計(jì)算可產(chǎn)生所需治療效果，還含有所需的藥物載體。本發(fā)明中劑量單位形式的具體規(guī)格直接決定于(a)抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性受體1多肽或Nogo受體融合蛋白的獨(dú)特性質(zhì)以及需要達(dá)到的特定的治療或預(yù)防效果，和(b)用于個(gè)體敏感性治療時(shí)復(fù)合配制這種抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性受體1多肽或Nogo受體融合蛋白的固有限制。在一些實(shí)施方案中Nogo受體1抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量范圍是0.1-4毫克每千克體重每天。在一些實(shí)施方案中Nogo受體1抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量范圍是0.2-4毫克每千克體重每天。在一些實(shí)施方案中Nogo受體1抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量范圍是0.2毫克每千克體重每天。
抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性抗體和融合蛋白的應(yīng)用在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過向有需要的哺乳動(dòng)物給藥抗Nogo受體1抗體、這種抗體的抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽或者包含這種多肽的融合蛋白等而抑制Nogo受體1活性的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制Nogo受體1與配基結(jié)合的方法，該方法包含下面的步驟使Nogo受體1與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，配基選自NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)椎萎陷的方法，該方法包含以下步驟使神經(jīng)元與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供降低神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或出芽的抑制的方法，該方法包含以下步驟使神經(jīng)元與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在一些這樣的方法中，神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或出芽是軸突生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)哺乳動(dòng)物瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的方法，該方法包含以下步驟(a)提供表達(dá)(i)抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段，或者(ii)可溶性Nogo受體1多肽的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(b)將宿主細(xì)胞引入哺乳動(dòng)物神經(jīng)元所在的位置或者其附近。Almudena Ramon-Cueto，M Isabel Cordero，F(xiàn)ernando FSantos-Benito and Jesus Avila(2000)Functional recovery ofparalegic rats and motor axon regneration in their spinal cordsby olfactory ensheathing cells.Neuron 25，425-435.在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)哺乳動(dòng)物瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的基因治療方法，該方法包含以下步驟在神經(jīng)元所在的位置或者其附近施用病毒載體，此載體包含編碼(a)抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段；或(b)可溶性Nogo受體1多肽的核苷酸序列，其中的抗Nogo受體1抗體，抗原結(jié)合片段或可溶性Nogo受體1多肽從哺乳動(dòng)物體內(nèi)的核苷酸序列表達(dá)，其表達(dá)量足以促進(jìn)神經(jīng)元的存活。病毒載體和對(duì)這些實(shí)施方案有用的方法在文獻(xiàn)例如 et al.，Human GeneTherapy，13，1483-93(2002)中有描述。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制Nogo受體1與配基結(jié)合的方法，該方法包含以下步驟使配基與本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽或Nogo受體1融合蛋白相接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)Nogo受體1配基活性的方法，該方法包含以下步驟使Nogo受體1配基與本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽或Nogo受體1融合蛋白相接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)椎萎陷的方法，該方法包含以下步驟使Nogo受體1配基與本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽或者Nogo受體1融合蛋白相接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供降低神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或出芽的抑制的方法，該方法包含以下步驟使Nogo受體1配基與本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽或Nogo受體1融合蛋白相接觸。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，配基選自NogoA，Nogob，NogoC，MAG和OM-gp。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)突的生長(zhǎng)或出芽是軸突生長(zhǎng)。在這里描述的任何類型的抗體或者受體可以用于治療。在一些實(shí)施方案中，抗Nogo受體1抗體是人抗體。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人類患者。在一些實(shí)施方案中，抗體或者其抗原結(jié)合片段施用于表達(dá)Nogo受體1的非人哺乳動(dòng)物(例如靈長(zhǎng)類，獼猴或恒河猴)，抗體與表達(dá)的Nogo受體1發(fā)生交叉反應(yīng)，用于獸醫(yī)的目的或者作為人類疾病的動(dòng)物模型。這種動(dòng)物模型可能用于評(píng)價(jià)本發(fā)明抗體的治療效果。在一些實(shí)施方案中，使用抗Nogo受體1抗體或抗原結(jié)合片段，或可溶性Nogo受體1多肽或融合蛋白給藥以治療脊髓損傷，促進(jìn)損傷部位的軸突生長(zhǎng)。本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體或抗原結(jié)合片段，或可溶性Nogo受體1多肽或融合蛋白可以單獨(dú)提供，或者聯(lián)合使用，或者與其他調(diào)節(jié)特定病理過程的藥劑相繼聯(lián)合使用。例如，在中風(fēng)之后可以同時(shí)給服消炎藥，以阻止進(jìn)一步的神經(jīng)元損傷和對(duì)軸突再生的抑制。正如在這里所使用的，Nogo受體1抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1和Nogo受體融合蛋白，與一或者多種其他治療劑聯(lián)合使用，二者可以同時(shí)、連續(xù)或者獨(dú)立使用。本發(fā)明的抗Nogo受體1抗體，抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體1多肽、Nogo受體1融合蛋白可以通過腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔、透皮、吸入或者口腔等途徑給藥。例如可以通過微灌輸在損傷的部位局部給藥。通常的給藥位置包括，但不止限于，損傷導(dǎo)致的脊髓受損區(qū)域。給藥的劑量取決于年齡、健康狀況、接受注射者的體重、同時(shí)進(jìn)行的治療的種類以及治療頻率(如果有的話)，所需取得的效果的性質(zhì)。本發(fā)明的化合物可以體內(nèi)應(yīng)用，一般用于哺乳動(dòng)物，例如人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠或者體外應(yīng)用。
本發(fā)明的載體在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有編碼序列的重組DNA分子(rDNA)。正如這里所使用的，rDNA分子是經(jīng)過分子操作的DNA分子。產(chǎn)生rDNA分子的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，例如參見Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press.在一些rDNA分子中，將編碼DNA序列與表達(dá)調(diào)控序列和載體序列操作性連接起來。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含了編碼本發(fā)明多肽的核酸的載體。操作性與本發(fā)明的核酸相連的載體和表達(dá)調(diào)控序列的選擇，直接取決于所需的功能特性(例如蛋白表達(dá)以及需要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞)，這是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。本發(fā)明的載體至少可以指導(dǎo)復(fù)制或者向宿主染色體的插入，優(yōu)選能夠指導(dǎo)rDNA分子內(nèi)包含的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。操作性與蛋白編碼序列相連的、用于調(diào)控表達(dá)的表達(dá)調(diào)控元件是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，它們包括，但是不止限于，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、分泌信號(hào)和其他調(diào)控元件。優(yōu)選地，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是很容易控制的，例如對(duì)宿主細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生應(yīng)答的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有編碼核酸分子的載體含有原核復(fù)制子，即一段DNA序列，它能夠指導(dǎo)自我復(fù)制并且維持重組DNA分子位于被該DNA分子轉(zhuǎn)化了的原核宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌宿主細(xì)胞)的染色體之外。這種復(fù)制子在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。此外，包含有原核復(fù)制子的載體還可以包含一個(gè)基因，該基因的表達(dá)使載體具有可被檢測(cè)到的或可被篩選的標(biāo)記，例如藥物抗性。通常的細(xì)菌藥物抗性基因是那些使載體具有氨芐青霉素或四環(huán)素抗性的基因。包含原核復(fù)制子的載體還可以包含能夠指導(dǎo)編碼基因序列在細(xì)菌宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)內(nèi)表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的原核或細(xì)菌噬菌體啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是由DNA序列組成的表達(dá)調(diào)控元件，它可以與RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。與細(xì)菌宿主相容的啟動(dòng)子序列通常由質(zhì)粒載體提供，該質(zhì)粒載體含有適宜的限制性位點(diǎn)的，可以方便插入本發(fā)明的DNA片段。這種載體質(zhì)粒的實(shí)例有pUC8，pUC9，pBR322和pBR329(Bio-RadLaboratories)，pPL和pKK223(Pharmacia)。任何適宜的原核宿主都可以用來表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的重組DNA分子。與真核細(xì)胞相容的表達(dá)載體，優(yōu)選那些與脊椎動(dòng)物細(xì)胞相容的載體，也可以用于形成含有編碼序列的rDNA。真核細(xì)胞表達(dá)載體在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，可以從許多商業(yè)來源獲得。通常提供的這種載體含有適宜的限制性位點(diǎn)可以方便地插入目的DNA片段。這種載體的實(shí)例有pSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1，pML2d(InternationalBiotechnologies)，pTDT1(ATCC31255)以及其他真核表達(dá)載體。用于構(gòu)建本發(fā)明的rDNA分子的真核細(xì)胞表達(dá)載體還包括在真核細(xì)胞中有效的選擇標(biāo)記，優(yōu)選藥物抗性選擇標(biāo)記。優(yōu)選的藥物抗性標(biāo)記是其表達(dá)產(chǎn)生新霉素抗性的基因，即新霉素磷酸基轉(zhuǎn)移酶(neo)基因。(Southern et al.，(1982)J.Mol.Anal.Genet.1，327-341).或者選擇標(biāo)記位于另外一個(gè)質(zhì)粒上，兩個(gè)載體通過共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，通過在針對(duì)所選標(biāo)記的適當(dāng)藥物中培養(yǎng)來篩選轉(zhuǎn)染子。為表達(dá)本發(fā)明的抗體或抗體部分，將編碼部分或者全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA插入表達(dá)載體中，使基因有效地與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列相連。表達(dá)載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、EBV衍生的附加體等。將抗體基因連入載體內(nèi)，使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯序列行使它們預(yù)定的功能，調(diào)控抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列的選擇要與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入不同的載體中。在一些實(shí)施方案中，二者被插入同一個(gè)表達(dá)載體中。使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如抗體基因片段上和載體上互補(bǔ)限制性位點(diǎn)的連接，或者沒有限制性位點(diǎn)時(shí)使用平末端連接)將抗體基因插入到表達(dá)載體中。適宜的載體編碼功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，通過基因工程引入適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)，這樣任何VH或VL序列可以很容易地插入和表達(dá)，如前所述。在這種載體中，拼接通常在被插入的J區(qū)中的拼接供體位點(diǎn)和人C區(qū)之前的拼接受體位點(diǎn)之間發(fā)生，以及在人CH外顯子內(nèi)的拼接區(qū)域中。多聚腺嘌呤化和轉(zhuǎn)錄終止出現(xiàn)在編碼區(qū)下游的天然染色體位置。重組表達(dá)載體也可以編碼信號(hào)肽，信號(hào)肽有助于抗體鏈從宿主細(xì)胞中分泌出來?？梢詫⒖贵w鏈基因克隆入載體，使得信號(hào)肽與抗體鏈基因的氨基端以正確的閱讀框相連。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白的信號(hào)肽或者異源信號(hào)肽(即來自非免疫球蛋白的信號(hào)肽)。除了本發(fā)明的免疫原性多肽、Nogo受體1抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽和可溶性Nogo受體1融合蛋白之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體攜帶控制這些蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)控序列的選擇，可能取決于要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。對(duì)于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)，優(yōu)選的調(diào)控序列包括指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平蛋白表達(dá)的病毒元件，例如衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、猴病毒40(SV40)(例如SV40的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))、多瘤病毒以及強(qiáng)哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，如天然免疫球蛋白和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。關(guān)于病毒調(diào)控元件的進(jìn)一步描述以及其序列，參見Stinski的美國(guó)專利5,168,062，Bell等人的美國(guó)專利4,510,245和Schaffner等人的美國(guó)專利4,968,615.除了異源基因和調(diào)控序列之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶額外的序列，例如調(diào)控載體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的序列(如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因有助于選擇已經(jīng)帶有載體的宿主細(xì)胞(參見美國(guó)專利例如4,399,216，4,634,665和5,179,017，所有的作者都是Axel et al.)。例如，通常選擇性標(biāo)記基因使已經(jīng)攜帶載體的宿主細(xì)胞具有對(duì)藥物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于dhfr-的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行氨甲蝶呤篩選/擴(kuò)增)以及neo基因(用于G418篩選)。
宿主細(xì)胞和重組生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的方法編碼本發(fā)明中的抗Nogo受體1抗體、免疫原性多肽、可溶性Nogo受體1多肽、可溶性Nogo受體1融合蛋白的核酸和包含這些核酸分子的載體可以用于轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可以使用任何已知的向宿主細(xì)胞內(nèi)引入多聚核苷酸的方法。向哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引入異源多聚核苷酸的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、用脂質(zhì)體包裹多聚核苷酸以及直接將DNA微注射進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。此外，還可以通過病毒載體將核酸分子引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，用本發(fā)明的rDNA分子轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞宿主，這些方法通常取決于所使用的載體類型和宿主系統(tǒng)。對(duì)于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可以使用電穿孔和鹽處理的方法(參見例如Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cohen et al.，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110-2114).對(duì)于用含有rDNA的載體轉(zhuǎn)化脊椎動(dòng)物細(xì)胞，可以使用電穿孔、陽離子脂質(zhì)或者鹽處理的方法(參見例如Graham et al.，(1973)Virology 52，456-467；Wigleret al.，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，1373-1376)?？梢酝ㄟ^眾所周知的技術(shù)，包括對(duì)選擇標(biāo)記的篩選，鑒定被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明rDNA分子的細(xì)胞。例如，引入本發(fā)明的rDNA后的細(xì)胞可以被克隆產(chǎn)生單細(xì)胞集落。收獲這些集落，裂解并使用Southern，(1975)J.Mol.Biol.98，503-517描述的方法檢查它們的DNA中是否存在rDNA，或者用免疫學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?？勺鳛楸磉_(dá)宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，包括許多可從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得的無限增殖細(xì)胞系。這些細(xì)胞系包括，特別是中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，NSO，SP2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(例如Hep G2)，A459細(xì)胞和一系列其他細(xì)胞系。通過確定哪些細(xì)胞系具有高表達(dá)水平來篩選特別優(yōu)選的細(xì)胞系。其他可以使用的細(xì)胞系有昆蟲細(xì)胞系，如Sf9細(xì)胞。當(dāng)把編碼本發(fā)明的免疫原性多肽、Nogo受體1抗體或抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽和可溶性Nogo受體1融合蛋白的重組表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)宿主細(xì)胞一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間，抗體、多肽和融合蛋白就會(huì)在細(xì)胞中表達(dá)，或者更優(yōu)選的是，本發(fā)明的免疫原性多肽、Nogo受體1抗體或抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽和可溶性Nogo受體1融合蛋白被分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收本發(fā)明的免疫原性多肽、Nogo受體1抗體或抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽和可溶性Nogo受體1融合蛋白。而且，可以使用一系列已知的技術(shù)提高本發(fā)明的免疫原性多肽、Nogo受體1抗體或抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽和可溶性Nogo受體1融合蛋白(或者來自本發(fā)明的其他部分)從生產(chǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)。例如谷胺酰胺合成酶基因表達(dá)系統(tǒng)(GS系統(tǒng))是在某些特定條件下提高表達(dá)的常用方法。GS系統(tǒng)在歐洲專利0 216 846，0 256055，和0 323 997以及歐洲專利申請(qǐng)89303964.4中有完整或部分的討論。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供了由核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該核酸分子編碼本發(fā)明中的Nogo受體1抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽和/或可溶性Nogo受體1融合蛋白。宿主細(xì)胞可以是原核或者真核的。只要細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)方法、與表達(dá)載體的擴(kuò)增、與基因產(chǎn)物的表達(dá)相兼容，則對(duì)適用于表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞就沒有限制。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括，但是不止限于，酵母、昆蟲和人細(xì)胞，優(yōu)選脊椎動(dòng)物細(xì)胞，例如來自小鼠、大鼠、猴或人的細(xì)胞系。有用的真核宿主細(xì)胞的實(shí)例包括中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，此細(xì)胞系可以從ATCC獲得，編號(hào)為CCL61；NIH瑞士小鼠胚胎細(xì)胞NIH-3T3，其ATCC編號(hào)為CRL1658；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)，等等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系。
使用rDNA分子的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)本發(fā)明還提供使用這里描述的核酸分子，生產(chǎn)本發(fā)明中的Nogo受體1抗體或者抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1多肽和/或可溶性Nogo受體1融合蛋白。一般來說，重組形式蛋白質(zhì)的生產(chǎn)通常包括以下的步驟首先，要獲得編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子。如果編碼序列中沒有內(nèi)含子，則該編碼序列可以直接用于任何宿主中的表達(dá)。核酸分子可選操作性地與適宜的調(diào)控序列連接，如上面所述，形成含有蛋白質(zhì)開放閱讀框的表達(dá)單位。使用該表達(dá)單位轉(zhuǎn)化適宜的宿主，被轉(zhuǎn)化的宿主在允許重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)。可選重組蛋白從培養(yǎng)基或者從細(xì)胞中分離；在可以容忍一些雜質(zhì)的情況下，則不一定要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行回收和純化。前面的每一步都可以通過多種不同的方式完成。例如，所需的編碼序列可以從基因組片段中獲得，并且直接用于適當(dāng)?shù)乃拗?。利用適當(dāng)?shù)膹?fù)制子和調(diào)控序列，如以上提到的那些，構(gòu)建適用于多種不同宿主的表達(dá)載體。調(diào)控序列、表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化方法取決于用于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞類型，這些在前面有詳細(xì)的討論。如果原來沒有的話，可以在編碼序列的兩端添加適宜的限制性位點(diǎn)，這樣就得到一個(gè)可切除基因，在插入這些載體中之后，還可以切除出來。熟練的技術(shù)人員可以容易地根據(jù)所使用的本發(fā)明中的核酸分子，來調(diào)整本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何宿主/表達(dá)系統(tǒng)，以生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。為了更好的理解本發(fā)明，給出以下實(shí)施例。這些實(shí)施例的目的僅僅是舉例說明，而不應(yīng)該被理解為以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。
實(shí)施例1小鼠抗Nogo受體1單克隆抗體的生產(chǎn)使用以下的方法和步驟制備與本發(fā)明中免疫原性Nogo受體1多肽特異結(jié)合的抗Nogo受體1抗體。
免疫使用兩種免疫方式1.使用COS-7細(xì)胞或者含有Nogo受體1(NogoR-1)的COS-7細(xì)胞膜作為免疫原將大鼠Nogo受體1基因(GenBankTM登錄號(hào)AF 462390)克隆到含有CMV啟動(dòng)子和用于藥物篩選的遺傳霉素抗性基因的表達(dá)載體pEAG1256(Biogen)中。使用Superfect(Qiagen)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞。使用遺傳霉素(GibcoTM，2毫克/毫升)篩選轉(zhuǎn)染子，克隆和通過FACS法證實(shí)Nogo受體1蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)。根據(jù)[Wang etal.，J.Neurochem.，751155-1161(2000)]描述的步驟制備COS-7細(xì)胞膜，兩次漂洗，并于10％甘油中，以濃度為1毫克/毫升(蛋白濃度)，在-70℃儲(chǔ)存。使用含有50微克大鼠Nogo受體1-COS-7細(xì)胞膜或者含有50微克在其表面表達(dá)Nogo受體1的整個(gè)COS-7細(xì)胞及50微升RIBIMPL+TDM+CWS佐劑(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)的乳劑，通過腹腔內(nèi)免疫八周齡的雌性RBF小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，免疫程序?yàn)槊績(jī)芍芤淮?Lipman et al.，1992)。分別在第一次免疫前、第二次免疫后7天、第三次免疫后7天和第三次免疫后38天采集免疫小鼠的血清，使用以下描述的ELISA測(cè)量抗Nogo受體1抗體的滴度。
2.使用特異的Nogo受體1多肽作為免疫原使用Vector NTiTM軟件(圖2)分析大鼠Nogo受體1基因序列的抗原性。使用標(biāo)準(zhǔn)的戊二醛方法將在分析中鑒定出的抗原性多肽與鑰孔血蘭蛋白(KLH)偶聯(lián)。使用含有50微克KLH偶聯(lián)多肽及50微升完全弗氏佐劑(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)的乳劑通過腹腔內(nèi)免疫八周齡的雌性RBF小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，免疫程序?yàn)槊績(jī)芍芤淮?。分別在第一次免疫前、第二次免疫后一周、第三次免疫后一周天采集免疫小鼠的血清，測(cè)量抗Nogo受體1抗體的滴度。第三次免疫以后增強(qiáng)免疫一次。此次增強(qiáng)免疫之后三天開始融合實(shí)驗(yàn)。
雜交瘤的制備和篩選使用ELISA篩選Nogo受體1抗原性多肽免疫的小鼠血清，而用表達(dá)Nogo受體1的COS-7細(xì)胞免疫的小鼠血清用細(xì)胞流式儀來篩選。使用細(xì)胞流式儀鑒別產(chǎn)生了能夠特異結(jié)合Nogo受體1-COS-7細(xì)胞的抗體的小鼠并處死。根據(jù)描述(Kennett et al.，1993.Monoclonal AntibodiesA New Dimension in Biological Analysis.Plenum Press，New York)分離脾細(xì)胞并與FL653骨髓瘤(Ig-/HGPRT-Balb/c小鼠骨髓瘤的APRT-衍生物，維持液是含有10％胎牛血清、4500毫克/升葡萄糖、4mM L-谷胺酰胺和20毫克/毫升8-氮鳥嘌呤的DMEM)融合。融合細(xì)胞接種在24孔或48孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning Glass Works，Corning，NY)中，培養(yǎng)基中添加腺嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(AAT)。通過ELISA或流式儀篩選抗AAT培養(yǎng)物中是否存在與Nogo受體1-COS-7細(xì)胞的結(jié)合或者與Nogo受體1抗原性多肽的結(jié)合，如下描述。陽性孔中的細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)一步亞克隆。為了篩選與Nogo受體1抗原性多肽結(jié)合的抗體，將作為免疫原使用的肽與BSA偶聯(lián)。在96孔MaxiSorpTM細(xì)胞培養(yǎng)板(NuncTM)的每一孔中加入50微升含有0.5毫克偶聯(lián)多肽的0.1M碳酸氫鈉，pH9.0緩沖液。在37℃孵育1小時(shí)或者4℃孵育16小時(shí)，使用含有25mM HEPES，pH7.4 0.1％BSA，0.1％卵清蛋白，0.1％blotto和0.001％疊氮化物的封閉液封閉非特異性位點(diǎn)。加入雜交瘤上清，在25℃孵育1小時(shí)。使用PBS漂洗三次之后，在每一孔中加入50微升1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch Inc.)，繼續(xù)孵育一小時(shí)。漂洗三次之后，使用TMB(Pierce)顯色并用2M硫酸中止。使用分光光度計(jì)在450nm處測(cè)量顏色的深淺。使用以下方法篩選與全長(zhǎng)Nogo受體1結(jié)合的抗體。根據(jù)銷售商提供的方法，使用0.1μM CellTrackerTMGreen CMFDA(Molecular Probes，Eugene，OR)標(biāo)記COS-7細(xì)胞。加入抗Nogo受體1待測(cè)血清孵育之前，將CellTrackerTM標(biāo)記的對(duì)照細(xì)胞與漂洗過的Nogo受體1-COS-7細(xì)胞等體積混和。50微升的細(xì)胞混合物均勻分散至96孔V型底聚苯乙烯板(Costar3877，Corning，NY)的每一孔中，加入100微升的雜交瘤上清或者對(duì)照抗-Nogo受體1抗體。在4℃孵育半小時(shí)后，漂洗細(xì)胞，加入50微升溶于PBS的R-藻紅蛋白偶聯(lián)的親和純的山羊抗小鼠IgG Fc gamma特異二抗F(ab′)2片段，(1∶200稀釋，JacksonImmunoResearch Laboratory，West Grove，PA)。在孵育結(jié)束時(shí)，使用PBS漂洗細(xì)胞兩次，用含有1％胎牛血清的200微升PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行FACS分析?；蛘撸瑢ogo受體1-COS-7細(xì)胞與雜交瘤上清混和，然后使用R-藻紅蛋白偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗處理，之后直接進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的FACS分析。我們使用多種不同的免疫原制備了25個(gè)抗Nogo受體1抗體。我們使用大鼠Nogo受體1殘基110-125對(duì)應(yīng)的多肽序列作為免疫原，制備了兩個(gè)抗體7E11和5B10。我們使用全長(zhǎng)大鼠Nogo受體1轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞制備的細(xì)胞膜作為免疫原，制備了三個(gè)抗體1H2，3G5和2F7。我們使用sNogoR310-Fc作為免疫原，制備了13個(gè)抗體(1D9.3，1E4.7，1B4.3，2C4.3，1F10.3，2H1.4，1H3.3，1G4.1，1E4.1，2G7.1，2C4.1，2F11.1，和1H4.1)，使用與大鼠Nogo受體1殘基423-434對(duì)應(yīng)的多肽序列作為免疫原，制備了7個(gè)抗體(2E8.1，2G11.2，和1B5.1).
單克隆抗體7E11和5B10的序列分析我們使用QiagenRNeasymini試劑盒提取總RNA，并且從分離的RNA得到cDNA。我們使用引物5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3’(SEQ ID NO12)和5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’，用PCR擴(kuò)增出輕鏈的序列；我們使用引物5’-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’(SEQ ID NO13)和5’-GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3’(SEQ IDNO14)用PCR擴(kuò)增出重鏈的序列。這些引物包含簡(jiǎn)并的核苷酸，如下S代表G或C；M代表A或C，R代表G或A；W代表A或T；K代表G或T；以及Y代表T或C。我們將PCR片段克隆入測(cè)序載體中，利用雙脫氧終止法，使用測(cè)序載體特異的引物確定了CDR區(qū)的DNA序列。我們從概念上翻譯了單克隆抗體7E11和5B10的重鏈和輕鏈的CDR區(qū)的DNA序列和部分的氨基酸序列，序列示于表2。表2中在來自單克隆抗體重鏈和輕鏈的三個(gè)CDR區(qū)，加上了下劃線。7E11和5B10的輕鏈有94％的氨基酸序列一致性，重鏈有91％的氨基酸序列一致性。單克隆抗體7E11，5B10，和1H2屬于IgG1同種型；單克隆抗體3G5和2F7屬于IgG2a同種型。這5個(gè)單抗中每個(gè)都有一個(gè)kappa輕鏈。我們使用這種方法分析了其他單抗的序列。
表2單抗7E11和5810的氨基酸序列
用抗Nogo受體1單克隆抗體抑制配基與可溶性Nogo受體1的結(jié)合我們檢測(cè)了以上制備的抗Nogo受體1單克隆抗體，確定它們是否抑制配基與Nogo受體1結(jié)合。按照以下的描述制備包含大鼠Nogo受體1的26-344氨基酸殘基和鉸鏈區(qū)以及大鼠IgG1分子Fc區(qū)(sNogoR344-Fc)的可溶性Nogo受體1融合蛋白。25℃下，將0.5微克的該融合蛋白固定在250毫克的蛋白A或小麥胚凝集素偶聯(lián)的SPA凝膠珠上2小時(shí)。每個(gè)樣品孔中加入50微升含有以下物質(zhì)--偶聯(lián)有Fc-sNogoR-1〔這是哪個(gè)sNOGO？〕的SPA珠、抗Nogo受體1單抗和1微升125I-Nogo66(Amersham，2000居里/毫摩爾，1nM)--的HEPES緩沖的孵育培養(yǎng)基(10mM HEPES，pH7.4，0.1％牛血清白蛋白，0.1％卵清蛋白，2mM MgCl2，2mM CaCl2和蛋白酶抑制劑)。16小時(shí)以后使用TopCount(Packard)測(cè)量四個(gè)平行樣品孔中的放射性。根據(jù)曲線擬合分析(圖3)(PRISM，GraphPadSoftware，NJ)計(jì)算IC50數(shù)值。在一些實(shí)驗(yàn)中，我們也使用堿性磷酸酶-配基偶聯(lián)物(例如AP-Nogo66)并且通過檢測(cè)堿性磷酸酶的活性監(jiān)測(cè)結(jié)合。我們還檢測(cè)了單抗阻斷配基MAG-Fc和AP-OM-gp與Nogo受體1結(jié)合的能力。單克隆抗體7E11，5B10，1H2，3G5和2F7全部抑制Nogo66、MAG和OM-gp與sNogoR344-Fc的結(jié)合。計(jì)算出來的7E11和1H2對(duì)Nogo66的IC50分別為400nM和60nM。由ELISA監(jiān)測(cè)的單抗介導(dǎo)的對(duì)三種配基與Nogo受體1結(jié)合的抑制數(shù)據(jù)總結(jié)如表3。
表3.單克隆抗體抑制Nogo66、MAG和OM-gp與Nogo受體1的結(jié)合
顯示的取代百分比是在30nM抗體濃度時(shí)的，所述的曲線擬合分析確定某些單抗的EC50?！?“表示沒有可被檢測(cè)到的活性，“ND”表示沒有測(cè)定。
實(shí)施例2Fab-噬菌體抗Nogo受體1抗體的制備與本發(fā)明中免疫原性Nogo受體1多肽特異結(jié)合的抗Nogo受體1Fab-噬菌體抗體，也是通過如下篩選Fab-噬菌體文庫制備的。使用重組大鼠可溶性sNogoR310-Fc蛋白和表達(dá)大鼠Nogo受體1的COS7細(xì)胞篩選MorphoSys Fab-噬菌體文庫HuCALGOLD。與Nogo受體1特異結(jié)合的Fab-噬菌體被純化和鑒定出來。14D5的重鏈衍生自VH2基因，輕鏈衍生自VK1基因。這些Fab-噬菌體中的一個(gè)，14D5，其重鏈和輕鏈的CDR的氨基酸序列示于表4。
表4 14D5的CDR的氨基酸序列 14D5以單價(jià)和二價(jià)兩種形式與大鼠Nogo受體1結(jié)合。此外，14D5還與小鼠和人的Nogo受體1以及人的Nogo受體2結(jié)合，但是不與小鼠的Nogo3結(jié)合。
實(shí)施例3
用抗Nogo受體1單克隆抗體免疫沉淀Nogo受體1為了進(jìn)行免疫沉淀，將100微升裂解的細(xì)胞或者50微升PiPLC處理的細(xì)胞分別與400或450微升的提取緩沖液[10mMTris-HCl，pH 7.2，0.5％Tween-20TM，0.2mM PMSF]或者RIPA緩沖液混和，其中分別存在30微升蛋白A或G和1-2毫克抗體?；旌衔镏糜谡袷幤髦?，在4C孵育16小時(shí)。輕輕離心樣品使偶聯(lián)蛋白A或G的珠沉下來。洗滌凝膠珠三次，每次用1毫升洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.2，0.1％Tween-20TM)。最后一次洗滌用10％體積的原洗滌液。用100微升含有10％beta-巰基乙醇的2×SDS上樣緩沖液重懸凝膠顆粒。樣品在室溫放置，然后進(jìn)行SDS-PAGE，使用4-20％Tris-甘氨酸凝膠。SDS-PAGE凝膠電泳的結(jié)果顯示，單克隆抗體3G5和2F7可以免疫沉淀Nogo受體1。
實(shí)施例4用ELISA確定抗體特異性為了確定實(shí)施例1和2中制備的單克隆抗體和Fab-噬菌體抗體的特異性，我們使用了一組Nogo受體1多肽進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。該組多肽由以下多肽組成sNogoR310-Fc(包含大鼠Nogo受體-1的26-310氨基酸和一個(gè)大鼠Fc片段的融合蛋白)，sNogoR344-Fc(見上)，多肽p-617(SEQ ID NO1)，多肽p-618(來自大鼠Nogo受體1 LRR7區(qū)的19個(gè)氨基酸的多肽；圖2；SEQ ID NO25)和多肽p-4(SEQ IDNO26)以及p-5(SEQ ID NO27)(分別來自Nogo受體1的LRR5和LRRCT區(qū)的多肽)。使用卵清蛋白和BSA作為對(duì)照。如圖4所示，單克隆抗體1H2、3G5和2F7全部與sNogoR344-Fc特異結(jié)合。在類似的實(shí)驗(yàn)中，那些抗體還與由大鼠Nogo受體1(SEQ ID NO3)的310-344氨基酸殘基的多肽特異結(jié)合，且單抗7E11和5B10與多肽p-617(SEQ ID NO1)特異結(jié)合。來自sNogoR310-Fc免疫的10個(gè)抗體(1D9.3，1E4.7，1B4.3，2C4.3，1F10.3，2H1.4，1H3.3，1G4.1，1E4.1，和2G7.1)在結(jié)合方面可以互相替代，表明它們識(shí)別sNogoR310-Fc上相似的或者重疊的抗原表位。來自sNogoR310-Fc免疫的另外三個(gè)抗體(2C4.1，2F11.1，和1H4.1)識(shí)別位于氨基酸殘基26-310上的不同表位。我們還使用Fab-噬菌體14D5進(jìn)行了ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)。使配基AP-Nogo66，AP-OM-gp和MAG-Fc與固定化的sNogoR344-Fc結(jié)合，1μM的14D5完全抑制了Nogo和MAG的結(jié)合。需要10μM的14D5以完全抑制OM-gp與sNogoR344-Fc的結(jié)合。
實(shí)施例5神經(jīng)突向外生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)上面產(chǎn)生的單抗和Fab-噬菌體抗體減輕CNS髓鞘對(duì)神經(jīng)元抑制的能力，用0.1毫克/毫升多聚-D-賴氨酸(Sigma)包被Lab-Tek培養(yǎng)用載玻片(4孔)。將3微升一滴的CNS髓鞘或PBS點(diǎn)在載片上。在髓鞘或PBS中加入熒光微球體(Polysciences)，用于在后面的步驟中鑒定液滴(Grandpre et al，Nature 403，2000)。然后潤(rùn)洗Lab-Tek載片，用10微克/毫升的層粘連蛋白(GibcoTM)包被。用1毫克/毫升的類型1膠原酶(Worthington)解離P3-4 Sprague Dawley大鼠幼仔的背根神經(jīng)節(jié)，用火磨光的巴氏吸管吹打，預(yù)接種以增加神經(jīng)元細(xì)胞，最終以23000細(xì)胞每孔的密度接種到事先包被好的Lab-Tek培養(yǎng)載片中。培養(yǎng)基是含有5％熱滅活供體馬血清、5％熱滅活胎牛血清和50納克/毫升小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的F12，在37℃和5％CO2條件下孵育6小時(shí)。在接種后立即加入15微克/毫升的單抗7E11。使用含有20％蔗糖的4％多聚甲醛溶液固定載玻片20分鐘，使用抗beta-III-微管蛋白抗體(Covance TUJ1)1∶500稀釋，染色檢查神經(jīng)元標(biāo)記。二抗是抗小鼠Alexa Fluor594(MolecularProbes)，1∶300稀釋，并且用Gel/MountTM(BimedaTM)覆蓋在載玻片上。使用OpenLabTM軟件獲得放大5倍的數(shù)碼圖像，并使用MetaMorph軟件分析定量神經(jīng)突的生長(zhǎng)。單抗7E11保護(hù)DRG神經(jīng)元，使其不發(fā)生髓鞘介導(dǎo)的對(duì)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的抑制。用單抗1H2和3G5觀察到了類似的結(jié)果。在神經(jīng)突向外生長(zhǎng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，其中將大鼠的P7 DRG神經(jīng)元培養(yǎng)在CNS髓鞘基質(zhì)上，二價(jià)的14D5也可以有效地促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)。
實(shí)施例6在轉(zhuǎn)染了Nogo受體1的細(xì)胞上用7E11進(jìn)行免疫組織化學(xué)為了進(jìn)一步鑒定根據(jù)實(shí)施例1中的描述生產(chǎn)的抗Nogo受體1單抗的結(jié)合特性，我們比較了與固定的或者活的表達(dá)大鼠或人Nogo受體1的COS-7細(xì)胞或293細(xì)胞的結(jié)合。
固定的細(xì)胞被Nogo受體1轉(zhuǎn)染和沒有被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于8孔的Lab-Tek培養(yǎng)載玻片上，用4％多聚甲醛固定15分鐘，用含有10％正常山羊血清和0.1％TritonX-100的PBS封閉1小時(shí)。在封閉液中加入15微克/毫升和1.5微克/毫升的單抗7E11室溫孵育2小時(shí)；用封閉液1∶300稀釋Alexa-偶聯(lián)的抗小鼠二抗(Molecular Probes)，孵育1小時(shí)。在二抗中加入5微克/毫升的DAPI，以標(biāo)記所有的細(xì)胞核。
活細(xì)胞被Nogo受體1轉(zhuǎn)染和沒有被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于8孔的Lab-Tek培養(yǎng)載玻片上，用FACS緩沖液(含有4％供體馬血清)4℃封閉30分鐘，在FACS緩沖液中用15微克/毫升和1.5微克/毫升的7E11，4℃孵育1小時(shí)，潤(rùn)洗后用(FACS緩沖液1∶300稀釋的)Alexa-偶聯(lián)的抗小鼠二抗，4℃孵育30分鐘。免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)證明了所有的單抗都與表達(dá)大鼠Nogo受體1的細(xì)胞結(jié)合。單抗7E11，2G7.1和2C4.1與表達(dá)人Nogo受體1的固定細(xì)胞和活細(xì)胞都能結(jié)合。
實(shí)施例7脊髓挫傷小鼠模型為了檢測(cè)實(shí)施例1中制備的抗Nogo受體1單抗對(duì)神經(jīng)元的體內(nèi)作用，我們使用一個(gè)脊髓挫傷小鼠模型。用止痛劑和抗生素藥劑預(yù)防性地處理雌性小鼠(18-22克體重)。麻醉小鼠，將其置于立體定位儀中，在立體顯微鏡下固定脊柱。使用改良的重物下落打擊法(M.Li et al.，F(xiàn)unctional role andtherapeutic implications of neuronal caspase-1 and-3 in a mousemodel of traumatic spinal cord injury.Neuroscience Vol.99，pp.333 342，2000)致脊髓外傷。簡(jiǎn)而言之，實(shí)施T9和T10椎板切除術(shù)，用一對(duì)小鼠橫夾穩(wěn)定脊柱，從兩旁支撐T9-T10的橫切作用。將直徑為1.4毫米、重量為2克的不銹鋼沖擊棒置于硬脊膜上方2.5厘米處，且向下落在脊髓的T10節(jié)段上。在手術(shù)中將小鼠置于37℃保溫的毯子上，且術(shù)后每只小鼠均皮下注射1毫升熱的無菌鹽水以防止脫水。每天一次人工將膀胱內(nèi)的尿液擠出，直至對(duì)膀胱的反射控制恢復(fù)。所有的小鼠在術(shù)后每8-12小時(shí)麻醉止痛一次，術(shù)后每天接受兩次抗生素治療連續(xù)7天。在研究過程中動(dòng)物可以自由攝食和飲水。通過髓鞘內(nèi)注射將抗Nogo受體1抗體輸送到損傷部位，連續(xù)28天，見下面描述的大鼠脊髓橫切模型。
實(shí)施例8
可溶性Nogo受體1融合蛋白的性質(zhì)為了研究可溶性Nogo受體1多肽(sNogoR-1)和融合蛋白(Fc-sNogoR-1)的性質(zhì)，我們進(jìn)行了下面的實(shí)驗(yàn)。將3微克的可溶性Nogo受體(sNogoR310-Fc和sNogoR344-Fc)固定在250微克的WGA-SPA珠上，加入0.5微升的放射性配基(終濃度為0.5nM)，終體積為100微升結(jié)合緩沖液(20mM HEPES，pH 7.4，2mM Ca，2mM Mg，0.1％BSA，0.1％卵清蛋白和蛋白酶抑制劑)。配基包括10μM Nogo66，10μM125I-Nogo40(NogoA的1-40氨基酸)，對(duì)每個(gè)配基用10微升抗-Nogo受體1的上清。Nogo40上的三個(gè)酪氨酸分別用碘標(biāo)記，分別命名為Nogo40-A，-B和-C。用標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)合放射性百分比表示三個(gè)平行樣的平均值(圖6，7和8)。誤差棒表示的是平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。在數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，將沒有抑制劑時(shí)的結(jié)合放射性作為100％，而在10μM Nogo40存在時(shí)的結(jié)合放射性作為0％。
實(shí)施例9配基與可溶性Nogo受體1融合蛋白結(jié)合的抑制使用與實(shí)施例8中的結(jié)合實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)實(shí)施例1中產(chǎn)生的兩個(gè)單抗抑制125I-Nogo66與sNogoR344-Fc結(jié)合的能力。單抗2F7和3G5抑制125I-Nogo66與sNogoR344-Fc的結(jié)合。
實(shí)施例10神經(jīng)突向外生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)用0.1毫克/毫升的多聚-D-賴氨酸(Sigma)包被Lab-Tek培養(yǎng)載玻片(4孔)。3微升只含有CNS髓鞘的液滴或者分別含有CNS髓鞘與sNogoR310的混合物、與sNogoR310-Fc融合蛋白的混合物、與單抗5B10的混合物的液滴或者與對(duì)照PBS的混合物的液滴分別點(diǎn)在載玻片上。在髓鞘或PBS中加入熒光微球體(Polysciences)用于后面的步驟中鑒定液滴(Grandpre et al，Nature 403，2000)。然后潤(rùn)洗Lab-Tek培養(yǎng)載玻片，用10微克/毫升的層粘連蛋白(GibcoTM)包被。用1毫克/毫升的類型1膠原酶(Worthington)解離P3-4Sprague Dawley大鼠幼仔的背根神經(jīng)節(jié)，用火磨光的巴氏吸管吹打，預(yù)接種以增加神經(jīng)元細(xì)胞，最終以23000細(xì)胞每孔的密度接種到事先包被好的Lab-Tek培養(yǎng)載片上。培養(yǎng)基是含有5％熱滅活供體馬血清、5％熱滅活胎牛血清和50納克/毫升小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的F12，在37℃和5％CO2條件下孵育6小時(shí)。使用含有20％蔗糖的4％多聚甲醛溶液固定載玻片20分鐘，并使用1∶500稀釋的抗beta-III-微管蛋白抗體(Covance TUJ1)染色檢查神經(jīng)元標(biāo)記。二抗是抗小鼠Alexa.Fluor594(MolecularProbes)，1∶300稀釋使用，在載玻片上覆蓋Gel/MountTM(BimedaTM)。使用OpenLabTM軟件獲得放大5倍的數(shù)碼圖像。使用MetaMorph軟件分析定量神經(jīng)突的生長(zhǎng)。sNogoR310，sNogoR310-Fc和單抗5B10全部保護(hù)DRG神經(jīng)元不受髓鞘介導(dǎo)的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的抑制(圖9-11)。在一個(gè)類似的使用雞神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)sNogo310有保護(hù)效果。我們還使用層粘連蛋白存在或者不存在時(shí)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了可溶性Nogo受體的神經(jīng)元保護(hù)作用。在沒有層黏連蛋白的培養(yǎng)基中神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)得很不好，模擬了神經(jīng)元的脅迫生長(zhǎng)條件。從出生后6-7天的大鼠幼仔(P6-7)中分離出背根神經(jīng)節(jié)，解離為單個(gè)細(xì)胞，加入到事先用多聚-D-賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中，如上所述。在一些孔中，在接種細(xì)胞之前加入2微克/毫升的層粘連蛋白孵育2-3小時(shí)并在鋪入細(xì)胞之前沖洗。孵育培養(yǎng)板18-20小時(shí)之后，使用4％的多聚甲醛固定，用兔抗Beta-III-微管蛋白抗體(Covance1∶500稀釋的)和1∶100稀釋的抗-HuC/D(Molecular Probes)染色，以1∶200稀釋度加入熒光二抗(Molecular Probes)。使用ArrayScanII(Cellomics)獲得放大5倍的數(shù)碼圖像，將神經(jīng)突向外生長(zhǎng)定量為每孔中的平均神經(jīng)突向外生長(zhǎng)/神經(jīng)元，通過使用神經(jīng)突向外生長(zhǎng)應(yīng)用。對(duì)于每個(gè)條件下的3個(gè)孔分析了9張5倍的圖像。在一些實(shí)驗(yàn)中使用了PC12細(xì)胞(NeuroscreenTM)的亞克隆。NeuroscreenTM細(xì)胞用200納克/毫升的神經(jīng)生長(zhǎng)因子預(yù)分化7天，脫壁并重新接種到事先用多聚-D-賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中。在一些孔中，在接種細(xì)胞之前加入5微克/毫升的層粘連蛋白孵育2-3小時(shí)并在鋪入細(xì)胞之前沖洗。孵育兩天以后培養(yǎng)板使用4％的多聚甲醛固定，用1∶500稀釋的兔抗Beta-III-微管蛋白抗體(Covance)和Hoechst(核染)染色。使用ArrayScanII(Cellomics)對(duì)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)進(jìn)行定量，如在DRG細(xì)胞中一樣。在接種細(xì)胞時(shí)，向P6-7 DRG神經(jīng)元和分化的NeuroscreenTM細(xì)胞中加入溶解的sNogoR344-Fc或大鼠IgG。P6 DRG神經(jīng)元在沒有層粘連蛋白時(shí)生長(zhǎng)，觀察到1μM和10μM的sNogoR344-Fc具有神經(jīng)元保護(hù)作用。神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的定量實(shí)驗(yàn)顯示，隨著sNogoR344-Fc的加入神經(jīng)突的生長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量依賴的增長(zhǎng)。向生長(zhǎng)在層粘連蛋白基質(zhì)中的DRG神經(jīng)元中加入相同濃度的sNogoR344-Fc，不能產(chǎn)生任何特殊異常的效果，表明sNogoR344-Fc只是在受脅迫的細(xì)胞中才有活性。對(duì)于NeuroscreenTM細(xì)胞，沒有層粘連蛋白時(shí)，相同濃度的sNogoR344-Fc具有神經(jīng)元保護(hù)作用。
實(shí)施例11Fc-sNogoR-1融合蛋白的制備和純化編碼大鼠Nogo受體1的-310氨基酸的cDNA構(gòu)建體與位于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體上的大鼠IgG1 Fc融合，用電穿孔將該載體轉(zhuǎn)入中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)(DG44)細(xì)胞中。細(xì)胞在含有10％透析的胎牛血清、2mM谷胺酰胺和抗生素及抗霉劑的alpha-MEM培養(yǎng)基中維持。轉(zhuǎn)染后兩天，收獲條件培養(yǎng)基，在還原條件下用蛋白印跡分析。使用多克隆兔抗Nogo受體1抗體檢測(cè)到一個(gè)約60kD的蛋白條帶。使用R-PE偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和篩選。在第二次篩選后，將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，接種密度為每孔一個(gè)細(xì)胞。使用三明治ELISA檢測(cè)和比較每一個(gè)孔中分泌出的可溶性Nogo受體1蛋白水平。ELISA平板包被有山羊抗大鼠IgGFcκ特異的抗體。使用條件培養(yǎng)基。用HRP偶聯(lián)的驢抗大鼠IgG Fab，F(xiàn)c-特異的抗體檢測(cè)結(jié)合上的可溶性Nogo受體1蛋白?？寺?C12具有最高的分泌水平。4C12在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中的CHO-M7培養(yǎng)基中擴(kuò)增和生長(zhǎng)。在37C時(shí)的分泌水平大約是10毫克/升。大量培養(yǎng)表達(dá)sNogoR310-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞。從10升的生物反應(yīng)器一次培養(yǎng)獲得1.7升濃縮的條件培養(yǎng)基。加入1/10體積的1.0M Tris-HCl，pH 8.9升高pH值。加入固體的氯化鈉和甘氨酸至濃度分別為3.0M和1.5M。準(zhǔn)備60毫升蛋白A-SepharoseTM層析柱，用10mM Tris-HCl，3M NaCl，1.5M甘氨酸，pH 8.9平衡。濃縮的條件培養(yǎng)基上柱，使用蠕動(dòng)泵控制上樣速度為1.5毫升/分鐘。用300毫升10mM Tris-HCl，3M氯化鈉，1.5M甘氨酸，pH 8.9然后用120毫升5mM Tris-HCl，3M NaCl pH 8.9洗柱。用25mM磷酸鈉、100mM NaCl，pH2.8溶液洗脫蛋白。在含有1.0毫升1.0M HEPES，pH 8.5的試管中收集10毫升洗脫級(jí)分。混和蛋白質(zhì)洗脫級(jí)分，每次用2升5mM磷酸鈉，300mM NaCl，pH 7.4透析，連續(xù)三次。
實(shí)施例12脊髓橫切實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)其促進(jìn)體內(nèi)功能性恢復(fù)的能力，使用大鼠脊髓橫切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了sNogoR-1融合蛋白。使用當(dāng)日新鮮配制的待測(cè)溶液(sNogoR310-Fc溶于PBS)充滿Alzet滲透壓泵。裝載濃度計(jì)算為5和50μM。在向動(dòng)物移植之前，泵在37C提前運(yùn)轉(zhuǎn)40小時(shí)以上。雌性Long Evans大鼠在術(shù)前給服止痛藥和鎮(zhèn)靜劑，并使用3％異氟烷(在氧氣中)麻醉。將大鼠置于立體定向架中，暴露運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)，用于在兩側(cè)灌輸脊髓束示蹤劑BDA(分子量為10,000)。然后對(duì)大鼠實(shí)施T5-T6段脊髓背部半切斷，之后移植髓鞘內(nèi)導(dǎo)管和泵系統(tǒng)，以輸送待測(cè)化合物(每組11只大鼠)。術(shù)后讓大鼠自由恢復(fù)和存活，直至第28天。損傷誘導(dǎo)之后使用BBB系統(tǒng)記錄行為評(píng)分，直至第28天，即本研究中的有生命階段結(jié)束之前。灌注和固定之后，取出脊髓，冷凍保存，切片，染色，進(jìn)行軸突計(jì)數(shù)。對(duì)小鼠和大鼠在損傷后進(jìn)行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)(Basso等人1996，Newrotrauma13，343-359)運(yùn)動(dòng)評(píng)分、斜板試驗(yàn)和傾斜格柵行走試驗(yàn)(Li和Strittmatter，2003，J Neurosci.2003，23，4219-27)。對(duì)于斜板試驗(yàn)，我們測(cè)量了小鼠停留5秒鐘不滑下時(shí)，50厘米×60厘米板能夠傾斜的最大角度。對(duì)于傾斜格柵行走試驗(yàn)，訓(xùn)練小鼠爬上傾斜45度的線格柵(35厘米長(zhǎng)，2.54平方厘米的方格)。每次從下到上爬行的過程中計(jì)數(shù)后爪落在柵格板以下的次數(shù)。使用BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、格柵行走和腳印分析對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。對(duì)于格柵行走，訓(xùn)練大鼠爬上線格柵(70厘米長(zhǎng)，2.54平方厘米的方格)，計(jì)數(shù)后爪落在柵格板以下的次數(shù)。對(duì)于腳印分析，用墨水記錄大鼠在連續(xù)運(yùn)動(dòng)經(jīng)過90厘米長(zhǎng)的跑道時(shí)后爪的行走模式，計(jì)算每側(cè)的步幅長(zhǎng)度和步幅寬度(Metz et al.，2000，Brain Res.，883，165-177)。所有這些行為學(xué)測(cè)驗(yàn)至少由兩個(gè)人進(jìn)行。在手術(shù)、行為學(xué)測(cè)驗(yàn)和組織分析的全過程中，研究者不知道迷你泵中的化合物是什么。sNogoR310-Fc促進(jìn)功能的恢復(fù)(圖12)。
實(shí)施例13大鼠脊髓挫傷實(shí)驗(yàn)用大鼠脊髓挫傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可溶性Nogo受體1多肽和融合蛋白對(duì)體內(nèi)神經(jīng)元的作用。使用止痛劑和抗生素預(yù)防性的處理頭包頭巾的LongEvans雌性大鼠(體重170-190克)。手術(shù)前10分鐘，通過腹腔注射咪達(dá)唑侖2.5毫克每公斤體重使動(dòng)物鎮(zhèn)靜，然后用2-3％異氟烷(混于氧氣中的)使動(dòng)物麻醉。然后將大鼠的毛刮掉，用乙醇和聚維酮碘擦拭，在眼部施用眼潤(rùn)滑劑。接下來沿著中線切開，暴露T7到T12段椎骨。在T91/2和T10段脊椎處進(jìn)行背部椎板切除術(shù)，暴露脊髓。將大鼠安放在沖擊器上。首先將T7和T8節(jié)段夾住，然后將T11和T12節(jié)段固定在沖擊器尾側(cè)的夾子上。在大鼠的胸部下方放一塊柔軟的材料。將沖擊棒設(shè)置在0的位置，將電地線夾連在傷口邊緣。然后將沖擊棒抬高到25毫米，調(diào)節(jié)其位置至它恰巧正好在暴露的脊髓之上。然后釋放沖擊棒擊中脊髓，之后立即抬起沖擊棒。然后將大鼠從沖擊器上放下，在傷口處抹上Gelfoam?？p合傷口之上的肌肉，切口通過手術(shù)膠帶封合。將動(dòng)物置于一個(gè)孵化器內(nèi)直至它們從麻醉中蘇醒。根據(jù)需要為大鼠提供抗生素、止痛劑和鹽水。此后每天早晚擠壓膀胱，直至功能恢復(fù)。如上所述，通過髓鞘內(nèi)向上述的大鼠脊髓橫切模型施用可溶性受體1融合蛋白(例如sNogoR310-Fc)。術(shù)后第二天進(jìn)行BBB評(píng)分，之后每周一次，直至4到6周。
實(shí)施例14sNogoR310在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)我們制備了表達(dá)可溶性Nogo受體1蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，以檢測(cè)可溶性Nogo受體1蛋白在體內(nèi)表達(dá)時(shí)的作用。我們將小鼠的sNogoR310 cDNA(對(duì)應(yīng)于Nogo受體1的1-310氨基酸；SEQ ID NO28)克隆入C-3123載體的NotI位點(diǎn)中。在這個(gè)載體中，sNogoR310的表達(dá)是在神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(gfap)基因的調(diào)控序列的控制下的，這可以產(chǎn)生高水平表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物可以從損傷部位的活性星形膠質(zhì)細(xì)胞中分泌出來。接下來我們用AatI和SfiI消化得到的載體，在3.4kb片段上分離出gfap::sNogoR310構(gòu)建體。我們將這個(gè)片段微注射入胚胎中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。我們通過PCR證實(shí)了轉(zhuǎn)基因已經(jīng)整合并且鑒定出了5個(gè)起始品系。我們將具有最高表達(dá)水平的兩個(gè)雜合雄性起始品系與雌性C57BL/6J小鼠交配。我們使用抗Nogo受體1的抗體，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，確證在雜合的轉(zhuǎn)基因小鼠中，GFAP陽性的細(xì)胞表達(dá)和分泌sNogoR310。我們將皮質(zhì)和脊髓在含有蛋白酶抑制劑(Roche)的Tris鹽緩沖鹽溶液中勻漿，在4℃ 40,000rpm離心勻漿產(chǎn)物20分鐘。我們用4％多聚甲醛處理上清20分鐘以提高抗體的特異性，并在免疫印跡之前進(jìn)行透析。我們通過在RIPA緩沖液(含1％TritonX-100，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS的PBS)中用超聲波處理勻漿微粒級(jí)分，將得到的勻漿產(chǎn)物離心，同上處理此上清(去污劑-可溶性微粒級(jí)分)。我們使用1∶2000稀釋的Nogo受體1的兔抗血清，通過免疫印跡分析了20微克的大腦或脊髓蛋白質(zhì)。在與AP偶聯(lián)的抗兔IgG和NBT/BCIP AP底物孵育之后，我們顯現(xiàn)了免疫反應(yīng)性。我們檢測(cè)到，在兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系Tg08和Tg01的皮質(zhì)和脊髓的不含去污劑的可溶性提取物中有分泌型37kD sNogoR310，但是在同窩野生型小鼠中不存在任何大小為37kD或81kD的可溶性Nogo受體1蛋白的(若有也很少)。對(duì)微粒級(jí)分的檢查證明了在野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠中都存在相當(dāng)水平的內(nèi)源Nogo受體1。
實(shí)施例15損傷之后在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)sNogoR310通過背部過半切斷損傷，檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷對(duì)sNogoR310在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)的影響。我們通過如實(shí)施例14中描述的方法將雜合雄性與C57/BL6雌性交配，獲得sNogoR310轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談?dòng)物。我們深度麻醉成年雌性雜合轉(zhuǎn)基因或同窩野生型小鼠(10-16周齡)，實(shí)施完全椎板暴露手術(shù)，將背部脊髓T6和T7段完全暴露。我們對(duì)T6段脊髓實(shí)施背部過半切斷，使用30號(hào)針和顯微手術(shù)剪將背部和背外側(cè)皮質(zhì)脊髓束(CTS)完全分開。我們用做了記號(hào)的針多次穿過脊髓的背段，以確認(rèn)損傷的深度為1.0毫米。我們縫合椎板暴露手術(shù)上方的肌肉層，使用手術(shù)膠帶將背部皮膚封合。為了跟蹤皮質(zhì)脊髓束，我們?cè)诩顾钃p傷后14天在大腦皮質(zhì)上方的右側(cè)向顱骨內(nèi)鉆了一個(gè)骨窗。我們?cè)谄べ|(zhì)表面以下0.7毫米深的四個(gè)位置注射示蹤劑BDA(分子量10000，濃度為10％溶于PBS)(Molecular Probes，Eugene，OR)。損傷后四周，小鼠心臟灌注PBS，然后用4％多聚甲醛固定。用于sNogoR310表達(dá)實(shí)驗(yàn)的小鼠不注射任何示蹤劑。用于蛋白印跡分析的小鼠，損傷之后14天，不進(jìn)行灌注，收集在T3和L3段之間的脊髓。用于Nogo受體1免疫組織化學(xué)染色的小鼠在半切后10天用4％多聚甲醛灌注，取出受損的脊髓進(jìn)行切片。使用固定于立體定位裝置(David Kopf，Tujunga，CA)中的11號(hào)解剖刀的刀刃對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠實(shí)施皮質(zhì)針刺損傷，以檢查sNogoR310在受損腦部中的表達(dá)。在前囟后0.5毫米、距離中線側(cè)1.5毫米處作一個(gè)4毫米長(zhǎng)的副矢狀切割，切割為3.5毫米深。損傷10天以后，我們?cè)谵D(zhuǎn)基因小鼠的脊髓可溶性提取物中檢測(cè)到sNogoR310表達(dá)的提高，但是在野生型小鼠中沒有檢測(cè)到。這與損傷后在損傷部位周圍GFAP的水平升高是一致的。為了確證這不是由于NogoA補(bǔ)償性增量調(diào)節(jié)造成的，我們檢測(cè)了NogoA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在野生型或轉(zhuǎn)基因小鼠中完整未損的或者受損的皮質(zhì)和脊髓中表達(dá)是類似的。我們使用Nogo受體1抗體和GAFP抗體，通過對(duì)受損的腦和含有受損區(qū)域的脊髓進(jìn)行免疫染色，檢查了在受損CNS中sNogoR310的細(xì)胞表達(dá)。有反應(yīng)活性的星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)在野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有形態(tài)學(xué)差異，但是在gfap::sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠中的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外間隙中，Nogo受體1的染色強(qiáng)度明顯高于野生型小鼠，表明在轉(zhuǎn)基因小鼠的損傷周圍，sNogoR310表達(dá)的提高。Nogo受體1蛋白和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP僅在轉(zhuǎn)基因小鼠中共定位。在轉(zhuǎn)基因樣本中，存在明顯增強(qiáng)的非細(xì)胞染色擴(kuò)散，這與細(xì)胞外間隙中的sNogo310R是一致的。在野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠中都檢測(cè)到了神經(jīng)元細(xì)胞體的Nogo受體1染色。
實(shí)施例16分泌的sNogoR310誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠中CSF出芽我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因小鼠中損傷周圍sNogoR310表達(dá)的提高是否導(dǎo)致受損軸突的再生。我們根據(jù)Li和Strittmatter，2003，J.Neurosci.，23，4219-27，通過在右側(cè)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中注射順向示蹤劑生物素葡聚糖胺(BDA)檢測(cè)了下行皮質(zhì)脊髓束(CSF)的完整性。在同窩野生型小鼠中，在損傷位置的頭向，凸起的背部皮質(zhì)脊髓束被緊緊綁縛在一起，在同側(cè)能看到只有少數(shù)背外側(cè)CST纖維。少量的BDA標(biāo)記的短側(cè)芽伸向灰質(zhì)，特別是在腹側(cè)脊髓中，但是出芽主要局限于與示蹤劑注射對(duì)側(cè)的脊髓中。但是在sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的背部半切斷位置頭向的切片中顯示了十分不同的BDA標(biāo)記分布。在所有的轉(zhuǎn)基因小鼠品系Tg08或者Tg01中，在凸起的背部皮質(zhì)脊髓束以外都觀察到了高密度的BDA標(biāo)記的CST纖維。異位纖維遍布灰質(zhì)區(qū)域，而一些纖維到達(dá)了外側(cè)和背外側(cè)的白質(zhì)中。在脊髓的對(duì)側(cè)(示蹤劑注射點(diǎn)的同側(cè))可見許多纖維(每個(gè)橫切中4-12個(gè)芽)。側(cè)芽的微量光密度測(cè)量表明在sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠中出芽密度大約增加了10倍。對(duì)sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠距離損傷處1到4毫米的副矢狀面縱切切片進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)dCST纖維向腹側(cè)灰質(zhì)區(qū)域伸出大量分支芽，這與同窩野生型小鼠形成對(duì)比。一般來說，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，在損傷位置的頭向出芽的型式和程度與全身使用Nogo受體1拮抗肽NEP1-40治療的小鼠中觀察到的類似(Li和Strittmatter，2003)。這些結(jié)果證明分泌的sNogoR310誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠中CST出芽。
實(shí)施例17在sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠中，CST軸突越過損傷部位向脊髓遠(yuǎn)端生長(zhǎng)我們從轉(zhuǎn)基因小鼠中分離出離損傷部位頭向4毫米且尾向4毫米的脊髓(總共8毫米長(zhǎng))，將其包埋于戊二醛聚合的白蛋白基質(zhì)中，在振動(dòng)切片機(jī)上作副矢狀(30微米厚)切割。我們收集離損傷部位頭向5-7毫米且尾向5-7毫米的脊髓橫切(50微米)。對(duì)于大鼠中的sNogoR310-Fc注射實(shí)驗(yàn)，離損傷部位頭向10毫米且尾向10毫米延伸的脊髓，在振動(dòng)切片機(jī)上作副矢狀切割(50微米厚)。收集離損傷部位頭向11-16毫米且尾向11-16毫米脊髓的橫切。將切片與親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物共同溫育，使用鎳增強(qiáng)的二氨基聯(lián)苯胺HPR反應(yīng)(Grandpre，2002，Nature，417，547-551)來顯現(xiàn)BDA示蹤劑。我們處理了一些用于5-羥色胺組織化學(xué)(抗5-羥色胺抗體)的切片，使用間接免疫熒光技術(shù)。為了看到受損的區(qū)域，我們用GFAP抗體(Sigma，St.Louis，MO)對(duì)一些切片進(jìn)行了雙染色。我們對(duì)切片進(jìn)行了封固、脫水，并用封固劑覆蓋切片。我們檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠受損后表達(dá)的sNogoR310誘導(dǎo)出的纖維是否跨過受損區(qū)域到達(dá)尾向脊髓，使得功能恢復(fù)。在顯微鏡描圖器中描繪的跨越損傷部位的連續(xù)副矢狀切片顯示損傷部位周圍幾個(gè)毫米處再生的CST纖維呈全面分布。野生型小鼠的切片顯示沒有從受損部位處伸出的CST纖維。sNogo310轉(zhuǎn)基因小鼠的類似切片顯示大量跨越橫切區(qū)域的CST纖維，且伸向遠(yuǎn)端的灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域，呈現(xiàn)高度分支的型式。在半切的頭向近旁，來自凸起dCST的、高密度的BDA標(biāo)記的CST出芽伸向受損區(qū)域，但是大多數(shù)CST出芽不能穿越疤痕形成和組織空洞大量存在的橫切區(qū)域。小量但是非常顯著的一部分再生軸突，通過腹側(cè)和腹外側(cè)灰質(zhì)和白質(zhì)的殘余組織橋，繞過受損部位。此外，少量CST纖維自身通過受損的背側(cè)和背外側(cè)脊髓跨過橫切區(qū)域，到達(dá)遠(yuǎn)端區(qū)域。在損傷的附近，再生纖維的行進(jìn)路線通常是曲折的，與頭向CST中正常平直的纖維顯著不同。在遠(yuǎn)端脊髓的灰質(zhì)區(qū)域中經(jīng)常見到的是平行纖維和樹枝狀纖維。重建表明，在各轉(zhuǎn)基因小鼠中，在損傷部位尾向1-4毫米的任何水平，5-15 BDA-標(biāo)記的再生纖維沿著頭-尾向軸向行進(jìn)。在所有轉(zhuǎn)基因小鼠中，在背部半切斷尾向的5-7毫米的橫切切片中，在灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域都可以觀察到BDA標(biāo)記的CST軸突。轉(zhuǎn)基因小鼠的纖維計(jì)數(shù)提示，在矢狀切片中的近端水平上有大致相近數(shù)目的BDA標(biāo)記的CST纖維。除了CST纖維以外，其他下行傳導(dǎo)束，例如縫核脊髓(raphespinal)纖維，也在小鼠的運(yùn)動(dòng)功能中起作用。在這個(gè)小鼠背部過半切斷模型中，橫切損傷了大部分5-羥色胺能纖維，使腹角中這些纖維的密度降低了大約80％。對(duì)尾向脊髓腹角中5-羥色胺能纖維的分析表明，在轉(zhuǎn)基因小鼠中這些纖維的數(shù)目比野生型小鼠中的多，顯示sNogoR310在轉(zhuǎn)基因小鼠中的生長(zhǎng)促進(jìn)作用并不只限于一條軸突下行路徑。
實(shí)施例18轉(zhuǎn)基因表達(dá)sNogoR310促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)CST軸突示蹤和5-羥色胺能纖維分析表明在轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的sNogoR310刺激脊髓中受損的下行軸突廣泛的結(jié)構(gòu)再生。我們進(jìn)行了許多行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例12所示，以確定這些再生的纖維是否有益于功能恢復(fù)。根據(jù)BBB實(shí)驗(yàn)給出的結(jié)果，野生型小鼠在4周的存活期內(nèi)部分地恢復(fù)了運(yùn)動(dòng)功能。在損傷后4周時(shí)，大多數(shù)野生型小鼠的功能恢復(fù)到了持續(xù)負(fù)重的跖肌步行，但是它們僅僅表現(xiàn)出偶爾到經(jīng)常的前后肢協(xié)調(diào)，在剛剛接觸測(cè)試表面時(shí)出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)爪位置的旋轉(zhuǎn)。與此相反，在7-28天的觀察期內(nèi)，sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的兩個(gè)品系Tg08和Tg01的BBB評(píng)分顯著高于對(duì)照組(圖13A和13B)。損傷后28天，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的前后肢協(xié)調(diào)，而且優(yōu)勢(shì)爪位置與身體平行。我們使用兩個(gè)另外的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)。首先我們測(cè)量了小鼠能夠在5秒鐘之內(nèi)不滑下的最大平板傾斜角度。在背部半切斷損傷之前，轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠都能夠在平板傾角為55度時(shí)保持它們的姿勢(shì)。在損傷后7-28天內(nèi)，對(duì)于所有的小鼠，可以經(jīng)受的傾角都有所縮小，但是轉(zhuǎn)基因小鼠的可經(jīng)受的傾角明顯大于對(duì)照組小鼠(圖13C)。在另一個(gè)行為實(shí)驗(yàn)中，小鼠攀爬與垂直方向呈45度角的格柵，并計(jì)數(shù)爬行途中后肢落在格柵的平面以下的次數(shù)(Metz et al.，2000)。在損傷之前的訓(xùn)練中，所有的小鼠都沒有在該實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)這樣的錯(cuò)誤。在損傷后2-6周期間，野生型小鼠出現(xiàn)大量的后腳錯(cuò)誤，且只有最低限度的提高。與此相反，在此期間，sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠在爬格柵實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出持續(xù)的提高，主要的提高出現(xiàn)在損傷后1-3周之間(圖13D)。這樣，從星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌sNogoR310的轉(zhuǎn)基因小鼠在胸髓(thoracic spinal)半切斷之后表現(xiàn)出CST再生，縫核脊髓出芽和運(yùn)動(dòng)功能的增強(qiáng)。
實(shí)施例19髓鞘內(nèi)施用sNogoR310-Fc蛋白誘導(dǎo)CST出芽作為第二個(gè)檢測(cè)可溶性Nogo受體1在脊髓外傷之后有促生長(zhǎng)益處的實(shí)驗(yàn)，我們髓鞘內(nèi)給藥純化的蛋白。我們將大鼠Nogo受體1的配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域(27-310)與大鼠IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域相融合，以提高穩(wěn)定性，有助于純化。我們從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中純化蛋白。該蛋白阻斷Nogo-66，MAG和髓鞘在體外的作用，如以前對(duì)小鼠sNogoR310-Myc His的研究所示(Fournier et al.，2002，J Neurosci.，22，8876-8883；Liu et al.，2002，Science，297，1190-1193)。我們通過滲透壓小泵，將sNogoR310-Fc蛋白髓鞘內(nèi)給予受到中胸背部半切斷損傷的小鼠。在損傷后4周的存活期內(nèi)，每只大鼠局部注射1.2毫克sNogoR310-Fc蛋白。在接受載體處理(1.2毫克大鼠IgG)的大鼠中，半切斷位置頭向的切片顯示在損傷部位上方有緊緊綁縛的突出背部CST和極少的異位BDA標(biāo)記的CST纖維。接受sNogoR310-Fc蛋白的損傷大鼠，其損傷位置頭向的切片顯示了十分不同的標(biāo)記分布模式。從橫切和副矢狀切片中可以觀察到大量從BDA標(biāo)記的CST上發(fā)出的異位纖維。有些情況下，突出越過了臨近中線的dCST區(qū)域，到達(dá)索的周圍，與背外側(cè)的CST混和在一起。出芽的軸突在灰質(zhì)中的擴(kuò)展比在白質(zhì)中的擴(kuò)展程度要大。測(cè)量顯示，在sNogoR310-Fc處理的大鼠中與dCST鄰近的異位出芽纖維(在橫切中≥100微米；在矢狀切面中≥200微米)增加得更多。
實(shí)施例20在sNogoR310-Fc治療的大鼠中，CST軸突的再生向遠(yuǎn)端脊髓進(jìn)行我們對(duì)雌性Sprague Dawley大鼠(體重190-250克)實(shí)施深度麻醉，在T6-7段脊髓實(shí)施胸椎暴露術(shù)，暴露脊髓。我們切開脊髓背部一半，使用30號(hào)針和顯微剪刀將背部CSGT束分開，并用11號(hào)手術(shù)刀的鋒利的刀刃通過髓的背部一半(Grandpre et al.，2002，Nature，417，547-551)以確保損傷的深度(1.8毫米)。滲透壓小泵((Alzet2ML4，2毫升容積，2.5微升每小時(shí)，28天給藥)中充滿含有1.2毫克大鼠IgG的PBS或者含1.2毫克sNogoR310-Fc融合蛋白的PBS，將泵縫在動(dòng)物背部皮膚下的肌肉中。與小泵的出口相連的導(dǎo)管，通過一個(gè)硬脊膜上的小洞，被插入到T7-8段脊髓的髓鞘內(nèi)空隙。Nogo受體1拮抗劑蛋白灌輸在大鼠半切斷位置的頭向誘導(dǎo)出大量的出芽，但是更為關(guān)鍵的問題是出芽的CST纖維是否伸向遠(yuǎn)端脊髓且是否有助于運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。在載體處理的大鼠中，損傷部位的縱切切片顯示，在損傷以下沒有可被檢測(cè)到的或者只檢測(cè)到很少數(shù)目的BDA標(biāo)記的腹側(cè)CST纖維(GrandPre et al.，2002；Weidner et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，3513-3518)。來自經(jīng)sNogoR310-Fc治療的大鼠的類似切片顯示，有許多BDA標(biāo)記的纖維通過腹側(cè)和腹外側(cè)脊髓的橋梁組織繞過了橫切部位伸向脊髓的尾向。對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP的免疫染色顯示，橫切到達(dá)的深度深過脊髓的中央管區(qū)。與突出的背部CST中頭向纖維的線形走勢(shì)不同，再生的CST纖維在遠(yuǎn)端脊髓中通常呈現(xiàn)高度的分支型式，特別是在灰質(zhì)區(qū)內(nèi)。在脊髓的許多區(qū)域內(nèi)都檢測(cè)到這些纖維，但是在整個(gè)脊髓的中部和背部一半可以更容易地看到。矢狀切片中的CST纖維計(jì)數(shù)顯示，在每一只sNogoR310-Fc治療的大鼠中，損傷部位后面1-2毫米處有大約20個(gè)BDA標(biāo)記的軸突；且在損傷部位遠(yuǎn)端7-8毫米處有15個(gè)標(biāo)記的軸突。一般來說，這些纖維的分支型式與局部NEP1-40肽處理的動(dòng)物中出現(xiàn)的分支型式相似，但是使用sNogoR310-Fc蛋白治療的切片中可以看到每一個(gè)芽體更加向兩側(cè)分支。對(duì)從遠(yuǎn)端脊髓發(fā)出的芽進(jìn)行測(cè)量，表明sNogoR310-Fc處理的動(dòng)物中每一個(gè)芽的總側(cè)向長(zhǎng)度是NEP1-40處理的動(dòng)物中的兩倍。脊髓尾向1-10毫米內(nèi)芽體(長(zhǎng)度≥200微米)的數(shù)目，在兩組Nogo受體1拮抗劑處理的大鼠中都比對(duì)照組大20-40倍。與局部使用NEP 1-40的治療比較，sNogoR310-Fc治療的大鼠中可以看到更多的出芽(NEP組中每只大鼠約25個(gè)出芽，sNogoR310-Fc組中每只大鼠約50個(gè)出芽)，但是這種區(qū)別在統(tǒng)計(jì)上不顯著(p＝0.1713，t檢驗(yàn))在接受sNogoR310-Fc治療的大鼠半切斷部位尾向11-15毫米處的脊髓橫切切片中，可以見到正在再生的CST軸突。這些纖維在脊髓的灰質(zhì)和白質(zhì)中都可以檢測(cè)到。與白質(zhì)相比，在灰質(zhì)中檢測(cè)到的纖維通常具有更加側(cè)向的分支。與此相反，賦形劑處理組的橫切切片中，在腹側(cè)白質(zhì)區(qū)域中，只能偶爾看到BDA標(biāo)記，這與未損傷組的腹側(cè)CST軸突一致。在遠(yuǎn)端脊髓的這一水平上，兩種Nogo受體1拮抗劑處理組(sNogoR310-Fc和NEP 1-40)中BDA標(biāo)記的CST纖維的平均數(shù)目是載體處理大鼠的大約20倍。兩種Nogo受體拮抗劑--sNogoR310-Fc蛋白和NEP 1-40肽一起，可以使遠(yuǎn)端脊髓中產(chǎn)生顯著的CST軸突再生，但是由sNogoR310-Fc蛋白誘導(dǎo)出的出芽呈現(xiàn)出更為高度分支的模式。
實(shí)施例21局部sNogoR310-Fc誘導(dǎo)受損的大鼠脊髓中紅核脊髓的和5-羥色胺能軸突的出芽半切斷后14天，在下肢感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)上方的顱骨的各側(cè)鉆一個(gè)骨窗，以示蹤C(jī)ST纖維。在各側(cè)硬脊膜下深度為1.5毫米的7個(gè)注射部位注射順向的神經(jīng)元示蹤劑BDA(溶于PBS中，濃度為10％，每個(gè)皮質(zhì)3.5微升)(Grandpre，2002)。對(duì)于大鼠中紅核脊髓束的示蹤，將示蹤劑BDA(分子量10000，溶于PBS中，濃度為10％，1微升)注射入左側(cè)的紅核內(nèi)(前囪前5.8毫米，距離顱骨表面外側(cè)0.7毫米，腹側(cè)7.0毫米)。BDA注射后兩周，依次使用PBS和4％多聚甲醛灌注動(dòng)物，收集組織，用于組織學(xué)分析。脊髓損傷之后功能改善的原因是受損紅核脊髓束(RST)纖維的修復(fù)(Liu et al.，1999，J.Neurosci.，19，4370-4387)。在CNS神經(jīng)元內(nèi)Nogo受體1的廣泛分布使得Nogo受體1被其拮抗劑抑制可能導(dǎo)致RST軸突在受損后重新生長(zhǎng)。為了檢測(cè)sNogoR310-Fc對(duì)受損RST的作用，使用BDA注射入左側(cè)紅核，示蹤該途徑的完整性。在脊髓水平上，RST纖維一般位于脊髓的背外側(cè)白質(zhì)區(qū)，且被本研究中的背部半切斷橫切開。在對(duì)照組大鼠中，損傷頭向11-15毫米處的橫切切片顯示，在突出的RST和背角灰質(zhì)之間可以看到少量的BDA標(biāo)記的短纖維。在同一水平的sNogoR310-Fc處理的切片中，在RST主干和背角灰質(zhì)之間呈現(xiàn)有許多連接纖維。載體處理的大鼠中，距離SCI遠(yuǎn)端11-15毫米處的橫切切片顯示，沒有BDA標(biāo)記的RST纖維。與此相反，接受sNogoR310-Fc處理的同一水平的切片中顯示，在示蹤劑注射對(duì)側(cè)的灰質(zhì)和白質(zhì)中有大量的BDA標(biāo)記的RST纖維。在與BDA注射同側(cè)的灰質(zhì)中可見一些具有分支模式的出芽。在經(jīng)sNogoR310-Fc治療的脊髓損傷的大鼠中還檢查了紅核脊髓束纖維。免疫染色表明，損傷部位頭向11-15毫米處5-羥色胺能纖維的密度在接受載體和sNogoR310-Fc治療的組中大致相同。在損傷部位下面11-15毫米處的切片中，sNogoR310-Fc治療的大鼠的5-羥色胺纖維的數(shù)目是對(duì)照組的兩倍。這些結(jié)果表明sNogoR310-Fc蛋白對(duì)Nogo受體1的抑制作用不止限于CST纖維，而且其他下行束，例如紅核脊髓束和5-羥色胺能軸突，也對(duì)Nogo受體1拮抗作用有反應(yīng)。
實(shí)施例22使用sNogoR310-Fc局部治療增進(jìn)大鼠的功能恢復(fù)通過髓鞘內(nèi)給藥sNogoR310-Fc蛋白，促進(jìn)外傷性脊髓損傷后許多下行途徑中軸突的再生。我們檢測(cè)了該蛋白在受損的脊髓中是否還增進(jìn)了功能恢復(fù)。半切斷后兩周，接受賦形劑治療的大鼠的運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分達(dá)到了穩(wěn)定的12分水平(圖14A)。損傷后4周，大多數(shù)對(duì)照(7個(gè)中有6個(gè))具有頻繁到持續(xù)的負(fù)重跖肌步行，以及頻繁到持續(xù)的前后肢協(xié)調(diào)，但是它們?cè)诔醮谓佑|測(cè)試表面時(shí)，優(yōu)勢(shì)爪位置有旋轉(zhuǎn)。與此相反，接受sNogoR310-Fc蛋白治療的大鼠中，運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分在損傷后2到4周內(nèi)持續(xù)升高。損傷后的4周時(shí)，所有9只sNogoR310-Fc治療的動(dòng)物都具有持續(xù)的前后肢協(xié)調(diào)，并且爪在首次接觸測(cè)試表面時(shí)是平行的。使用格柵行走來評(píng)價(jià)脊髓損傷后下行精細(xì)運(yùn)動(dòng)控制中的缺陷(Metz et al.，2000)。格柵行走需要前后肢的協(xié)調(diào)和由腹外側(cè)纖維、皮質(zhì)脊髓纖維和紅核脊髓束纖維介導(dǎo)的自主運(yùn)動(dòng)控制。在損傷之前的訓(xùn)練中，所有的大鼠都準(zhǔn)確地將它們的后肢放在格子的邊框上。損傷后2-4周，對(duì)照大鼠在每次行走中要出現(xiàn)8-9個(gè)錯(cuò)誤，并且隨時(shí)間延長(zhǎng)只有最低限度的改善。與此相反，使用sNogoR310-Fc治療的大鼠在格柵行走時(shí)表現(xiàn)出穩(wěn)定的改善，出現(xiàn)的錯(cuò)誤顯著減少(平均每次行走4-7個(gè)錯(cuò)誤)。改善主要出現(xiàn)在損傷后的2-3周。對(duì)照組后爪腳印的分析顯示，與未受到損傷的大鼠或者接受sNogoR310-Fc治療的受損傷大鼠相比，對(duì)照組大鼠半切斷后4周時(shí)步幅的長(zhǎng)度顯著減小且步幅的寬度增加(圖14C)。因此，這些多種行為學(xué)測(cè)試表明使用局部注射拮抗劑蛋白抑制了Nogo受體1的功能，增進(jìn)了損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
生物保藏雜交瘤HB 7E11(ATCC登錄編號(hào)PTA-4587)，HB 1H2(ATCC登錄編號(hào)PTA-4584)，HB 3G5(ATCC登錄編號(hào)PTA-4586)，HB5B10(ATCC登錄編號(hào)PTA-4588)以及HB 2F7(ATCC登錄編號(hào)PTA-4585)2002年8月9日保藏于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(″ATCC″)中，地址為10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。正如本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所理解的，在不脫離本發(fā)明的本質(zhì)精神的前提下，可以對(duì)優(yōu)選實(shí)施例作多方面的改動(dòng)和調(diào)整。這些改動(dòng)應(yīng)該是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。
權(quán)利要求
1.多肽，其選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4和SEQ ID NO5。
2.編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的核酸，其操作性連接于表達(dá)調(diào)控序列。
4.包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的核酸的載體。
5.宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的核酸或者包含根據(jù)權(quán)利要求4的載體。
6.制備根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的方法，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞；以及(b)從該宿主細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收多肽。
7.制備抗體的方法，該方法包括以下步驟(a)使用根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或者根據(jù)權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞免疫宿主；以及(b)回收抗體。
8.通過根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求7的方法制備的抗體或者所述抗體的抗原結(jié)合片段。
9.與根據(jù)權(quán)利要求1的多肽特異結(jié)合的抗體或者其抗原結(jié)合片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的抗體或者抗原結(jié)合片段，其中的抗體(a)抑制神經(jīng)元的生長(zhǎng)椎萎陷；(b)降低對(duì)神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和出芽的抑制；以及(c)抑制Nogo受體1與配基結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的抗體或者抗原結(jié)合片段，其中神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和出芽是軸突生長(zhǎng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的抗體或者抗原結(jié)合片段，其中的神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。
13.根據(jù)權(quán)利要求8或9的抗體或者抗原結(jié)合片段，其中的抗體是單克隆抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求8或9的抗體或者抗原結(jié)合片段，其中的抗體是小鼠抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求8或9的抗體，其中抗體選自人源化抗體、嵌合抗體以及單鏈抗體。
16.雜交瘤細(xì)胞系，它選自HB 7E11(ATCC登錄號(hào)PTA-4587)，HB1H2(ATCC登錄號(hào)PTA-4584)，HB 3G5(ATCC登錄號(hào)PTA-4586)，HB5B10(ATCC登錄號(hào)PTA-4588)以及HB 2F7(ATCC登錄號(hào)PTA-4585)。
17.由根據(jù)權(quán)利要求16的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體或者其抗原結(jié)合片段。
18.抗體或者其抗原結(jié)合片段，它競(jìng)爭(zhēng)性抑制根據(jù)權(quán)利要求17的抗體與根據(jù)權(quán)利要求1的多肽結(jié)合或者抑制根據(jù)權(quán)利要求17的抗體與Nogo受體1結(jié)合。
19.抑制Nogo受體1與配基結(jié)合的方法，該方法包括以下步驟使Nogo受體1與根據(jù)權(quán)利要求10或者17的抗體或者抗原結(jié)合片段相接觸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中的配基選自NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp。
21.抑制神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)椎萎陷的方法，該方法包括以下步驟使該神經(jīng)元與根據(jù)權(quán)利要求10或者17的抗體或者其抗原結(jié)合片段相接觸。
22.降低對(duì)神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或者出芽的抑制的方法，該方法包括以下步驟使該神經(jīng)元與根據(jù)權(quán)利要求10或者17的抗體或者其抗原結(jié)合片段相接觸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或者出芽是軸突生長(zhǎng)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21或者22的方法，其中的神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。
25.可溶性Nogo受體1多肽，它基本上由Nogo受體1的N-端結(jié)構(gòu)域(NT)、8個(gè)富集亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)以及LRR C端結(jié)構(gòu)域(LRRCT)組成。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的可溶性Nogo受體1多肽，其與信號(hào)序列相連。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的可溶性Nogo受體1多肽，其中LRR包括異源LRR。
28.可溶性Nogo受體1多肽，該多肽選自SEQ ID NO6的26-344氨基酸殘基；SEQ ID NO7的26-310氨基酸殘基；SEQ ID NO8的26-344氨基酸殘基；SEQ ID NO9的26-310氨基酸殘基；SEQ ID NO8的27-344氨基酸殘基；和SEQ ID NO9的27-310氨基酸殘基。
29.核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求25到28中任意一項(xiàng)的可溶性Nogo受體1多肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的核酸，其操作性連接表達(dá)調(diào)控序列。
31.載體，它包含根據(jù)權(quán)利要求29或者30的核酸。
32.宿主細(xì)胞，它包含根據(jù)權(quán)利要求29或者30的核酸或者包含根據(jù)權(quán)利要求31的載體。
33.制備根據(jù)權(quán)利要求25到28中任意一項(xiàng)的可溶性Nogo受體1多肽的方法，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞；以及(b)從該宿主細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收多肽。
34.Nogo受體1融合蛋白，它包含可溶性Nogo受體1多肽和異源多肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的Nogo受體1融合蛋白，其中可溶性Nogo受體1多肽主要由Nogo受體1的N-端結(jié)構(gòu)域(NT)、8個(gè)富集亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)以及LRR C端結(jié)構(gòu)域(LRRCT)組成。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的Nogo受體1融合蛋白，其與信號(hào)序列相連。
37.根據(jù)權(quán)利要求34或者35的Nogo受體1融合蛋白，其中的LRR包含異源LRR。
38.根據(jù)權(quán)利要求34到37中的任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白，其中可溶性Nogo受體1多肽包含根據(jù)權(quán)利要求25到28中任意一項(xiàng)的多肽。
39.根據(jù)權(quán)利要求34到37中的任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白，其中異源多肽包含免疫球蛋白的恒定區(qū)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的Nogo受體1融合蛋白，其中免疫球蛋白恒定區(qū)是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的Nogo受體1融合蛋白，其中免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)是IgG重鏈恒定區(qū)。
42.根據(jù)權(quán)利要求34到37中的任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白，其中異源多肽是Fc。
43.根據(jù)權(quán)利要求34到37中的任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白，其中Nogo受體1融合蛋白是二聚體。
44.核酸，它編碼根據(jù)權(quán)利要求34到37中的任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的核酸，其操作性連接于表達(dá)調(diào)控序列。
46.包含根據(jù)權(quán)利要求44或者45的核酸的載體。
47.宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求44或者45的核酸或者包含根據(jù)權(quán)利要求46的載體。
48.制備根據(jù)權(quán)利要求34到37中任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求47的宿主細(xì)胞；以及(b)從該宿主細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收Nogo受體1多肽。
49.抑制Nogo受體1與配基結(jié)合的方法，該方法包括以下步驟使所述配基與根據(jù)權(quán)利要求25到28中任意一項(xiàng)的可溶性Nogo受體1多肽相接觸，或者與根據(jù)權(quán)利要求34到37中任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白相接觸。
50.調(diào)節(jié)Nogo受體1配基活性的方法，該方法包括以下步驟使該Nogo受體1配基與根據(jù)權(quán)利要求25到28中任意一項(xiàng)的多肽相接觸或者與根據(jù)權(quán)利要求34到37中任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白相接觸。
51.抑制神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)椎萎陷的方法，該方法包括以下步驟使Nogo受體1配基與根據(jù)權(quán)利要求25到28中任意一項(xiàng)的多肽相接觸或者與根據(jù)權(quán)利要求34到37中任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白相接觸。
52.降低對(duì)神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或者出芽抑制的方法，該方法包括以下步驟使Nogo受體1配基與根據(jù)權(quán)利要求25到28中任意一項(xiàng)的多肽相接觸或者與根據(jù)權(quán)利要求34到37中任意一項(xiàng)的Nogo受體1融合蛋白相接觸。
53.根據(jù)權(quán)利要求49到52中任意一項(xiàng)的方法，其中配基選自NogoA、NogoB、NogoC、MAG和OM-gp。
54.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或者出芽是軸突生長(zhǎng)。
55.根據(jù)權(quán)利要求51或者52的方法，其中的神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。
56.組合物，它包含可藥用載體和選自下列的組分(a)根據(jù)權(quán)利要求8，9和16中任意一項(xiàng)的抗體或者抗原結(jié)合片段；(b)根據(jù)權(quán)利要求25到28中任意一項(xiàng)的可溶性Nogo受體1多肽；以及(c)根據(jù)權(quán)利要求34到37中任意一項(xiàng)的融合蛋白。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的組合物，該組合物還包含一或更多種其他的治療劑。
58.促進(jìn)瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的方法，該方法包括使該神經(jīng)元與有效量的(a)抗Nogo受體1抗體或者抗原結(jié)合片段相接觸；或者與有效量的(b)可溶性Nogo受體1多肽相接觸。
59.權(quán)利要求58的方法，其中神經(jīng)元是體外的。
60.權(quán)利要求58的方法，其中可溶性Nogo受體1多肽是融合蛋白。
61.權(quán)利要求60的方法，其中融合蛋白是Fc融合蛋白。
62.權(quán)利要求61的方法，其中Fc融合蛋白是Ig-sNogoR344。
63.權(quán)利要求58的方法，其中神經(jīng)元在哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
64.權(quán)利要求63的方法，其中哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、亨丁頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森氏癥、糖尿病性神經(jīng)病、中風(fēng)、外傷性腦損傷或脊髓損傷的征兆或者癥狀。
65.促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的方法，該方法包括以下步驟(a)提供培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，其表達(dá)(i)抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段；或者(ii)可溶性Nogo受體1多肽；以及(b)將該宿主細(xì)胞引入哺乳動(dòng)物神經(jīng)元所在位置或者附近。
66.促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的基因治療方法，該方法包括，在神經(jīng)元所在位置或者附近施用包含核苷酸序列的病毒載體，該核苷酸序列編碼(a)抗Nogo受體1抗體或者其抗原結(jié)合片段；或者(b)可溶性Nogo受體1多肽，其中在哺乳動(dòng)物中該抗Nogo受體1抗體、其抗原結(jié)合片段或者可溶性Nogo受體1多肽從所述核苷酸表達(dá)足夠促進(jìn)神經(jīng)元存活的量。
67.抗體或者其抗原結(jié)合片段，其與Nogo受體1特異結(jié)合，其中所述的抗體或者片段包含輕鏈，該輕鏈包含選自以下序列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO15的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO16的氨基酸序列；以及(c)包含SEQ ID NO22，23和24的CDR1，CDR2和CDR3氨基酸序列的氨基酸序列。
68.權(quán)利要求67中的抗體或者抗原結(jié)合片段，它還包含重鏈，該重鏈包含選自以下序列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO17的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO18的氨基酸序列；以及(c)包含SEQ ID NO19、20和21的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的氨基酸序列。
69.抗體或者其抗原結(jié)合片段，它與Nogo受體1特異結(jié)合，其中所述的抗體或者片段包含重鏈，該重鏈包含選自以下序列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO17的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO18的氨基酸序列；以及(c)包含SEQ ID NO19、20和21的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的氨基酸序列。
70.權(quán)利要求69中的抗體或者抗原結(jié)合片段，它還包含輕鏈，該輕鏈包含選自以下序列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO15的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO16的氨基酸序列；以及(c)包含SEQ ID NO22，23和24的CDR1，CDR2和CDR3氨基酸序列的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開的是具有免疫原性的Nogo受體1多肽、Nogo受體1抗體及其抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體及其融合蛋白，以及編碼上述多肽/蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明還公開了組合物，組合物包含這些Nogo受體抗體及其抗原結(jié)合片段、具有免疫原性的Nogo受體－1多肽、可溶性Nogo受體及其融合蛋白以及編碼上述多肽/蛋白質(zhì)的核酸，還有制備和使用上述多肽/蛋白質(zhì)和核酸的方法。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1681838SQ03821409
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月10日
發(fā)明者D·H·S·李, R·B·佩平斯凱, W·李, S·A·拉巴奇, J·K·雷爾頓, D·S·沃利, S·M·斯特里特馬特, D·Y·W·賽赫 申請(qǐng)人:拜奧根Idec馬薩諸塞公司, 耶魯大學(xué)