專利名稱：Alcam和alcam調(diào)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和免疫治療的領(lǐng)域。更具體而言，它涉及已知抗原ALCAM除了黑素瘤外還與多種人類癌癥相關(guān)且抗ALCAM抗體可用于治療這些癌癥的有關(guān)發(fā)現(xiàn)。它還涉及ALCAM介導(dǎo)的新血管形成。
背景技術(shù)：
已激活的白細(xì)胞粘附分子(ALCAM)是I類跨膜蛋白和免疫球蛋白超家族成員。ALCAM還被稱為/已知為CD166、KG-CAM或神經(jīng)生長素，它具有一個短的細(xì)胞質(zhì)尾部和含五個Ig結(jié)構(gòu)域(兩個N-末端可變型結(jié)構(gòu)域以及隨后的三個恒定型Ig結(jié)構(gòu)域)的細(xì)胞外部分(Ohneda等，(2001)Blood 98(7)2134-2142)。ALCAM與雞粘附分子BEN/SC1/DM-GRASP具有超過90％的同源性，與人黑素瘤細(xì)胞粘附分子Mel-CAM/MUC18/CD146有30％的同一性和50％的相似性(Leon等，(2001)J Biol Chem 276(28)25783-25790)。
已發(fā)現(xiàn)ALCAM表達(dá)于激活的白細(xì)胞亞群、成纖維細(xì)胞和上皮及神經(jīng)細(xì)胞上，其中ALCAM的表達(dá)與細(xì)胞的群集相關(guān)。ALCAM被認(rèn)為參與發(fā)育的多個過程，包括血細(xì)胞生成、胸腺發(fā)育、免疫應(yīng)答系統(tǒng)、軸突延長、神經(jīng)細(xì)胞遷移和骨發(fā)生。
免疫組織化學(xué)研究已顯示了ALCAM表達(dá)于胚胎內(nèi)皮和背主動脈中。胚胎內(nèi)皮中ALCAM的活化導(dǎo)致了血細(xì)胞生成、內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育和內(nèi)皮管的形成(Ohneda等，(2001)Blood 98(7)2134-2142)。胚胎細(xì)胞刺激新血管形成以及血細(xì)胞生成的能力不存在于不表達(dá)ALCAM的成年細(xì)胞中。
新血管形成是新的血管在組織中的生長。一般而言，新的血管系統(tǒng)主要由內(nèi)皮細(xì)胞(即，通常在血管中發(fā)現(xiàn)且組成血管的細(xì)胞)組成，內(nèi)皮細(xì)胞的生長以各種血管生成因子作為信號。在腫瘤中，尤其是在那些與周圍正常組織相比快速且侵略性生長的癌癥中，已觀察到了新血管的生長。有些人認(rèn)為此新血管生成由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的信號介質(zhì)引起，而據(jù)推測這樣的介質(zhì)的作用在于刺激血管生長進(jìn)入腫瘤。一直以來，認(rèn)為此新的腫瘤血管系統(tǒng)一般由通常與血管有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞組成。研究小組已嘗試用抑制正常血管形成的各種物質(zhì)(如內(nèi)抑制素(endostatin)和制管張素)來阻止所說的腫瘤血管生成。
阻斷腫瘤血管生成的另一種方法包括鑒定選擇性阻止腫瘤中和腫瘤周圍新血管形成而不影響健康組織中正常脈管形成的藥劑。這種方法的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)在被稱為“血管摹擬”(vascular mimicry)的過程中新血管系統(tǒng)產(chǎn)生自腫瘤細(xì)胞而非產(chǎn)生自從腫瘤外進(jìn)入的內(nèi)皮細(xì)胞(參閱，如，Hendrix等(2000)Breast Cancer Res.2417-422)。
ALCAM首先被確定為CD6的配體。ALCAM與CD6的結(jié)合被認(rèn)為涉及T細(xì)胞與單核細(xì)胞和其它已活化的T細(xì)胞，以及上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和特化細(xì)胞，諸如胰島細(xì)胞之間的相互作用。ALCAM還表達(dá)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者發(fā)炎的滑膜中的單核細(xì)胞系細(xì)胞上(Levesque等，(1998)ArthiritisRheum 41(12)2221-9)。ALCAM-CD6相互作用的定位暗示了其在諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之類疾病中維持慢性發(fā)炎反應(yīng)的作用(美國專利No.5998172)。盡管涉及ALCAM的某些結(jié)合相互作用已被描述且ALCAM相關(guān)事件也正被闡明，但ALCAM的作用機(jī)制仍然有待確定。通過鑒定允許ALCAM與信號分子或其它分子相互作用的有關(guān)事件將大大增加對ALCAM功能的了解并將提供能調(diào)節(jié)ALCAM功能的物質(zhì)。這些物質(zhì)將可以用于治療和診斷一系列的疾病，包括與上述過程相關(guān)的和下述章節(jié)中的那些病理學(xué)情況。因此需要更好的了解使得ALCAM可以與其天然配體相互作用的事件和由此產(chǎn)生的生物學(xué)事件，還需要能調(diào)節(jié)這些事件的肽及其它結(jié)構(gòu)物。
按照從人轉(zhuǎn)移性黑素瘤中所觀察到的，除了異型ALCAM-CD6細(xì)胞間相互作用外，ALCAM還能形成同型ALCAM-ALCAM相互作用。先前的研究已表明，轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤細(xì)胞表達(dá)ALCAM，而在非轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤細(xì)胞中則未檢測到ALCAM。ALCAM的表達(dá)與黑素瘤從非侵襲性放射生長狀態(tài)向能轉(zhuǎn)移的垂直生長狀態(tài)發(fā)展有關(guān)?？笰LCAM抗體已被用作原發(fā)性惡性黑素瘤發(fā)展情況的診斷標(biāo)志(Van kempen等，(2000)American J Path 156(3)769-774)。
除了用于診斷外，抗體還可以用作治療劑。例如，免疫療法或以治療為目的的抗體應(yīng)用近年來已被用于治療癌癥。被動的免疫療法包括在癌癥治療中使用抗體，通常是單克隆抗體。參閱，例如，癌癥腫瘤學(xué)原理及實踐(CancerPrinciples and Practice of Oncology)，第6版(2001)第20章，第495-508頁。這些抗體可能具有內(nèi)在的治療用生物學(xué)活性，其能直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長或存活，并能募集身體免疫系統(tǒng)的天然細(xì)胞殺傷活性。這些藥劑可以單獨施用或與放射療法或化療劑聯(lián)合施用。以商標(biāo)Rituxan和Herceptin銷售的單克隆抗體，已被批準(zhǔn)分別用于治療淋巴瘤和乳腺癌，是所說療法的兩個例子。或者，抗體可用于制備抗體綴合物，其中的抗體與毒性劑連接并通過與腫瘤的特異結(jié)合使此毒性劑定向于該腫瘤。以商標(biāo)Mylotarg出售的抗體綴合物是已批準(zhǔn)用于治療白血病的抗體綴合物的一個例子。結(jié)合癌癥細(xì)胞并可能用于診斷和治療的單克隆抗體在出版物中已有公布。參閱，例如，其中尤其是公布了某些靶蛋白分子量的以下專利申請美國專利NO.6054561(200KD c-erbB-2(Her2)，和其它大小為40-200KD的未鑒定抗原)和美國專利NO.5656444(50KD和55KD，癌胚蛋白)。在臨床試驗中和/或已批準(zhǔn)用于治療實體腫瘤的抗體例子包括Herceptin(抗原180kD，HER2/neu)、Panorex(抗原40-50kD，Ep-CAM)、HMFG1(抗原＞200kD，HMW粘蛋白)、C225(抗原150kD和170kD，EGF受體)、Campath(抗原21-28kD，CD52)和Rituxan(抗原35kD，CD20)。用于治療乳癌的Herceptin(Her-2受體)和在臨床試驗中用于治療幾種癌癥的C225(EGF受體)的靶抗原以某種可檢測的水平呈現(xiàn)于很多正常成人組織中，包括皮膚、結(jié)腸、肺、卵巢、肝和胰腺中。使用這些療法的安全范圍可能由這些位點處表達(dá)水平的差異或抗體接近程度或活性的差異來決定。至2002年四月為止，已知特異結(jié)合ALCAM的公眾可獲得的抗體包括克隆18，來自AntigenixAmerica Inc.，紐約；克隆3A6，來自Ancell公司，明尼蘇達(dá)；克隆j3-119，來自Chromaprobe有限公司，加利福利亞；克隆L50，來自CaltagLaboratories有限公司，加州；目錄號AF656的產(chǎn)品，來自R&D Systems有限公司，明尼蘇達(dá)；和目錄號為sc-8548和sc-8549的產(chǎn)品，來自SantaCruz Biotechnology，加州，這些列舉于Linscott氏免疫學(xué)和生物學(xué)試劑字典(ISSN0740-7394)中。
現(xiàn)需要的是非黑素瘤癌癥細(xì)胞表面的新靶標(biāo)，這些靶可通過特異識別這些非黑素瘤癌癥細(xì)胞表面靶的抗體和其它藥劑用于治療這些癌癥?；诒疚乃嫉陌l(fā)現(xiàn)內(nèi)容，另外還需要特異識別細(xì)胞表面靶的新抗體和其它藥劑，這些抗體和藥劑可調(diào)節(jié)，即降低或增強(qiáng)新發(fā)現(xiàn)的ALCAM的新血管形成活性。
發(fā)明概述本文公布的發(fā)明涉及如下發(fā)現(xiàn)除轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤之外，已知抗原ALCAM還存在于多種人類原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥中，以及抗ALCAM抗體可用于治療這些癌癥。此外，本發(fā)明還提供了ALCAM激動劑和拮抗劑以調(diào)節(jié)新血管形成。
一方面，本發(fā)明涉及包含與癌癥細(xì)胞上呈遞的ALCAM結(jié)合的抗ALCAM抗體的組合物。在優(yōu)選的實施方案中，癌癥細(xì)胞選自卵巢、肺、前列腺、胰腺、結(jié)腸和乳房的癌細(xì)胞。在某些實施方案中，所說的癌癥細(xì)胞是分離的。在某些實施方案中，癌癥細(xì)胞存在于生物學(xué)樣品中。一般而言，生物學(xué)樣品來自個體，諸如人。在某些實施方案中，將抗ALCAM抗體與治療劑或可檢測標(biāo)記連接。
在一些實施方案中，本發(fā)明涉及由宿主細(xì)胞(ATCC PTA-4478)或其子代細(xì)胞所產(chǎn)生的抗ALCAM抗體mKID2。
另一方面，本發(fā)明涉及抗ALCAM抗體或競爭性抑制抗ALCAM抗體與ALCAM的優(yōu)先結(jié)合的多肽(可以是抗體或非抗體)。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或多肽(可以是抗體或非抗體)優(yōu)先結(jié)合的ALCAM表位與別的抗ALCAM抗體與ALCAM結(jié)合的表位相同或不同。
另一方面，本發(fā)明涉及包含抗ALCAM抗體的片段或區(qū)域的抗體。在一實施方案中，所說的片段是抗體的輕鏈。在另一實施方案中，所說的片段是抗體的重鏈。在又一實施方案中，所說的片段包含來自抗體輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。在另一實施方案中，所說的片段包含來自抗體輕鏈和/或重鏈的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)。
另一方面，本發(fā)明提供了包含以下之任一在內(nèi)的多肽(可以是抗體或非抗體)a)來自抗ALCAM抗體輕鏈或重鏈的一個或多個CDR(或其片段)；b)來自抗ALCAM抗體輕鏈的三個CDR；c)來自抗ALCAM抗體重鏈的三個CDR；d)來自抗ALCAM抗體輕鏈的三個CDR和來自其重鏈的三個CDR；e)抗ALCAM抗體的輕鏈可變區(qū)；f)抗ALCAM抗體的重鏈可變區(qū)。
另一方面，本發(fā)明是人源化的抗體。在某些實施方案中，所說的人源化抗體包含非人抗ALCAM抗體的一個或多個CDR。在某些實施方案中，人源化抗體所結(jié)合的表位與其它抗ALCAM抗體結(jié)合的表位相同或不同。一般而言，本發(fā)明的人源化抗體包含衍生自原先非人抗ALCAM抗體的CDR和/或與此CDR相同的一個或多個(1、2、3、4、5、6個或其片段)CDR。在某些實施方案中，此人抗體與其它抗ALCAM抗體結(jié)合相同或不同表位。另一方面，本發(fā)明是包含衍生自非人抗ALCAM抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的可變區(qū)域及衍生自人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)的恒定區(qū)域的嵌合抗體。
另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生單克隆抗體mKID2的宿主細(xì)胞(ATCCNO.PTA-4478)。
另一方面，本發(fā)明是編碼保藏號為ATCC PTA-4478的宿主細(xì)胞或其后代所產(chǎn)生的抗體mKID2的分離多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述任何抗體(包括抗體片段)以及其它任何多肽的多核苷酸。
另一方面，本發(fā)明是含有本文所述任何多肽(包括本文所述任何抗體)或多核苷酸以及藥用可接受賦形劑的藥物組合物，諸如包含與化學(xué)治療劑連接的抗ALCAM抗體、含抗ALCAM抗體片段的抗體、非人抗ALCAM抗體的人源化抗體、含來自非人抗ALCAM抗體可變區(qū)的可變區(qū)域和衍生自人抗體恒定區(qū)的恒定區(qū)域的嵌合抗體、或具有非人抗ALCAM抗體的一個或多個特性的人抗體、或與化學(xué)治療劑(如放射性部分)連接的任何本文所述抗ALCAM抗體、以及藥用可接受賦形劑的藥物組合物。
另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生抗體mKID2的方法，包括在允許抗體mKID2產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞(ATCC NO.PTA-4478)或其后代，并純化抗體mKID2。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本文所述的任何抗體(或多肽)的方法，即通過在合適的細(xì)胞中表達(dá)編碼抗體的一個或多個多核苷酸(可作為單一的輕鏈或重鏈獨立表達(dá)，或輕鏈和重鏈都表達(dá)自一個載體)，隨后通常回收和/或分離目的抗體或多肽。
另一方面，本發(fā)明是用于診斷個體是否患癌癥的方法，包括測定來自個體的選定細(xì)胞上是否有ALCAM的表達(dá)，其中ALCAM在所說細(xì)胞上的表達(dá)是所述癌癥的指示標(biāo)志。在一些實施方案，ALCAM的表達(dá)使用抗ALCAM抗體確定。在某些實施方案中，該方法包括檢測細(xì)胞的ALCAM表達(dá)水平。術(shù)語“檢測”用于此處包括在參考或不參考對照的條件下進(jìn)行定性和/或定量檢測(測量水平)。
另一方面，本發(fā)明是用于診斷個體是否患卵巢癌的方法，包括測定個體的卵巢細(xì)胞上是否有ALCAM的表達(dá)，其中在所述細(xì)胞上ALCAM的表達(dá)是所說癌癥的指示標(biāo)志。在某些實施方案中，用抗ALCAM抗體測定ALCAM的表達(dá)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是mKID2。在某些實施方案中，該方法包括檢測細(xì)胞表達(dá)ALCAM的水平。術(shù)語“檢測”用于此處包括在參考或不參考對照的條件下進(jìn)行定性和/或定量檢測(測量水平)。
另一方面，本發(fā)明是用于診斷個體是否患肺癌的方法，包括測定個體的肺細(xì)胞上是否有ALCAM的表達(dá)，其中在所述細(xì)胞上ALCAM的表達(dá)是所說癌癥的指示標(biāo)志。在某些實施方案中，用抗ALCAM抗體測定ALCAM的表達(dá)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是mKID2。在某些實施方案中，該方法包括檢測細(xì)胞表達(dá)ALCAM的水平。
另一方面，本發(fā)明是用于診斷個體是否患前列腺癌的方法，包括測定個體的前列腺細(xì)胞上是否有ALCAM的表達(dá)，其中在所述細(xì)胞上ALCAM的表達(dá)是所說癌癥的指示標(biāo)志。在某些實施方案中，用抗ALCAM抗體測定ALCAM的表達(dá)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是mKID2。在某些實施方案中，該方法包括檢測細(xì)胞表達(dá)ALCAM的水平。
另一方面，本發(fā)明是用于診斷個體是否患胰腺癌的方法，包括測定個體的胰腺細(xì)胞上是否有ALCAM的表達(dá)，其中在所述細(xì)胞上ALCAM的表達(dá)是所說癌癥的指示標(biāo)志。在某些實施方案中，用抗ALCAM抗體測定ALCAM的表達(dá)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是mKID2。在某些實施方案中，該方法包括檢測細(xì)胞表達(dá)ALCAM的水平。
另一方面，本發(fā)明是用于診斷個體是否患結(jié)腸癌的方法，包括測定個體的結(jié)腸細(xì)胞上是否有ALCAM的表達(dá)，其中在所述細(xì)胞上ALCAM的表達(dá)是所說癌癥的指示標(biāo)志。在某些實施方案中，用抗ALCAM抗體測定ALCAM的表達(dá)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是mKID2。在某些實施方案中，該方法包括檢測細(xì)胞表達(dá)ALCAM的水平。
另一方面，本發(fā)明是用于診斷個體是否患乳癌的方法，包括測定個體的乳房細(xì)胞上是否有ALCAM的表達(dá)，其中在所述細(xì)胞上ALCAM的表達(dá)是所說癌癥的指示標(biāo)志。在某些實施方案中，用抗ALCAM抗體測定ALCAM的表達(dá)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是mKID2。在某些實施方案中，該方法包括檢測細(xì)胞表達(dá)ALCAM的水平。
另一方面，本發(fā)明是用于幫助診斷個體是否患癌癥(諸如但不局限于卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或乳癌)的方法，包括測定在來自個體的生物學(xué)樣品中ALCAM的表達(dá)。在某些實施方案中，用抗ALCAM抗體測定ALCAM的表達(dá)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是mKID2。在某些實施方案中，該方法為檢測細(xì)胞表達(dá)ALCAM的水平。
在又一方面，本發(fā)明是在個體中將化學(xué)治療劑投遞至癌癥細(xì)胞處的方法，包括對個體施用有效量的含有與化學(xué)治療劑締合(包括連接)的抗ALCAM抗體的組合物。在某些實施方案中，癌癥細(xì)胞是(但不局限于)卵巢、前列腺、胰腺、肺、結(jié)腸或乳房的癌細(xì)胞。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是衍生自mKID2的人源化抗體(通常，但不是必要的，包含抗體mKID2的一個或多個部分或完整的CDR)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是具有抗體mKID2的一種或多種特性的人抗體。在某些實施方案中，化學(xué)治療劑(諸如毒素或放射性分子)被遞送入卵巢癌細(xì)胞內(nèi)(被內(nèi)在化)。在某些實施方案中，該化學(xué)治療劑是皂草素。
另一方面，本發(fā)明是治療個體所患癌癥的方法，包括對個體施用有效量的含有與化學(xué)治療劑締合(包括連接)的抗ALCAM抗體的組合物。在某些實施方案中，癌癥選自，但不局限于卵巢、前列腺、胰腺、肺、結(jié)腸和乳房的癌癥。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是衍生自mKID2的人源化抗體(通常，但不是必要的，包含抗體mKID2的一個或多個CDR)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是具有抗體mKID2的一種或多種特性的人抗體。在某些實施方案中，被治療的癌癥是卵巢癌，而化學(xué)治療劑(諸如毒素或放射性分子)被遞送入卵巢癌細(xì)胞內(nèi)(被內(nèi)在化)。在某些實施方案中，該化學(xué)治療劑是皂草素。
在另一方面，本發(fā)明是抑制體外或個體內(nèi)癌細(xì)胞生長和/或增殖的方法，包括將有效量的含有與化學(xué)治療劑締合(包括連接)的抗ALCAM抗體的組合物施用于細(xì)胞培養(yǎng)物或樣品或個體。在某些實施方案中，癌細(xì)胞是(但不局限于)卵巢、前列腺、胰腺、肺、結(jié)腸或乳房的癌細(xì)胞。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是衍生自mKID2的人源化抗體(通常，但不是必要的，包含抗體mKID2的一個或多個部分或完整的CDR)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是具有抗體mKID2的一種或多種特性的人抗體。在某些實施方案中，癌細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞，且化學(xué)治療劑(諸如毒素或放射性分子)被遞送入卵巢癌細(xì)胞內(nèi)(被內(nèi)在化)。在某些實施方案中，該化學(xué)治療劑是皂草素。
在另一方面，本發(fā)明是延遲患癌癥的個體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生的方法，包括對個體施用有效量的含有與化學(xué)治療劑締合(包括連接)的抗ALCAM抗體的組合物。在某些實施方案中，癌癥是卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳癌。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是衍生自mKID2的人源化抗體(通常，但不是必要的，包含抗體mKID2的一個或多個CDR)。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是具有抗體mKID2的一種或多種特性的人抗體。在某些實施方案中，所述癌癥是卵巢癌，而化學(xué)治療劑(諸如毒素或放射性分子)被遞送入了卵巢癌細(xì)胞內(nèi)(被內(nèi)在化)。在某些實施方案中，該化學(xué)治療劑是皂草素。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過增強(qiáng)或降低的方式來調(diào)節(jié)ALCAM與細(xì)胞質(zhì)信號配偶體(Partner)締合的方法。通過使呈遞于細(xì)胞表面的ALCAM分子接觸可以調(diào)節(jié)信號配偶體與ALCAM的結(jié)合的藥劑，能影響ALCAM與細(xì)胞質(zhì)信號配偶體的締合。阻斷或減少ALCAM與其結(jié)合配偶體和/或信號配偶體締合的藥劑可用于調(diào)節(jié)ALCAM介導(dǎo)的新血管形成中所涉及的生物學(xué)和病理學(xué)過程。涉及此作用的病理學(xué)過程包括與腫瘤相關(guān)的血管生長。
可檢測藥劑阻斷、減少、增強(qiáng)或以其它方式調(diào)節(jié)ALCAM與抗ALCAM抗體或CD6之類結(jié)合配偶體締合的能力。具體而言，通過將含ALCAM相互作用位點(通常為存在于完整活細(xì)胞上的其天然構(gòu)象形式)的肽與結(jié)合配偶體和待測藥劑一起溫育并測定待測藥劑是否減少或增強(qiáng)了結(jié)合配偶體與ALCAM肽的結(jié)合，從而可以檢測藥劑調(diào)控這些相互作用的能力。激動劑、拮抗劑和其它調(diào)制劑是特別預(yù)期的。
在另一方面，本發(fā)明是促進(jìn)體外或個體內(nèi)血管產(chǎn)生的方法，包括將有效量的含有抗ALCAM藥劑的組合物施用于個體。
在另一方面，本發(fā)明是促進(jìn)體外或個體內(nèi)血管產(chǎn)生的方法，包括將有效量的含有抗ALCAM抗體的組合物施用于個體。
在另一方面，本發(fā)明是抑制體外或個體內(nèi)血管產(chǎn)生的方法，包括將有效量的含有抗ALCAM拮抗劑的組合物施用于個體。
在另一方面，本發(fā)明是抑制體外或個體內(nèi)血管產(chǎn)生的方法，包括將有效量的含有拮抗性抗ALCAM抗體的組合物施用于個體。
在另一方面，本發(fā)明是促進(jìn)新血管形成的組合物，其中包含可以與非內(nèi)皮細(xì)胞上的ALCAM結(jié)合的藥劑。
在另一方面，本發(fā)明是抑制新血管形成的組合物，其中包含可以與非內(nèi)皮細(xì)胞上的ALCAM結(jié)合的拮抗劑。
在另一方面，本發(fā)明是促進(jìn)新血管形成的組合物，其中包含可以與非內(nèi)皮細(xì)胞上的ALCAM結(jié)合的抗體。
在另一方面，本發(fā)明是抑制新血管形成的組合物，其中包含可以與非內(nèi)皮細(xì)胞上的ALCAM結(jié)合的拮抗性抗體。
在另一方面，本發(fā)明是抑制體外或個體內(nèi)血管產(chǎn)生的方法，包括將有效量的含有對抗新血管形成促進(jìn)分子的抗體的組合物施用于個體。
在另一方面，本發(fā)明是促進(jìn)體外或個體內(nèi)血管產(chǎn)生的方法，包括將有效量的含有至少一種新血管形成促進(jìn)分子的組合物施用于個體。
附圖簡述本專利或申請文件包含至少一幅彩圖。在提出要求并且交付必要的費用后，本專利局可提供帶彩圖的本專利或?qū)＠暾埑霭嫖锏膹?fù)印件。


圖1顯示了抗ALCAM單克隆抗體2D4與9種不同的胰腺癌細(xì)胞系結(jié)合的矩形圖。用熒光激活細(xì)胞分選儀將各細(xì)胞系中的細(xì)胞進(jìn)行分選。在各矩形圖中，灰色填充的曲線代表在無一抗的情況下抗人IgG Fc與各個細(xì)胞系的非特異性結(jié)合。黑色曲線是抗ALCAM與各個胰腺癌細(xì)胞系結(jié)合的矩形圖。
圖2是顯示移植了Rav9926細(xì)胞的裸鼠(移植在腎囊下)的血管形成的照片，Rav9926是一種專利人胰腺腫瘤細(xì)胞系。圖2A和2B是注射了賦形劑的對照小鼠腎囊的照片。圖2C和2D是注射了抗ALCAM抗體克隆2D4的小鼠腎囊照片。
圖3是顯示mKID2和MAb-ZAP(與皂草素綴合的抗IgG)對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長的影響的曲線圖。
圖4是顯示mKID2(濃度為1μg/ml、10μg/ml和20μg/ml)和MAb-ZAP對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長的影響的曲線圖。
發(fā)明詳述本文所公布的發(fā)明涉及抗原ALCAM存在于多種人類癌癥中的有關(guān)發(fā)現(xiàn)，所述癌癥包括但不局限于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳癌。本發(fā)明提供了與ALCAM結(jié)合的抗體和多肽，以及制備和利用這些抗體和多肽診斷所說癌癥并治療這些癌癥的方法。已發(fā)現(xiàn)抗ALCAM抗體通過與呈遞于細(xì)胞表面的ALCAM結(jié)合并導(dǎo)致治療劑內(nèi)化進(jìn)入癌細(xì)胞，可以抑制癌細(xì)胞在體外的生長。
I.一般技術(shù)除非另外提及，本發(fā)明的實施將應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生化和免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻(xiàn)中進(jìn)行了充分的說明，如，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Mannual)，第二版(Sambrook等，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait編輯，1984)；分子生物學(xué)中的方法(Methods in MolecularBiology)，Humana出版社；細(xì)胞生物學(xué)實驗室手冊(Cell BiologyALaboratory Notebook)(J.E.Cellis編輯，1998)，學(xué)術(shù)出版社；動物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney編輯，1987)；細(xì)胞和組織培養(yǎng)入門(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum出版社；細(xì)胞和組織培養(yǎng)實驗室方法(Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures)(A.Doyle，J.B.Griffiths，和D.G.Newell編輯，1993-8)J.Wiley and Sons；酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)(Academic Press，Inc.)；實驗免疫學(xué)手冊(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯)；哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos編輯，1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M Ausubel等編，1987)；PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR(The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis等編輯，1994)；免疫學(xué)通用方法(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等編輯，1991)；分子生物學(xué)簡略方法(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)；免疫生物學(xué)(Immunobiology)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗體(Antibodies)(P.Finch，1997)；抗體應(yīng)用方法(Antibodiesa practical approach)(D.Catty編輯，IRL出版社，1988-1989)；單克隆抗體應(yīng)用方法(Monoclonal antibodiesa practical approach)(P.Shepherd和C.Dean編輯，牛津大學(xué)出版社，2000)；應(yīng)用抗體實驗室手冊(Usingantibodiesa laboratory manual)(E.Harlow和D.Lane，冷泉港實驗室出版社，1999)；抗體(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra編輯，HarwoodAcademic Publishers，1995)；和癌癥腫瘤學(xué)原理和實踐(CancerPrinciples and Practice of Oncology)(V.T.DeVita等編輯，J.B.Lippincott公司，1993)。
II.定義“抗體”是能通過位于免疫球蛋白分子可變區(qū)內(nèi)的至少一個抗原識別位點特異識別諸如多肽之類靶標(biāo)的免疫球蛋白分子。用于本文時，此術(shù)語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(ScFv)、天然存在的變體、包含具有所需特異性的抗原識別位點的抗體部分在內(nèi)的融合蛋白質(zhì)、諸如人源化抗體之類的嵌合抗體、以及包含具有所需特異性的抗原識別位點在內(nèi)的任何其它修飾構(gòu)型的免疫球蛋白分子。
“單克隆抗體”指可以包括天然變體的基本上同質(zhì)的抗體群，其中的單克隆抗體是由涉及抗原的選擇性結(jié)合的氨基酸(天然存在和非天然存在的)組成的。單克隆抗體是高度特異性的，定向于單一的抗原位點。該術(shù)語并不限制抗體的來源或其制備方式(如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組體表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)，等等)。該術(shù)語包括上文“抗體”定義下的完整免疫球蛋白以及片段等。
“人源化抗體”指通常用重組技術(shù)制備的一種嵌合分子，它包含非人可變區(qū)和人恒定區(qū)。這樣就消除了在人體內(nèi)作為免疫原的恒定區(qū)，但仍保留了對外源可變區(qū)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的可能性(LoBuglio，A.F.等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 864220-4224)。另一種方法不僅著手于提供來源于人的恒定區(qū)，還對可變區(qū)進(jìn)行修飾以便將它們改造得盡可能接近人的形式。已知重鏈和輕鏈可變區(qū)均包含隨應(yīng)答的目標(biāo)抗原不同而變化的并決定結(jié)合能力的三個互補決定區(qū)(CDR)，CDR的兩側(cè)是在給定物種中相對保守并被認(rèn)為為CDR提供了腳手架的四個構(gòu)架區(qū)(FR)。在制備針對特定抗原的非人抗體時，通過將來源于非人抗體的CDR移植至待修飾的人抗體的FR上可“改形(reshape)”或“人源化”可變區(qū)。將此方法應(yīng)用于多種抗體中的有關(guān)報道參閱以下文獻(xiàn)Sato，K.等，(1993)Cancer Res 53851-856；Riechmann，L.等，(1988)Nature 332323-327；Verhoeyen，M.等，(1988)Science 2391534-1536；Kettleborough，C.A.等，(1991)Protein Engineering 4773-3783；Maeda，H.等，(1991)HumanAntibodies Hybridoma 2124-134；Gorman，S.D.等(1991)Proc Natl AcadSci USA 884181-4185；Tempest，P.R.等，(1991)Bio/Technology 9266-271；Co，M.S.等，(1991)Proc Natl Acad Sci USA 882869-2873；Carter，P.等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 894285-4289；和Co，M.S.等，(1992)J Immunol 1481149-1154。在某些實施方案中，人源化抗體保持了所有CDR序列(例如，包含所有六個來自小鼠抗體的CDR的人源化小鼠抗體)。在其它實施方案中，人源化抗體具有相應(yīng)于原先抗體有所改變的一個或多個CDR(1、2、3、4、5、6個)，它們也被稱為“衍生自”原先抗體的一個或多個CDR的一個或多個CDR。
與抗體或多肽“特異結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”(在此可交換使用)的表位是一個本領(lǐng)域通曉的術(shù)語，而測定這些特異或優(yōu)先結(jié)合的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。如果，某分子與特定細(xì)胞或底物的反應(yīng)或結(jié)合相對于該分子與其它細(xì)胞或底物的反應(yīng)或結(jié)合更頻繁、更迅速、持續(xù)時間更長且/或具有更高的親和力，那么此分子就被稱為呈現(xiàn)了“特異結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”。如果相對于與其它底物的結(jié)合而言，抗體與靶的結(jié)合具有更高的親和性、親合力、更容易且/或持續(xù)時間更長，那么該抗體就是“特異結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”所說的靶。例如，特異或優(yōu)先結(jié)合某ALCAM表位的抗體是相對于此抗體與其它ALCAM表位或非ALCAM表位的結(jié)合而言，與此ALCAM表位結(jié)合時親和性、親合力更高、更容易且/或持續(xù)時間更長的抗體。閱讀此定義時也應(yīng)理解，例如，與第一靶特異或優(yōu)先結(jié)合的抗體(或部分或表位)可能會或可能不會與第二靶特異或優(yōu)先結(jié)合。因此，“特異結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”并非一定要求(盡管它可以包括)是唯一的結(jié)合。一般而言，但不是必定的，提及結(jié)合時是指優(yōu)先的結(jié)合。
用于本文中時，術(shù)語“mKID2”、“抗體mKID2”和“單克隆抗體mKID2”可互換用于指保藏號為ATCC No.PTA-4478的宿主細(xì)胞或其后代所產(chǎn)生的免疫球蛋白。
抗ALCAM抗體與不同的生物學(xué)功能有關(guān)，包括但不局限于，結(jié)合ALCAM的能力(包括癌細(xì)胞上的ALCAM，包括但不局限于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞上的ALCAM)、在體外或體內(nèi)與暴露于活細(xì)胞表面的ALCAM的部分結(jié)合的能力、運送化學(xué)治療劑至表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞(如卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞)的能力、將治療劑或可檢測標(biāo)記運送入表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞(諸如卵巢癌細(xì)胞)內(nèi)的能力。正如本文所討論的，本發(fā)明的多肽(包括抗體)可以具有這些特征中的任一個或多個。
“抗ALCAM等價抗體”或“抗ALCAM等價多肽”指具有與抗ALCAM抗體有關(guān)的一種或多種生物學(xué)功能，諸如，結(jié)合特異性的抗體或多肽。
術(shù)語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在此可互換用于指任何長度的氨基酸聚合物。所說的聚合物可以是線性的或有分支的，它可以包含已修飾的氨基酸，且可以被非氨基酸所中斷。這些術(shù)語還包括已天然修飾或人工修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵的形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其它操作或修飾，諸如與標(biāo)記組分綴合。還包括在此定義范圍內(nèi)的是，例如，含一種或多種氨基酸類似物(包括，例如，非天然的氨基酸，等等)以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。可以理解，因為本發(fā)明的多肽是以抗體為基礎(chǔ)的，所以這樣的多肽可作為單鏈或締合的鏈存在。
在一實施方案中，藥物組合物的“有效量”是指足以產(chǎn)生有益或期望結(jié)果的量，所述結(jié)果包括但不局限于以下臨床結(jié)果例如，使腫瘤的尺寸減小、阻滯癌細(xì)胞的生長、延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生、減少疾病產(chǎn)生的癥狀、提高疾病患者的生活質(zhì)量、降低治療該疾病所需的其它藥物的劑量、通過諸如定向和/或內(nèi)在化方式增強(qiáng)其它藥物的效用、延遲疾病的發(fā)展、和/或延長患有與癌癥相關(guān)的嚴(yán)重疾病的患者的存活期。在另一實施方案中，有效量是指在用ALCAM激動劑或拮抗劑治療時足以調(diào)節(jié)(促進(jìn)或抑制)新血管形成的量。有效量可以一次或分次施用。對于本發(fā)明的目的而言，藥物組合物的有效量是指足以直接或間接減少(或破壞)癌細(xì)胞的增殖以及減緩和/或延遲癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移發(fā)生的量。在某些實施方案中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以與或可以不與其它藥物、化合物或藥物組合物聯(lián)合達(dá)到。因此，可以在施用一種或多種化學(xué)治療劑的背景下考慮“有效量”，并且對于單個的藥劑，如果在與一種或多種其它藥劑聯(lián)合的情況下，可能達(dá)到或會達(dá)到期望的效果，則可以認(rèn)為以有效量施用該單個藥劑。盡管個體需要不同，但確定每一組分有效量的最適范圍是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范疇的內(nèi)容。典型的劑量包括0.1-100mg/kg體重。優(yōu)選的劑量包括1-100mg/kg體重。最優(yōu)選的劑量包括10-100mg/kg體重。
用于本文時，“治療”或“處理”是指用于獲得有益的或期望的效果的方法，所說的效果包括并優(yōu)選為臨床效果。就本發(fā)明的目的而言，有益的或期望的臨床效果包括，但不局限于，以下一種或多種減少癌細(xì)胞或其它疾病細(xì)胞的增殖(或消滅它們)、減少癌癥中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、使腫瘤的尺寸減小、減輕疾病產(chǎn)生的癥狀、提高疾病患者的生活質(zhì)量、降低治療該疾病所需的其它藥物的劑量、延遲疾病的發(fā)展、和/或延長癌癥患者的存活期。
用于本文時，“延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生”指推遲、阻礙、減緩、推后、穩(wěn)定和/或延遲瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。此延遲的時間長度可以變化，取決于癌癥和/或待治療個體的病史。事實上，正如對本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員來說顯而易見的，足夠或顯著的延遲可以包含預(yù)防，即個體不發(fā)生瘤轉(zhuǎn)移。
“生物學(xué)樣品”包括來自個體并可用于診斷或監(jiān)測試驗的各種樣品。此定義包括血液和生物來源的其它液體樣品、諸如活組織檢查標(biāo)本之類的實體組織樣品或由其衍生的組織培養(yǎng)物或細(xì)胞及其后代，例如，從收集自疑似癌癥患者個體的組織樣品中獲得的細(xì)胞，優(yōu)選地來自卵巢、肺、前列腺、胰腺、結(jié)腸和乳房組織。術(shù)語“生物學(xué)樣品”既包括臨床樣品，還包括培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物流體和組織樣品。
于本文中，當(dāng)核酸分子、藥劑、抗體、組合物或細(xì)胞等基本上與其天然來源中的雜質(zhì)核酸分子、抗體、藥劑、組合物或細(xì)胞等分開時，我們說該核酸分子或藥劑、抗體、組合物或細(xì)胞等是“分離的”。
“個體”是指脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類。所說的哺乳動物包括但不局限于農(nóng)畜、運動型動物、寵物(如貓、狗、馬)、靈長類、小鼠和大鼠。
用于本文中時，“藥劑”指生物學(xué)、制藥學(xué)或化學(xué)化合物。舉例來說包括但不局限于簡單或復(fù)雜的有機(jī)或無機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物、抗體片段、維生素衍生物、碳水化合物、毒素或化學(xué)治療化合物。多種化合物可被合成，例如，小分子和寡聚體(如寡肽和寡核苷酸)，以及基于各種核心結(jié)構(gòu)合成的有機(jī)化合物。此外，可從多種天然來源，諸如植物或動物提取物，等等中篩選化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到，有關(guān)本發(fā)明藥劑的結(jié)構(gòu)性質(zhì)并不存在限制。
應(yīng)用于本發(fā)明方法中的藥劑可以隨機(jī)挑選或理性的進(jìn)行選擇或設(shè)計。于本文中，未考慮ALCAM與其天然配偶體或已知抗體結(jié)合中所涉及的特異序列而隨機(jī)挑選的藥劑被稱為是隨機(jī)選擇的。隨機(jī)選擇藥劑的例子是使用化學(xué)文庫或肽組合文庫。
本文中，考慮到藥劑作用的靶位點序列和/或其構(gòu)象而非隨機(jī)挑選的藥劑被認(rèn)為是理性選擇或設(shè)計的。就抗ALCAM藥劑而言，目前認(rèn)為在ALCAM上至少有三個可以引起抗體形成的表位，因此對于藥劑來說至少有三個阻斷ALCAM/抗ALCAM相互作用的作用位點。本發(fā)明還包括作用于ALCAM和其天然結(jié)合配偶體間相互作用位點處的藥劑，通常已知的天然結(jié)合配偶體為CD6(其它天然配體和它們的活性ALCAM相互作用位點也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，不管是目前已知的或以后確定的)。利用組成受體/配體對和/或ALCAM/抗ALCAM抗體對的接觸位點的肽序列可理性的選擇或設(shè)計藥劑。例如，理性選擇的肽藥劑可以是其氨基酸序列與在ALCAM的天然環(huán)境中暴露于活細(xì)胞表面的ALCAM上所呈現(xiàn)的表位一致的肽。這樣的藥劑將通過與抗ALCAM抗體或CD6的結(jié)合而減少或阻斷ALCAM抗體與ALCAM的締合或ALCAM與CD6的締合。
用于本文中時，術(shù)語“標(biāo)記的”對于抗體而言包括通過偶聯(lián)(即物理連接)可檢測物質(zhì)對抗體進(jìn)行直接標(biāo)記，如將放射性試劑或熒光基團(tuán)(如異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE))偶聯(lián)到抗體上，和通過與可檢測物質(zhì)反應(yīng)間接標(biāo)記探針或抗體。
用于本文中時，術(shù)語“締合(association)”就抗體而言包括與藥劑(如化學(xué)治療劑)的共價和非共價附著或結(jié)合。抗體可以通過直接結(jié)合的方式與藥劑(如化學(xué)治療劑)締合，或通過附著于共同平臺上以間接結(jié)合的方式締合，這樣抗體可以指導(dǎo)藥劑定位于抗體所結(jié)合的癌細(xì)胞處，其中抗體和藥劑在生理條件下基本上不解離從而使得藥劑可以導(dǎo)向于與抗體結(jié)合的相同癌細(xì)胞或使得藥劑的效力不會降低。
III.抗ALCAM抗體的組合物本領(lǐng)域中存在特異于活化的白細(xì)胞粘附分子(ALCAM)的已知抗體，包括多克隆和單克隆抗體。至2002年四月為止，公眾可獲得的抗ALCAM抗體可來自R&D System，Inc.；克隆18，來自Antigenix America Inc.，紐約；克隆3A6，來自Ancell公司，明尼蘇達(dá)；克隆j3-119，來自Chromaprobe有限公司，加州；克隆L50，來自Caltag Laboratories有限公司，加州；目錄號AF656的產(chǎn)品，來自R&D Systems有限公司，明尼蘇達(dá)； (這些列舉于Linscott氏免疫學(xué)和生物學(xué)試劑字典(ISSN0740-7394)中)，以及多克隆抗體，來自Santa Cruz Biotechnology。這些抗體可以購買到，或抗原ALCAM可以購買到或通過常規(guī)方法獲得并用作免疫原來產(chǎn)生別的抗ALCAM抗體。利用表達(dá)ALCAM的細(xì)胞作為免疫原的技術(shù)在下文中有進(jìn)一步的詳述。
本發(fā)明還包括組合物，包括藥物組合物，其中包含抗ALCAM抗體、衍生自抗ALCAM抗體的多肽、含抗ALCAM抗體編碼序列的多核苷酸和本文所述的其它藥劑?？贵wmKID2是適用于本發(fā)明實踐中的抗ALCAM抗體。它產(chǎn)生自2002年6月21日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801University Blvd.，Manassas VA 20110-2209)的雜交瘤，該雜交瘤的保藏編號為PTA-4478。用于本文中時，組合物還包含可以與ALCAM結(jié)合的一種或多種抗體、多肽和/或蛋白質(zhì)，以及/或含有編碼可以與ALCAM結(jié)合的一種或多種抗體、多肽和/或蛋白質(zhì)的序列的一種或多種多核苷酸。正如下文所進(jìn)一步論述的，本發(fā)明的組合物還包括可以增加或減少ALCAM介導(dǎo)的新血管形成的藥劑。不局限于任何特殊的作用機(jī)制，這些新血管形成調(diào)制劑可直接作用于ALCAM或作用于其天然的或誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)合配偶體。依照本發(fā)明的教導(dǎo)，CD6是已知的結(jié)合配偶體的一個例子，它適于用增加和減少ALCAM所介導(dǎo)的新血管形成的藥劑進(jìn)行調(diào)節(jié)。在本發(fā)明實踐中可利用具有本文所述的期望特征的抗CD6抗體。
除了藥理學(xué)活性劑外，本發(fā)明的組合物還可包含合適的可藥用載體，包括本領(lǐng)域眾所周知的賦形劑和輔助劑，它將有利于將活性化合物加工成在制藥學(xué)上可用于向作用位點遞送的制劑。適于腸胃外投藥的適宜制劑包括水溶形式的活性化合物，例如水溶性鹽的水溶液。此外，當(dāng)適于油性注射懸浮液時還可施用活性化合物的懸浮液。合適的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射懸浮液可包含增加懸浮液粘性的物質(zhì)，包括，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。懸浮液還可任選地包含穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體也可用于將藥劑包囊化以便向細(xì)胞遞送。
依照本發(fā)明全身施用的藥用制劑可配制成腸道內(nèi)施用、腸道外施用或局部施用的形式。實際上，所有的三種制劑可同時施用以達(dá)到全身施用活性組分的目的。
適于口服的制劑包括硬的或軟的明膠膠囊、藥丸、片劑(包括包衣片劑)、酏劑、懸浮劑、糖漿或吸入劑和其控釋形式。
可以用以下任何標(biāo)準(zhǔn)(一條或多條)對本發(fā)明的抗體、藥劑、多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和表征(a)與ALCAM(包括癌細(xì)胞，包括但不局限于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞上的ALCAM)結(jié)合的能力；(b)競爭性抑制已知抗ALCAM抗體與ALCAM優(yōu)先結(jié)合的能力，包括優(yōu)先結(jié)合與原始抗體所優(yōu)先結(jié)合的ALCAM表位相同的表位的能力；(c)體外或體內(nèi)與暴露于活細(xì)胞表面的ALCAM部分結(jié)合的能力；(d)與暴露于活的癌細(xì)胞表面的ALCAM部分結(jié)合的能力，所述癌細(xì)胞諸如但不局限于，卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞；(e)將化學(xué)治療劑或可檢測標(biāo)記遞送至表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞(諸如但不局限于，卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞)的能力；(f)將治療劑遞送至表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞(諸如但不局限于卵巢癌細(xì)胞)的能力。
在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是ATCC PTA-4478的宿主細(xì)胞或其后代產(chǎn)生的抗體mKID2。本發(fā)明還包括各種mKID2制劑和等價的抗體或多肽片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、單鏈抗體(ScFv)、它們的突變體、含抗體一部分的融合蛋白、人源化抗體、和含有具有所需特異性的抗原(ALCAM)識別位點在內(nèi)的任何其它已修飾構(gòu)型的mKID2。本發(fā)明還提供展示出mKID2的一種或多種生物學(xué)特征的人抗體。可以用上述五個標(biāo)準(zhǔn)中的任一條或多條對mKID2的等價抗體(包括人源化抗體和人抗體)、mKID2的多肽片段和含這些片段之任一的多肽進(jìn)行鑒定和表征。
在某些實施方案中，與ALCAM結(jié)合的本發(fā)明抗體、多肽和蛋白質(zhì)是競爭性抑制mKID2與ALCAM優(yōu)先結(jié)合的抗體、多肽和蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，抗體、多肽和蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合ALCAM上與抗體mKID2所優(yōu)先結(jié)合的表位相同的表位。
因此，本發(fā)明提供以下任一物質(zhì)(或包含以下任一物質(zhì)的組合物，包括藥物組合物)(a)ATCC PTA-4478的宿主細(xì)胞或其后代產(chǎn)生的抗體mKID2；(b)人源化形式的抗體mKID2；(c)含抗體mKID2的一個或多個輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的抗體；(d)嵌合抗體，含有來自抗體mKID2重鏈和輕鏈可變區(qū)或與之同源的可變區(qū)以及來自人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)或與之同源的恒定區(qū)；(e)包含mKID2的一個或多個輕鏈和/或重鏈CDR(至少1、2、3、4、5或6個)的抗體；(f)含mKID2重鏈和/或輕鏈的抗體；(g)與mKID2等價的人抗體?？贵w的人源化形式可以具有或不具有與mKID2或ATCC PTA-4478宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體一致的CDR。CDR區(qū)域的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了含有至少一個CDR與mKID2或ATCC PTA-4478宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個CDR基本上同源(或，在某些實施方案中與mKID2的或衍生自mKID2的所有6個CDR基本上同源)的CDR的抗體。其它的實施方案包括具有至少2個、3個、4個、5個或6個CDR與mKID2的或衍生自mKID2的或ATCC PTA-4478宿主細(xì)胞所產(chǎn)生抗體的至少2個、3個、4個、5個或6個CDR基本上同源的抗體?？梢岳斫猓瑸榱诉_(dá)到本發(fā)明的目的，通常保留結(jié)合特異性和/或整體活性(該活性可以就如下而言遞送化學(xué)治療劑至或進(jìn)入癌細(xì)胞從而減緩癌細(xì)胞的生長和/或增殖、在癌細(xì)胞中誘發(fā)細(xì)胞程序死亡、延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生；以及/或緩解性治療)，盡管與mKID2相比活性程度可能有所變化(可能更高或更低)。本發(fā)明還提供了制備任何此類抗體的方法。制備抗體的方法是本領(lǐng)域所已知的且在本文中對其進(jìn)行了描述。
本發(fā)明還提供了含諸4如mKID2之類本發(fā)明抗體的氨基酸序列的多肽。在某些實施方案中，該多肽含有所說抗體的一個或多個輕鏈和/或重鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，該多肽含有所說抗體的一個或多個輕鏈和/或重鏈CDR。在某些實施方案中，該多肽含有所說抗體的輕鏈和/或重鏈的三個CDR。在某些實施方案中，該多肽含有具有以下任一片段的所說抗體的氨基酸序列原始抗體序列中的至少5個連續(xù)的氨基酸、至少8個連續(xù)的氨基酸、至少約10個連續(xù)的氨基酸、至少約15個連續(xù)的氨基酸、至少約20個連續(xù)的氨基酸、至少約25個連續(xù)的氨基酸、至少約30個連續(xù)的氨基酸，其中至少有3個氨基酸來自抗體的可變區(qū)。在某一實施方案中，可變區(qū)來自原始抗體輕鏈。在另一實施方案中，可變區(qū)來自抗體的重鏈。在另一實施方案中，有5個(或更多個)連續(xù)氨基酸來自抗體的互補決定區(qū)(CDR)。
IV.產(chǎn)生抗ALCAM抗體的方法制備抗ALCAM抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。通常，單克隆抗體產(chǎn)生于非人物種中，諸如小鼠。通過用免疫原性量的含有人ALCAM的細(xì)胞、細(xì)胞提取物或蛋白質(zhì)制品(如，人胸腺上皮細(xì)胞)免疫小鼠產(chǎn)生抗體?？蓪⒆鳛槊庖咴褂玫募?xì)胞在用作免疫原前先培養(yǎng)一段時間(至少24個小時)。細(xì)胞自身可用作免疫原，或可與諸如Ribi之類非變性佐劑聯(lián)合起來用作免疫原。一般而言，細(xì)胞在用作免疫原時應(yīng)保持完整且優(yōu)選有生存力。與破裂細(xì)胞內(nèi)的抗原相比，完整細(xì)胞可使抗原更好地被檢測到。變性佐劑或粗糙的佐劑(harsh adjuvant)，如弗氏佐劑的使用可能破裂細(xì)胞，因此并不鼓勵使用?？芍T如兩周一次或每周一次定期間隔多次施用免疫原，或可以用能維持其在動物體內(nèi)(如在組織重組體內(nèi))的生存能力的方式施用。雜交瘤可以例如，利用通常的體細(xì)胞雜交技術(shù)融合脾細(xì)胞和小鼠腫瘤配偶體而制備(Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497)。
作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一個選擇，可用EBV永生化的B細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體。如果需要，可將所說的雜交瘤擴(kuò)增和亞克隆，并用常規(guī)檢測方法(如，F(xiàn)ACS、IHC、放射免疫測定法、酶免疫測定法、熒光免疫測定法，等等)測定上清的抗免疫原活性。
或者，可通過重組方法制備抗體。制備重組抗體的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。單克隆抗體mKID2和任何其它等價抗體都可在體外測序并用重組方法產(chǎn)生。在一個實施方案中，對mKID2進(jìn)行測序，然后將多核苷酸序列克隆入用于表達(dá)或增殖的載體中。編碼目的抗體的序列可保持在宿主細(xì)胞內(nèi)的載體中，然后擴(kuò)增宿主細(xì)胞并將其凍存以備未來使用?；蛘?，可以用噬菌體展示技術(shù)制備重組抗體。參閱，例如，美國專利NO.5565332、5580717、5733743、6265150；以及Winter等，Annu.Rev.Immunol.(1994)12433-455。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的Edman降解法對抗體mKID2或任何其它目的抗體或目的蛋白進(jìn)行測序?？捎觅|(zhì)譜或Edman降解法產(chǎn)生的肽信息來設(shè)計探針或引物用于克隆目的蛋白。
克隆目的蛋白的另一種方法是用ALCAM“淘選”表達(dá)目的抗體或蛋白的細(xì)胞?！疤赃x”方法進(jìn)行如下從表達(dá)目的抗體或蛋白的組織或細(xì)胞獲取cDNA文庫，在另一種類型的細(xì)胞中過表達(dá)cDNA，篩選特異結(jié)合ALCAM的后一種類型的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在本領(lǐng)域中可找到通過“淘選”用于克隆編碼細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的哺乳動物基因的方法的有關(guān)詳述。參閱，例如，Aruffo，A.和Seed，B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，8573-8577(1987)和Stephan，J.等，Endocrinology 1405841-5854(1999)。
可按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法將來自特定細(xì)胞類型的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。具體而言，可按照Sambrook等人(引文同上)提出的方法用各種分解酶或化學(xué)溶液分離mRNA或按照制造商(如，Qiagen，Invitrogen，Promega)提供的附屬說明書通過商品化的核酸結(jié)合樹脂提取mRNA。然后將合成的cDNA引入表達(dá)載體中從而在另一種類型的細(xì)胞中產(chǎn)生目的抗體或蛋白。這就意味著表達(dá)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)必須是可復(fù)制的，或者作為附加體或者作為染色體DNA的一部分存在。合適的表達(dá)載體包括但不局限于質(zhì)粒、病毒載體，包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及粘粒。
可用許多合適方法中的任一種將含目的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞中，包括電穿孔；利用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂轉(zhuǎn)染法；和感染(如，在載體為諸如痘苗病毒之類的感染劑的情況下)。對引入載體或多核苷酸的方法的選擇將常常取決于宿主細(xì)胞的性質(zhì)。
任何能過表達(dá)異源DNA的宿主細(xì)胞都可用于分離編碼目的抗體、多肽或蛋白的基因。非局限性的哺乳動物宿主細(xì)胞例子包括但不限于COS、HeLa和CHO細(xì)胞。優(yōu)選的，宿主細(xì)胞中cDNA的表達(dá)水平比宿主細(xì)胞中相應(yīng)內(nèi)源性目的抗體或蛋白(如果有的話)的表達(dá)水平高約5倍，更優(yōu)選高10倍，還更優(yōu)選高20倍?？梢杂妹庖邫z測法或FACS篩選特異結(jié)合ALCAM的宿主細(xì)胞。過表達(dá)目的抗體或蛋白的細(xì)胞可被鑒別。
本發(fā)明包括含本發(fā)明抗體如mKID2的氨基酸序列的多肽。可用本領(lǐng)域已知的方法制備本發(fā)明的多肽。可用如上所述的重組方法(即，單一的多肽或融合多肽)或化學(xué)合成法或通過抗體的蛋白水解或其它降解方式產(chǎn)生多肽?？贵w的多肽，尤其是長度不超過約50個氨基酸的較短多肽可通過化學(xué)合成方便的制備。化學(xué)合成法是本領(lǐng)域已知的且已商品化。例如，可應(yīng)用固相方法通過自動多肽合成儀生產(chǎn)mKID2多肽。
本發(fā)明還包括諸如mKID2之類的本發(fā)明抗體的單鏈可變區(qū)片段(“scFv”)。通過用短的連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變區(qū)可以制備單鏈可變區(qū)片段。Bird等(1988)Science242423-426。連接肽的例子是(GGGGS)3(SEQ ID NO1)，它在一個可變區(qū)的羧基末端和另一個可變區(qū)的氨基末端間架設(shè)一約3.5nm的橋梁。還有其它序列的接頭也已被設(shè)計并應(yīng)用。Bird等(1988)。接頭還可反過來被修飾以獲得附加的功能，諸如與藥物附著或與固相支持物附著。單鏈變體可通過重組或合成方式產(chǎn)生。為了進(jìn)行scFv的合成生產(chǎn)，可使用自動合成儀。為了進(jìn)行scFv的重組生產(chǎn)，可將含有編碼scFv的多核苷酸的合適質(zhì)粒引入合適的宿主細(xì)胞，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞等真核細(xì)胞或諸如大腸桿菌之類的原核細(xì)胞?？赏ㄟ^諸如多核苷酸連接之類的常規(guī)操作制備編碼目的scFv的多核苷酸。所產(chǎn)生的scFv可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)進(jìn)行分離。
本發(fā)明包括對抗體進(jìn)行的修飾，諸如對抗體mKID2和其它抗ALCAM抗體的修飾，包括未顯著影響其特性的功能上同等的抗體和多肽以及活性增強(qiáng)或降低的變體。對多肽進(jìn)行修飾在本領(lǐng)域中是常規(guī)的實驗，在此不必詳述。經(jīng)修飾的多肽的例子包括其中具有氨基酸殘基保守性替代、缺失或添加了一個或多個氨基酸卻未使其功能活性有顯著不利變化，或應(yīng)用了化學(xué)類似物的多肽。可保守性替代成另一氨基酸的氨基酸殘基包括但不局限于甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化的多肽，以及經(jīng)其它翻譯后修飾的多肽，諸如，用不同的糖進(jìn)行糖基化、乙?；土姿峄?yōu)選的，氨基酸替代是保守性的，即，用于替代的氨基酸具有與原來的氨基酸相似的化學(xué)特性。這樣的保守性替代是本領(lǐng)域所已知的，上文已提供了其實例。氨基酸修飾的涵蓋范疇可以包括從改變或修飾一個或多個氨基酸到完全重新設(shè)計某區(qū)域，如可變區(qū)?？勺儏^(qū)中的變化可改變結(jié)合親合力和/或特異性。進(jìn)行修飾的其它方法包括使用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)技術(shù)，包括但不局限于，酶促方法、氧化取代和螯合。修飾作用可用于，例如，連接在免疫檢測法中使用的標(biāo)記物，如連接在放射免疫測定法中使用的放射性部分。可用本領(lǐng)域已建立的方法制備經(jīng)修飾的mKID2多肽并且用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)檢測法進(jìn)行篩選。
本發(fā)明還包括含有來自諸如mKID2之類本發(fā)明抗體的一個或多個片段或區(qū)域的融合蛋白。在一個實施方案中，提供了含可變輕鏈區(qū)中至少10個連續(xù)氨基酸和可變重鏈區(qū)中至少10個氨基酸的融合多肽。在另一實施方案中，融合多肽含有異源免疫球蛋白的恒定區(qū)。在另一實施方案中，融合多肽包含mKID2的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，mKID2融合蛋白包含一個或多個mKID2多肽以及在mKID2天然分子中未連接的其它氨基酸序列，例如，來自另一區(qū)域的異源序列或同源序列?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法，例如合成或重組方法產(chǎn)生mKID2多肽。
因為產(chǎn)生的抗體通常是小鼠抗體或其它非人抗體，所以產(chǎn)生自雜交瘤的抗體在人體內(nèi)會引起免疫應(yīng)答。為了減少免疫應(yīng)答，抗體可以被“人源化”。產(chǎn)生人源化抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的?？缮a(chǎn)含有來自小鼠抗ALCAM抗體的可變區(qū)和來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)的嵌合分子。通過只將小鼠抗體互補決定區(qū)(CDR)移植至人抗體可變構(gòu)架上可進(jìn)一步使免疫應(yīng)答最小化，但此修飾會導(dǎo)致所產(chǎn)生的嵌合抗體的結(jié)合活性降低。進(jìn)一步的改進(jìn)可涉及通過鑒定具有增強(qiáng)結(jié)合親合力的改變的抗體可變區(qū)優(yōu)化抗體可變區(qū)(參閱，例如，WO01/27160)。
在某些實施方案中，提供了mKID2嵌合體，其中的重鏈和/或輕鏈?zhǔn)侨诤系鞍住Ｔ谀承嵤┓桨钢?，鏈的恒定結(jié)構(gòu)域來自一特定物種和/或類型，而可變結(jié)構(gòu)域來自不同的物種和/或類型。例如，嵌合抗體(在某些實施方案中)中的恒定區(qū)可以來自于人，而可變區(qū)可以與之同源或來自mKID2(即，小鼠)。還包含于本發(fā)明中的是具有人源化可變區(qū)的抗體，其中(在某些實施方案中)CDR區(qū)域包含mKID2氨基酸序列，而構(gòu)架區(qū)則來自于人的序列。其它形式的人源化抗體是本領(lǐng)域所已知的并描述于此。此外還包括嵌合體的功能片段。其中一個例子是人源化的Fab片段，它包含人的鉸鏈區(qū)、人的第一恒定區(qū)、人1輕或重鏈恒定區(qū)和mKID2的輕和/或重鏈可變區(qū)。人源化的mKID2 Fab片段可反過來制備成Fab二聚體。通常，本發(fā)明的mKID2融合蛋白和mKID2嵌合體可通過用本文所述重組方法制備抗體編碼多核苷酸并表達(dá)之來制造，盡管它們也可用本領(lǐng)域已知的其它方法制備，包括，例如，化學(xué)合成。參閱，例如，美國專利NO.5807715；4816567和6331415。
可以通過4個一般步驟來使單克隆抗體人源化。它們是(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸和預(yù)期的氨基酸序列，(2)設(shè)計人源化抗體，即，決定在人源化過程中使用什么抗體構(gòu)架區(qū)，(3)真正的人源化方法學(xué)/技術(shù)和，(4)轉(zhuǎn)染和表達(dá)人源化抗體。例如，如果抗體用于人的臨床試驗和治療中，可將恒定區(qū)工程化以便更類似于人的恒定區(qū)從而避免免疫應(yīng)答。參閱，例如，美國專利NO.5997867和5866692。
文獻(xiàn)中已描述了包含來自非人免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的許多“人源化”抗體分子，包括含有與人恒定區(qū)融合的嚙齒動物或修飾過的嚙齒動物V區(qū)及其相關(guān)互補決定區(qū)(CDR)的嵌合抗體。參閱，例如，Winter等，Nature 349293-299(1991)；Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 864220-4224(1989)；Shaw等，J Immunol.1384534-4538(1987)和Brown等，Cancer Res.473577-3583(1987)。其它文獻(xiàn)描述了在與合適的人抗體恒定結(jié)構(gòu)域融合前移植入人支持構(gòu)架區(qū)(FR)內(nèi)的嚙齒動物CDR。參閱，例如，Riechmann等，Nature332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)和Jones等，Nature321522-525(1986)。另外的文獻(xiàn)描述了用重組鑲嵌的嚙齒動物構(gòu)架區(qū)支持的嚙齒動物CDR。參閱，例如，歐洲專利出版物519596。設(shè)計這些“人源化”分子的目的在于使得針對于嚙齒動物抗人抗體分子的不想要的免疫學(xué)應(yīng)答最小化，這樣的免疫應(yīng)答將限制這些結(jié)構(gòu)成分在人受體中治療施用時的持續(xù)時間和效力。還可利用的將抗體人源化的其它方法，參閱，Daugherty等，Nucl.Acids Res.192471-2476(1991)和美國專利NO.6180377、6054297、5997867、5866692、6210671、6350861和PCT WO01/27160。
另外，還可用已被工程化從而表達(dá)特異的人免疫球蛋白的商品化小鼠獲得完全人抗體。還可將設(shè)計成產(chǎn)生更期望的(如，完全的人抗體)或更強(qiáng)的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動物用于產(chǎn)生人源化的或人的抗體。這些技術(shù)的例子有來自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM和來自Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse和TC MouseTM。
V.ALCAM結(jié)合抗體的篩選方法有許多方法可用于篩選與ALCAM結(jié)合的單克隆抗體。一種可應(yīng)用的方法是免疫組織化學(xué)法(IHC)。標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。參閱，例如，動物細(xì)胞培養(yǎng)方法(Animal Cell CultureMethods)(J.P.Mather和D.Barnes編輯，學(xué)術(shù)出版社，第57卷，第18章和19章，第314-350頁，1998)。
在IHC篩選中選擇合適的抗ALCAM抗體的第一步是將一抗與多種組織或細(xì)胞結(jié)合。生物學(xué)樣品(如，組織)可獲自活組織檢查、尸體解剖或尸檢。在一個實施方案中，組織樣品可以是來自不同器官的冰凍組織切片。冰凍組織可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法中的任一種在固定或未固定的情況下制備、切片，然后進(jìn)行IHC。參閱，例如，Stephan等，Dev.Biol.212264-277(1999)和Stephan等，Endocrinology 1405841-54(1999)。在另一實施方案中，組織樣品是新鮮組織的切片。所說的細(xì)胞或組織樣品可以是癌性的或非癌性的。
可利用許多不同的檢測系統(tǒng)探測抗體與組織切片的結(jié)合。典型地，免疫組織化學(xué)法包括使一抗與組織結(jié)合，然后與綴合了可檢測標(biāo)記(如，辣根過氧化物酶、HRP或堿性磷酸酶)的二抗(與產(chǎn)生一抗的物種具反應(yīng)性)結(jié)合。可利用的另一種方法是多克隆鏡像互補抗體或polyMICA。D.C.Mangham和P.G.Isaacson所述的(組織病理學(xué)(Histopatholoy)(1999)35(2)129-33)polyMICA(多克隆鏡像互補抗體)技術(shù)可用于檢測一抗與正常組織和癌組織的結(jié)合。有數(shù)種polyMICATM檢測試劑盒可購自The Binding Site Limited(P.O.Box 4073 Birmingham B29 6AT England)。編號為HK004.D的產(chǎn)品是利用DAB為色原的polyMICATM檢測試劑盒。編號為HK004.A的產(chǎn)品是利用AEC為色原的polyMICATM檢測試劑盒?；蛘撸捎每蓹z測標(biāo)記物直接標(biāo)記一抗。
為了確定抗體是否與ALCAM特異結(jié)合，可用Western印跡法檢測抗體與ALCAM的結(jié)合(參閱實施例1)。或者，可通過在已知表達(dá)ALCAM的組織上的結(jié)合檢測抗體與ALCAM的特異結(jié)合?？蓪⒔M織樣品包埋在防止冷凍過程中的損壞的固體或半固體物質(zhì)(如，瓊脂糖凝膠或OCT)中，然后切片用于染色。來自不同器官和處于不同階段的癌癥可用于篩選抗體。可用于篩選目的的組織例子包括但不局限于卵巢、肺、前列腺、胰腺、結(jié)腸和乳房。
或者，諸如但不局限于SK-Ov-3(ATCC#HTB 77)、CFPAC-1(ATCC#CRL 1918)和HPAF-II(ATCC#CRL-1997)之類的癌細(xì)胞系和諸如但不局限于卵巢上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和活化的白細(xì)胞之類來自各自組織的正常細(xì)胞可用于篩選對ALCAM具有結(jié)合親合力的單克隆抗體。已知無ALCAM表達(dá)的培養(yǎng)細(xì)胞，諸如MOLT-3(ATCC#CRL-1552)和SK-LMS-1(ATCC#HTB88)可用作陰性對照。癌性或非癌性的細(xì)胞可按照文件WO 01/43869中所述的方法培養(yǎng)于玻璃載玻片或蓋玻片或塑料表面上，或制備于CellArrayTM中，并用如上所述用于組織的IHC篩選與抗體的結(jié)合?；蛘?，可用非蛋白水解的方式從培養(yǎng)表面取下細(xì)胞并離心沉淀，然后將其像組織一樣包埋和處理以進(jìn)行如上所述的IHC分析?；蛘?，單細(xì)胞可通過與一抗和連接了熒光分子的二級報道抗體一起溫育進(jìn)行篩選，然后用熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)器進(jìn)行分析。
選擇與表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞或組織結(jié)合的抗體。在優(yōu)選的實施方案中，單克隆抗體與人細(xì)胞有交叉反應(yīng)性。2D4和mKID2是與抗原ALCAM結(jié)合的抗體的實例，ALCAM存在于許多不同的癌組織上，包括但不局限于卵巢、肺、前列腺、胰腺、結(jié)腸和乳房組織。
可選擇上述分泌單克隆抗體的雜交瘤來產(chǎn)生這樣的抗體，該抗體優(yōu)先結(jié)合ALCAM上與已知抗ALCAM抗體所優(yōu)先結(jié)合的表位相同的表位。選擇這些抗體的方法是本領(lǐng)域所已知的。例如，結(jié)合競爭檢測法可用于確定抗體是否能與原抗體競爭性地抑制與同一表位的結(jié)合。一個抗體與另一抗體競爭性地結(jié)合ALCAM，表明了該抗體優(yōu)先結(jié)合原抗體所結(jié)合的表位。目前認(rèn)為當(dāng)ALCAM在其天然環(huán)境中以天然構(gòu)型存在于細(xì)胞表面上時其上至少有兩個和可能的更多個表位。因此，可能具有變化的結(jié)合特異性但仍保持本發(fā)明的期望生物學(xué)作用的抗ALCAM抗體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。結(jié)合競爭檢測法是本領(lǐng)域眾所周知的。
表位作圖可用于對抗體進(jìn)行進(jìn)一步的表征。商品化的服務(wù)(如，PepscanSystems，P.O.Box 2098，8203 AB Lelystad，荷蘭)可用于確定抗原ALCAM上的哪一個表位是抗體所結(jié)合的。
VI.抗ALCAM抗體與化學(xué)治療劑的締合在一個實施方案中，抗ALCAM的抗體(或其片段)可以與化學(xué)治療劑締合(包括連接)?？梢韵蛐枰祟愔委煹膫€體施用此化學(xué)治療劑，以便將這些藥劑遞送至表達(dá)該抗體所識別的抗原的癌細(xì)胞處并由此消滅癌細(xì)胞。化學(xué)治療劑包括放射性分子和毒素，后者也被稱為細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑，它包括不利于癌細(xì)胞生存的任何藥劑，另外，化學(xué)治療劑還包括含化學(xué)治療化合物的藥劑和脂質(zhì)體或其它囊泡?；瘜W(xué)治療劑的例子包括但不局限于加利車霉素、美登木素生物堿、紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、鬼臼亞乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長春花新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、道諾紅菌素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素及其類似物或同系物、抗代謝物(如，氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、decarbazine)、烷化劑(如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、二甲磺酸丁酯、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)順氯氨鉑)、蒽環(huán)霉素(如，道諾紅菌素(從前的道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(如，更生霉素(從前的放線菌素)、博萊霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有絲分裂劑(如，長春花新堿和長春花堿)。在優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞毒素對分裂的或快速分裂的細(xì)胞尤其有效，這樣未分裂的細(xì)胞就相對不受毒性作用的傷害。
本發(fā)明的抗體可被內(nèi)化入它們所結(jié)合的癌細(xì)胞(諸如卵巢癌細(xì)胞)內(nèi)并因此對于治療應(yīng)用特別有用，例如，將由于其不利的活性而需內(nèi)在化的毒素送入細(xì)胞。這些毒素的例子包括但不局限于皂草素、加利車霉素、auristatin和美登木素生物堿。
本發(fā)明的抗體或多肽可與放射性分子、毒素或其它治療劑或含治療劑的脂質(zhì)體或囊泡共價或非共價、直接或間接地締合(包括綴合或連接)。抗體可與放射性分子、毒素或化學(xué)治療分子在抗體上的任何位置連接，只要抗體能與其靶ALCAM結(jié)合就可。
毒素或化學(xué)治療劑可與合適的單克隆抗體直接或間接(如，通過連接基團(tuán)，或者通過具有合適附著位點的連接分子，如美國專利5552391所述的平臺分子)偶聯(lián)(如，共價鍵合)。本發(fā)明的毒素和化學(xué)治療劑可利用本領(lǐng)域已知方法與此特定的導(dǎo)向蛋白(targeting proteins)直接偶聯(lián)。例如，當(dāng)藥劑和抗體具有能相互反應(yīng)的取代基時，它們之間的直接反應(yīng)就是可能的。例如，在一個分子上的親核基團(tuán)，諸如氨基或巰基，可能可以與另一分子上的含羰基基團(tuán)，諸如酸酐或酰基鹵，或含良好離去基團(tuán)的烷基(如，鹵化物)反應(yīng)。
抗體或多肽還可通過微載體與化學(xué)治療劑連接。微載體指不溶于水的生物可降解或生物不可降解微粒，其尺寸小于約150、120或100μm，更常見的是小于約50-60μm，優(yōu)選小于約10、5、2.5、2或1.5μm。微載體包括“納米載體”，它是尺寸小于約1μm的微載體，優(yōu)選小于約500nm。這樣的微粒在本領(lǐng)域中是已知的。固相微載體可以是由生物相容性天然聚合物、合成聚合物或合成共聚物形成的微粒，它可以包括或不包括由瓊脂糖或交聯(lián)瓊脂糖以及本領(lǐng)域已知的其它生物可降解材料形成的微載體。生物可降解固相微載體可以由在哺乳動物生理學(xué)條件下可降解的(如，聚(乳酸)、聚(羥基乙酸)及其共聚物)或可侵蝕的(如，聚(原酸酯，諸如3，9-二亞乙基-2，4，8，10-四氧雜螺[5，5]十一碳烷(DETOSU)，或聚(酸酐)，諸如癸二酸的聚(酸酐))聚合物形成。微載體還可以是液相的(如，以油或脂質(zhì)為基礎(chǔ)的)，諸如脂質(zhì)體、無抗原的iscom(免疫刺激性復(fù)合物，它是膽固醇、磷脂和具有佐劑活性的皂甙的穩(wěn)定復(fù)合物)，或以水包油或油包水乳劑存在的微滴或微膠粒，只要該液相微載體是生物可降解的即可。生物可降解液相微載體通常摻合了生物可降解油，其中的許多油是本領(lǐng)域所已知的，包括角鯊烯和植物油。微載體通常是球形的，但非球形的微載體也是可接受的(如，橢圓形、桿狀，等)。由于它們不可溶的特性(相對于水而言)，微載體可從水和以水為基礎(chǔ)的溶液(水溶液)中過濾出來。
本發(fā)明的抗體或多肽綴合體可以包括雙官能接頭，該接頭含有能與毒性劑或化學(xué)治療劑偶聯(lián)的基團(tuán)和能與抗體偶聯(lián)的基團(tuán)。接頭可用作間隔區(qū)將抗體和藥劑分隔開以避免干擾結(jié)合能力。接頭可以是可裂解的或不可裂解的。接頭還可用于提高藥劑或抗體上取代基的化學(xué)反應(yīng)性，并由此提高偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的提高還可以有利于原不可能使用的藥劑或藥劑上官能基團(tuán)的使用。雙官能接頭可通過本領(lǐng)域已知的方式與抗體偶聯(lián)。例如，含活性酯部分，諸如N-羥基琥珀酰亞胺酯的接頭可用于通過酰胺鍵與抗體中的賴氨酸殘基偶聯(lián)。在另一實例中，包含親核胺或肼殘基的接頭可與抗體碳水化合物殘基糖酵解氧化作用所產(chǎn)生的醛基偶聯(lián)。除了這些直接的偶聯(lián)方法外，接頭還可通過諸如氨基葡聚糖之類的中間載體間接與抗體偶聯(lián)。在這些實施方案中，修飾后的連接通過賴氨酸、碳水化合物或中間載體實現(xiàn)。在一個實施方案中，接頭以位點選擇性方式與蛋白質(zhì)中的自由疏基偶聯(lián)。適于選擇性偶聯(lián)蛋白質(zhì)上的疏基的部分是本領(lǐng)域眾所周知的。例子包括二硫化物化合物、α-鹵代羰基和α-鹵代羧基化合物以及順丁烯二酰亞胺。當(dāng)親核胺官能團(tuán)與α-鹵代羰基或羧基出現(xiàn)于同一分子中時，就存在通過胺的分子內(nèi)烷基化發(fā)生環(huán)化作用的可能。防止這種問題發(fā)生的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的，例如制備其中的胺和α鹵代官能團(tuán)被諸如芳基或反式-烯烴之類剛性基團(tuán)分開的分子，這樣將使得不想要的環(huán)化作用在立體化學(xué)上是不利的。參閱，例如，用于通過二硫化物部分制備美登木素生物堿和抗體的綴合物的美國專利NO.6441163。
可用于制備抗體-藥物綴合體的可裂解接頭之一是以順烏頭酸為基礎(chǔ)的酸不穩(wěn)定性接頭，它利用了諸如受體介導(dǎo)的胞吞過程中遇到的內(nèi)體和溶酶體之類的不同細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的酸性環(huán)境。參閱，例如，Shen等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048-1054(1981)，有關(guān)道諾紅菌素和大分子載體的綴合物的制備；Yang等，J.Natl.Canc.Inst.801154-1159(1988)，有關(guān)道諾紅菌素和抗黑素瘤抗體的綴合物的制備；Dillman等，Cancer Res.486097-6102(1988)，有關(guān)用酸不穩(wěn)定性接頭以相似方式制備道諾紅菌素與抗T細(xì)胞抗體的綴合物；Trouet等，Proc.Natl.Acad.Sci.79626-629(1982)，有關(guān)通過肽間隔臂連接道諾紅菌素和抗體。
本發(fā)明的抗體(或多肽)可通過本領(lǐng)域已知的任何方法與放射性分子綴合(連接)。對抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記的有關(guān)方法的討論參閱“用單克隆抗體進(jìn)行的癌癥治療(Cancer Therapy with Monoclonal Antibodies)”，D.M.Goldenberg編輯(CRC出版社，Boca Raton，1995)。
或者，如Segal在美國專利NO.4676980中所述的，抗體可與二抗綴合形成抗體雜綴合物。交聯(lián)抗體的形成可將免疫系統(tǒng)定向于特異的細(xì)胞類型，例如，表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞。
VII.ALCAM是多種非黑素瘤癌癥的標(biāo)記有關(guān)報道已公開ALCAM表達(dá)于轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤中，而在非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系中則檢測不到(Degen等，(1998)Am J Pathol 152805-813)?？笰LCAM單克隆抗體2D4和mKID2被用于篩選各種非黑素瘤癌細(xì)胞，包括卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和乳癌細(xì)胞。我們已發(fā)現(xiàn)除了轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤外，某些癌癥細(xì)胞也表達(dá)ALCAM，包括卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和乳癌細(xì)胞。利用抗ALCAM抗體篩選癌細(xì)胞取決于ALCAM在癌細(xì)胞上和在同一類型的正常細(xì)胞上有不同的表達(dá)。在一個實施方案中，該方法包括，使生物學(xué)樣品與抗ALCAM抗體接觸，并將待測樣品中存在或缺乏ALCAM的情況和對照樣品中存在或缺乏ALCAM的情況相比較。用抗ALCAM單克隆抗體2D4篩選原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性卵巢癌和前列腺癌組織，發(fā)現(xiàn)原來在正常組織中ALCAM表達(dá)呈陰性的細(xì)胞出現(xiàn)ALCAM表達(dá)。用Medarex，Inc.(Princeton，NJ)提供的轉(zhuǎn)基因小鼠所產(chǎn)生的抗ALCAM單克隆抗體2D4測定了卵巢癌和前列腺癌組織以及一組正常組織中ALCAM的表達(dá)水平，見實施例2。另外還檢測了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞系中ALCAM的表達(dá)。如實施例3所示，9個胰腺癌細(xì)胞系中有8個表達(dá)可檢測水平的ALCAM，而在正常胰腺中ALCAM只在導(dǎo)管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。另外還檢測了原發(fā)性肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系并發(fā)現(xiàn)有ALCAM的表達(dá)，參見實施例4。此外還用單克隆抗體mKID2檢測了結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌和乳癌組織以及皮膚、腎、肺、肝、胰腺、結(jié)腸和十二指腸正常組織中ALCAM的表達(dá)，見實施例6。
VIII.診斷癌癥的方法為了診斷的目的，按照本文所公布方法制備的單克隆抗體可用于鑒定或檢測各種細(xì)胞和組織中是否存在表達(dá)抗原ALCAM的癌細(xì)胞，所說的細(xì)胞和組織包括但不局限于卵巢、肺、前列腺、胰腺、結(jié)腸或乳房細(xì)胞和組織。這其中包括使ALCAM與特異結(jié)合ALCAM的抗體形成復(fù)合物，以評估生物學(xué)樣品中ALCAM的水平。在優(yōu)選的實施方案中，抗體攜帶可檢測的標(biāo)記物。可使用的標(biāo)記物的例子包括放射性物質(zhì)或熒光團(tuán)，諸如異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白。這樣的復(fù)合物可在體外或體內(nèi)形成。單克隆抗體還可用于鑒別在不同發(fā)育階段的癌細(xì)胞。抗體可識別表達(dá)ALCAM的卵巢、前列腺和胰腺的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌以及肺的原發(fā)性癌。正如本文中所使用的，檢測可以包括定性和/或定量的檢測，還可包括將檢測到的水平與正常細(xì)胞相比，從而確定癌細(xì)胞中增高的ALCAM表達(dá)水平。
本發(fā)明還提供了用任何可以結(jié)合ALCAM的抗體在受試者中輔助診斷癌癥(如卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌或乳癌)的方法以及可用于測定ALCAM表達(dá)水平的任何其它方法。用于本文中時，用于“輔助診斷”的方法意指這些方法在有關(guān)癌癥的分類或性質(zhì)的臨床確定中起到輔助的作用，但就確診來說卻可以是結(jié)論性的也可以不是。因此，輔助癌癥診斷的方法可包括以下步驟檢測來自個體的生物學(xué)樣品中ALCAM的水平和/或測定樣品中ALCAM的表達(dá)水平。
按本文所公布的方法制備的抗ALCAM抗體還可用于確定已診斷為癌癥患者的個體是否可以被視為是使用抗ALCAM抗體進(jìn)行免疫治療的侯選者。在一個實施方案中，可以用抗ALCAM的抗體檢測惡性腫瘤或活組織檢查樣品中ALCAM的表達(dá)。攜帶表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞的個體是用抗ALCAM抗體進(jìn)行免疫治療的合適候選人。利用抗ALCAM抗體達(dá)到篩選免疫療法候選人的目的的方法在進(jìn)行任何形式的抗癌治療(如化療或放療)之前和之后都是有用的，可用于確定哪一種腫瘤最有可能對所給出的療法產(chǎn)生反應(yīng)、受試者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移性疾病的腫瘤的亞型或來源、以及疾病的進(jìn)展或?qū)χ委煯a(chǎn)生的反應(yīng)。
體外檢測ALCAM的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫沉淀、免疫熒光、酶免疫測定(EIA)、放射免疫測定(RIA)和蛋白質(zhì)印跡分析。在一個實施方案中，取出含癌細(xì)胞的組織并用本領(lǐng)域眾所周知的方法對此組織進(jìn)行制備以供免疫組織化學(xué)使用，如，經(jīng)固定或不經(jīng)固定，在冷凍化合物中包埋、冷凍和切片；在使用或不使用各種抗原修復(fù)(antigen retrieval)和復(fù)染方法的情況下進(jìn)行固定和石蠟包埋。
在另一實施方案中，用單克隆抗體2D4、mKID2或本文所述的任何其它結(jié)合ALCAM的實施方式檢測非黑素瘤癌細(xì)胞中ALCAM的表達(dá)。為了簡單起見，通常提及2D4或mKID2，但是可以理解這些方法適用于本文所述的任何結(jié)合ALCAM的實施方式。抗ALCAM單克隆抗體2D4和mKID2特異結(jié)合多種表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞類型，包括但不局限于卵巢、肺、前列腺、胰腺、結(jié)腸和乳癌細(xì)胞。在卵巢、肺、前列腺、胰腺、結(jié)腸和乳癌細(xì)胞中不是所有細(xì)胞都表達(dá)ALCAM，而其它組織中的癌細(xì)胞也可能表達(dá)ALCAM，因此應(yīng)檢查受試者癌細(xì)胞上是否存在ALCAM以確定免疫療法對受試者的有用性。在一個實施方案中，可通過用抗ALCAM抗體對前列腺組織進(jìn)行染色，將正常前列腺上皮細(xì)胞與前列腺癌上皮細(xì)胞區(qū)分開來。組織學(xué)上正常前列腺上皮細(xì)胞組織良好，而癌組織則具有非常不同的形態(tài)。用抗ALCAM抗體進(jìn)行染色可以將癌組織與正常組織區(qū)分開來。
用標(biāo)記的抗ALCAM單克隆抗體2D4篩選了一組胰腺癌細(xì)胞系。如實施例3所示，抗ALCAM抗體2D4與多種胰腺癌細(xì)胞系結(jié)合，9個胰腺癌細(xì)胞系中有8個表達(dá)ALCAM。單克隆抗體2D4與轉(zhuǎn)移的和原發(fā)的胰腺癌細(xì)胞系均發(fā)生反應(yīng)。
在另一實施方案中，除了單克隆抗體2D4外，還可用特異結(jié)合ALCAM的單克隆抗體篩選非黑素瘤癌細(xì)胞和組織中ALCAM的存在。
一種可用于體內(nèi)檢測ALCAM的技術(shù)將標(biāo)記的抗ALCAM抗體引入已診斷為癌癥患者的個體中。在一個實施方案中，使用抗體篩選免疫療法候選者的方法是體內(nèi)腫瘤成像，其中，將抗體與放射性或不透射線的物質(zhì)連接，向個體施用抗體并用x-射線或其它成像機(jī)器來顯現(xiàn)標(biāo)記后的抗體在已知癌細(xì)胞(如，腫瘤)區(qū)域處的定位。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體是mKID2或可以與ALCAM結(jié)合的生物學(xué)等價抗體或多肽。
還可用識別此抗原的抗體(或多肽)建立診斷免疫測定法以檢測活的或垂死的癌細(xì)胞向體液中釋放或分泌的抗原，所說的體液包括但不局限于血液、唾液、尿液、肺液或腹水。如實施例中所進(jìn)一步詳述的，2D4和mKID2可與來自組織的不同階段的各種形式癌癥結(jié)合，所述組織包括但不局限于卵巢、乳房、肺、前列腺、結(jié)腸和胰腺。將本發(fā)明抗體和藥劑用于診斷目的的方法在進(jìn)行任何形式的抗癌治療(如化療或放療)之前和之后都是有用，可用于確定哪一種腫瘤最可能對給定的療法產(chǎn)生反應(yīng)、病人的預(yù)后、轉(zhuǎn)移性疾病的腫瘤亞型或來源以及疾病的進(jìn)展或?qū)χ委煹姆磻?yīng)。
IX.用抗ALCAM抗體進(jìn)行免疫治療的方法按本文所述方法制備的單克隆抗體2D4和其它抗ALCAM抗體(諸如人源化的或嵌合的抗體)可用于例如治療攜帶了表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞的個體，所述癌細(xì)胞包括但不局限于卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞。治療可以包括按如上所述在體內(nèi)或體外形成抗ALCAM抗體和ALCAM的復(fù)合物。在優(yōu)選的實施方案中，用抗ALCAM抗體進(jìn)行的治療可以包括按如上所述將抗ALCAM抗體與化學(xué)治療劑或其它抗體締合。
本發(fā)明提供了將任何本文所述組合物(包括綴合物)運送至ALCAM表達(dá)細(xì)胞，諸如表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞的方法。這些方法需要將本文所述組合物(包括綴合物)施用于個體。在某些實施方案中，該方法可用于，例如，將綴合物引入靶細(xì)胞。在另一實施方案中，抗ALCAM抗體(諸如人源化或嵌合形式的抗ALCAM抗體和這些抗體的各種制劑)可與化學(xué)治療劑(諸如放射性分子、毒素，如皂草素、加利車霉素、auristatin或美登木素生物堿，或其它化學(xué)治療分子)或含化學(xué)治療化合物的脂質(zhì)體或囊泡綴合(包括連接)并施用于個體，從而將這些化合物定向于含有被抗體所識別的抗原的癌細(xì)胞并由此消滅癌細(xì)胞。在某些實施方案中，化學(xué)治療劑被運送入癌細(xì)胞(諸如卵巢癌細(xì)胞)。
本發(fā)明還提供了用抗ALCAM抗體或連接了化學(xué)治療劑的可以與ALCAM結(jié)合的其它實施方式抑制前列腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌或結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和/或增殖的方法。在某些實施方案中，所說的抗體是人源化的或嵌合形式的非人抗ALCAM抗體。
本發(fā)明還提供了用抗ALCAM抗體或連接了化學(xué)治療劑的可與ALCAM結(jié)合的其它實施方式延遲癌癥患者(包括但不局限于前列腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌或結(jié)腸癌)中轉(zhuǎn)移發(fā)生的方法。在某些實施方案中，抗體是人源化的或嵌合形式的非人抗ALCAM抗體。
在另一實施方案中，為了延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，在手術(shù)切除表達(dá)該抗原的癌后可將所說的抗體用作輔助治療(adjuvant therapy)。也可將所說抗體或與化學(xué)治療劑締合的抗體在手術(shù)前施用給具有表達(dá)該抗原的腫瘤的患者以減小腫瘤的大小，從而使手術(shù)能夠進(jìn)行或得以簡化、在手術(shù)過程中不傷害組織和/或減少所產(chǎn)生的畸形。
在另一實施方案中，mKID2或本文所述任何可以結(jié)合ALCAM的實施方式可以與表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞結(jié)合并誘導(dǎo)抗表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞的主動免疫應(yīng)答。在某些情況下，主動免疫應(yīng)答可引起癌細(xì)胞的死亡(如，抗體與癌細(xì)胞的結(jié)合誘發(fā)了細(xì)胞的程序死亡)或抑制癌細(xì)胞的生長(如，阻斷了細(xì)胞周期的進(jìn)行)。在其它情況下，mKID2或本文所述的任何抗體可與癌細(xì)胞結(jié)合且抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)可消滅與mKID2結(jié)合的癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了刺激免疫應(yīng)答的方法，包括施用本文所述任何組合物。
在某些情況中，抗體的結(jié)合還可激活細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答并募集更多的天然殺傷細(xì)胞或提高細(xì)胞因子的產(chǎn)量(如，IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNF-β等)，這樣就進(jìn)一步激活了個體的免疫系統(tǒng)以破壞癌細(xì)胞。在另一實施方案中，mKID2可與癌細(xì)胞結(jié)合，而巨噬細(xì)胞或其它吞噬細(xì)胞可調(diào)理癌細(xì)胞。
與化學(xué)治療劑締合(包括連接)的抗ALCAM抗體或片段(如，F(xiàn)ab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)的各種制劑均可以用于給藥，這些制劑如嵌合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體和含具所需特異性的抗原ALCAM識別位點的任何其它修飾構(gòu)型的抗ALCAM抗體。在某些實施方案中，抗ALCAM抗體或其片段可不經(jīng)稀釋直接施用。在其它實施方案中，抗ALCAM抗體或其片段可以與藥用可接受賦形劑一起施用并且可以是各種制劑形式。藥用可接受賦形劑是本領(lǐng)域所已知的，它們是有利于藥理學(xué)有效物質(zhì)施用的相對惰性的材料。例如，賦形劑可以使藥物成形或保持一定的稠度，或用作稀釋液。合適的賦形劑包括但不局限于穩(wěn)定劑、潤濕劑和乳化劑、用于變動滲透壓的鹽、包囊劑、緩沖液和皮膚穿透增強(qiáng)劑。用于腸胃外和非腸胃外藥物運送的賦形劑以及制劑參閱RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins，Publishing。
一般的，這些藥劑被配制成用于注射方式施用(如，腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉注射，等)，盡管其它給藥形式(如，口服、粘膜施用，等)也可使用。因此，抗ALCAM抗體和其等價物優(yōu)選與諸如鹽、林各溶液、葡萄糖溶液等藥物可接受賦形劑組合。具體的服藥方案，即劑量、時間選擇和重復(fù)用量取決于具體的個體和該個體的醫(yī)療史。一般而言，任何以下劑量均可使用施用至少約50mg/kg體重的劑量；至少約10mg/kg體重；至少約3mg/kg體重；至少約1mg/kg體重；至少約750μg/kg體重；至少約500μg/kg體重；至少約250μg/kg體重；至少約100μg/kg體重；至少約50μg/kg體重；至少約10μg/kg體重；至少約1μg/kg體重，或更多。經(jīng)驗性考慮因素，諸如半衰期，通常有助于給藥量的確定?？梢岳门c人免疫系統(tǒng)相容的抗體，諸如人源化抗體或完全的人抗體，延長抗體的半壽期并防止抗體被宿主免疫系統(tǒng)攻擊。在治療過程中可以確定和調(diào)整給藥頻率，其基礎(chǔ)是減少癌細(xì)胞的數(shù)目、保持癌細(xì)胞的縮小、減少癌細(xì)胞的增殖或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生?；蛘撸笰LCAM抗體的持續(xù)連續(xù)釋放制劑可能是合適的。用于達(dá)到持續(xù)釋放的各種制劑和裝置是本領(lǐng)域所已知的。
在一個實施方案中，抗ALCAM抗體的給藥量在已給藥一次或多次的個體中可以按經(jīng)驗決定?？梢韵騻€體施用遞增量的抗ALCAM抗體。為了評估抗ALCAM或其片段的效力，可用各種方法跟蹤特定癌癥的狀態(tài)，諸如通過觸診或目測法直接檢測腫瘤的大?。挥脁-射線或其它成像技術(shù)間接檢測腫瘤的大?。煌ㄟ^直接的腫瘤活組織檢查和腫瘤樣品的顯微鏡檢驗評估病情的改善；檢測間接的腫瘤標(biāo)志(如，用于前列腺癌的PSA)；疼痛、麻痹的減輕、言語、視覺、呼吸受損或其它與腫瘤相關(guān)的其它障礙的減輕；食欲增加；或用公認(rèn)的試驗測量生命質(zhì)量的提高或生存期的延長。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，給藥量的變化將取決于個體、癌癥的類型、癌癥的階段、癌癥是否已開始轉(zhuǎn)移到個體的其它部位以及過去和同時使用的療法。
其它的制劑包括本領(lǐng)域已知的合適遞送形式，包括但不局限于，諸如脂質(zhì)體之類的載體。參閱，例如，Mahato等，(1997)Pharm.Res.14853-859。脂質(zhì)體制品包括但不局限于細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑、多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。
在某些實施方案中，可以存在一種以上的抗體。這樣的組合物可以包含對例如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞具有反應(yīng)性的一種或一種以上的抗體(可以包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同的抗體)。正如本領(lǐng)域中常常論述的，抗體的混合物可能對治療較寬范圍的個體群特別有用。
可以用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行疾病的評估，諸如成像方法和監(jiān)測適當(dāng)?shù)臉?biāo)記。
X.ALCAM參與新血管形成在細(xì)胞表面表達(dá)ALCAM的細(xì)胞或組織(包括成年細(xì)胞和組織以及移植的細(xì)胞和組織)在抗ALCAM抗體施用后可激活新血管形成。如實施例5中所示，將一種表達(dá)ALCAM的具有專利的人胰腺腫瘤細(xì)胞系Rav9926植入裸鼠?？笰LCAM單克隆抗體2D4的施用導(dǎo)致了小鼠血管在此人腫瘤中的新血管形成。在進(jìn)一步的實驗中，使表達(dá)ALCAM的人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3于腎囊下或作為皮下腫瘤進(jìn)行培養(yǎng)。2D4的施用導(dǎo)致了所產(chǎn)生的卵巢腫瘤中新血管形成的增加。因為單克隆抗體2D4不與小鼠ALCAM結(jié)合，所以MAb 2D4與表達(dá)ALCAM的外源細(xì)胞(即，人胰腺腫瘤細(xì)胞)結(jié)合并將其激活，然后引發(fā)了血管的生長。不受理論的局限，ALCAM的活化導(dǎo)致促進(jìn)血管產(chǎn)生的促血管形成分子的釋放。
因此，在一個實施方案中，可以將諸如抗ALCAM抗體之類的抗ALCAM劑以有效引發(fā)組織中血管生長的量施用于個體。在一個實施方案中，所述個體已接受了組織移植且可能需要在組織移植物中形成血管。可以通過施用有效量的抗ALCAM藥劑達(dá)到新血管形成的目的。
在另一實施方案中，抗ALCAM抗體可用于鑒別促血管形成分子。例如，可用抗ALCAM抗體刺激細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)新血管形成的活性。可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化促進(jìn)新血管形成或血管生成的分子，諸如對來自呈現(xiàn)所說活性的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物進(jìn)行親和層析。編碼這些活性分子的多核苷酸(如，DNA或RNA)可用諸如表達(dá)克隆、差異展示和基因陣列之類的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行分離并克隆。在一個實施方案中，本發(fā)明可通過如下方式鑒別促血管形成分子用抗ALCAM抗體刺激腫瘤細(xì)胞，分級分離釋放自腫瘤細(xì)胞的分子，分析各組分的血管形成活性，從而鑒別在用抗ALCAM抗體刺激后自腫瘤細(xì)胞釋放的促血管形成分子。
在另一實施方案中，可將有效量的促血管形成分子施用于個體以引發(fā)組織中的血管生長。可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如上文所述)制備針對促血管形成分子的抗體。在另一實施方案中，可將有效量的藥劑，諸如抗已鑒別的促血管形成分子的抗體施用給個體以抑制促血管形成分子的新血管形成活性。
諸如實施例5所述的動物模型可用于篩選抑制ALCAM的新血管形成活性的一種或多種拮抗劑，如拮抗抗體。在施用候選拮抗劑，如拮抗性抗體后，監(jiān)測動物模型中新血管形成的減少。新血管形成量的減少將指示候選抗體對血管生長具有抑制作用。
具有本文所述的期望特征的抗CD6抗體可用于本發(fā)明的實踐中。此外，某些CD6肽和多肽片段及類似物分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選那些與本發(fā)明的ALCAM激動劑和拮抗劑具有共同生物學(xué)活性的分子，包括但不局限于可以調(diào)節(jié)ALCAM的血管形成相關(guān)活性的那些分子。
盡管本文頻繁討論到將抗體作為本發(fā)明的候選治療劑，但本發(fā)明的組合物也可以包括能增加或減少ALCAM介導(dǎo)的新血管形成的非抗體藥劑。不受任何特定作用機(jī)制的限制，這些新血管形成的調(diào)制劑可直接作用于ALCAM或作用于其天然或誘導(dǎo)的結(jié)合配偶體。按照本發(fā)明的教導(dǎo)，CD6是適于用增加或減少ALCAM介導(dǎo)的新血管形成的藥劑調(diào)節(jié)的已知結(jié)合配偶體的一個例子?？蓹z測藥劑阻斷、減少、增加或以另外方式調(diào)節(jié)ALCAM與諸如抗ALCAM抗體或CD6之類結(jié)合配偶體的締合的能力。具體而言，可以通過將含有ALCAM相互作用位點(通常采取當(dāng)ALCAM存在于完整活細(xì)胞上時的天然構(gòu)象)的肽與結(jié)合配偶體及待測藥劑一起溫育并測定待測藥劑是否減少或增強(qiáng)結(jié)合配偶體與ALCAM肽的結(jié)合，測定該藥劑調(diào)節(jié)此相互作用的能力。激動劑、拮抗物和其它調(diào)制劑是本發(fā)明所明確考慮的。
XI.含有與ALCAM結(jié)合的抗體的試劑盒本發(fā)明還提供了含有與ALCAM結(jié)合的抗體的試劑盒，用于篩選個體是否可以作為接受各種癌癥免疫治療的候選者，用于使表達(dá)ALCAM的組織形成新血管或抑制其新血管形成。因此，該試劑盒包含可與ALCAM特異結(jié)合并/或與ALCAM形成復(fù)合物的抗體(用于，例如，檢測卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞)。在某些實施方案中，試劑盒包含抗體mKID2或競爭性抑制mKID2與ALCAM優(yōu)先結(jié)合的抗體，它們可作為單獨藥劑使用或以和化學(xué)治療劑或標(biāo)記物質(zhì)連接的形式使用。這些試劑盒還可以包括說明書和/或試劑，用于將該抗體或本文所述任何抗體或多肽實施方式與化學(xué)治療劑或標(biāo)記物質(zhì)連接在一起。在某些情況下，抗體(如，單克隆、人的、人源化的，等等)的結(jié)合可以用于篩選個體是否可以作為免疫治療的候選者。在另外的方面，試劑盒可用于，例如，治療癌癥患者。在某些實施方案中，用于治療癌癥患者的試劑盒包括用于將送化學(xué)治療劑遞送至癌細(xì)胞(諸如但不局限于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳癌細(xì)胞)或遞送入癌細(xì)胞(諸如但不局限于卵巢癌細(xì)胞)的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒可以適宜地進(jìn)行包裝，且可以任選地提供諸如緩沖液和說明書之類用于測定與ALCAM的結(jié)合的另外組分，如捕獲試劑、顯影試劑、標(biāo)記物、反應(yīng)表面、檢測手段、對照樣品和說明性信息。該說明書可用于任何測定抗原結(jié)合的方法，包括但不局限于本文所述的那些測定法。在某些實施方案中提供了上述試劑以便可以進(jìn)行多重測定，如允許對同一個體隨時間進(jìn)行測定或?qū)Χ鄠€個體進(jìn)行測定。適于檢測抗體結(jié)合的方式都可以應(yīng)用(并提供于試劑盒中)，諸如標(biāo)記的抗人抗體，其中的標(biāo)記物可以是酶、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光材料、放射性同位素或輔酶。在其它的實施方案中，抗ALCAM抗體可以與化學(xué)治療劑締合作為化學(xué)療法治療癌癥患者。
以下實施例僅供舉例說明，而非對本發(fā)明的限制。
實施例實施例1前列腺癌細(xì)胞中ALCAM的蛋白質(zhì)印跡分析在175cm2的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)LNCAP細(xì)胞(前列腺癌細(xì)胞ATCC#CRL-1740或CRL-10995)至匯合。用Hank氏平衡鹽溶液(HBSS+，不含碳酸氫鈉或酚紅；用10mM HEPES，pH7.4緩沖，來自Sigma Chemicals)洗滌匯合的細(xì)胞單層三次，然后用200μg磺基-NHS-LC-生物素(PierceEndogen)在室溫對其進(jìn)行生物素化30分鐘。將細(xì)胞進(jìn)一步用含0.1M Tris，pH7.4(Sigma Chemicals)的HBSS+洗三次并于室溫下在含0.1M Tris，pH7.4的HBSS+中保溫15分鐘。細(xì)胞最后用HBSS+洗三次，然后冰上于裂解緩沖液(含2％Triton X-100、2mM PMSF、0.1％疊氮化鈉的HBSS+、每5ml裂解緩沖液中加一片無EDTA的完全小量蛋白酶混合物(complete mini-protease cocktail)，無EDTA的完全小量蛋白酶混合物獲自Roche Molecular Biochemicals，所有的其它試劑來自Sigma Chemicals)中溫育5分鐘進(jìn)行裂解。將細(xì)胞在裂解緩沖液中刮下并收集裂解物。在4℃14000g離心1小時使裂解物澄清。澄清后的裂解物首先在4℃用5μl綴合了人IgG(1mg/ml)的CNBr 4MB瓊脂糖珠子(Amersham Pharmacia)預(yù)清除2小時。移出人IgG珠子，然后將預(yù)清除的裂解物與綴合了CNBr 4MB瓊脂糖珠子的單克隆抗體2D4(以1mg/ml綴合)一起在4℃保溫2小時。2小時保溫后移出2D4珠子。將人IgG珠子和2D4珠子都分別用1ml裂解緩沖液洗3次，，然后用HBSS+洗3次，1ml/次。洗后的珠子通過添加30μl SDS-PAGE樣品緩沖液并在99℃煮沸5分鐘進(jìn)行洗脫。類似地，用來自AncellCorporation，Minnesota的抗ALCAM單克隆抗體克隆3A6將ALCAM從LNCAP細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出來。樣品于4-20％Novex梯度凝膠(Invitrogen)上解析，轉(zhuǎn)移到0.2μm的硝酸纖維素(Invitrogen)上并用綴合了鏈霉親和素的辣根過氧化物酶(HRP)(Pierce Endogen)顯色或用5μg 2D4/個印跡的量進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。為了用綴合了鏈霉親和素的HRP進(jìn)行檢測，首先用封閉緩沖液(5％脫脂干奶于含0.05％Tween-20的磷酸緩沖鹽水(PBST)中，Sigma Chemicals)封閉硝酸纖維素膜1小時。將綴合了鏈霉親和素的HRP在PBST中稀釋至1μg/ml并室溫接觸硝酸纖維素30分鐘。在用DAB底物顯色前先用PBST洗硝酸纖維素膜三次。為了用2D4進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡雜交，硝酸纖維素膜類似地用封閉緩沖液封閉1小時。然后將硝酸纖維素膜在含有1ml稀釋于封閉緩沖液中的5μg/ml 2D4的熱密封塑料袋中保溫。用PBST洗硝酸纖維素膜3次，然后與1μg/ml綴合了驢抗人IgG(重鏈和輕鏈特異、交叉吸附牛、小雞、山羊、豚鼠、敘利亞倉鼠、馬、人、兔子、綿羊血清蛋白質(zhì)，Jackson Immunoreasearch，目錄號709-035-149)的HRP 10ml一起室溫保溫1小時。最后用PBST洗硝酸纖維素膜三次，再用DAB底物呈色顯現(xiàn)。對于用來自Santa Cruz(sc-8548和sc-8549)的多克隆抗ALCAM抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡雜交而言，類似地用封閉緩沖液將硝酸纖維素膜封閉1小時。然后將硝酸纖維素膜在熱密封塑料袋中保溫，袋中含有按供應(yīng)商說明書稀釋于封閉緩沖液中的一抗1ml。用PBST洗硝酸纖維素膜3次，然后與1μg/ml綴合了驢抗山羊IgG(重鏈和輕鏈特異，Jackson Immunoreasearch，目錄號705-035-147)的HRP 10ml一起室溫溫育1小時。最后用PBST洗硝酸纖維素膜三次，再用DAB底物呈色顯現(xiàn)。
結(jié)果顯示2D4和3A6均免疫沉淀了112kDa的生物素化細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，這是用HRP-鏈霉親和素檢測到的。被2D4或3A6免疫沉淀的同一蛋白質(zhì)帶在蛋白質(zhì)印跡中也被抗ALCAM單克隆抗體2D4及sc-8548和sc-8549所識別。這些結(jié)果證實所有這些抗體都結(jié)合共同的抗原-ALCAM，ALCAM存在于前列腺癌細(xì)胞系LNCAP中。
實施例2用生物素化的抗ALCAM一抗進(jìn)行組織切片中ALCAM的免疫組織化學(xué)染色用Leica CM3050切10微米厚的冰凍切片并解凍-貼(thaw-mounted)在載玻片上。將切片在室溫空氣干燥至少30分鐘。通過將載玻片浸入乙醇(在-20℃預(yù)冷)中隨后空氣干燥過夜來固定切片，或用4％的多聚甲醛固定5分鐘。固定后的載玻片可立即使用或保存于-80℃的冰箱中待用。為了滅活內(nèi)源性的過氧化物酶活性，將載玻片在甲醇中的1％過氧化氫中室溫保溫30分鐘。在與一抗進(jìn)行保溫前，將載玻片與在含0.1％Tween20的PBS中的5％山羊血清一起室溫保溫60分鐘，以封閉非特異結(jié)合位點。
生物素化的抗ALCAM抗體制備如下已純化的單克隆抗體用NaHCO3緩沖液，pH9.0透析過夜。加入50μl生物素標(biāo)記試劑(于DMSO中的N-羥基琥珀酰亞胺生物素2mg/ml，Pierce目錄號20217)并混合。將反應(yīng)混合物在搖動平臺上室溫輕搖反應(yīng)過夜，然后用PBS透析去除過量的游離生物素?；旌衔锵♂層诤?％山羊血清和0.1％Tween20的PBS中至終濃度約1μg/ml，然后以足夠覆蓋整個組織切片的量加到載玻片上，通常為0.5ml/片。將載玻片密封于用PBS飽和的潮濕室中于4℃保溫過夜。在保溫結(jié)束的時候，用PBS洗載玻片3次，5分鐘/次，以去除過量的一抗。然后，將載玻片于室溫于鏈霉親和素-HRP溶液(Sigma，目錄號S-5512，10μg/ml，于含5％山羊血清和0.1％Tween20的PBS中)中保溫1小時。重復(fù)用PBS洗載玻片3次，5分鐘/次，去除過量的鏈霉親和素-HRP。最后，用過氧化物酶底物緩沖液，pH5.00的醋酸鈉緩沖液洗載玻片2次，然后在室溫下于過氧化物酶底物DAB/H2O2中顯色直至達(dá)到合適的反差，通常在幾分鐘內(nèi)。通過在水中洗去除未反應(yīng)的底物以終止反應(yīng)。用蘇木精復(fù)染載玻片并在顯微鏡檢查前將蓋玻片放到載玻片上。在Nikon顯微鏡(Model E800)下檢查染色結(jié)果并照相。對于表1和2中的結(jié)果，弱陽性染色記錄為‘+’，中等陽性染色記錄為‘2+’，強(qiáng)陽性染色記錄為‘3+’，陰性染色記錄為‘- 。表1顯示抗ALCAM抗體與多種卵巢癌和前列腺癌組織的結(jié)合。1#至21#組織樣品是卵巢癌細(xì)胞組織，而22#至27#樣品是前列腺癌組織樣品。表2顯示了抗ALCAM抗體與多種正常人組織的結(jié)合。

實施例3 抗ALCAM與胰腺癌的結(jié)合用熒光激活細(xì)胞分選儀在活細(xì)胞中分析抗ALCAM單克隆抗體2D4與胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1(ATCC#CRL-1682)、Capan-1(ATCC#HTB-79)、CFPAC-1(ATCC#CRL-1918)、HPAF-II(ATCC#CRL-1997)、HS700T(ATCC#HTB-147)、HS766T(ATCC#HTB-134)、PANC1(ATCC#CRL-1469)、SU.86.86(ATCC#CRL-1837)和Rav9926(專利性胰腺癌細(xì)胞系))的結(jié)合。如圖1中所示，在各個矩形圖中，灰色填充的曲線代表熒光標(biāo)記的抗人IgG Fc與各細(xì)胞系在無一抗的情況下的非特異性結(jié)合。黑色曲線顯示的是與抗ALCAM抗體結(jié)合的細(xì)胞的FACS分選。黑色曲線從灰色曲線向右邊的移動表明抗ALCAM抗體與相應(yīng)細(xì)胞系的特異結(jié)合，因此意味著該細(xì)胞系在細(xì)胞表面表達(dá)ALCAM。所測試的9個胰腺細(xì)胞系中有8個表達(dá)ALCAM(Capan-1、CFPAC-1、HPAF-II、HS700T、HS766T、PANC1、SU-86-86和Rav9926)。
實施例4抗ALCAM與肺癌的結(jié)合用活細(xì)胞酶聯(lián)免疫測定法分析抗ALCAM抗體與肺癌細(xì)胞系SK-MES-1(一種原發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌)(ATCC#HTB 58)的結(jié)合。在用組織培養(yǎng)液處理過的96孔組織培養(yǎng)板(Falcon目錄號354075)中在補充了10％胎牛血清的F12/DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)SK-MES-1細(xì)胞系至匯合。用組織培養(yǎng)基洗細(xì)胞，然后在存在或不存在10μg/ml抗ALCAM抗體(MAb2D4)的情況下室溫保溫于含1％BSA和0.1％疊氮化鈉的Hank氏平衡鹽緩沖液(HBSS)中1小時。然后用100μl/孔的HBSS洗細(xì)胞3次，之后將細(xì)胞與用HBSS稀釋、濃度為0.8μg/ml、綴合了驢抗人IgG重鏈和輕鏈特異抗體的辣根過氧化物酶(HRP)50μl/孔一起室溫保溫30分鐘。最后用HBSS洗細(xì)胞3次并在100μlTMB底物(KPL目錄號50-65-00和50-76-01)中保溫5分鐘，添加100μl/孔的1M磷酸終止反應(yīng)。讀取顯色后的平板在450nm波長的O.D.值。結(jié)果顯示，當(dāng)將對照(無MAb 2D4)的O.D.450值設(shè)為空白時，MAb 2D4產(chǎn)生的O.D.450值為0.356，標(biāo)準(zhǔn)誤差值為0.064，表明SK-MES-1細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)ALCAM。
實施例5抗ALCAM抗體增強(qiáng)裸鼠體內(nèi)ALCAM陽性細(xì)胞移植物中的血管形成Rav9926細(xì)胞(專利性人胰腺腫瘤細(xì)胞系)被移植至裸鼠(nu/nu)的腎囊下。讓移植物生長1周。每兩天一次以100mg/kg的劑量腹膜內(nèi)注射ALCAM單克隆抗體克隆2D4，共3次。對照小鼠則注射賦形劑。在第10天，無痛處死動物，并檢查帶移植物的腎。圖2顯示了在對照小鼠中的細(xì)胞移植物是白色半透明的，而在注射了2D4單克隆抗體的小鼠中的細(xì)胞移植物則被密集的脈管系統(tǒng)所纏繞(如箭頭所示)。結(jié)果顯示了2D4單克隆抗體增強(qiáng)了組織移植物細(xì)胞中的血管生成。
因為ALCAM可呈遞于內(nèi)皮細(xì)胞表面，所以檢測了抗ALCAM抗體添加至內(nèi)皮細(xì)胞的效果。人臍靜脈(目錄號CC2519)、成人主動脈(目錄號CC2535)和新生兒皮膚(目錄號CC-2516)微血管內(nèi)皮細(xì)胞獲自BioWhittaker的Clonetics分部并在早期傳代時進(jìn)行測試。將細(xì)胞以約1500個細(xì)胞/孔的密度鋪于96孔平板中并在加入或未加入50μg/ml 2D4的情況下保溫4天，通過結(jié)晶紫染色并讀取光密度來檢查生長狀況。ALCAM抗體的存在對這些內(nèi)皮細(xì)胞的生長均無影響。因此可以推斷用ALCAM抗體處理后在體內(nèi)觀察到的血管形成增加極有可能不是由于對內(nèi)皮細(xì)胞生長的直接作用所致。另外的實驗已顯示了2D4 MAb展示了物種特異性且不與小鼠ALCAM結(jié)合。在本發(fā)明的某些實施方案中，并不局限于特定的作用機(jī)制，在體內(nèi)觀察到的新血管形成是由于腫瘤細(xì)胞以ALCAM抗體依賴性方式釋放促血管形成物質(zhì)所致，所說的釋放繼發(fā)引起新血管形成。
實施例6用生物素化的抗ALCAM抗體mKID2進(jìn)行組織切片中ALCAM的免疫組織化學(xué)染色按實施例2描述的方法制備組織切片并用抗ALCAM抗體mKID2進(jìn)行染色。抗ALCAM抗體mKID2產(chǎn)生自雜交瘤，該雜交瘤保藏于美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)10801 University Blvd.，Manassas VA20110-2209，保藏日為2002年6月21日，專利保藏號PTA-4478。在Nikon顯微鏡(ModelE800)下檢查染色結(jié)果并照相。對于表1和2中的結(jié)果，弱陽性染色記錄為‘+’，中等陽性染色記錄為‘2+’，強(qiáng)陽性染色記錄為‘3+’，陰性染色記錄為‘- 。表3顯示了抗ALCAM抗體mkID2與多種結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌和乳癌組織的結(jié)合。
表3ALCAM在腫瘤中的分布(mKID2抗體)
+/-表示染色不明確實施例7抗ALCAM抗體和綴合了毒素的抗小鼠IgG的內(nèi)在化MAb-ZAP(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA)是綴合了皂草素的抗小鼠IgG，皂草素是一種抑制蛋白質(zhì)合成的毒素。這種毒素不能透過細(xì)胞膜。如果單克隆抗體與可內(nèi)在化的細(xì)胞表面抗原結(jié)合，此毒素綴合物就可以與已結(jié)合的單克隆結(jié)合而被內(nèi)在化，最終殺死細(xì)胞。由于依賴于內(nèi)在化來證明毒性，MAb-ZAP可用于評估是否某一給出的表面抗原可以用作任何如下毒素的合適靶子，所說的毒素依賴于內(nèi)在化來表現(xiàn)細(xì)胞毒性作用。由此，MAb-ZAP可用作諸如美登木素生物堿和加利車霉素之類內(nèi)在化依賴型毒素的模型。
為了檢測抗ALCAM抗體和綴合了皂草素的抗小鼠IgG的內(nèi)在化以及皂草素內(nèi)在化后抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，在測定中使用了單克隆抗ALCAM抗體mKID2。從含10mM EDTA的儲存燒瓶中取出人卵巢癌細(xì)胞SKOV3(ATCC#HTB 77)并離心。細(xì)胞以50000個/ml的密度重懸于合適的培養(yǎng)基中并以100μl/孔的密度鋪于96孔板中。立即將mKID2抗體以10倍濃縮物形式加入合適的孔中至終濃度為10μg/ml。室溫放置15分鐘后以10X濃度將MAb-ZAP(目錄號IT-04，Advanced Targeting Systems，SanDiego CA)加入合適的孔中至終濃度為0.001pM至104pM。培養(yǎng)4天后，加入MTT(貯液為5mg/ml PBS，1∶10稀釋于孔中)，在37℃保溫4小時。然后從各孔中除去培養(yǎng)基并加入100μl/孔的DMSO。將平板輕輕轉(zhuǎn)動使藍(lán)色的MTT沉淀溶解，然后在平板讀數(shù)器上讀取540nm處的數(shù)值。
如圖3中所示，當(dāng)MAb-ZAP加到高于100pM時，與缺乏mKID2的染色情況相比，存在mKID2時SKOV3細(xì)胞中的MTT染色減少了，這表明在mKID2和MAb-ZAP存在下人卵巢細(xì)胞SKOV3的生長被抑制，且mKID2和綴合了毒素的抗小鼠IgG被內(nèi)在化進(jìn)入SKOV3中。
在人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中用不同的mKID2濃度進(jìn)行了類似的試驗。如圖4中所示，在存在與10nM MAb-ZAP組合的1μg/ml、10μg/ml和20μg/ml mKID2的情況下，SKOV3細(xì)胞中的MTT染色減少。
可以理解為本文所述的實施例和實施方案只是為了達(dá)到舉例說明的目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)它們提出多種修飾或改變，但這些修飾和改變也包括在本說明書的精神和范圍內(nèi)。為了所有的目的，此處引用的所有出版物、專利和專利申請文件均全文收編于此作為參考，就如同特異和單獨地指明各個出版物、專利或?qū)＠暾埼募站幾鳛閰⒖家粯印?br> 權(quán)利要求
1.基本純化的免疫球蛋白多肽或其抗原結(jié)合片段，其特異結(jié)合活化的白細(xì)胞粘附分子(ALCAM)，且具有至少一項或多項以下特征a)結(jié)合癌細(xì)胞上的ALCAM的能力；b)在體外或在體內(nèi)與暴露于活細(xì)胞表面的ALCAM部分結(jié)合的能力；c)將治療劑或可檢測標(biāo)記遞送至表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞的能力；d)將治療劑或可檢測標(biāo)記遞送入表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞內(nèi)的能力；e)在個體中增強(qiáng)血管生成的能力；和f)在個體中減弱血管生成的能力。
2.權(quán)利要求1的純化的免疫球蛋白多肽或抗原結(jié)合片段，其中所述癌細(xì)胞選自卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、和乳癌細(xì)胞。
3.編碼權(quán)利要求1的免疫球蛋白多肽或其抗原結(jié)合片段的分離的核酸序列。
4.權(quán)利要求3的核酸，其中核酸與啟動子可操作連接。
5.權(quán)利要求4的核酸，其中啟動子和核酸包含于表達(dá)載體中。
6.權(quán)利要求3的核酸，其中多肽是單克隆抗體。
7.用包含權(quán)利要求3的核酸的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、或感染的細(xì)胞系。
8.生產(chǎn)基本純化的免疫球蛋白多肽或其抗原結(jié)合片段的方法，包括以下步驟a)在表達(dá)免疫球蛋白多肽或抗原結(jié)合片段的條件下培養(yǎng)經(jīng)過權(quán)利要求3的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系；和b)收獲所表達(dá)的免疫球蛋白多肽或片段。
9.權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞系是雜交瘤。
10.權(quán)利要求9的方法，其中雜交瘤是ATCC NO.PTA-4478。
11.權(quán)利要求8的方法，其中免疫球蛋白多肽是單克隆抗體。
12.包含治療有效劑量的權(quán)利要求1或15-16之任一項的純化的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段以及制藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
13.包含治療有效劑量的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段以及制藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，其中所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段特異結(jié)合ALCAM，且具有至少一項或多項以下特征a)結(jié)合癌細(xì)胞上的ALCAM的能力；b)在體外或在體內(nèi)與暴露于活細(xì)胞表面的ALCAM部分結(jié)合的能力；c)將治療劑或可檢測標(biāo)記遞送至表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞的能力；d)將治療劑或可檢測標(biāo)記遞送入表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞內(nèi)的能力；e)在個體中增強(qiáng)血管生成的能力；和f)在個體中減弱血管生成的能力。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中組合物包含額外的治療性部分。
15.特異結(jié)合ALCAM并減少新血管形成的純化的免疫球蛋白多肽或其抗原結(jié)合片段。
16.特異結(jié)合ALCAM并增強(qiáng)新血管形成的純化的免疫球蛋白多肽或其抗原結(jié)合片段。
17.保藏號ATCC PTA-4478的分離的細(xì)胞系或其后代。
18.將化學(xué)治療劑遞送至癌細(xì)胞的方法，包括施用含有與化學(xué)治療劑締合的抗ALCAM抗體的組合物，其中癌細(xì)胞選自卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳癌細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中將化學(xué)治療劑施用給個體。
20.權(quán)利要求18的方法，其中抗ALCAM抗體是細(xì)胞系A(chǔ)TCC NO.PTA-4478或其后代表達(dá)的抗體。
21.抑制個體中癌細(xì)胞生長的方法，包括給個體施用有效量的組合物，所述組合物包含與化學(xué)治療劑締合的抗ALCAM抗體，其中癌細(xì)胞選自卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳癌細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中將化學(xué)治療劑遞送到癌細(xì)胞內(nèi)。
23.權(quán)利要求21的方法，其中抗ALCAM抗體是細(xì)胞系A(chǔ)TCC NO.PTA-4478或其后代表達(dá)的單克隆抗體。
24.檢測個體中癌細(xì)胞存在與否的方法，包括將來自個體的細(xì)胞與抗ALCAM抗體接觸，并檢測，如果存在的話，來自細(xì)胞的ALCAM與抗體的復(fù)合物，其中癌細(xì)胞選自卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳癌細(xì)胞。
25.阻斷ALCAM結(jié)合配偶體與ALCAM間的至少一種如下相互作用的藥劑a)結(jié)合癌細(xì)胞上的ALCAM的能力；b)在體外或在體內(nèi)與暴露于活細(xì)胞表面的ALCAM部分結(jié)合的能力；c)將治療劑或可檢測標(biāo)記遞送至表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞的能力；d)將治療劑或可檢測標(biāo)記遞送入表達(dá)ALCAM的癌細(xì)胞內(nèi)的能力；e)在個體中增強(qiáng)血管生成的能力；和f)在個體中減弱血管生成的能力。
26.包含治療有效劑量的依照權(quán)利要求25的藥劑以及制藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了關(guān)于已知抗原ALCAM的新發(fā)現(xiàn)，即，ALCAM除了與正在轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤有關(guān)外還存在于多種人類癌癥中。此外還公開了通過使用抗ALCAM的抗體診斷和治療表達(dá)ALCAM的癌癥的方法。本發(fā)明還公開了用于調(diào)節(jié)ALCAM介導(dǎo)的新血管形成的組合物和方法。
文檔編號C07K16/18GK1662254SQ03814688
公開日2005年8月31日 申請日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月3日
發(fā)明者J·P·馬瑟, 李榮豪, M·C·察索, D·T·洛 申請人:雷文生物技術(shù)公司