專(zhuān)利名稱(chēng)：人睪丸特異基因hsd-3.8編碼蛋白的生物學(xué)功能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一個(gè)能夠與人G蛋白β1亞基相互作用的人睪丸特異表達(dá)基因/蛋白質(zhì)(命名為HSD-3.8)，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中人睪丸特異表達(dá)基因所編碼蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1992年Zhang Meilin等采用能引起精子凝集的不孕婦女血清作為探針篩選人睪丸λgt11表達(dá)文庫(kù)獲得一長(zhǎng)約0.7kb的cDNA片段，再以該片段作為探針繼續(xù)篩選人睪丸cDNA文庫(kù)，從中得到一長(zhǎng)為2.4kb的基因片段，命名為HSD-2.4。后利用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法獲得了該基因的全長(zhǎng)，命名為HSD-3.8。HSD-3.8編碼蛋白質(zhì)中的一個(gè)片段HSD-0.7的抗體對(duì)大鼠具有比較好的抗生育效果，該片段包含HSD-3.8編碼蛋白質(zhì)中靠近羧基端的一個(gè)由三個(gè)TPR基序構(gòu)成的TPR區(qū)和一個(gè)P-loop區(qū)，P-loop區(qū)能夠與GTP或ATP特異結(jié)合，有GTPase或ATPase活性。TPR蛋白質(zhì)家族的成員都含有串聯(lián)的34個(gè)氨基酸組成的TPR基序，但不同蛋白質(zhì)所含TPR基序的個(gè)數(shù)從3-16個(gè)不等。此蛋白質(zhì)家族的成員通過(guò)TPR基序所形成的特殊構(gòu)象來(lái)介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用，在細(xì)胞周期調(diào)控，神經(jīng)發(fā)生，有絲分裂和免疫反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)證明HSD-0.7蛋白片段在體外具有GTPase活性，能夠特異的結(jié)合GTP，此結(jié)合具有飽和性。
HSD-3.8基因在人睪丸組織中特異表達(dá)。
目前研究主要集中于探討HSD-3.8基因/蛋白質(zhì)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的功能，應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)，細(xì)胞免疫熒光及細(xì)胞免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSD-0.7蛋白能夠與人G蛋白β1亞基相互作用，不僅影響了各類(lèi)生精細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)，而且對(duì)精卵識(shí)別和融合過(guò)程、受精卵中信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活及基因表達(dá)的重新啟動(dòng)都有著極其重要的作用。
發(fā)明目的闡明HSD-3.8基因/蛋白質(zhì)的生理生化功能不僅對(duì)了解精子發(fā)生及受精過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制具有重要的意義，并且為相關(guān)疾病的基因診斷、基因治療及抗生育研究提供可能的目標(biāo)基因，為相關(guān)疾病治療藥物提供潛在的靶向載體。
內(nèi)容與要求應(yīng)用基因組信息學(xué)原理、cDNA文庫(kù)篩選、DNA序列測(cè)定技術(shù)、5’-RACE、重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法、分子克隆、酵母雙雜交技術(shù)、基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純化技術(shù)、抗血清制備、免疫組織化學(xué)、Western Blot檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞免疫熒光、以及細(xì)胞免疫共沉淀技術(shù)和激光共聚焦顯微技術(shù)等，克隆鑒定了與HSD-3.8基因編碼蛋白質(zhì)片段HSD-0.7相互作用的人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸及全長(zhǎng)cDNA，表達(dá)純化了目的蛋白并免疫家兔制備了抗血清，進(jìn)而進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析；借助細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫熒光及激光共聚焦顯微等技術(shù)，確定了HSD-0.7蛋白和人G蛋白β1亞基在細(xì)胞中的共定位；綜合運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫共沉淀和Western Blot檢測(cè)技術(shù)初步確定了HSD-3.8基因/蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。
該基因/蛋白質(zhì)達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.HSD-3.8基因編碼蛋白質(zhì)片段HSD-0.7和人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸(Gβ1-C144)在酵母系統(tǒng)中能夠相互作用。
2.人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸(Gβ1-C144)于大腸桿菌中獲得明顯表達(dá)，經(jīng)親和層析純化后的產(chǎn)物免疫家兔，制備了高滴度抗人G蛋白β1亞基抗體(見(jiàn)圖1)。
3.G蛋白β1亞基在大鼠睪丸組織中主要表達(dá)于精母細(xì)胞和成熟精子細(xì)胞頂體中(見(jiàn)圖2)。
4.HSD-0.7蛋白和人G蛋白β1亞基在HEK 293細(xì)胞中均可表達(dá)，且定位于胞漿中，二者呈現(xiàn)完全共定位(見(jiàn)圖3，4)。
5.HSD-0.7蛋白在去磷酸化狀態(tài)下呈現(xiàn)活性并和人G蛋白β1亞基結(jié)合(見(jiàn)圖5)。
6.該基因及其編碼蛋白質(zhì)與各類(lèi)生精細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)及精卵識(shí)別和融合過(guò)程等生命現(xiàn)象密切相關(guān)。


圖1.pET-30a(+)-Gβ1-C144重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中的表達(dá)及純化結(jié)果1低分子量蛋白質(zhì)Marker；2誘導(dǎo)的pET-30a(+)/BL21(DE3)菌體蛋白質(zhì)；3未誘導(dǎo)的pET-30a(+)-Gβ1-C144/BL21(DE3)菌體蛋白質(zhì)；4誘導(dǎo)的pET-30a(+)-Gβ1-C144/BL21(DE3)菌體蛋白質(zhì)；5誘導(dǎo)的pET-30a(+)-Gβ1-C144/BL21(DE3)菌體蛋白質(zhì)裂解液的上清部分；6誘導(dǎo)的pET-30a(+)-Gβ1-C144/BL21(DE3)菌體蛋白質(zhì)裂解液的包涵體部分；7純化的His6-tagged-Gβ1亞基羧基端144個(gè)氨基酸。
圖2.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)G蛋白β1亞基在大鼠睪丸組織中的表達(dá)左圖為對(duì)照組，藍(lán)色為蘇木精細(xì)胞核對(duì)照染色；中圖和右圖為實(shí)驗(yàn)組，G蛋白β1亞基主要定位于精母細(xì)胞和成熟精子細(xì)胞頂體中。左圖和中圖放大250倍，右圖放大500倍。
圖3.Western Blot檢測(cè)HSD-0.7蛋白與人G蛋白β1亞基在HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)情況1HA-tagged-HSD-0.7在HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)；2FLAG-tagged-Gβ1在HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)圖4.HSD-0.7蛋白與人G蛋白β1亞基在HEK 293細(xì)胞中的共定位研究左圖中綠色熒光顯示HA-tagged-HSD-0.7定位于HEK293細(xì)胞胞漿中；中間圖中紅色熒光顯示FLAG-tagged-Gβ1定位于HEK 293細(xì)胞胞漿中；右圖為前兩張圖片疊加的結(jié)果。兩種熒光疊加后呈現(xiàn)黃色，顯示HSD-0.7蛋白與人G蛋白β1亞基在HEK 293細(xì)胞中完全共定位圖5.細(xì)胞免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測(cè)HSD-0.7在去磷酸化狀態(tài)下和人G蛋白β1亞基結(jié)合以ProteinA-Agarose結(jié)合兔抗HSD-0.7蛋白抗血清為親合柱，加入轉(zhuǎn)染了相應(yīng)真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。以小鼠抗FLAG單克隆抗體為第一抗體，HRP結(jié)合的山羊抗小鼠IgG為第二抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。組4中用免疫前兔血清代替兔抗HSD-0.7蛋白抗血清。
1HA-tagged-HSD-0.7在HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)；2FLAG-tagged-Gβ1在HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)；3對(duì)照組FLAG-tagged-Gβ1不能與抗HSD-0.7蛋白抗血清結(jié)合；4對(duì)照組HA-tagged-HSD-0.7和FLAG-tagged-Gβ1不能與免疫前血清共沉淀；5實(shí)驗(yàn)組HA-tagged-HSD-0.7和FLAG-tagged-Gβ1在500μmol/L GDP存在時(shí)能夠共沉淀；6實(shí)驗(yàn)組HA-tagged-HSD-0.7和FLAG-tagged-Gβ1在200μmol/L GTPγs存在時(shí)不能共沉淀。
實(shí)施例1.HSD-3.8蛋白相互作用蛋白質(zhì)分子的篩選將HSD-0.7 cDNA克隆入pAS2-1質(zhì)粒，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。
用500μg人卵巢pACT2文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化帶有pAS2-1-HSD-0.7的酵母菌株Y190，共得到轉(zhuǎn)化子6.06×106，轉(zhuǎn)化子總數(shù)大于卵巢文庫(kù)的獨(dú)立克隆數(shù)，可滿(mǎn)足篩庫(kù)要求。一周后在SD/Trp-Leu-His-+20mmol/L 3-AT培養(yǎng)基上挑取較大的克隆進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)。隨后將初步判斷為陽(yáng)性的克隆擴(kuò)增并抽提酵母質(zhì)粒，將酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101進(jìn)行質(zhì)粒挽救；將挽救的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化Y190，以排除假陽(yáng)性。最后獲得一與誘餌質(zhì)粒相互作用克隆，該克隆編碼人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸。
2.人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸的原核表達(dá)及純化將編碼人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸的cDNA克隆到pET30a(+)載體中，用CaCl2法轉(zhuǎn)化BL21細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得高效表達(dá)的His6-tagged融合蛋白。
首先小量培養(yǎng)鑒定His6-tagged融合蛋白表達(dá)水平及該融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)形式，然后進(jìn)行大量表達(dá)，自經(jīng)過(guò)鑒定的質(zhì)粒保存板中挑單菌落入100ml新鮮LB的錐形瓶(含卡那霉素50μg/ml)。37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜菌液按1/10比例接種到一個(gè)含500ml LB(含卡那霉素)的2000ml錐形瓶中，37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)1-1.5h，使菌液的AD600mm值達(dá)0.4-0.6。加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3h。收集培養(yǎng)物，5000rpm離心10min，棄上清。PBS洗菌體沉淀，用PBS按照5ml/g重懸，冰浴下以工作10s/冷卻20s/300W/20次的參數(shù)，超聲破碎細(xì)胞。12000rpm離心20min，分別取少量上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析蛋白質(zhì)在胞內(nèi)表達(dá)形式。其余于-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 采用Novagen公司的His Bind Metal Chelation Resin產(chǎn)品進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的純化。經(jīng)鑒定表達(dá)蛋白以包涵體蛋白形式存在。以含6mol/L尿素的結(jié)合緩沖液(5mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20mmol/L Tris·HCl，pH7.9)重懸超聲裂解離心后的包涵體沉淀，于冰浴下靜置1.5小時(shí)或更長(zhǎng)，使包涵體完全裂解至溶液清亮。4℃，12000rpm離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片。輕混Ni-NTA樹(shù)脂，使其與保存液混勻呈完全懸浮狀態(tài)。吸取2.5ml樹(shù)脂懸液加到聚丙烯柱內(nèi)，使樹(shù)脂在重力作用下沉積。分別以3倍柱床體積去離子水、5倍體積charging buffer(50mM NiSO4)及3倍體積含6mol/L尿素的binding buffer洗柱。當(dāng)binding buffer下降到柱床上緣時(shí)，加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的待純化樣品。調(diào)節(jié)流速約為6滴/min。分別以10倍柱床體積含6mol/L尿素的bindingbuffer、6倍體積washing buffer(40mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20mmol/LTris·HCl，pH7.9)洗柱。以6倍體積或更少的含6mol/L尿素的elute buffer(1mol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，20mmol/LTris·HCl，pH7.9)洗脫目的蛋白，收集洗脫液。取少量進(jìn)行SDS-PAGE鑒定(圖1)。
3.人Gβ1-C144抗血清的制備兩只2kg重的新西蘭大耳白兔，一只作為實(shí)驗(yàn)組，一只為對(duì)照組。免疫前從耳緣靜脈取1ml正常血液收集血清做對(duì)照。
將純化的His6-tagged-Gβ1-C144與福氏完全佐劑混合，采用背部皮下多點(diǎn)注射，約20-30點(diǎn)。對(duì)照組取泡膠液與佐劑混合。初始免疫后2、4、8周采用抗原和福氏不完全佐劑混合進(jìn)行加強(qiáng)免疫。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)抗體滴度，Western Blot檢測(cè)抗體特異性。
4.睪丸組織切片的免疫組織化學(xué)分析5μm厚睪丸組織冰凍切片，改良Bovin液固定10min。PBS洗2次，每次5min。3％H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。5-10％正常羊血清(PBS配)室溫封閉10min。傾去封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的抗人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸抗血清，4℃過(guò)夜。PBS洗3次，每次5min。滴加適當(dāng)稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。滴加適當(dāng)稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素霉卵白素復(fù)合物，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。AEC顯色(4mgAEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml 0.1mol/L乙酸緩沖液，pH5.2，加入15μl 30％H2O2，過(guò)濾后即可)40min。自來(lái)水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，封片(圖2)。
5.HSD-0.7蛋白和人G蛋白β1亞基在HEK 293細(xì)胞中的共定位將HSD-0.7和人Gβ1亞基分別克隆入pcDNA6/V5-HisB-HA和pcDNA6/V5-HisB-FLAG質(zhì)粒，構(gòu)建融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。分組在HEK 293細(xì)胞中進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組1pcDNA6/V5-HisB-HA-HSD-0.7；實(shí)驗(yàn)組2pcDNA6/V5-HisB-FLAG-Gβ1。實(shí)驗(yàn)方法如下準(zhǔn)備將蓋玻片分次置于濃酸中浸泡2小時(shí)，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理的蓋玻片置于10倍稀釋的多聚賴(lài)氨酸溶液中，室溫放置5分鐘后取出，置于60℃干燥1小時(shí)或室溫過(guò)夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30分鐘。
實(shí)驗(yàn)前兩天將處理過(guò)的蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK 293細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)至90％飽和度。用50μl無(wú)抗生素?zé)o血清DMEM分別稀釋5μg質(zhì)粒和5μl LipofectAMINETM2000 Reagent(Invitrogen)。室溫放置2分鐘后將稀釋的質(zhì)粒和LipofectAMINE 2000 Reagent混勻，室溫放置20分鐘。將上述混合物加到6孔培養(yǎng)板中，來(lái)回振蕩混勻后放置于CO2孵箱。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后，將培養(yǎng)基換為有血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞免疫熒光染色1)細(xì)胞固定用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10分鐘。2)PBS漂洗，3×5分鐘。3)細(xì)胞透化室溫下，0.5％Triton/PBS透化處理10分鐘。4)PBS漂洗，3×5分鐘。5)細(xì)胞封閉以3％BSA/PBS封閉，37℃，30分鐘或4℃過(guò)夜。6)一抗孵育∶抗體按1∶100稀釋?zhuān)?7℃，30分鐘。7)PBS漂洗，3×5分鐘。8)二抗孵育∶抗體按1∶50稀釋?zhuān)?7℃，30分鐘。9)PBS漂洗，3×5分鐘。10)去離子水漂洗，2×5分鐘。11)封片取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，周?chē)弥讣子头庾　?2)用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察(圖4)。
6.Western Blot檢測(cè)HSD-0.7蛋白與人G蛋白β1亞基在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況12％SDS-PAGE電泳，電泳完畢，取下凝膠在凝膠一角切下一小塊作為標(biāo)記。將凝膠放入電轉(zhuǎn)緩沖液(3.03g Tris-HCl，14.41g甘氨酸，150ml甲醇，加去離子水至1000ml)中平衡5min，PVDF膜經(jīng)100％甲醇浸透，電轉(zhuǎn)液平衡20min，夾好支架在冰浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，80V，2h；或14V，12h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于TBS漂洗三次，每次5min。切下邊側(cè)的蛋白質(zhì)分子量Marker條帶，入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后以10％乙酸脫色至可見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶，蒸餾水漂洗觀(guān)察轉(zhuǎn)移效果，并密封保存留待以后作為分析結(jié)果時(shí)分子量的參照。轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)印膜勿干，加入適量封閉液中，室溫輕搖2h。將轉(zhuǎn)印膜放入雜交袋內(nèi)，按照0.1ml/cm2分別加入用封閉液以適當(dāng)比例稀釋的一抗，除盡氣泡，封口。于4℃輕搖過(guò)夜。取出轉(zhuǎn)印膜，用TBS-T洗三次，每次10min。將膜放入雜交袋內(nèi)，按照0.1ml/cm2加入用封閉液配制的堿性磷酸酶標(biāo)記或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)抗體，趕除氣泡封口，室溫振蕩2h。取出轉(zhuǎn)印膜，用TBS-T洗三次，每次10min。
堿性磷酸酶顯色反應(yīng)堿性磷酸酶顯色緩沖液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris-HCl pH9.5)洗膜5min。將轉(zhuǎn)印膜浸入含100μl Reagent A與100μl Reagent B(Bio-Rad)的10ml顯色緩沖液中，于室溫下輕輕搖晃使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，蒸餾水中漂洗，4℃避光保存并照相。
辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光法各取等體積ECL試劑A液、B液混合(按每平方厘米轉(zhuǎn)印膜0.125ml ECL混合液計(jì)算)。將轉(zhuǎn)印膜輕輕接觸濾紙吸干液體，有蛋白質(zhì)的一面朝上放在保鮮膜上。將ECL混合液加到轉(zhuǎn)印膜上，反應(yīng)1min，提起轉(zhuǎn)印膜，輕輕接觸濾紙吸干液體。用保鮮膜覆蓋轉(zhuǎn)印膜，注意表面要平整。用透明膠帶將保鮮膜覆蓋的轉(zhuǎn)印膜固定在顯影盒中，有蛋白質(zhì)的一面朝上。于暗室與X光片曝光10sec，30sec，1min不等，沖片觀(guān)察結(jié)果。
7.細(xì)胞免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測(cè)HSD-0.7在去磷酸化狀態(tài)下和人G蛋白β1亞基結(jié)合細(xì)胞轉(zhuǎn)染前兩天將75cm2培養(yǎng)瓶中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1∶3傳入75cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至70～80％時(shí)，用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。質(zhì)粒用量為880μl(40ng/μl)。轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞。每瓶中加入1.5ml冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(20mmol/L HEPES pH 7.5，150mmol/LNaCl，1％NP40，1mmol/L EDTA，100mmo/L NaF，10mmol/L焦磷酸鈉，20mmol/L β-甘油磷酸鈉，1mmol/L釩酸鈉1mmol/L DTT，2mmol/L PMSF 10μg/ml Aprotinin)，其中一瓶另加入500μmol/L GDP，一瓶另加入200μmol/L GTPγs。放置冰上裂解1h，其間追加一次PMSF，并且間隔10min用細(xì)胞刮攪動(dòng)一次。細(xì)胞裂解物于4℃ 14000rpm離心20min后收集上清。1ml細(xì)胞裂解液中加入40μl 50％protein A agarose，4℃振搖3h以除去非特異吸附的蛋白質(zhì)。12000rpm離心20sec收集上清。將40μl anti-HSD-0.7的兔抗血清加入上清中，4℃振搖1h后再追加50μl 50％protein A agarose，繼續(xù)振搖1h。隨后用含有1mmol/L釩酸鈉的裂解液1ml洗滌3次，最后再用不含釩酸鈉的裂解液洗滌一次。樣品經(jīng)上樣緩沖液處理，用抗FLAG的單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，ECL法顯色(圖5)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一個(gè)人睪丸特異表達(dá)的、與生育相關(guān)的HSD-3.8基因編碼的蛋白質(zhì)片段，命名為HSD-0.7。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之HSD-0.7基因/蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)在酵母雙雜交系統(tǒng)中能夠與人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸(Gβ1-C144)相互作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之HSD-0.7基因/蛋白質(zhì)，其特征在于在酵母雙雜交系統(tǒng)中與該基因/蛋白質(zhì)相互作用的人G蛋白β1亞基的同源基因在大鼠睪丸組織中主要表達(dá)于精母細(xì)胞和成熟精子細(xì)胞頂體中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述之HSD-0.7基因/蛋白質(zhì)，其特征在于在HEK 293細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)的HSD-0.7蛋白和Gβ1亞基都分布于細(xì)胞胞質(zhì)中，而且二者呈現(xiàn)完全共定位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述之HSD-0.7基因/蛋白質(zhì)，其特征在于HSD-0.7蛋白只有在去磷酸化狀態(tài)下才呈現(xiàn)活性并和Gβ1亞基結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述之HSD-0.7基因/蛋白質(zhì)，其特征在于HSD-0.7蛋白與Gβ1亞基在特定條件下的結(jié)合與各類(lèi)生精細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)及精卵識(shí)別和融合等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，在抗生育領(lǐng)域以及新藥的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)中具有潛在的應(yīng)用前景。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)人睪丸特異表達(dá)的基因編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，該基因/蛋白質(zhì)命名為HSD－3.8(GenBank注冊(cè)號(hào)AF311312)。內(nèi)容包括以HSD－3.8蛋白中與生育相關(guān)的片段HSD－0.7作為“誘餌”蛋白，利用酵母雙雜交的方法篩選人卵巢cDNA文庫(kù)，得到編碼人G蛋白β1亞基羧基端144個(gè)氨基酸的cDNA片段；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，G蛋白β1亞基在大鼠睪丸組織中主要定位于精母細(xì)胞和成熟精子細(xì)胞頂體中；細(xì)胞免疫熒光共定位結(jié)果顯示，在HEK 293細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)的“誘餌”蛋白和“捕獲”蛋白都分布于胞漿中，二者呈現(xiàn)完全共定位；細(xì)胞免疫共沉淀結(jié)合Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明HSD－0.7在去磷酸化狀態(tài)下呈現(xiàn)活性并和Gβ1相互作用。這些結(jié)果提示HSD－3.8蛋白不僅參與了精子發(fā)生和受精過(guò)程，而且影響了各類(lèi)生精細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)及精卵識(shí)別和融合過(guò)程，闡明其生理生化功能對(duì)了解精子發(fā)生及受精過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制具有重要的意義。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1515588SQ0310018
公開(kāi)日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2003年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月9日
發(fā)明者劉寧, 林雯, 繆時(shí)英, 王琳芳, 張曉東, 宗書(shū)東, 劉 寧 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所