專利名稱：癌的診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及諸如癌癥等惡性疾病，特別涉及診斷某些癌癥、例如卵巢癌的方法和組合物。
背景技術(shù)：
癌癥包括多種疾病，影響全世界約四分之一人口。癌癥不利影響的嚴重性是深遠的，一般影響醫(yī)療政策、程序及社會。許多類型癌癥的特征在于惡性細胞快速而失調(diào)的增殖，因此需要早期檢測及診斷是改進癌癥解決方法的突出難題。為開發(fā)診斷惡性疾病存在的準確可靠的標準，已經(jīng)進行了很多努力。很多努力特別針對使用血清學定義的抗原性標志，稱為腫瘤相關(guān)抗原，它由癌細胞獨特表達或以顯著較高的水平存在于惡性疾病的受試者中。
然而，由于腫瘤相關(guān)抗原表達具有高度不均一性，例如癌抗原差異極大，需要用于癌癥診斷的另外的腫瘤標志。已知許多單克隆抗體與癌相關(guān)抗原具有反應(yīng)性(參見例如Papsidero，1985 Semin.Surg.Oncol.1171，Allum等人，1986 Surg.Ann.1841)。以上及其它所述單克隆抗體可結(jié)合各種不同的癌相關(guān)抗原，包括糖蛋白、糖脂和粘蛋白(mucin)(參見例如Fink等人，1984 Prog.Clin.Pathol.9121；美國專利4,737,579；美國專利4,753,894；美國專利4,579,827；美國專利4,713,352)。很多這類單克隆抗體識別受限表達于源自特定細胞系或組織類型的某些而非其它腫瘤的腫瘤相關(guān)抗原。
只有相對較少的腫瘤相關(guān)抗原的例子似乎可用于鑒定特定類型的惡性腫瘤。例如單克隆抗體B72.3特異性結(jié)合選擇性表達于很多不同癌(包括若非全部也是多數(shù)的卵巢癌以及絕大多數(shù)非小細胞肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌)上的高分子量(＞106Da)腫瘤相關(guān)粘蛋白抗原(參見例如Johnston，1987 Acta Cytol.1537；美國4,612,282)。然而，對于優(yōu)選在積聚大量腫瘤物質(zhì)之前早期檢測惡性疾病的診斷性篩選而言，手術(shù)切除腫瘤后檢測細胞相關(guān)的腫瘤標志(例如由B72.3識別的粘蛋白抗原)可能用處有限。
通過篩選手術(shù)切除樣本的腫瘤相關(guān)抗原來診斷特定類型癌癥的替代方法，將提供用于檢測通過非侵害性或最小侵害性方法所獲受試者樣品中這類抗原的組合物和方法，通常只在檢測到積聚的腫瘤物質(zhì)之后才需要侵害性手術(shù)。例如卵巢和其它癌癥，目前在易于獲得的生物學液體、例如血清或粘膜分泌物樣品中可檢測到很多可溶性腫瘤相關(guān)抗原。其中標志之一是癌相關(guān)抗原CA125，它脫落到血流中，可在血清中檢測到(例如Bast等人，1983 N Eng.J.Med.309883；Lloyd等人，1997 Int.J Canc.71842)。已經(jīng)測定了血清及其它生物學液體中的CA125水平連同其它標志的水平，例如癌胚抗原(CEA)、鱗狀細胞癌抗原(SCC)、組織多肽特異性抗原(TPS)、唾液酸TN粘蛋白(sialylTN mucin，STN)以及胎盤堿性磷酸酶(PLAP)，以便提供卵巢和其它癌癥的診斷性和/或預(yù)后性特征(例如Sarandakou等人，1997 Acta Oncol.36755；Sarandakou等人，1998 Eur.J.Gynaecol.Oncol.1973；Meier等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)2945；Kudoh等人，1999 Gynecol.Obstet.Invest.4752；Ind等人，1997 Br.J.Obstet.Gynaecol.1041024；Bell等人1998 Br..1 Obstet.Gynaecol.1051136；Cioffi等人，1997Tumori 83594；Meier等人1997 Anticanc.Res.17(4B)2949；Meier等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)3019)。
然而，血清CA125單獨或連同其它已知標識物的水平升高，未提供惡性腫瘤、或特定惡性腫瘤(例如卵巢癌)的明確診斷。例如，陰道分泌液和血清中CA125、CEA和SCC升高，相對于宮頸癌和生殖道癌，與良性婦科疾病中的炎癥高度相關(guān)(例如Moore等人，1998 Infect.Dis.Obstet.Gynecol.6182；Sarandakou等人，1997 Acta Oncol.36755)。另一個例子，血清CA125升高可能還伴有成神經(jīng)細胞瘤(例如Hirokawa等人，1998 Surg.Today 28349)，而CEA和SCC等升高可能伴有結(jié)腸直腸癌(Gebauer等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)2939)。另一標志，分化抗原mesothelin表達于正常間皮細胞表面以及某些癌細胞、包括內(nèi)皮卵巢腫瘤和間皮瘤。有關(guān)mesothelin的組合物和方法(Chang等人，1992 Canc.Res.52181；Chang等人，1992 Int.J.Canc.50373；Chang等人，1992 Int.j.Canc.51548；Chang等人，1996 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93136；Chowdhury等人，1998 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95669；Yamaguchi等人，1994 J.Biol.Chem.269805；Kojima等人，1995 J.Biol.Chem.27021984)以及結(jié)構(gòu)相關(guān)的mesothelin相關(guān)抗原(MRA；參見例如Scholler等人，1999 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 9611531)為本領(lǐng)域已知，包括在癌癥檢測和治療中的用途，如WO 00/50900和美國申請09/513,597所述。因此顯然迫切需要使用另外的標志，包括用于多因子診斷性篩選的標志。(參見例如Sarandakou等人，1998；Kudoh等人，1999；Ind等人，1997.)如下文詳述，這類另外的標志可能由“四-二硫鍵核心(four-disulfide core)”蛋白質(zhì)家族有效提供，其包含具有不同功能的酸或熱穩(wěn)定性小分子，并包括人附睪四-二硫鍵核心蛋白質(zhì)或″HE4″(Kirchhoff等人，1991 Biol.Reprod.45350-357；Wang等人，1999 Gene229101；Schummer等人，1999 Gene 238375)。據(jù)認為四-二硫鍵核心家族成員多肽氨基酸序列中的八個核心半胱氨酸殘基的保守性間隔指導這些分子折疊為緊密而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。許多四-二硫鍵核心家族成員是蛋白酶抑制劑；但尚未明確鑒定某些家族成員、包括HE4的功能。四-二硫鍵核心蛋白質(zhì)家族的其它成員包括Wp蛋白質(zhì)、SLP-1和ps20，已經(jīng)從若干物種中分離了四-二硫鍵核心蛋白質(zhì)家族的另外成員。這些蛋白質(zhì)共享若干特性，包括尺寸小以及熱及酸穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，這是由四-二硫鍵核心穩(wěn)定。這些蛋白質(zhì)由分泌細胞產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)于粘性分泌物中，例如精漿、乳汁、腮腺及宮頸分泌物。
已經(jīng)克隆了四-二硫鍵核心家族的原型分子Wp蛋白質(zhì)，也稱為乳清磷蛋白(Dandekar等人，1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 793987-3991)。乳清磷蛋白在乳汁中表達，約1-2mg/ml，但在基因超甲基化的乳癌中不表達。未發(fā)現(xiàn)乳清磷蛋白對蛋白酶具有抑制活性。然而，該基因在轉(zhuǎn)基因動物中過表達損害了乳房小泡細胞的發(fā)育(Burdon等人，1991 Mechanisms Dev.3667-74)，提示該蛋白質(zhì)在沁乳期的重要作用。從人的子宮頸克隆了另一種四-二硫鍵核心家族蛋白質(zhì)分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(SLP-1)，但它也存在于其它粘性分泌物中，包括精漿和腮腺分泌物(Heinzel等人，1986 Eur.J.Biochem.16061-67)。SLP-1是12kDa的兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和組織蛋白酶G潛在的抑制劑。已經(jīng)公布了SLP-1復合胰凝乳蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)(Grutter等人，1988 EMBO J.7345-351)。上述資料表明，SLP-1結(jié)構(gòu)域可以獨立并同時抑制不同的蛋白酶，在結(jié)構(gòu)域2中鑒定了可結(jié)合胰凝乳蛋白酶的小的(8氨基酸)活性位點。
彈力素(elafin)是四-二硫鍵核心家族的單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)成員，分離自人牛皮癬皮膚，以確定該多肽的氨基酸序列(Wiedow等人，1990 J.Biol.Chem.26514791-14795)。彈力素是彈性蛋白酶的潛在抑制劑，但對其它蛋白酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G或纖溶酶不表現(xiàn)明顯的抑制活性。彈力素的氨基酸序列顯示與SLP-1C端區(qū)(結(jié)構(gòu)域1)38％的同源性。最近從平滑肌中分離了編碼ps20蛋白質(zhì)的基因，將該基因轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，表達了ps20蛋白質(zhì)(Larsen等人，1998J.Biol.Chem.2734574-4584)。發(fā)現(xiàn)ps20抑制癌細胞生長，已經(jīng)將其歸類為生長抑制劑；但迄今未描述該蛋白質(zhì)的直接功能活性(例如抑制蛋白酶)。
如上所述，雖然已從精漿中鑒定了其它小的酸和熱穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑，認為其通過結(jié)合精子并調(diào)節(jié)精子與卵細胞外基質(zhì)的相互作用而在生育中具有重要作用，但尚未鑒定最初從附睪上皮細胞中鑒定的HE4具有蛋白酶抑制活性(Fitz等人，Proteases and Biological Controls，Reich，E.，Rifkin，D.，Shaw，E.(eds.)，1975 Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.737-766；Saling，1989Oxf.Rev.Reprod.Biol.11339-388)。HE4 cDNA起初分離自人的附睪(Kirchhoff等人，1991 Biol.Reprod.45350-357)，后來在構(gòu)建自卵巢癌的cDNA文庫中檢測到很高頻率的HE4 cDNA(Wang等人，1999 Gene229101；Schummer等人，1999 Gene 238375)。
由于上述原因，顯然需要改進的診斷標志和治療靶標，用于檢測和治療惡性疾病，例如癌癥。本發(fā)明的組合物和方法通過使用HE4和/或HE4相關(guān)抗原的特異性抗體檢測以可溶性形式和/或在細胞表面天然存在的多肽，從而提供了篩選惡性疾病存在的方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)的上述局限，并帶來了其它相關(guān)益處。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于篩選受試者中惡性疾病存在的組合物和方法。本發(fā)明特別涉及以下意外發(fā)現(xiàn)，即可以在受試者的生物樣品中檢測以可溶性形式天然存在并具有與HE4a多肽的至少一種特異性抗體反應(yīng)的抗原決定蔟的可溶性及細胞表面形式的HE4多肽，此處稱作HE4a或HE4a分子。
本發(fā)明一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足以檢測抗體與抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使受試者生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的抗體，以確定該生物樣品中存在以可溶性形式天然存在于樣品中的分子、或在樣品包含至少一個受試者細胞的某些實施方案中以細胞表面分子存在的分子，該分子具有與至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定蔟，從而檢測惡性疾病的存在。在某些實施方案中，該生物樣品是血液、血清、漿膜液、血漿、淋巴、尿、腦脊髓液、唾液、粘膜分泌物、陰道分泌物、腹水、胸膜液、心包膜液、腹膜液、腹液、培養(yǎng)基、條件培養(yǎng)基和灌洗液。
在某些其它實施方案中，該HE4a多肽包含具有SEQ ID NO5、7、9或11中任一項所示氨基酸序列的多肽、或其片段或衍生物。在另一實施方案中，該HE4a抗原多肽變體是剪接變體。在本發(fā)明某些實施方案中，抗體包含多克隆抗體，其它實施方案中的抗體包含親和純化的抗體。在特別優(yōu)選的實施方案中，該抗體包含單克隆抗體。在另一實施方案中，該抗體包含重組抗體，另一實施方案中的抗體包含嵌合抗體。在另一實施方案中，該抗體包含人源化抗體。在另一實施方案中，該抗體包含單鏈抗體。
在本發(fā)明某些實施方案中，檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含檢測放射性核素。在其它實施方案中，檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含檢測熒光團。在另一實施方案中，檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含檢測親和素分子與生物素分子之間的結(jié)合事件，另一實施方案中，檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含檢測鏈親和素分子與生物素分子之間的結(jié)合事件。在某些實施方案中，檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含分光光度法檢測酶反應(yīng)產(chǎn)物。在本發(fā)明某些實施方案中，至少一種抗體被可檢測性標記，而在某些其它的實施方案中，至少一種抗體未被可檢測性標記，對抗體結(jié)合抗原決定簇的檢測是間接的。
根據(jù)本發(fā)明某些實施方案，惡性疾病可能是腺癌、間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌或非小細胞肺癌。
本發(fā)明另一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足以檢測抗體與抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使受試者生物樣品接觸至少一種抗體，以確定該生物樣品中存在選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于樣品中的分子，以及(ii)樣品包含受試者細胞時的細胞表面分子，該分子具有與至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定蔟，其抗原結(jié)合位點競爭性抑制單克隆抗體2H5、3D8或4H4的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。
本發(fā)明另一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足以檢測抗體與抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使受試者生物樣品接觸至少一種抗體，以確定該生物樣品中存在選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于樣品中的分子，以及(ii)樣品包含受試者細胞時的細胞表面分子，該分子具有與抗體反應(yīng)的抗原決定蔟，其抗原結(jié)合位點競爭性抑制單克隆抗體3D8的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。
本發(fā)明另一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足以檢測至少一種抗體與抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下(其中該至少一種抗體免疫特異性結(jié)合HE4a抗原)，使受試者生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的抗體，以確定該生物樣品中存在選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于樣品中的分子，以及(ii)樣品包含受試者的細胞時的細胞表面分子，該分子具有與抗體反應(yīng)的抗原決定蔟，從而檢測惡性疾病的存在。在某些實施方案中，該HE4a抗原也與單克隆抗體3D8、2H5或4H4免疫特異性反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足以檢測抗體與抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下(其中該至少一種抗體免疫特異性結(jié)合HE4a抗原)，使受試者生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的抗體，以確定該生物樣品中存在選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于樣品中的分子，以及(ii)樣品包含受試者細胞時的細胞表面分子，該分子具有與至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定蔟，其抗原結(jié)合位點競爭性抑制單克隆抗體2H5或4H4的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。在某些實施方案中，該mesothelin相關(guān)抗原也與單克隆抗體3D8免疫特異性反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足夠使至少一種固定化的第一抗體與HE4a抗原多肽特異性結(jié)合、從而形成免疫復合物的條件和時間下，使受試者生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的固定化的第一抗體，以確定該生物樣品中存在以可溶性形式天然存在于樣品中的分子；去除未特異性結(jié)合至少一種固定化第一抗體的樣品組分，在足以檢測至少一種第二抗體與HE4a抗原多肽特異性結(jié)合的條件和時間下，使免疫復合物接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的至少一種第二抗體，其中至少一種第二抗體的抗原結(jié)合位點不競爭性抑制至少一種固定化第一抗體的抗原結(jié)合位點，從而檢測惡性疾病的存在。
本發(fā)明另一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足夠使至少一種固定化第一抗體與HE4a抗原多肽結(jié)合、從而形成免疫復合物的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的固定化的第一抗體，以確定所述生物樣品中存在以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，其中至少一種第一抗體的抗原結(jié)合位點競爭性抑制單克隆抗體3D8的免疫特異性結(jié)合；去除未特異性結(jié)合至少一種固定化第一抗體的樣品組分；在足以檢測至少一種第二抗體與HE4a抗原多肽特異性結(jié)合的條件和時間下，使免疫復合物接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的第二抗體，其中所述至少一種第二抗體的抗原結(jié)合位點不競爭性抑制單克隆抗體2H5的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。
本發(fā)明另一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足夠至少一種固定化第一抗體與HE4a抗原多肽結(jié)合、從而形成免疫復合物的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的固定化的第一抗體，以確定所述生物樣品中存在以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，其中至少一種第一抗體的抗原結(jié)合位點競爭性抑制單克隆抗體3D8的免疫特異性結(jié)合；去除未特異性結(jié)合至少一種固定化第一抗體的樣品組分；在足以檢測至少一種第二抗體與mesothelin相關(guān)抗原多肽特異性結(jié)合的條件和時間下，使免疫復合物接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的第二抗體，其中所述至少一種第二抗體的抗原結(jié)合位點不競爭性抑制單克隆抗體4H4的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。
在某些實施方案中，本發(fā)明方法另外包含確定所述樣品中存在惡性疾病的至少一種可溶性標志，其中該標志是mesothelin相關(guān)抗原、癌胚抗原、CA125、唾液酸TN、鱗狀細胞癌抗原、組織多肽抗原或胎盤堿性磷酸酶。
本發(fā)明另一方面提供了篩選受試者中惡性疾病存在的方法，其包含在足以檢測抗體與抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使(i)懷疑具有惡性疾病的第一位受試者的第一份生物樣品以及(ii)已知沒有惡性疾病的第二位受試者的第二份生物樣品各接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的抗體，以確定第一份和第二份生物樣品每一份中存在一種分子，該分子選自(i)以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，(ii)第一份和第二份生物樣品各分別包含來自第一位和第二位受試者的細胞時的細胞表面分子，該分子具有與至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇，并比較該抗體與第一份及第二份生物樣品中抗原決定簇的可檢測性結(jié)合水平，從而檢測惡性疾病的存在。
另一方面，本發(fā)明提供了篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含檢測受試者生物樣品中存在免疫特異性結(jié)合HE4a抗原多肽的抗體。在某些實施方案中，該mesothelin相關(guān)抗原多肽包含具有SEQ IDNO5、7、11或13中任一項所示氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明另一方面提供HE4a抗原多肽特異性的抗體，其包含特異性結(jié)合HE4a抗原多肽的單克隆免疫球蛋白可變區(qū)，該HE4a抗原多肽包含具有SEQ ID NO5、7、11或13中任一項所示氨基酸序列。在某些實施方案中，該抗體時融合蛋白質(zhì)，而某些其它實施方案的抗體是單鏈抗體。在某些實施方案中，該HE4a抗原多肽另外包含糖基化多肽。在其它實施方案中，該抗體特異性結(jié)合SEQ ID NO11所示HE4a抗原多肽序列、但不特異性結(jié)合SEQ ID NO9所示多肽序列，或該抗體特異性結(jié)合SEQ ID NO11所示HE4a抗原多肽序列以及SEQ ID NO9所示多肽序列。在某些實施方案中，該抗體是單克隆抗體2H5、3D8或4H4。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測HE4a多肽結(jié)合以可溶性形式天然存在于樣品中的抗體的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸可檢測性標記的HE4a多肽，從而檢測惡性疾病的存在。
本發(fā)明另一方面提供了分離的核酸分子，該核酸分子是編碼HE4a抗原多肽的核酸分子，該多肽包含SEQ ID NO5、7、11或13所示氨基酸序列；或該核酸分子是編碼HE4a抗原多肽、或融合蛋白質(zhì)、或能夠在中度嚴謹性條件下與所述編碼HE4a抗原的核酸分子雜交的核酸分子，其中該分離的核酸分子不是由SEQ ID NO9所示核酸序列組成的核酸分子。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了反義寡核苷酸，其包含與編碼HE4a抗原多肽的核酸分子互補的至少15個連續(xù)核苷酸。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了融合蛋白質(zhì)，其包含與HE4a抗原多肽融合的多肽序列。在某些另外的實施方案中，該融合結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白或其變體或片段。在某些另外的實施方案中，該融合HE4a抗原多肽的多肽序列可由蛋白酶切割的。在另一實施方案中，該多肽序列是具有配基親和力的親和標記多肽。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了重組表達構(gòu)建體，其包含至少一種與上述編碼HE4a抗原多肽的核酸分子可操作性連接的啟動子。在某些實施方案中，該啟動子是調(diào)節(jié)啟動子，在某些其它實施方案中，該HE4a多肽被表達為與另一種核酸序列的多肽產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)。在另一實施方案中，所述另一種核酸序列的多肽產(chǎn)物是免疫球蛋白恒定區(qū)。在另一實施方案中，該表達構(gòu)建體是重組病毒性表達載體。根據(jù)其它實施方案，本發(fā)明提供了包含此處提供的重組表達構(gòu)建體的宿主細胞。在一個實施方案中，該宿主細胞是原核細胞，而另一實施方案的宿主細胞是真核細胞。
另一方面，本發(fā)明提供了通過培養(yǎng)包含重組表達構(gòu)建體的宿主細胞而產(chǎn)生重組HE4a抗原多肽的方法，該構(gòu)建體包含至少一種與此處提供的編碼HE4a抗原多肽的核酸分子可操作連接的啟動子。在某些實施方案中，該啟動子是調(diào)節(jié)型啟動子。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了通過培養(yǎng)利用此處提供的用于表達重組HE4a抗原多肽的重組病毒表達構(gòu)建體感染的宿主細胞產(chǎn)生重組HE4a抗原多肽的方法。
在另一實施方案中，本發(fā)明還提供了檢測樣品中HE4a表達的方法，其通過使上述反義寡核苷酸接觸包含編碼具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽的核酸序列、或其片段或變體的樣品；并檢測樣品中一定量的可與該反義寡核苷酸雜交的HE4a多肽編碼核酸，從而檢測樣品中HE4a的表達。在另一實施方案中，使用聚合酶鏈式反應(yīng)來測定可與該反義寡核苷酸雜交的HE4a多肽編碼核酸的量。在另一實施方案中，使用雜交分析來測定可與該反義寡核苷酸雜交的HE4a多肽編碼核酸的量。在另一實施方案中，該樣品包含RNA或cDNA制備物。
根據(jù)本發(fā)明的某些其它實施方案提供了治療惡性疾病的方法，其包含給予有此需要的患者包含HE4a抗原多肽特異性抗體的組合物，該抗體包含特異性結(jié)合具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a抗原多肽的單克隆免疫球蛋白可變區(qū)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了治療惡性疾病的方法，其包含給予有此需要的患者包含具有SEQID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的組合物。在某些另外的實施方案中，該組合物誘導患者產(chǎn)生能夠特異性結(jié)合具有SEQID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的抗體，在某些其它另外的實施方案中，該組合物誘導患者能夠特異性識別具有SEQ IDNO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的T淋巴細胞。根據(jù)某些其它的實施方案提供了改變(例如以統(tǒng)計學顯著的方式相對于合適的對照提高或降低)受孕、避孕和/或生育的組合物和方法，其包含給予HE4a多肽或其片段或變體(包括融合蛋白質(zhì))、或給予包含可特異性結(jié)合HE4a多肽、或其片段或變體的免疫球蛋白可變區(qū)的組合物。
參照以下發(fā)明詳述及附圖，本發(fā)明上述及其它方面將更為顯而易見。此外，此處所示各種參考文獻詳述了本發(fā)明的某些方面，因而全文引入以供參考。
附圖簡述

圖1顯示實時PCR檢測一系列人樣品中的HE4a編碼cDNA。
圖2顯示所表達的HE4a融合蛋白質(zhì)的western印跡分析。
圖3描述利用ELISA檢測兩只免疫小鼠(1605和1734)血清中與HE4a-mIg融合蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體。
圖4描述使用ELISA篩選雜交瘤上清并檢測HE4a特異性雜交瘤抗體的典型結(jié)果。
圖5顯示使用固定化HE4a特異性單克隆抗體3D8作為捕獲劑、生物素化HE4a特異性單克隆抗體2H5作為檢測劑，通過雙測定子夾心ELISA檢測HE4a-hIgG融合蛋白質(zhì)。還顯示檢測卵巢癌細胞系4007上清液中的可溶性HE4a(A)。
圖6顯示利用夾心ELISA檢測系列稀釋的卵巢癌患者腹水中的HE4a抗原。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分涉及有關(guān)此處所述″四-二硫鍵核心″蛋白質(zhì)家族新成員HE4a的發(fā)現(xiàn)，它顯示高度類似但不同于HE4的序列(Kirchhoff等人，1991 Biol.Reproduct.45350-357)。如此處所述，極其意外地顯示HE4a(而非HE4)在某些惡性腫瘤、例如卵巢癌以及許多其它人組織中過表達，與HE4在人附睪上皮細胞中的有限表達模式明顯相反(Kirchhoff等人，1991)。本發(fā)明還部分涉及此處所述組合物和方法所獲得的驚人益處，其提供了檢測受試者中天然存在的細胞表面和/或可溶性形式的某些基因產(chǎn)物(此處即指HE4a多肽)，包括在具有某些癌癥(例如卵巢癌)的受試者中水平升高的所述多肽。本發(fā)明因而提供了有用的組合物和方法，通過特異性檢測該細胞表面和/或可溶性HE4a多肽來檢測和診斷受試者的惡性疾病。
如下文詳述，本發(fā)明的某些實施方案涉及HE4a多肽，其包括可溶性和細胞表面形式的HE4a和HE4多肽，包括HE4和HE4a多肽抗原和融合蛋白質(zhì)。在某些其它的實施方案中，本發(fā)明涉及HE4a多肽的片段、衍生物和/或類似物。簡言之，根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案提供了通過使受試者的生物樣品接觸人HE4a多肽特異性抗體來篩選受試者中存在惡性疾病的方法。此處公開了HE4a多肽和HE4a-Ig融合蛋白質(zhì)的完整氨基酸及核酸編碼序列，包括意外觀察到來源于卵巢癌cDNA的核酸分子編碼具有不同于Kirchhoff等人(1991)所述HE4序列的表達產(chǎn)物，更意外觀察到雖然Kirchhoff等人所述HE4表達局限于附睪上皮細胞，但很容易在卵巢癌中檢測到本公開的HE4a表達。
如此處所述，提供了特異性識別HE4多肽的單克隆抗體，使本領(lǐng)域一般技術(shù)人員使用本說明教導連同本領(lǐng)域公知的方法，可能按常規(guī)無需過多實驗來免疫宿主并篩選HE4a多肽特異性抗體產(chǎn)生。例如，此處描述了構(gòu)建重組HE4a表達載體和宿主細胞、包括重組HE4a融合蛋白質(zhì)，并提供了HE4a特異性抗體。
根據(jù)此處所述HE4a多肽的物理化學及免疫化學特性并使用本公開的HE4a編碼核酸序列，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員也可能制備重組HE4a多肽，可用于按照公知方法產(chǎn)生及表征特異性抗體。HE4a多肽可以在合適啟動子的控制下于哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中表達。也可以使用來源于此處所述HE4a多肽DNA編碼區(qū)的RNA，利用無細胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)。用于原核和真核宿主的合適克隆及表達載體由Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY，(1989)所述。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，在哺乳動物細胞中表達HE4a多肽。
本發(fā)明的核酸可能是RNA或DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA。DNA可能是雙鏈或單鏈，若為單鏈，則可能是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。本發(fā)明所用編碼HE4a多肽的編碼序列可能與SEQ ID NO3、4、6、10或12所示編碼序列一致，或者可能是由于遺傳密碼的豐余性或簡并性而產(chǎn)生的不同的編碼序列編碼與例如SEQ ID NO10和12的cDNA相同的HE4a多肽。本發(fā)明因而提供編碼具有SEQ ID NO5、7、11或13氨基酸序列的HE4a抗原多肽的分離的核酸分子、或能夠與該HE4a多肽編碼核酸雜交的核酸分子、或具有與其互補的序列的核酸分子。
變體顯示與編碼天然He4a抗原多肽或其部分的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO10和12所示核酸序列)優(yōu)選至少約70％一致性、更優(yōu)選至少約80-85％一致性、最優(yōu)選至少約90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。使用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員公知的計算機算法、例如可在NCBI網(wǎng)站(http//www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)獲得的Align或BLAST算法(Altschul，J.Mol.Biol.219555-565，1991；Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919，1992)進行序列比較，很容易測定一致性百分比?？墒褂萌笔?shù)。
某些變體與天然基因基本同源。在中度嚴謹性條件下，這類多核苷酸變體能夠與天然存在的編碼天然HE4a抗原的DNA或RNA序列(或其互補序列)雜交。合適的中度嚴謹性條件包括，例如以下步驟或其等效步驟在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液中預(yù)洗；在50℃-65℃、5X SSC中雜交過夜；然后在包含0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC中65℃、20分鐘各洗滌兩次。另外的嚴謹性條件可能包括，例如在0.1X SSC和0.1％SDS中60℃洗滌15分鐘或等效條件。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員容易理解，可能按常規(guī)方式改變參數(shù)，以產(chǎn)生按某種方式選擇特定目的核酸的適當嚴謹性雜交條件，另當進一步理解所述條件可能特別隨雜交中涉及的特定核酸序列而定，例如此處公開的編碼He4a多肽的SEQ ID NO10和12序列。另見，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing，1995，有關(guān)核酸雜交條件選擇。
編碼HE4a多肽，例如具有SEQ ID NO11氨基酸序列的人HE4a多肽、或本發(fā)明所用任何其它的HE4a多肽的核酸可能包括但不限于僅僅HE4a多肽的編碼序列；HE4a多肽編碼序列及另外的編碼序列；HE4a多肽編碼序列(并可選另外的編碼序列)及非編碼序列，諸如內(nèi)含子或HE4a多肽編碼序列的5′和/或3′非編碼序列，例如可能另外包括但不必限于一種或多種調(diào)節(jié)性核酸序列，可能是受調(diào)節(jié)或可調(diào)節(jié)的啟動子、增強子、其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列、抑制子結(jié)合序列、翻譯調(diào)節(jié)序列或任何其它調(diào)節(jié)性核酸序列。因此，術(shù)語″HE4a多肽的編碼核酸″涵蓋只包括該多肽編碼序列的核酸以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的核酸。
本發(fā)明另外涉及此處所述核酸的變體，其編碼HE4a多肽的片段、類似物和衍生物，例如具有SEQ ID NO11推斷的氨基酸序列的人HE4a多肽。編碼HE4a的核酸的變體可能是該核酸天然存在的等位變體或非天然存在的變體。如本領(lǐng)域所知，等位變體是可能具有至少一個替換、缺失或添加一個或多個核苷酸的另一種形式的核酸序列，其中任何一種均基本不改變所編碼的HE4a多肽的功能。因此，例如本發(fā)明包括編碼SEQ ID NO5、7或11所示相同HE4a多肽的核酸以及所述核酸的變體，這些變體可能編碼其中任何多肽的片段、衍生物或類似物。
通過HE4a多肽編碼核酸序列的突變可能獲得HE4a的變體和衍生物。利用多種常規(guī)方法之一，可能進行天然氨基酸序列的改變。通過合成包含突變序列的寡核苷酸，并側(cè)接限制性位點以便連接天然序列片段，可以在特定位點引入突變。連接后得到的重構(gòu)序列編碼具有所需氨基酸插入、替換或缺失的類似物。
或者，可以利用寡核苷酸指導的位點特異性突變方法提供改變的基因，其中可以通過替換、缺失或插入而改變預(yù)訂的密碼子。進行此類改變的典型方法公開于Walder等人(Gene 42133，1986)；Bauer等人(Gene 3773，1985)；Craik(Bio Techniques，January 1985，12-19)；Smith等人(Genetic EngineeringPrinciples and Methods，PlenumPress，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488，1985)；Kunkel等人(Methods in Enzymol.154367，1987)；以及美國專利4,518,584和4,737,462。
鑒定用作反義物質(zhì)的核酸分子、包括HE4a多肽或其變體或片段的編碼核酸序列特異性的反義寡核苷酸和核酶；以及鑒定編碼供基因治療靶向轉(zhuǎn)移的HE4a基因的DNA寡核苷酸，均涉及本領(lǐng)域公知的方法。例如，眾所周知該寡核苷酸所需的特性、長度及其它特征。在某些優(yōu)選實施方案中，這種反義寡核苷酸包含至少15-30個與此處提供的編碼HE4a多肽的分離的核酸分子互補的連續(xù)核苷酸，在某些其它的實施方案中，這種反義寡核苷酸可能包含至少31-50、51-75、76-125或更多的與此處提供的編碼HE4a多肽的分離的核酸分子互補的連續(xù)核苷酸。一般使用以下連接將反義寡核苷酸設(shè)計成抗內(nèi)源性溶核酶降解硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、砜(sulfone)、硫酸酯(sulfate)、ketyl，二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯及其它這類連接(參見例如Agrwal等人，Tetrehedron Lett.283539-3542(1987)；Miller等人，J Am.Chem.Soc.936657-6665(1971)；Stec等人，Tetrehedron Lett.262191-2194(1985)；Moody等人，Nucl.Acids Res.124769-4782(1989)；Uznanski等人，Nucl.Acids Res.(1989)；Letsinger等人，Tetrahedron 40137-143(1984)；Eckstein，Annu.Rev.Biochem.54367-402(1985)；Eckstein，Trends Biol.Sci.1497-100(1989)；SteinInOligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of Gene Expression，Cohen，Ed，Macmillan Press，London，pp.97-117(1989)；Jager等人，Biochemistry 277237-7246(1988))。
反義核苷酸是以序列特異性方式結(jié)合核酸、例如mRNA或DNA的寡核苷酸。結(jié)合具有互補序列的mRNA時，反義序列阻止mRNA翻譯(參見例如Altman等人美國專利5,168,053；Inouye的美國專利5,190,931、Burch的美國專利5,135,917；Smith的美國專利5,087,617以及Clusel等人(1993)Nucl.Acids Res.213405-3411，描述了啞鈴反義寡核苷酸)。三鏈分子是指單鏈DNA分子結(jié)合雙鏈DNA而形成共線性三鏈分子，從而阻止轉(zhuǎn)錄(參見例如Hogan等人的美國專利5,176,996，其中描述了可結(jié)合雙鏈DNA靶位點的合成寡核苷酸的制備方法)。
根據(jù)本發(fā)明的這個實施方案，特別有用的反義核苷酸和三鏈分子是互補或結(jié)合可編碼HE4a多肽的DNA有義鏈或mRNA的分子，從而抑制編碼HE4a多肽的mRNA翻譯。
核酶是特異性切割RNA底物例如mRNA、導致特異性抑制或干擾細胞基因表達的RNA分子。存在至少五類已知與RNA鏈切割和/或連接有關(guān)的核酶。核酶可以靶向到任何RNA轉(zhuǎn)錄本并催化切割該轉(zhuǎn)錄本(參見例如美國專利5,272,262；美國專利5,144,019；以及Cech等人的美國專利5,168,053、5,180,818、5,116,742和5,093,246)。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，可將任何此類HE4a mRNA特異性核酶或編碼這類核酶的核酸轉(zhuǎn)移到宿主細胞，以實行抑制HE4a基因表達。可能因而通過與真核啟動子、例如真核病毒性啟動子連接的編碼核酶的DNA，將核酶等轉(zhuǎn)移到宿主細胞，以便在引入細胞核后直接轉(zhuǎn)錄核酶。
本發(fā)明也包括編碼各種添加或替換氨基酸殘基或序列、或缺失生物學活性非必需的末端或內(nèi)部殘基或序列的等效DNA構(gòu)建體。例如，可以改變編碼生物學活性非必需的Cys殘基的序列，使Cys殘基缺失或替換為其它氨基酸，防止復性時形成錯誤的分子內(nèi)二硫鍵。通過修飾鄰近的二堿性氨基酸殘基，可以制備其它等效物，以增強在具有KEX2蛋白酶活性的酵母系統(tǒng)中的表達。EP 212,914公開了使用位點特異性突變來失活蛋白質(zhì)中的KEX2蛋白酶加工位點。通過缺失、添加或替換殘基來改變Arg-Arg、Arg-Lys和Lys-Arg對，去除存在的這些鄰近堿性殘基，可以失活KEX2蛋白酶加工位點。據(jù)認為Lys-Lys配對對于KEX2切割相當不敏感，將Arg-Lys或Lys-Arg轉(zhuǎn)變?yōu)長ys-Lys是失活KEX2位點的保守而又優(yōu)選的方法。
利用各種方法可將合適的DNA序列插入多種公知的適于所選宿主細胞的任一載體。一般利用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點。用于克隆、DNA分離、擴增及純化的標準技術(shù)、涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶學反應(yīng)以及各種分離技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并常用的技術(shù)。例如Ausubel等人(1993 Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook等人(1989Molecular Cloning，Second Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)等描述了許多標準技術(shù)。
哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包括Gluzman，Cell 23175(1981)所述猴腎成纖維細胞COS-7系以及能夠表達相容性載體的其它細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體應(yīng)包含復制起點、合適的啟動子和增強子以及任何必需的核糖體結(jié)合位點、聚腺苷?；稽c、剪接供體和受體位點、轉(zhuǎn)錄終止序列以及5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。來自例如SV40剪接和聚腺苷酰化位點的DNA序列可能用于提供所需的非轉(zhuǎn)錄性遺傳元件。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種方法，包括但不限于例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染或電穿孔(Davis等人，1986 Basic Methods in Molecular Biology)，將構(gòu)建體引入宿主細胞。
本發(fā)明另外涉及HE4a多肽，特別涉及檢測惡性疾病的方法。在一個優(yōu)選實施方案中，通過確定生物樣品中存在一種天然存在的可溶性分子、或包含細胞的樣品中存在一種細胞表面分子，其具有與至少一種HE4a多肽特異性的抗體反應(yīng)的抗原決定簇，從而檢測惡性腫瘤。在另一優(yōu)選實施方案中，通過確定生物樣品中存在至少一種天然存在的HE4a多肽來檢測惡性腫瘤。此處提供的″HE4a抗原多肽″或″HE4a多肽″包括具有SEQ ID NO11氨基酸序列的任何多肽，包括其任何片段、衍生物或類似物，也包括由包含SEQ ID NO10或12的核酸分子、或能夠與SEQ ID NO10或12的核酸分子雜交的核酸分子、或其片段、衍生物或類似物編碼的任何多肽。本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案包括針對此處提供的HE4a序列(例如SEQ ID NO10-13)的組合物和方法，但根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和/或細胞類型表達或組織分布等(包括抗體確定的可檢測表位，也包括寡核苷酸確定的雜交檢測)，顯然不包括Kirchoff等人(例如1991 Biol.Reproduct.45350；SEQ ID NOS8-9)公開的HE4序列。
本發(fā)明的HE4a多肽可能是未修飾多肽，或可能是經(jīng)翻譯后修飾的多肽，例如糖基化、磷酸化、脂肪?；ㄌ腔字＜〈煎^定修飾等、磷脂酶切割例如磷脂酰肌醇特異性磷脂酶c介導的水解等、蛋白酶切割、去磷酸化或任何其它類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，例如涉及共價化學鍵形成或斷裂的修飾。
論及HE4a多肽、HE4a抗原多肽或HE4a融合蛋白質(zhì)時，術(shù)語″片段″、″衍生物″和″類似物″是指基本保持與該多肽相同的生物學功能和/或活性的任何HE4a多肽。因此，類似物可能包括HE4a抗原多肽同工型，例如不同翻譯后修飾的HE4a多肽或變體，如剪接變體。如本領(lǐng)域公知，″剪接變體″包括來自于RNA轉(zhuǎn)錄本不同細胞內(nèi)加工的變體或其它形式的多肽。例如，如果兩種不同的mRNA種類的差別僅在于，其中一種mRNA包含特定外顯子對應(yīng)的全部或部分序列，而其它種類沒有，則其互為剪接變體。熟悉本領(lǐng)域的人員應(yīng)當理解，在一般認為是剪接變體的mRNA種類之間可以存在其它結(jié)構(gòu)關(guān)系。HE4a多肽另外包括蛋白原，可通過切割蛋白原部分而活化，產(chǎn)生活性HE4a多肽。
HE4a多肽或HE4a抗原多肽的片段、衍生物或類似物的生物學功能和/或活性包括但不必限于該多肽在此處公開的篩選受試者中存在惡性疾病的方法中作為標志的用途。例如，通過檢測受試者樣品中以可溶性形式天然存在并具有與至少一種HE4a多肽特異性的抗體反應(yīng)的抗原決定簇的分子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可能監(jiān)測HE4a多肽的生物學功能和/或活性。另外應(yīng)當注意到，在某些實施方案中，本發(fā)明篩選方法涉及比較(i)懷疑具有惡性疾病的第一位受試者的第一份生物樣品以及(ii)已知沒有惡性疾病的另一位受試者的另一份生物樣品中以可溶性形式天然存在并具有與至少一種HE4a多肽特異性的抗體反應(yīng)的抗原決定簇的可檢測分子的相對數(shù)量、水平和/或數(shù)量。因此，在生物樣品中存在相對數(shù)量的HE4a可能是HE4a多肽的生物學功能和/或活性，盡管這種生物學功能和/或活性不應(yīng)當如此局限。
HE4a多肽的片段、衍生物或類似物可能是(i)其中一個或多個氨基酸殘基由保守性或非保守性氨基酸殘基替換(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)；(ii)其中另外的氨基酸與HE4a多肽融合，包括可能用于純化HE4a多肽或蛋白原序列的另外氨基酸；或(iii)截短的HE4a多肽。相信這類片段、衍生物和類似物位于本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此處教導的范圍之內(nèi)。
截短的HE4a多肽可能是包含短于全長形式HE4a多肽的HE4a多肽分子。本發(fā)明提供的截短的分子可能包括截短的生物多聚物，在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，該截短的分子可能是截短的核酸分子或截短的多肽。截短的核酸分子短于已知或所述核酸分子的全長核苷酸序列，其中該已知或所述核酸分子可能是天然存在、合成或重組的核酸分子，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員認為它是全長分子即可。因此，例如對應(yīng)于基因序列的截短的核酸分子包含短于全長的基因，其中該全長基因包含編碼和非編碼序列、啟動子、增強子和其它調(diào)節(jié)序列、側(cè)翼序列等、以及被認為是基因部分的其它功能性和非功能性序列。在另一例子中，對應(yīng)于mRNA序列的截短的核酸分子包含短于全長的mRNA轉(zhuǎn)錄本(其可能包括各種翻譯和非翻譯區(qū)以及其它功能性和非功能性序列)。在其它優(yōu)選實施方案中，截短的分子是包含短于特定蛋白質(zhì)全長氨基酸序列的多肽。
此處所用″缺失″具有熟悉本領(lǐng)域人員所理解的常用含義，可能是指相對于對應(yīng)的全長分子而言、缺少來自末端或非末端區(qū)的一個或多個序列部分的分子，例如此處提供的截短的分子。作為線性生物多聚物例如核酸分子或多肽的截短的分子可能具有來自分子末端或非末端區(qū)的一個或多個缺失，這種缺失可能是缺失1-1500個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基、優(yōu)選1-500個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基、更優(yōu)選1-300個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基。
如本領(lǐng)域已知，通過將該多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸替換與另一種多肽的序列作比較，來確定兩種多肽之間的”相似性”。使用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員公知的計算機算法、例如可在NCBI網(wǎng)站(http//www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-binBLAST)獲得的BLAST算法(Altschul，J.Mol.Biol.219555-565，1991；Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919，1992)進行序列比較，很容易確定兩種多肽或核酸序列之間的相似性、或甚而一致性百分比。可能使用缺省參數(shù)。其它有用的計算機算法的例子有Align和FASTA，例如可以在Institut de Genetique Humaine，Montpellier，F(xiàn)rance的Genestream互聯(lián)網(wǎng)站點(www2.igh.cnrs.fr/home.eng.html)獲得并使用缺省參數(shù)。本發(fā)明多肽的片段或部分可能用于通過肽的合成產(chǎn)生相應(yīng)的全長多肽；因此，片段可能用作產(chǎn)生全長多肽的中間物。
術(shù)語”分離的”是指從其原始環(huán)境(例如，如果其是天然存在的，則指自然環(huán)境)中取出該物質(zhì)。例如，存在于活動物中的天然存在的多肽或多核苷酸不是分離的，與自然系統(tǒng)中某些或全部共存物質(zhì)分開的相同的多肽或多核苷酸則是分離的。這種多肽或多核苷酸可能是組合物的一部分，由于該組合物不是其自然環(huán)境的一部分，因而仍是分離的。
親和技術(shù)可特別用于分離供本發(fā)明方法使用的HE4a多肽，并可能包括利用與HE4a多肽特異性結(jié)合的相互作用而進行分離的任何方法。例如，由于HE4a多肽可能包含共價結(jié)合的寡糖成分(參見例如實施例中所述圖2)，親和技術(shù)，例如在可使凝集素結(jié)合糖的條件下使HE4a多肽結(jié)合合適的固定化凝集素，可能是特別有用的親和技術(shù)。其它有用的親和技術(shù)包括分離HE4a多肽的免疫學技術(shù)，該技術(shù)有賴于抗原的抗體結(jié)合位點與復合物中存在的抗原決定簇之間的特異性結(jié)合相互作用。免疫學技術(shù)包括但不必限于免疫親和層析、免疫沉淀、固相免疫吸附或其它免疫親和方法。上述及其它有用的親和技術(shù)參見例如Scopes，R.K.，Protein PurificationPrinciples and Practice，1987，Springer-Verlag，NY；Weir，D.M.，Handbook of ExperimentalImmunology，1986，Blackwell Scientific，Boston；以及Hermanson，G.T.等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques，1992，AcademicPress，Inc.，California；有關(guān)分離及鑒定復合物的細節(jié)、包括親和技術(shù)，此處全文引入以供參考。
如此處所述，本發(fā)明提供了包含融合于HE4a的多肽的融合蛋白質(zhì)。這種HE4a融合蛋白質(zhì)由具有在框架內(nèi)融合另外編碼序列的HE4a編碼序列的核酸編碼，以提供與另外功能性或非功能性多肽序列融合的HE4a多肽序列的表達，例如(說明而非限制)，可以檢測、分離和/或純化HE4a融合蛋白質(zhì)。這種HE4a融合蛋白質(zhì)使得可以通過基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)親和力、金屬親和力或電荷親和力的多肽純化、或通過特異性蛋白酶切割包含融合序列(可由蛋白酶切割的、以便從融合蛋白質(zhì)中分離HE4a多肽)的融合蛋白質(zhì)，從而檢測、分離和/或純化HE4a融合蛋白質(zhì)。
因而HE4a融合蛋白質(zhì)可能包含親和標記的多肽序列，即加入HE4a的多肽或肽，以便于通過與配基的特異性親和相互作用來檢測和分離HE4a。配基可能是任何分子、受體、反受體(counterrecepter)、抗體等，親和標記可能通過此處提供的特異性結(jié)合相互作用與其相互作用。這種肽包括例如多聚His或美國專利5,011,912以及Hopp等人(1988 Bio/Technology 61204)所述抗原性鑒定肽、或XPRESSTM表位標記(Invitrogen，Carlsbad，CA)。例如在細菌宿主的情況下，該親和序列可能是由pBAD/His(Invitrogen)或pQE-9載體提供的6組氨酸標記，以便提供純化融合該標志的成熟多肽，或者例如使用哺乳動物宿主如COS-7細胞時，該親和序列可能是血凝素(hemagglutinin，HA)標記。HA標記對應(yīng)于來自流感血凝素蛋白質(zhì)的抗體確定的表位(Wilson等人，1984 Cell 37767)。
在特別優(yōu)選的實施方案中并如下文詳述，HE4a融合蛋白質(zhì)可能另外包含加入HE4a的免疫球蛋白恒定區(qū)多肽，以便于檢測、分離和/或定位HE4a。該免疫球蛋白恒定區(qū)多肽優(yōu)選與HE4a多肽C端融合。根據(jù)非限制性理論，在此處提供的HE4a融合蛋白質(zhì)中包含免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可能具有益處，例如用于特定宿主時(即“自身”較之“非自身”)與特定Ig區(qū)的免疫原性或非免疫原性特性有關(guān)的益處，或便于分離和/或檢測融合蛋白質(zhì)的益處。熟悉本領(lǐng)域的人員根據(jù)本公開內(nèi)容，應(yīng)當理解Ig融合蛋白質(zhì)的上述及其它益處。例如Ashkenazi等人(PNAS USA 8810535，1991)和Byrn等人(Nature 344677，1990)描述了融合蛋白質(zhì)的一般制備，其中包含與各種抗體來源的多肽部分(包括Fc結(jié)構(gòu)域)融合的異源多肽。將編碼HE4aFc融合蛋白質(zhì)的基因融合物插入合適的表達載體。在本發(fā)明的某些實施方案中，可使HE4aFc融合蛋白質(zhì)組裝成更象抗體分子，在Fc多肽之間形成鏈間二硫鍵，產(chǎn)生二聚體HE4a融合蛋白質(zhì)。
由于包含免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域(由框架內(nèi)連接HE4a編碼序列的DNA序列編碼)的融合多肽而具有預(yù)選抗原特異性結(jié)合親和力的HE4a融合蛋白質(zhì)也位于本發(fā)明范圍之內(nèi)，包括此處提供的其變體和片段。例如，EP 0318554、U.S.5,132,405、U.S.5,091,513和U.S.5,476,786公開了具有免疫球蛋白V區(qū)融合多肽的融合蛋白質(zhì)的一般構(gòu)建策略。
本發(fā)明的核酸也可能編碼融合蛋白質(zhì)，該融合蛋白質(zhì)包含與具有所需親和特性、例如酶(如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)的其它多肽融合的HE4a多肽。另一例子，HE4a融合蛋白質(zhì)也可能包含與金黃葡萄狀球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A多肽融合的HE4a多肽；例如美國專利5,100,788一般公開了蛋白A編碼核酸及其在構(gòu)建具有免疫球蛋白恒定區(qū)親和力的融合蛋白質(zhì)中的用途。用于構(gòu)建HE4a融合蛋白質(zhì)的其它有用的親和多肽可能包括例如WO 89/03422、U.S.5,489,528、U.S.5,672,691、WO 93/24631、U.S.5,168,049、U.S.5,272,254等公開的鏈親和素融合蛋白質(zhì)以及親和素融合蛋白質(zhì)(參見例如EP 511,747)。如此處及引用的參考文獻所提供，HE4a多肽序列可能與融合多肽序列融合，該融合多肽可能是全長的融合多肽、或可能是其變體或片段。
本發(fā)明也包括包含多肽序列的HE4a融合蛋白質(zhì)，該多肽序列指引融合蛋白質(zhì)到達細胞核、位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)腔、通過經(jīng)典的ER-高爾基體途徑從細胞中分泌(參見例如von Heijne，J.Membrane Biol.115195-201，1990)、摻入質(zhì)膜、結(jié)合特定細胞漿成分包括跨膜細胞表面受體的胞漿結(jié)構(gòu)域、或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的任何各種已知的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分選機制導向到特定的亞細胞部位(例如參見Rothman，Nature 37255-63，1994，Adrani等人，1998 J Biol.Chem.27310317以及此處引用的參考文獻)。因此，涉及靶向目的多肽到達預(yù)定的細胞內(nèi)、膜或細胞外定位的此處組合物及方法包括以上及相關(guān)實施方案。
本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明核酸的載體和構(gòu)建體，特別涉及包括上文提供的編碼本發(fā)明HE4a多肽的任何核酸的“重組表達構(gòu)建體”；涉及利用本發(fā)明載體和/或構(gòu)建體遺傳改造的宿主細胞，并涉及利用重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明HE4a多肽和融合蛋白質(zhì)、或其片段或變體。HE4a蛋白質(zhì)可以在合適啟動子控制下表達于哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞。也可以使用來自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，利用無細胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生這類蛋白質(zhì)。例如，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，New York，(1989)描述了用于原核和真核宿主的合適的克隆和表達載體。
重組表達載體一般應(yīng)包括復制起點以及允許轉(zhuǎn)化宿主細胞的選擇標志、例如大腸桿菌(E.coli)氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因，以及來自高表達基因的啟動子以指導下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。該啟動子可來自編碼糖水解酶如3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase，PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白等的操縱子。按翻譯起始和終止序列的合適相位組裝異源結(jié)構(gòu)序列?？蛇x地，異源序列可編碼包括可帶來所需特征(例如穩(wěn)定或簡化所表達重組產(chǎn)物的純化)的N端鑒定肽的融合蛋白質(zhì)。
在表達載體中插入編碼目的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性DNA序列連同位于功能性啟動子有效閱讀相位的合適的翻譯起始和終止信號，構(gòu)建供細菌使用的有用的表達構(gòu)建體。構(gòu)建體可能包含一種或多種表型選擇標志及復制起點，以確保在宿主內(nèi)維持該載體構(gòu)建體，如若需要則提供擴增。供轉(zhuǎn)化的合適原核宿主包括大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)以及假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的多個品種，盡管也可能利用其它宿主以供選擇。只要可在宿主中復制并存活，便可能使用任何其它質(zhì)粒或載體。
作為典型但非限制性的例子，供細菌使用的有用的表達載體包含可選擇性標志以及細菌復制起點，來自于包含公知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件的可商品化獲得的質(zhì)粒。這種商品化載體包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)以及GEM1(Promega Biotec，Madison，Wisconsin，USA)。這些pBR322″主鏈″部分與合適啟動子以及待表達的結(jié)構(gòu)性序列相連。
轉(zhuǎn)化合適的宿主株、宿主株生長到適當細胞密度后，如果所選啟動子是此處提供的調(diào)節(jié)型啟動子，則利用適當方法誘導(例如變溫或化學誘導)，再培養(yǎng)細胞一段時間。細胞一般通過離心收集、利用物理或化學方法破壞，保留所得粗提物供進一步純化。可以通過任何常規(guī)方法、包括凍融循環(huán)、超聲、機械破碎或使用細胞裂解劑，破壞用于蛋白質(zhì)表達的微生物細胞；所述方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
因此，例如此處提供的本發(fā)明核酸可能包括于多種表達載體構(gòu)建體的任一種中，用作表達HE4a多肽重組表達構(gòu)建體。這類載體及構(gòu)建體包括染色體、非染色體以及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；細菌型質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；來源于質(zhì)粒和噬菌體DNA、病毒DNA組合的載體，例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和偽狂犬病。然而，任何其它載體，只要可在宿主中復制并存活，均可能用來制備重組表達構(gòu)建體。
可能通過多種方法將合適的DNA序列插入載體。一般利用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點。用于克隆、DNA分離、擴增及純化的標準技術(shù)、涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶學反應(yīng)以及各種分離技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并常用的技術(shù)。例如Ausubel等人(1993 Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook等人(1989 Molecular Cloning，SecondEd.，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)；Maniatis等人(1982 Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)等描述了許多標準技術(shù)。
表達載體中的DNA序列有效連接至少一種合適的表達控制序列(例如啟動子或調(diào)節(jié)型啟動子)，以指導mRNA合成。這種表達控制序列的典型例子包括LTR或SV40啟動子、大腸桿菌lac或trp、噬菌體λPL啟動子以及已知控制原核或真核細胞或其病毒表達的其它啟動子。可以使用CAT(chloramphenicol transferase，氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或帶有可選擇性標志的其它載體，從任何目的基因中選擇啟動子區(qū)。兩種合適的載體為pKK232-8和pCM7。特別命名的細菌性啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核啟動子你包括CMV即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR以及小鼠金屬硫蛋白-I。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員易于選擇合適的載體和啟動子，此處描述了制備某些特別優(yōu)選的重組表達構(gòu)建體，其中包含至少一個可操作連接HE4a多肽的編碼核酸的啟動子或調(diào)節(jié)型啟動子。
如上所述，在某些實施方案中，該載體可能是病毒性載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。例如，可能從中得到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma)、Harvey肉瘤病毒、禽類白細胞增生病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。
病毒性載體包括一種或多種啟動子?？赡芾玫暮线m啟動子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動子；以及Miller等人，Biotechniques 7980-990(1989)所述人巨細胞病毒(CMV)啟動子，或任何其它啟動子(例如，細胞啟動子諸如真核細胞啟動子，包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)?？赡苁褂玫钠渌《拘詥幼影ǖ幌抻谙俨《締幼印⑿剀占っ?TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。合適啟動子的選擇對于根據(jù)此處教導的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見，并可能選自調(diào)節(jié)型啟動子或上述啟動子。
利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導包裝細胞系，形成生產(chǎn)細胞系?？赡苻D(zhuǎn)染的包裝細胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2以及Miller，Human Gene Therapy，15-14(1990)所述DAN細胞系，在此全文引入以供參考。載體可能通過本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)導包裝細胞。所述方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體以及磷酸鈣沉淀。在一個可選方案中，可能將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體包入脂質(zhì)體微囊、或偶聯(lián)到脂質(zhì)，然后給予宿主。
生成細胞系產(chǎn)生感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，其中包括編碼HE4a多肽或融合蛋白質(zhì)的核酸序列。然后利用這種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導真核細胞。轉(zhuǎn)導的真核細胞將表達編碼HE4a多肽或融合蛋白質(zhì)的核酸序列。可能被轉(zhuǎn)導的真核細胞包括但不限于胚胎干細胞、胚胎癌細胞以及造血干細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質(zhì)形成細胞、內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞和各種其它適于培養(yǎng)的細胞系。
本發(fā)明使用病毒性載體制備重組HE4a表達構(gòu)建體的實施方案的另一例子是，在一個優(yōu)選實施方案中，利用指導HE4a多肽或融合蛋白質(zhì)表達的重組病毒性構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的宿主細胞，可能產(chǎn)生包含所表達的HE4a多肽或融合蛋白質(zhì)的病毒顆粒，該HE4a多肽或融合蛋白質(zhì)來自病毒出芽其間摻入病毒顆粒的宿主細胞膜部分。在另一優(yōu)選實施方案中，將HE4a編碼核酸序列克隆到桿狀病毒穿梭載體，該載體然后與桿狀病毒重組，產(chǎn)生用于感染例如Sf9宿主細胞的桿狀病毒表達構(gòu)建體，如Baculovirus Expression Protocols，Methods in MolecularBiology Vol.39，C.D.Richardson，Editor，Human Press，Totowa，NJ，1995；Piwnica-Worms，″Expression of Proteins in Insect Cells UsingBaculoviral Vectors，″Section II in Chapter 16 inShort Protocols inMolecular Biology，2nd Ed.，Ausubel等人，eds.，John Wiley & Sons，New York，New York，1992，pages 16-32至16-48所述。
另一方面，本發(fā)明涉及包含上述重組HE4a表達構(gòu)建體的宿主細胞。利用本發(fā)明的載體和/或表達構(gòu)建體(例如可能是克隆載體、穿梭載體或表達構(gòu)建體)遺傳改造(轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)宿主細胞。例如，該載體或構(gòu)建體可能是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。改造的宿主細胞可以在已改變?yōu)檫m于活化啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增特定基因(例如編碼HE4a多肽或HE4a融合蛋白質(zhì)的基因)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選擇用來表達的特定宿主細胞的培養(yǎng)條件、例如溫度、pH等，對于一般熟練技術(shù)人員顯而易見。
宿主細胞可以是高等真核細胞例如哺乳動物細胞、或低等真核細胞例如酵母細胞，或宿主細胞可以是原核細胞例如細菌細胞。本發(fā)明合適的宿主細胞的典型例子包括但不必限于細菌細胞，例如大腸桿菌、鏈霉菌(Streptomyces)、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，例如酵母；昆蟲細胞，例如果蠅S2(Drosophila S2)和夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)；動物細胞，例如CHO、COS或293細胞；腺病毒；植物細胞，或任何已經(jīng)適于體外增殖或為此重新建立的合適細胞。相信合適宿主的選擇屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此處教導的范圍之內(nèi)。
也可以利用各種哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明因而部分涉及通過培養(yǎng)包含重組表達構(gòu)建體的宿主細胞而產(chǎn)生重組HE4a多肽的方法，該構(gòu)建體包含至少一種可操作連接HE4a編碼核酸序列的啟動子。在某些實施方案中，該啟動子是此處提供的調(diào)節(jié)型啟動子，例如四環(huán)素可阻抑型啟動子。在某些實施方案中，該重組表達構(gòu)建體是此處提供的重組病毒性表達構(gòu)建體。哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包括Gluzman，Cell 23175(1981)所述猴腎成纖維細胞COS-7細胞系以及能夠表達相容性載體的其它細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體應(yīng)包含復制起點、合適的啟動子和增強子以及任何必需的核糖體結(jié)合位點、聚腺苷?；稽c、剪接供體和受體位點、轉(zhuǎn)錄終止序列以及5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列，例如此處有關(guān)制備MRA表達構(gòu)建體所述。來自SV40剪接和聚腺苷?；稽c的DNA序列可能用于提供所需的非轉(zhuǎn)錄性遺傳元件。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種方法，包括但不限于例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染或電穿孔(Davis等人，1986 Basic Methods inMolecular Biology)，將構(gòu)建體引入宿主細胞。
所表達的重組HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)或從其衍生的融合蛋白質(zhì)可能以完整宿主細胞；完整細胞器例如細胞膜、細胞內(nèi)囊泡或其它細胞器；或破裂細胞的制備物包括但不限于細胞勻漿物或裂解物、單層和多層膜泡或其它制備物的形式用作免疫原?；蛘撸梢酝ㄟ^以下方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析包括免疫親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析，從重組細胞培養(yǎng)物中回收并純化所表達的重組mesothelin相關(guān)抗原多肽(或mesothelin多肽)或融合蛋白質(zhì)。在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中，必要時可以使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，可以利用高效液相層析(HPLC)進行最后的純化步驟。所表達的重組HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)或融合蛋白質(zhì)也可能用作本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易進行的任何各種常規(guī)抗體篩選分析設(shè)置中的靶抗原。
作為產(chǎn)生用于本發(fā)明方法的特異性抗體的免疫原，HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)可能因而是天然的純化產(chǎn)物、或化學合成過程的產(chǎn)物、或利用重組技術(shù)從原核或優(yōu)選真核宿主中產(chǎn)生。如本領(lǐng)域已知及此處所提供，根據(jù)用于重組生產(chǎn)過程的宿主，本發(fā)明的多肽可能經(jīng)糖基化或翻譯后修飾。
根據(jù)本發(fā)明，可能在來自受試者或生物來源的生物樣品中檢測可溶性人HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)。生物樣品可能通過獲得來自于受試者或生物來源的血液樣品、活檢標本、組織外植體、器官培養(yǎng)物、生物液體或任何其它組織或細胞制備物而提供。該受試者或生物來源可能是人或非人動物、原代細胞培養(yǎng)物或易于培養(yǎng)的細胞系包括但不限于可能包含染色體整合的或附加體重組的核酸序列的遺傳工程細胞系、永生化或可永生化的細胞系、體細胞雜種細胞系、分化或可分化的細胞系、轉(zhuǎn)化細胞系等。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，可能認為該受試者或生物來源具有惡性疾病或處于患有惡性疾病的危險之中，在某些另外優(yōu)選的實施方案中可能是卵巢癌癥例如卵巢癌，在本發(fā)明某些其它優(yōu)選的實施方案中，可能已知該受試者或生物來源不存在該疾病或沒有患有該疾病的危險。
在某些優(yōu)選的實施方案中，該生物樣品包含受試者或生物來源的至少一個細胞，在某些其它的優(yōu)選實施方案中，該生物樣品是包含可溶性人mesothelin相關(guān)抗原多肽的生物液體。生物液體一般是處于生理溫度的液體，可能包括存在于、分離自、表達于或提取自受試者或生物來源的天然存在的液體。某些生物液體來自特定組織、器官或局部區(qū)域，而某些其它的生物液體可能更全身性或系統(tǒng)性位于受試者或生物樣品中。生物液體的例子包括血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴、尿、腦脊液、唾液、分泌性組織和器官的粘膜分泌物、陰道分泌物、腹水液例如與非固體腫瘤有關(guān)的腹水液、胸膜、心包、腹膜、腹腔及其它體腔的液體等。生物液體還可能包括接觸受試者或生物來源的液體溶液，例如細胞及器官培養(yǎng)基包括細胞或器官條件培養(yǎng)基、灌洗液等。在某些高度優(yōu)選的實施方案中，該生物樣品是血清，在某些其它高度優(yōu)選的實施方案中，該生物樣品是血漿。在其它優(yōu)選的實施方案中，該生物樣品是無細胞液體溶液。
在某些其它優(yōu)選的實施方案中，該生物樣品包含完整細胞，在某些其它優(yōu)選的實施方案中，該生物樣品包含細胞提取物，其中包含編碼具有SEQ ID NO11或13所示氨基酸序列的HE4a抗原多肽、或其片段或變體的核酸序列。
樣品中“以可溶性形式天然存在的分子”可能是可溶性蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂類、脂肪酸等或其衍生物；碳水化合物、糖類等或其衍生物；核酸、核苷酸、核苷、嘌呤、嘧啶或相關(guān)分子、或其衍生物等；或其任何組合，例如糖蛋白、糖脂、脂蛋白、蛋白脂質(zhì)或者是此處提供的生物樣品的可溶性或無細胞組分的任何其它生物分子?！耙钥扇苄孕问教烊淮嬖诘姆肿印绷硗庵肝挥谌芤褐谢虼嬖谟谏飿悠分械姆肿樱ù颂幪峁┑纳镆后w，以及未結(jié)合到完整細胞表面的分子。例如，以可溶性形式天然存在的分子可能包括但不必限于溶質(zhì)；大分子復合物的組分；從細胞中脫落、分泌或輸出的物質(zhì)；膠體；微米顆?；蚣{米顆?；蚱渌毿〉膽腋☆w粒等。
受試者中存在惡性疾病是指受試者中存在發(fā)育異常、癌性和/或轉(zhuǎn)化的細胞，包括例如贅生物(neoplastic)、腫瘤、非接觸抑制性或致癌性轉(zhuǎn)化細胞等。
通過說明而非限制，本發(fā)明上下文中惡性疾病可能另外指受試者中存在能夠分泌、脫落、輸出或釋放HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的癌癥細胞，由此在受試者的生物樣品中檢測到該多肽的水平升高。在優(yōu)選實施方案中，例如該癌癥細胞是惡性上皮細胞、例如癌細胞，在特別優(yōu)選的實施方案中，該癌癥細胞是惡性間皮瘤細胞，例如是發(fā)現(xiàn)于胸膜、心包膜、腹膜、腹腔及其它體腔內(nèi)層的鱗狀細胞上皮或間皮細胞的轉(zhuǎn)化變體。
在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，標示存在惡性疾病的腫瘤細胞是卵巢癌細胞，包括原發(fā)及轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞。本領(lǐng)域公知將惡性腫瘤歸類為卵巢癌的標準(參見例如Bell等人，1998 Br.J.Obstet.Gynaecol.1051136；Meier等人，1997 Anticancer Res.17(4B)3019；Meier等人1997 Anticancer Res.17(4B)2949；Cioffi等人，1997 Tumori 83594；以及此處引用的參考文獻)，以及建立并鑒定來自原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤的人卵巢癌細胞系(例如OVCAR-3，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA；Yuan等人，1997 Gynecol.Oncol.66378)。在其它實施方案中，惡性疾病可能是間皮瘤、胰腺癌、非小細胞肺癌或另一形式的癌癥，包括多種癌中的任一種，例如鱗狀細胞癌和腺癌，也包括肉瘤和血液惡性腫瘤(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)。熟悉本領(lǐng)域的人員已知上述及其它惡性疾病的分類，本公開內(nèi)容提供了無需過多實驗而確定HE4a多肽在該惡性疾病中的存在。
如此處所提供，篩選受試者中存在惡性疾病的方法可能以使用HE4a抗原多肽特異性抗體或HE4a多肽特異性抗體為特征。
HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)特異性抗體很容易以單克隆抗體或多克隆抗血清制備，或使用本領(lǐng)域公知方法制備成設(shè)計為具有所需特性的遺傳工程免疫球蛋白(Ig)。例如，說明而非限制，抗體可能包括重組IgG、具有來自免疫球蛋白序列嵌合的融合蛋白質(zhì)或“人源化”抗體(參見例如美國專利5,693,762、5,585,089、4,816,567、5,225,539、5,530,101以及此處引用的參考文獻)，均可能用于根據(jù)本發(fā)明檢測人HE4a多肽?？赡苋绱颂幩鲋苽溥@類抗體，包括如下文所述利用HE4a多肽進行免疫。例如，如此處所提供公開了編碼HE4a多肽的核酸序列，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員可能常規(guī)制備這些多肽來用作免疫原。例如，可能使用下文詳述的單克隆抗體2H5、3D8和4H4來實施本發(fā)明的某些方法。
術(shù)語″抗體″包括多克隆抗體、單克隆抗體、其片段例如F(ab′)2和Fab片段，以及任何天然存在或重組產(chǎn)生的結(jié)合配偶體，即特異性結(jié)合HE4a多肽的分子。如果抗體結(jié)合HE4a多肽的親合常數(shù)Ka大于或等于約104M-1、優(yōu)選大于或等于約105M-1、更優(yōu)選大于或等于約106M-1、更加優(yōu)選大于或等于約107M-1，則定義為″免疫特異性″或特異性結(jié)合。使用例如Scatchard等人Ann.NY.Acad.Sci.51660(1949)所述常規(guī)技術(shù)，可以輕易確定結(jié)合配偶體或抗體的親和力。使用任何已知方法，例如美國專利5,283,173和5,468,614所述酵母雙雜交篩選系統(tǒng)或等效方法，鑒定并獲得與其它蛋白質(zhì)或多肽特異性相互作用的蛋白質(zhì)，可以確定作為HE4a多肽結(jié)合配偶體的其它蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括使用HE4a多肽以及基于HE4a多肽氨基酸序列的肽，來制備特異性結(jié)合HE4a多肽的結(jié)合配偶體和抗體。
一般可能利用任何本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的多種技術(shù)制備抗體(例如參見Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988)。在其中一種技術(shù)中，起初將包含HE4a多肽的免疫原，例如表面上具有HE4a多肽的細胞或分離的HE4a多肽，注射到合適的動物中(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊)，優(yōu)選根據(jù)預(yù)定程序加入一次或多次加強免疫，并且動物定期取血。然后可能通過例如使用偶聯(lián)合適固相支持物的多肽的親和層析，從上述血清中純化HE4a多肽特異性多克隆抗體。
例如可能使用Kohler和Milstein(1976 Eur.J Immunol.6511-519)及其改進技術(shù)，制備HE4a多肽或其變體特異性的單克隆抗體。簡言之，這些方法包括制備能夠產(chǎn)生具有所需特異性(即，與目的mesothelin多肽的反應(yīng)性)的抗體的永生細胞系。例如可能從得自上述免疫動物的脾細胞中產(chǎn)生這種細胞系。然后例如通過融合骨髓瘤細胞融合配偶體、優(yōu)選與所免疫動物同源的配偶體，使脾細胞永生化。例如，可能利用膜融合促進劑、例如聚乙二醇或非離子型活性劑使脾細胞和骨髓瘤細胞結(jié)合幾分鐘，然后低密度接種于支持雜交細胞、但不支持骨髓瘤細胞生長的選擇性培養(yǎng)基中。優(yōu)選的選擇技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)選擇。經(jīng)過足夠時間，通常約1-2周，觀察雜合體集落。選擇單個集落，測試對該多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。本發(fā)明包括可產(chǎn)生特異性結(jié)合HE4a多肽的單克隆抗體的雜交瘤。
可從生長雜交瘤集落的上清中分離單克隆抗體。另外，可能利用多種技術(shù)增加生產(chǎn)，例如將雜交瘤細胞系注入合適脊椎動物宿主例如小鼠的腹腔。然后從腹水液或血液中收獲單克隆抗體?？赡芾贸Ｒ?guī)方法，例如層析、凝膠過濾、沉淀或萃取，從抗體中去除污染物。例如，可能使用標準技術(shù)，通過固定化蛋白G或蛋白A的層析來純化抗體。
在某些實施方案中，優(yōu)選使用抗體的抗原結(jié)合片段。此類片段包括可能使用標準技術(shù)(例如通過木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生Fab和Fc片段)制備的Fab片段。可能使用標準技術(shù)，通過親和層析(例如固定化蛋白A的柱子)分離Fab和Fc片段。參見例如Weir，D.M.，Handbook ofExperimental Immunology，1986，Blackwell Scientific，Boston。
由于免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域(由框架內(nèi)連接多種效應(yīng)蛋白質(zhì)編碼序列的DNA序列編碼)而具有預(yù)選抗原特異性結(jié)合親和力的多功能性融合蛋白質(zhì)為本領(lǐng)域已知，例如EP-Bl-0318554、美國專利5,132,405、美國專利5,091,513和美國專利5,476,786所述。這種效應(yīng)蛋白質(zhì)包括可能用于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的任何各種技術(shù)來檢測融合蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽結(jié)構(gòu)域，包括但不限于生物素模擬序列(參見例如Luo等人，1998 J.Biotechnol.65225和此處引用的參考文獻)、利用可檢測的標記成分直接共價修飾、非共價結(jié)合到特異性標記的報告分子、酶學修飾可檢測性底物或固定化(共價或非共價)于固相支持物。
也可能通過諸如噬菌體展示的方法產(chǎn)生并選擇用于本發(fā)明的單鏈抗體(參見例如美國專利5,223,409；Schlebusch等人，1997 Hybridoma1647；以及此處所述參考文獻)。簡言之，在此方法中將DNA序列插入絲狀噬菌體例如M13的基因III或基因VIII基因。已經(jīng)開發(fā)了用于插入的具有多克隆位點的若干載體(McLafferty等人，Gene 12829-36，1993；Scott和Smith，Science 249386-390，1990；Smith和Scott，Methods Enzymol.217228-257，1993)。插入的DNA序列可能隨機產(chǎn)生，或可能是用于結(jié)合到HE4a多肽的已知結(jié)合結(jié)構(gòu)域的變體。使用該方法可能很容易產(chǎn)生單鏈抗體。插入物一般編碼6-20個氨基酸。由插入序列編碼的肽被展示于噬菌體的表面。通過結(jié)合到固定化的HE4a多肽、例如使用本領(lǐng)域公知方法以及此處公開的核酸編碼序列制備的重組多肽，來選擇表達HE4a多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體。利用一般包含10mM Tris、1mM EDTA的無鹽或低鹽濃度的洗液去除未結(jié)合的噬菌體。結(jié)合的噬菌體則利用例如含鹽緩沖液洗脫。以逐步方式提高NaCl，直至洗脫所有噬菌體。高親和力結(jié)合的噬菌體一般由高鹽濃度釋放。洗脫的噬菌體在細菌宿主中繁殖。可能進行另輪選擇，以選擇幾種高親和力結(jié)合的噬菌體。然后測定結(jié)合噬菌體中插入物的DNA序列。一旦已知該結(jié)合多肽的推斷的氨基酸序列，便可能利用重組或合成方法制備充足的此處用作HE4a多肽特異性抗體的肽。若制備的抗體是融合蛋白質(zhì)，則使用重組方法。為了使親和力或結(jié)合達到最大，形成的肽也可能是兩種或多種相似或不相似的肽的隨機陣列。
為檢測與HE4a多肽特異性抗體反應(yīng)的抗原決定簇，檢測試劑一般是如此處所述制備的抗體。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知使用抗體檢測樣品中多肽的多種分析方式，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫熒光分析、免疫沉淀、平衡透析、免疫擴散及其它技術(shù)。例如參見Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology，1986，BlackwellScientific，Boston。例如，可能以Western印跡方式進行該分析，其中將來自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到合適的膜并使其與抗體反應(yīng)。然后如本領(lǐng)域公知及下文所述，使用合適的檢測試劑檢測膜上存在的抗體。
在另一實施方案中，該分析包含使用固定化于固相支持物的抗體結(jié)合HE4a靶多肽，并從樣品的剩余物中移出。然后使用與不同的HE4a多肽抗原決定簇反應(yīng)的第二抗體，例如包含可檢測報告成分的試劑，檢測所結(jié)合的HE4a多肽。根據(jù)本實施方案的一個非限制性例子是，固定化抗體和識別不同抗原決定簇的第二抗體可能是此處所述選自單克隆抗體2H5、3D8和4H4的任意兩種單克隆抗體?；蛘呖赡苁褂酶偁幮苑治觯渲蠬E4a多肽由可檢測性報告成分標記，使其在溫育固定化抗體和樣品之后，結(jié)合固定化的HE4a多肽特異性抗體。樣品組分抑制標記的多肽與抗體結(jié)合的程度表示出樣品與固定化抗體的反應(yīng)性，從而表示樣品中的HE4a水平。
固相支持物可能是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可能附著抗體的任何物質(zhì)，例如微量滴定板的測試孔、硝酸纖維素濾膜或另一種合適的膜。或者，該支持物可能是小球或圓盤，例如玻璃、纖維玻璃、乳膠或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。可能使用專利和科學文獻中詳述的、本領(lǐng)域人員已知的多種技術(shù)將抗體固定化在固相支持物上。
在某些優(yōu)選實施方案中，檢測樣品中HE4a抗原多肽的分析是雙抗體夾心分析。該分析可能如下進行，首先使固定化于固相支持物(通常是微量滴定板的孔)的HE4a多肽特異性抗體(例如單克隆抗體，如2H5、3D8或4H4)接觸生物樣品，以便使樣品中天然存在的、具有與抗體反應(yīng)的抗原決定簇的可溶性分子結(jié)合該固定化抗體(例如，室溫下溫育30分鐘一般足夠)，形成抗原-抗體復合物或免疫復合物。然后從固定化的免疫復合物中移出樣品的未結(jié)合成分。然后加入HE4a抗原多肽特異性的第二抗體，其中該第二抗體的抗原結(jié)合位點不競爭性抑制固定化第一抗體的抗原結(jié)合位點與HE4a多肽的結(jié)合(例如，與固定化于固相支持物上的單克隆抗體不相同的單克隆抗體，諸如2H5、3D8或4H4)?？赡苋绱颂幩隹蓹z測性標記第二抗體，以便可以直接檢測?；蛘?，可能通過使用可檢測性標記的次級(或”第二級”)抗抗體、或使用此處提供的特異性檢測試劑間接檢測第二抗體。熟悉免疫分析的人員應(yīng)當理解，很多試劑和設(shè)置可用于在雙抗體夾心免疫分析中免疫學檢測特定抗原(例如mesothelin多肽)，因此本發(fā)明方法不局限于任何特定的檢測方法。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案使用上述雙抗體夾心分析，HE4a抗原多肽特異性的固定化第一抗體是多克隆抗體，而HE4a抗原多肽特異性的第二抗體是多克隆抗體。在本發(fā)明某些其它實施方案中，HE4a抗原多肽特異性的固定化第一抗體是單克隆抗體，而HE4a抗原多肽特異性的第二抗體是多克隆抗體。在本發(fā)明某些其它實施方案中，HE4a抗原多肽特異性的固定化第一抗體是多克隆抗體，而HE4a抗原多肽特異性的第二抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明某些其它高度優(yōu)選的實施方案中，HE4a抗原多肽特異性的固定化第一抗體是單克隆抗體，而HE4a抗原多肽特異性的第二抗體是單克隆抗體。例如，在這些實施方案中應(yīng)當注意到，此處提供的單克隆抗體2H5、3D8和4H4識別HE4a多肽上不同的非競爭性抗原決定簇(例如表位)，以致可能利用這些單克隆抗體的任何配對組合。在本發(fā)明其它優(yōu)選實施方案中，HE4a抗原多肽特異性的固定化第一抗體和/或HE4a抗原多肽特異性的第二抗體可能是本領(lǐng)域已知的以及此處提及的任何種類抗體，例如為了說明而非限制，F(xiàn)ab片段、F(ab′)2片段、免疫球蛋白V區(qū)融合蛋白質(zhì)或單鏈抗體。熟悉本領(lǐng)域的人員應(yīng)當理解，本發(fā)明包括在此處公開及要求的方法中使用其它抗體形式、片段、衍生物等。
在某些特別優(yōu)選的實施方案中，第二抗體可能包含可檢測性報告成分或標記物，例如酶、染料、放射性核素、發(fā)光基團、熒光基團或生物素等。然后使用適用于特定可檢測性報告成分或標記物的方法，測定保持與固相支持物結(jié)合的第二抗體的數(shù)量。放射性基團一般適用閃爍計數(shù)或放射自顯影方法。可能使用多種偶聯(lián)技術(shù)制備抗體-酶綴合物(綜述參見例如Scouten，W.H.，Methods in Enzymology 13530-65，1987)?？赡苁褂梅止庑g(shù)(Spectroscopic)方法檢測染料(包括例如酶反應(yīng)的顯色產(chǎn)物)、發(fā)光基團和熒光基團?？赡苁褂门悸?lián)不同報告基團(一般是放射性或熒光基團或酶)的親和素或鏈親和素檢測生物素。一般通過加入底物(通常進行特定時間)、然后利用分光術(shù)、分光光度法或其它方法分析反應(yīng)產(chǎn)物，來檢測酶報告基團?？赡芾霉夹g(shù)，使用標準物或標準的添加物來檢測樣品中mesothelin多肽的水平。
在另一實施方案中，本發(fā)明包括使用此處提供的HE4a抗原多肽、通過檢測來自生物來源或受試者的生物樣品中的免疫特異性反應(yīng)抗體，來篩選存在的惡性疾病。根據(jù)此實施方案，HE4a抗原多肽(或其片段或變體，包括此處提供的截短的HE4a抗原多肽)被可檢測性標記并與生物樣品接觸，以檢測樣品中以可溶性形式天然存在的抗體與HE4a抗原多肽的結(jié)合。例如，可能使用此處公開的序列及公知的方法(例如體外翻譯期間摻入易于檢測(例如放射性標記)的氨基酸)、或使用其它上述可檢測的報告成分，通過生物合成來標記HE4a抗原多肽。不愿受理論限制，本發(fā)明的實施方案期望某些HE4a多肽，例如此處公開的HE4a融合多肽，可能提供具有特定免疫原性、從而產(chǎn)生特異性可檢測抗體的肽。例如，根據(jù)該理論，某些HE4a融合多肽可能代表激發(fā)希望的免疫應(yīng)答的“非自身”抗原，而缺少融合結(jié)構(gòu)域的HE4a多肽可能被免疫系統(tǒng)看作更類似“自身”抗原而不輕易引起體液或細胞免疫。
如上所述，本發(fā)明部分涉及以下驚人發(fā)現(xiàn)，即在受試者中天然存在可溶性形式的HE4a抗原多肽，包括該可溶性HE4a多肽在具有某些癌癥的受試者中水平升高。
通過檢測受試者生物樣品中一種以上的腫瘤相關(guān)標志，可能進一步加強本發(fā)明篩選惡性疾病存在的方法。因此，本發(fā)明某些實施方案提供了篩選方法，除了檢測天然存在的可溶性樣品組分與HE4a抗原多肽特異性抗體的反應(yīng)性之外，也包括使用本領(lǐng)域已知的以及此處提供的既定方法來檢測至少一種另外的惡性疾病的可溶性標志。如上所述，目前可以在易于獲得的生物液體樣本中檢測到多種可溶性腫瘤相關(guān)抗原。例如，本發(fā)明某些實施方案涉及人mesothelin多肽，其包括諸如Scholler等人(1999 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 9611531)及美國申請09/513,597所述新型可溶性mesothelin多肽相關(guān)抗原(MRA)多肽等多肽。
此處提供的″mesothelin多肽″是可溶性多肽，其具有包括以下肽的氨基酸序列EVEKTACPSGKKAREIDES SEQ ID NO14并另外具有至少一種與至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇，該抗體具有競爭性抑制MAb K-1(Chang等人，1996 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93136；MAb K-1可得自例如Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA)或U.S.A.N.09/513,597提供的單克隆抗體OV569、4H3、3G3或1A6的免疫特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點。
因此，本發(fā)明使用的這些另外的可溶性腫瘤相關(guān)抗原可能包括但不必限于mesothelin和mesothelin相關(guān)抗原、CEA、CA125、唾液酸TN、SCC、TPS和PLAP(參見例如Bast等人，1983 N.Eng.J Med.309883；Lloyd等人，1997 Int.J.Canc.71842；Sarandakou等人，1997Acta Oncol.36755；Sarandakou等人，1998 Eur.J.Gynaecol.Oncol.1973；Meier等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)2945；Kudoh等人，1999Gynecol.Obstet.Invest.4752；Ind等人，1997 Br.J.Obstet.Gynaecol.1041024；Bell等人1998 Br.J.Obstet.Gynaecol.1051136；Cioffi等人，1997 Tumori 83594；Meier等人1997 Anticanc.Res.17(4B)2949；Meier等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)3019)，并可能另外包括此處提供的任何已知的標志，其于生物樣品中的存在可能與至少一種惡性疾病的存在有關(guān)。
或者，可能使用標準的雜交和/或多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)來檢測HE4a多肽的編碼核酸序列。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可能根據(jù)此處提供的HE4a cDNA序列設(shè)計合適的探針和引物。一般可能使用從生物來源獲得的任何一種樣品進行分析，例如真核細胞、細菌、病毒、從所述生物體中制備的提取物以及在活生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的液體。
提供以下實施例以供說明、而非限制。
實施例實施例1實時PCR檢測人類樣本的HE4A表達根據(jù)the institutional review boards of the University ofWashington，Swedish Hospital and Fred Hutchinson Cancer ResearchCenter，all of Seattle，Washington核準的程序獲得158個人體組織活檢樣本或活檢的RNA樣本。包括來自正常組織(腎上腺、骨髓、腦、結(jié)腸、子宮內(nèi)膜、胃、心、腎、肝、肺、乳腺、骨骼肌、子宮肌膜、外周神經(jīng)、外周血淋巴細胞制備物、唾液腺、皮膚、小腸、脊髓、脾、氣管、胸腺、子宮、外周血淋巴細胞培養(yǎng)物以及40個正常卵巢)、良性卵巢病變(13個漿液性囊腺瘤)、2個瀕臨惡性的卵巢腫瘤、3個I期粘質(zhì)卵巢癌、3個I期漿液性卵巢癌、37個III期漿液性卵巢癌、7個IV期漿液性卵巢癌樣本、轉(zhuǎn)移卵巢癌組織的6個樣本以及卵巢癌婦女的2管樣本。所有組織樣本得自治療前的婦女，立即將每種腫瘤的一部分置于液氮中，其余樣本進行常規(guī)組織學分析。只使用經(jīng)組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)包含超過80％腫瘤細胞并且沒有壞死的樣本進行雜交和實時PCR實驗。還包括來自卵巢表面上皮培養(yǎng)物(ovarian surfaceepithelial culture，OSE，得自B.Karlan，Cedars Sinai Hospital，LosAngeles，CA)以及3個另外的OSE樣本(得自R.Hernandez，Universityof Washington，Seattle，WA)的RNA。總計保存了151個樣本(94個非惡性組織和57個癌)進行實時定量PCR，確證目的基因、包括下述HE4a的過表達。
如下進行實時定量PCR。HE4實時PCR的引物為AGCAGAGAAGACTGGCGTGT(正向)[SEQ ID NO15]和GAAAGGGAGAAGCTGTGGTCA(反向)[SEQ ID NO16]。
這些引物產(chǎn)生427bp長度的PCR產(chǎn)物。使用oligo-dT引物和Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies，Inc.，Bethesda，MD)如廠家所述反轉(zhuǎn)錄總RNA。使用ABI7700儀器(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)及SYBR-Green方法進行實時定量PCR。以五份兩倍系列稀釋的白細胞cDNA制備物作為標準擴增的模板(S31iii125，先前實驗證明它在正常和惡性組織中普遍表達，參見Schummer等人，1999 Gene1999)。
GenBank登錄號U61734，正向引物CGACGCTTCTTCAAGGCCAA，SEQ ID NO17反向引物ATGGAAGCCCAAGCTGCTGA SEQ ID NO18。
陰性對照由不加酶進行反轉(zhuǎn)錄的卵巢癌總RNA以及包含無任何模板的所有PCR組分的孔組成。所有運行按一式兩份進行。利用瓊脂糖凝膠分析每次運行中存在的單一PCR條帶，消除假象條帶。使用PCR儀器制造商提供的軟件(Sequence DetectorTM)分析每一96孔板的結(jié)果；該分析可以測定目的核酸序列(HE4a)相對于標準物的表達水平。
圖1所示表達值按相對于內(nèi)部標準物的任意單位進行描述，并不反映mRNA分子按標準測量單位的絕對量。根據(jù)平均HE4a表達水平的豐度(amplifude)以及這些數(shù)值與其它已知基因(特別是高表達的β肌動蛋白)的比較，圖1顯示編碼HE4a的轉(zhuǎn)錄本以中度到高度的相對水平表達。
實施例2
HE4A編碼核酸序列的克隆及表達從高通量HE4a cDNA克隆中擴增HE4a融合構(gòu)建體cDNA最初由Kirchoff等人，(1991)發(fā)表的HE4 cDNA序列(SEQ ID NO8)保藏于GenBank登錄#X63187，提供了進行寡核苷酸引物設(shè)計以克隆此處所述HE4a編碼cDNA(SEQ ID NO10)的基礎(chǔ)。將利用高通量cDNA陣列鑒定并分離的差異表達基因產(chǎn)物HE4a的cDNA 840bp片段克隆入pSPORT。使用該cDNA為PCR反應(yīng)模板，如本實施例所述，擴增適合產(chǎn)生合成的融合蛋白質(zhì)基因形式的HE4a。
HE4編碼序列(SEQ ID NO8)的一部分似乎編碼推測的分泌信號肽；因此，在起初的構(gòu)建體中使用該天然前導肽，以保持盡可能多的該分子結(jié)構(gòu)。另外，由于HE4a相對較小，其序列不包含任何罕見的結(jié)構(gòu)特征，例如跨膜結(jié)構(gòu)域或胞漿導向序列，因此設(shè)計了引入融合人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域的完整HE4a基因產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)。引物設(shè)計為編碼用于克隆的合適限制位點并產(chǎn)生最終構(gòu)建體所需的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的框架內(nèi)融合體。5′引物(SEQ ID NO1或HE4-5′)為39聚體(39-mer)，包括HindIII位點、提高相鄰第一個ATG表達的Kozak序列以及基于先前發(fā)表的HE4序列的一部分HE4a前導肽。3′引物(SEQ ID NO2或HE4-3′-1)為36聚體，包括用于融合人-Ig后部cDNA的框架內(nèi)BamHI位點以及恰好在終止密碼子前截短的HE4編碼序列的3′端。使用這兩種引物50pmol以及作為模板的HE4/pSPORT質(zhì)粒1ng進行PCR擴增反應(yīng)。根據(jù)包裝內(nèi)說明書，50μl反應(yīng)還包括2.5U(0.5ml)ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa Shuzo Biomedical，Otsu，Shiga，Japan)、稀釋的緩沖液和核苷酸。反應(yīng)擴增30個循環(huán)，擴增模式為94℃30秒、60℃30秒以及72℃、30秒。獲得了預(yù)期全長HE4大小(約400bp)的PCR產(chǎn)物。
這些片段經(jīng)限制性消化、純化并連接到適當消化的已包含人IgG1插入物的哺乳動物表達質(zhì)粒中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細菌細胞，篩選存在HE4-hIgG1融合基因插入物的轉(zhuǎn)化子。然后使用BigDyeTerminator Cycle Sequencing試劑盒(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)在ABI Prism 310(PE Biosystems)測序儀中測序來自若干分離物的質(zhì)粒DNA。此外，還如前述(Hayde等人，1994 Ther.Immunol.13)利用DEAE-葡聚糖瞬時轉(zhuǎn)染，將這些分離物的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS7細胞。72小時后收獲培養(yǎng)上清，利用蛋白A瓊脂糖免疫沉淀、還原型SDS-PAGE電泳以及Western印跡進行篩選(圖2)。使用1∶5000山羊抗人IgG綴合物、然后ECL顯色來探測Western印跡。
序列分析的結(jié)果表明，所獲HE4a編碼序列(SEQ ID NO10)及推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO11)在幾個位置不同于發(fā)表的HE4編碼(SEQ ID NO8)及翻譯(SEQ ID NO9)序列。因而也從來自正常人附睪的cDNA以及幾種腫瘤細胞系和原發(fā)腫瘤的RNA獲得序列，確證了SEQ ID NO10所示HE4a編碼序列以及SEQ ID NO11所示推斷的編碼氨基酸序列。
克隆腫瘤細胞系HE4 cDNA按照廠家說明書，使用Trizol(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)從包括4007和OVCAR3(參見例如Helistrom等人，2001 Canc.Res.612420)的幾種卵巢腫瘤細胞系中制備RNA。按照廠家說明書，使用1-3μg RNA、隨機六聚體以及Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)制備cDNA。在包含1μgcDNA、2.5U(0.5ml)ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa Shuzo Biomedical，Otsu，Shiga，Japan)、稀釋的緩沖液和根據(jù)插入方向的核苷酸以及HE4-5′和HE4-3′-1特異性引物的50μl反應(yīng)物中，從隨機引發(fā)(primed)的cDNA PCR擴增HE4 cDNA。反應(yīng)擴增30個循環(huán)，擴增模式為94℃30秒、60℃30秒以及72℃30秒。再使用HE4-5′和HE4-3′-1寡核苷酸從腫瘤來源的cDNA中PCR擴增HE4。獲得預(yù)期全長HE4大小的PCR產(chǎn)物，將該片段克隆到pT-AdvanTAge載體(Clontech，Palo Alto，CA)進行序列分析。如上所述測序帶有插入物的克隆，發(fā)現(xiàn)來自腫瘤RNA樣本的PCR片段編碼與上述原始克隆相同的HE4a序列；這些HE4a序列不同于發(fā)表的HE4序列(Kirchhoff等人，1991)。類似地，從正常附睪(SEQ ID NO10)和原發(fā)腫瘤組織cDNA(SEQ ID NO12)獲得HE4a編碼序列，匹配上述新的HE4a序列，但不同于Kirchhoff等人(1991)的HE4序列(SEQ ID NO8)。
產(chǎn)生HE4Ig融合蛋白質(zhì)。將HE4-hIgG1 cDNA構(gòu)建體(SEQ IDNO7)的HindIII-XbaI片段插入哺乳動物表達載體pD18的多克隆位點，pD18是前述pCDNA 3的衍生物(Hayden等人，1996 TissueAntigens 48242)。起初利用所述DEAE-葡聚糖瞬時轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染構(gòu)建體(Hayden等人，1994 Ther.Immunol.13)。制備若干分離物的質(zhì)粒DNA，用于瞬時轉(zhuǎn)染COS7細胞。72小時后收獲培養(yǎng)上清，利用蛋白A瓊脂糖免疫沉淀、還原型SDS-PAGE電泳以及Western印跡進行篩選(圖2)。
使用CHO-DG44細胞(Urlaub等人1986 Somat.Cell.Mol.Genet.1255)構(gòu)建表達高水平目的融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定細胞系。利用高拷貝電穿孔pD18載體(Hayden等人，1996 Tissue Antigens 48242；Barsoum，1990 DNA Cell Biol.9293)，并通過在包含重組胰島素(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)、丙酮酸鈉(Irvine Scientific，SantaAna，CA)、谷氨酰胺(Irvine Scientific)、MEM的2X非必需氨基酸(Irvine Scientific)以及100nM氨基蝶呤(Sigma，St.Louis，MO)的Excell 302 CHO培養(yǎng)基(JRH Biosciences，Denver，PA)中進行有限稀釋來選擇氨甲喋呤抗性克隆，產(chǎn)生表達HE4Ig的穩(wěn)定的CHO細胞系。然后利用IgG夾心ELISA分析抗性克隆的培養(yǎng)上清，篩選高生產(chǎn)細胞系。從大規(guī)模培養(yǎng)物中收獲用盡的(Spent)上清，利用通過2-ml蛋白A瓊脂糖(Repligen，Cambridge，MA)柱的蛋白A親和層析來純化HE4Ig。從柱中洗脫處于0.1M檸檬酸緩沖液(pH2.7)中的0.8-ml組分的融合蛋白質(zhì)，并使用100μl 1M Tris堿(pH10.5)進行中和。分析洗脫部分的280nm吸光值，混合包含融合蛋白質(zhì)的組分，在幾升PBS(pH7.4)中透析過夜，通過0.2-μm注射器過濾單位(Millipore，Bedford，MA)進行過濾滅菌。
使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生足夠蛋白質(zhì)來免疫BALB/c小鼠。小鼠起初間隔4周腹膜內(nèi)(IP)注射10μg純化的HE4-hIgG1融合蛋白質(zhì)。使用該免疫程序進行初次注射以及兩次加強之后，小鼠接著IP注射10μg蛋白質(zhì)外加TiterMax Gold佐劑，然后在收集脾之前進行另外兩次SC加強。將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤配偶體P3-X63-Ag8-653融合，制備雜交瘤。
Western分析HE4Ig融合蛋白質(zhì)。通過在10％Tris/Bis NOVEX凝膠(Invitrogen，San Diego CA)上進行SDS-PAGE電泳來分離蛋白質(zhì)樣品，并通過半干印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)。通過在PBS/0.25％NP-40或TBS-T(50mM Tris HCl，pH7.6，0.15M NaCl和0.05％Tween-20)中的5％脫脂奶粉(Carnation)中4℃溫育過夜來封閉膜，防止非特異性抗體結(jié)合。將膜與TBS-T中的HRP-山羊抗人IgG(1/10,000)或HRP-鏈親和素(1∶5000)(Caltag)室溫或4℃輕搖溫育1小時。利用TBST漂洗兩次、洗滌4次后，將膜在ECLTM(Amersham，LittleChalfont，UK)試劑中溫育60秒，對放射自顯影底片曝光，觀察條帶(圖2)。從培養(yǎng)上清或純化樣品以及使用50μl蛋白A瓊脂糖(Repligen，Cambridge，MA)沉淀蛋白A的蛋白A洗脫液中收集融合蛋白質(zhì)。將免疫沉淀物洗滌并重懸于SDS-PAGE還原性樣品上樣緩沖液中、煮沸，然后通過10％Tris/Bis NOVEX凝膠(Invitrogen，San Diego CA)SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)樣品，并通過半干印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)。通過在PBS/0.25％NP-40或TBS-T(50mM Tris HCl，pH7.6，0.15M NaCl和0.05％Tween-20)中的5％脫脂奶粉(Carnation)中4℃溫育過夜來封閉膜，防止非特異性抗體結(jié)合。將膜與HRP-山羊抗人IgG(1/10,000)溫育，在TBS-T中洗滌，接觸ECLTM(Amersham，Little Chalfont，UK)試劑60秒。然后將ECL-印跡對放射自顯影底片曝光，觀察條帶。圖2泳道1包含來自CTLA4-hIgG1轉(zhuǎn)染的COS7細胞上清的免疫沉淀樣品，泳道3和4包含HE4-hIgG1融合蛋白質(zhì)培養(yǎng)上清，泳道5包含模擬轉(zhuǎn)染的COS上清。HE4-hIgG1融合蛋白質(zhì)在還原膠或Western印跡中的表觀分子量約48kDa，大于根據(jù)預(yù)測的氨基酸序列而預(yù)期的39kDa，提示該分子被糖基化。
HE4-mIgG2a融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建及表達還進行與HE4-hIgG1融合基因類似的構(gòu)建，但將人IgG Fc片段替換為小鼠-IgG2a結(jié)構(gòu)域。使用另外的尾部(tail)，以致小鼠免疫不受人Ig尾部融合結(jié)構(gòu)域免疫原性的影響?，F(xiàn)有的mIgG2a尾部cDNA克隆位于上述HE4a克隆的框架之外，故從該質(zhì)粒重新擴增-mIgG2a盒，以便產(chǎn)生框架內(nèi)的融合結(jié)構(gòu)域。使用的正向、有義引物為mIgG2aBAMIF5′-gttgtcggatccgagcccagagggcccacaatcaag-3′[SEQ ID NO19]，而將反向、反義引物命名為mIgG2a3′Xba+S5′-gttgtttctagattatcatttacccggagtccgggagaagctc-3′[SEQ IDNO20].
所用模板包含與小鼠IgG2a Fc結(jié)構(gòu)域融合的小鼠CTLA4，在相對密碼子間隔的框架外的融合物接合處帶有限制性位點。新的寡核苷酸產(chǎn)生移框，改變了BamHI位點處的閱讀框架，以致與HE4的融合基因可表達完整的HE4-mIgG2a融合蛋白質(zhì)。如人融合基因所述擴增、亞克隆并處理PCR產(chǎn)物。如以上HE4-人IgG1融合蛋白質(zhì)所述，將分子亞克隆到pD18哺乳動物表達載體，產(chǎn)生穩(wěn)定的CHO克隆并表達融合蛋白質(zhì)。
實施例3HE4A特異性單克隆抗體產(chǎn)生抗HE4a Mab。在起初的實驗中，利用上述制備的HE4a-hIgG融合蛋白質(zhì)，在有或沒有佐劑的情況下免疫若干BALB/c小鼠。盡管在這些小鼠中觀察到較高抗體滴度，但由于針對具有hIgG尾部(CTLA4-hIg融合物)的對照融合蛋白質(zhì)觀察到同樣高的滴度，該抗體并非HE4a特異性。因而使用HE4a-mIgG融合蛋白質(zhì)進行免疫。圖3說明在兩只BALB/c小鼠(1605and 1734)中產(chǎn)生針對HE4a的高滴度抗體的兩次免疫的結(jié)果，每只小鼠利用尾部皮下給予的HE4a-mIgG外加佐劑(TiterMax，CytRx Corp.，Norcross，GA)按廠家說明書免疫兩次。利用顯示高HE4a特異性抗體滴度的小鼠的脾細胞通過標準方法制備HE4a特異性雜交瘤。圖4顯示最初利用ELISA檢測使用小鼠1605的脾細胞制備的雜交瘤(其血清數(shù)據(jù)如圖3所示)。3個孔顯示對HE4a-hIg的高反應(yīng)性。然后經(jīng)有限稀釋克隆，分離了3株雜交瘤2H5、3D8和4H4。根據(jù)競爭分析發(fā)現(xiàn)雜交瘤2H5和3D8識別不同表位。
構(gòu)建并應(yīng)用ELISA進行腫瘤診斷。使用上述兩種MAb 2H5和3D8，運用制備測定血清及其它液體中mesothelin/MPF及相關(guān)抗原所用的類似方法(Scholler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，11531，1999)構(gòu)建雙決定簇(″夾心″)ELISA。圖5顯示使用DMEM培養(yǎng)基稀釋的HE4a-hIgG制備的標準曲線的例子。如圖所示，在1ng水平的HE4a-hIgG檢測到信號。圖5還顯示來自卵巢癌系(4007)的未稀釋培養(yǎng)基給出可檢測信號。圖6顯示診斷具有卵巢癌的患者(命名為OV50)腹水液中包含在最高的測試稀釋度(1∶1280)仍可檢測到的HE4a抗原。
通過確定兩種抗體的最佳用量來改進最初的HE4a ELISA。其中一種抗體2H5被生物素化，另一抗體3D8則通過使其結(jié)合到測試板的底部而固定化；兩種單克隆抗體各自的分析劑量是2.5和100μg/ml。除了剛剛提及的不同的Mab及Mab使用劑量以外，該分析方法與所述用于mesothelin/MPF及相關(guān)分子的方法相同(Scholler等人，1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611531)。
初步測試卵巢癌患者及各種對照的血清，表明大部分卵巢癌患者、包括早期疾病患者的HE4a蛋白質(zhì)升高，對照血清則不然，其背景很低。在使用上述夾心ELISA分析以及約400位患者的編碼血清樣本(由Swedish Hospital，Seattle，WA提供)進行的研究中，診斷具有卵巢癌的患者的所有樣本均被HE4a ELISA準確計為陽性，進一步預(yù)報沒有假陽性。因此不愿受理論束縛，期望分析血清及其它體液中的HE4a蛋白質(zhì)可能因而為現(xiàn)有的卵巢癌診斷分析(例如CA125)提供臨床有益的補充。此外，盡管迄今研究了ELISA幫助診斷卵巢癌的能力，但它應(yīng)當同樣適用于過表達HE4a編碼抗原的任何腫瘤。如果未來的研究要鑒定HE4相關(guān)分子，相同的ELISA或其改進方法也應(yīng)當適用于研究HE4相關(guān)分子。
HE4a蛋白質(zhì)在細胞表面的表達。使用卵巢癌細胞系，以B細胞系為陰性對照，通過流式細胞術(shù)進行研究，表明HE4a編碼抗原在某些卵巢癌的細胞表面表達。先前已經(jīng)描述了所用細胞系及流式細胞術(shù)技術(shù)(Hellstrom等人，2001 Cancer Res.61，2420)。例如，93％的OVCAR 3細胞、卵巢癌系4010的71％細胞以及卵巢癌系HE50OV的38％細胞為陽性，而所測試的另外10株卵巢癌系中，少于20％的細胞是陽性。這提示根據(jù)非限制性理論，細胞表面的HE4a抗原可能為諸如HE4a特異性抗體介導和/或HE4a特異性T細胞介導的免疫治療策略提供靶標。
實施例4針對HE4A表位的預(yù)防性及治療性疫苗利用上述組合物和方法檢測HE4a編碼核酸序列的擴增和/或HE4a在某些腫瘤(特別是惡性卵巢腫瘤)中的過表達，并與正常組織的HE4a表達水平作比較。HE4a特異性單克隆抗體確定的表位在腫瘤中升高，提供了可用作適用于癌癥治療的預(yù)防性或防止性疫苗靶標的HE4a表位的鑒定；這種疫苗也可能用于改變(例如相對于合適的對照以統(tǒng)計學顯著的方式升高或降低)受精(在某些實施方案中可能反應(yīng)為通過使用公知用于四-二硫鍵核心家族成員、例如Slp-1的蛋白酶抑制分析來證明HE4a蛋白酶抑制或蛋白酶增強活性)。許多綜述文章已經(jīng)確認并描述了制備疫苗的大量方法(例如Hellstrom和Hellstrom，Handbook in Experimental Pharmacology，vol.″Vaccines″，Springer，Heidelberg，p.463，1999)。其中包括但不限于使用蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)及肽、DNA質(zhì)粒、重組病毒、抗獨特型抗體、體外利用肽表位脈沖的樹突細胞以及抗獨特型抗體。疫苗可能單獨使用或與佐劑和/或淋巴因子例如GMCSF聯(lián)用。根據(jù)非限制性理論，由于T細胞識別存在于細胞表面MHC分子中的表位，而不與循環(huán)中的抗原或免疫復合物反應(yīng)，不應(yīng)預(yù)料劑檢測如上所述的循環(huán)中的可溶性HE4a蛋白質(zhì)影響誘導T細胞介導免疫的疫苗的使用。
從上文應(yīng)當理解，盡管此處為說明起見而描述了本發(fā)明的特定實施方案，但可能不偏離本發(fā)明實質(zhì)和范圍而對其進行各種修改。因此，除所附權(quán)利要求之外，本發(fā)明不受限制。
在本說明書中，″包含″意思是″包括或由...組成″，″包含著″意思是″包括著或由...組成著″。
上述說明書、或以下權(quán)利要求、或附圖中公開的、以用于完成所公開功能的特定形式或方法來表達的特征，或用于獲得所公開結(jié)果的方法或過程，如若合適，可能分別或組合這些特征，用于以其不同形式實現(xiàn)本發(fā)明。
序列表<110>Pacific Northwest Research InstituteSchummer，MichelHellstrom，IngegerdHellstrom，Karl ErikLedbetter，Jeffrey A.
Hayden-Ledbetter，Martha<120>癌的診斷<130>730033.412PC<140>PCT<141>2002-08-27<160>20<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HE4編碼區(qū)的5’PCR引物。包括天然分泌信號肽。ATG上游的Hind III位點和Kozak共有序列。
<400>1gttgttaagc ttgccgccat gcctgcttgt cgcctaggc 39<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HE4編碼區(qū)的3’反義PCR引物，終止密碼區(qū)缺失/符合讀框地替換為用于克隆的BamHI限制位點<400>2gttgttggat ccgaaattgg gagtgacaca ggacac36<210>3<211>390<212>DNA<213>人類<400>3
aagcttgccg ccatgcctgc ttgtcgccta ggcccgctag ccgccgccct cctcctcagc 60ctgctgctgt tcggcttcac cctagtctca ggcacaggag cagagaagac tggcgtgtgc 120cccgagctcc aggctgacca gaactgcacg caagagtgcg tctcggacag cgaatgcgcc 180gacaacctca agtgctgcag cgcgggctgt gccaccttct gctctctgcc caatgataag 240gagggttcct gcccccaggt gaacattaac tttccccagc tcggcctctg tcgggaccag 300tgccaggtgg acagccagtg tcctggccag atgaaatgct gccgcaatgg ctgtgggaag 360gtgtcctgtg tcactcccaa tttcggatcc 390<210>4<211>1077<212>DNA<213>人類<400>4atgcctgctt gtcgcctagg cccgctagcc gccgccctcc tcctcagcct gctgctgttc 60ggcttcaccc tagtctcagg cacaggagca gagaagactg gcgtgtgccc cgagctccag 120gctgaccaga actgcacgca agagtgcgtc tcggacagcg aatgcgccga caacctcaag 180tgctgcagcg cgggctgtgc caccttctgc tctctgccca atgataagga gggttcctgc 240ccccaggtga acattaactt tccccagctc ggcctctgtc gggaccagtg ccaggtggac 300agccagtgtc ctggccagat gaaatgctgc cgcaatggct gtgggaaggt gtcctgtgtc 360actcccaatt tcggatccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 420ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 480accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 540gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 600aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 660caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 720gcccccatcg agaaaacaat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 780accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 840aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 900aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 960ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1020gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga1077<210>5<211>358<212>PRT<213>人類<400>5Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys65 70 75 80Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln85 90 95Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn100 105 110Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe Gly Ser Glu Pro115 120 125Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu130 135 140Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp165 170 175Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly180 185 190Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn195 200 205Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp210 215 220Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro225 230 235 240Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu245 250 255Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn260 265 270Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile275 280 285Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr290 295 300Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys305 310 315 320Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys325 330 335Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu340 345 350Ser Leu Ser Pro Gly Lys355<210>6<211>1098<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人-鼠合成融合基因<400>6aagcttgccg ccatgcctgc ttgtcgccta ggcccgctag ccgccgccct cctcctcagc 60ctgctgctgt tcggcttcac cctagtctca ggcacaggag cagagaagac tggcgtgtgc 120cccgagctcc aggctgacca gaactgcacg caagagtgcg tctcggacag cgaatgcgcc 180gacaacctca agtgctgcag cgcgggctgt gccaccttct gctctctgcc caatgataag 240gagggttcct gcccccaggt gaacattaac tttccccagc tcggcctctg tcgggaccag 300tgccaggtgg acagccagtg tcctggccag atgaaatgct gccgcaatgg ctgtgggaag 360gtgtcctgtg tcactcccaa tttcggatcc gagcccagag ggcccacaat caagccctgt 420cctccatgca aatgcccagc accgaattca gctggtacct catccgtctt catcttccct 480ccaaagatca aggatgtact catgatctcc ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg 540gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta 600cacacagctc agacacaaac ccatagagag gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt 660gccctcccca tccagcacca ggactggatg agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac 720aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga 780gctccacagg tatatgtctt gcctccacca gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact 840ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac 900gggaaaacag agctaaacta caagaacact gaaccagtcc tggactctga tggttcttac 960ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc 1020tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat caccacacga ctaagagctt ctcccggact 1080ccgggtaaat gatctaga 1098
<210>7<211>359<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人-鼠融合蛋白<400>7Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys65 70 75 80Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln85 90 95Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn100 105 110Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe Gly Ser Glu Pro115 120 125Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro130 135 140Asn Ser Ala Gly Thr Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys145 150 155 160Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val165 170 175Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn180 185 190Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr195 200 205Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp210 215 220Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu225 230 235 240Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg245 250 255Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys260 265 270Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp275 280 285Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys290 295 300Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser305 310 315 320Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser325 330 335Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser340 345 350Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys355
<210>8<211>583<212>DNA<213>人類<400>8cccctgcacc ccgcccggca tagcaccatg cctgcttgtc gcctaggccc gctagccgcc 60gccctcctcc tcagcctgct gctgttcggc ttcaccctag tctcaggcac aggagcagag 120aagactggcg tgtgccccga gctccaggct gaccagaact gcacgcaaga gtgcgtctcg 180gacagcgaat gcgccgacaa cctcaagtgc tgcagcgcgg gctgtgccac cttctgcctt 240ctctgcccca atgataagga gggttcctgc ccccaggtga acattaactt tccccagctc 300ggcctctgtc gggaccagtg ccaggtggac acgcagtgtc ctggccagat gaaatgctgc 360cgcaatggct gtgggaaggt gtcctgtgtc actcccaatt tctgaggtcc agccaccacc 420aggctgagca gtgaggagag aaagtttctg cctggccctg catctggttc cagcccacct 480gccctcccct ttttcgggac tctgtattcc ctcttggggt gaccacagct tctccctttc 540ccaaccaata aagtaaccac tttcagcaaa aaaaaaaaaa aaa583<210>9<211>125<212>PRT<213>人類<400>9Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Leu Leu Cys Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser65 70 75 80Cys Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp85 90 95Gln Cys Gln Val Asp Thr Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg100 105 110Asn Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe115 120 125<210>10<211>486<212>DNA<213>人類<400>10tgagagaaag cggccgcacc ccgcccggca tagcaccatg cctgcttgtc gcctaggccc 60gctagccgcc gccctcctcc tcagcctgct gctgttcggc ttcaccctag tctcaggcac 120aggagcagag aagactggcg tgtgccccga gctccaggct gaccagaact gcacgcaaga 180gtgcgtctcg gacagcgaat gcgccgacaa cctcaagtgc tgcagcgcgg gctgtgccac 240cttctgctct ctgcccaatg ataaggaggg ttcctgcccc caggtgaaca ttaactttcc 300ccagctcggc ctctgtcggg accagtgcca ggtggacagc cagtgtcctg gccagatgaa 360atgctgccgc aatggctgtg ggaaggtgtc ctgtgtcact cccaatttct gagctccggc 420caccaccagg ctgagcagtg aagatagaaa gtttctgcct ggccctgcag cgtgttacag 480cccacc 486<210>11
<211>124<212>PRT<213>人類<400>11Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys65 70 75 80Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln85 90 95Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn100 105 110Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe115 120<210>12<211>374<212>DNA<213>人類<400>12ccatgcctgc ttgtcgccta ggcccgctag ccgccgccct cctcctcagc ctgctgctgt 60tcggcttcac cctagtctca ggcacaggag cagagaagac tggcgtgtgc cccgagctcc 120aggctgacca gaactgcacg caagagtgcg tctcggacag cgaatgcgcc gacaacctca 180agtgctgcag cgcgggctgt gccaccttct gctctctgcc caatgataag gagggttcct 240gcccccaggt gaacattaac tttccccagc tcggcctctg tcgggaccag tgccaggtgg 300acagccagtg tcctggccag atgaaatgct gccgcaatgg ctgtgggaag gtgtcctgtg 360tcactcccaa tttc374<210>13<211>124<212>PRT<213>人類<400>13Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys65 70 75 80Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln85 90 95Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn100 105 110Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe115 120
<210>14<211>19<212>PRT<213>人類<400>14Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile1 5 10 15Asp Glu Ser<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向HE4實-時PCR引物<400>15agcagagaag actggcgtgt20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向HE4實-時PCR引物<400>16gaaagggaga agctgtggtc a 21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>17cgacgcttct tcaaggccaa20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>18atggaagccc aagctgctga20<210>19<211>36
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向有義引物<400>19gttgtcggat ccgagcccag agggcccaca atcaag 36<210>20<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向反義引物<400>20gttgtttcta gattatcatt tacccggagt ccgggagaag ctc 4權(quán)利要求
1.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測所述抗體與所述抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的抗體，以確定所述生物樣品中存在以可溶性形式天然存在于該樣品中、并具有與所述至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇的分子，從而檢測惡性疾病的存在。
2.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測所述抗體與所述抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使包含受試者細胞的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的抗體，以確定所述生物樣品中存在具有與所述至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇的細胞表面分子，從而檢測惡性疾病的存在。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述生物樣品選自血液、血清、漿膜液、血漿、淋巴、尿、腦脊髓液、唾液、粘膜分泌物、陰道分泌物、腹水液、胸膜液、心包膜液、腹膜液、腹液、培養(yǎng)基、條件培養(yǎng)基和灌洗液。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品是血清。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述生物樣品是血漿。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述生物樣品選自腹水液和胸膜液。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述生物樣品是陰道分泌物。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述HE4a抗原包含具有SEQID NO11所示序列的多肽、或其片段或衍生物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述HE4a抗原多肽是剪接變體。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述HE4a抗原包含具有SEQID NO5所示序列的多肽、或其片段或衍生物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述HE4a抗原多肽是剪接變體。
12.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述HE4a抗原多肽是HE4a抗原變體、或其片段或衍生物。
13.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗體包含多克隆抗體。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗體包含親和純化的抗體。
15.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗體包含單克隆抗體。
16.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗體包含重組抗體。
17.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗體包含嵌合抗體。
18.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗體包含人源化抗體。
19.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗體包含單鏈抗體。
20.權(quán)利要求1或2的方法，其中檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含檢測放射性核素。
21.權(quán)利要求1或2的方法，其中檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含檢測熒光團。
22.權(quán)利要求1或2的方法，其中檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含檢測親合素分子與生物素分子的結(jié)合事件。
23.權(quán)利要求1或2的方法，其中檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含檢測鏈親合素分子與生物素分子的結(jié)合事件。
24.權(quán)利要求1或2的方法，其中檢測抗體結(jié)合抗原決定簇包含分光光度法檢測酶反應(yīng)產(chǎn)物。
25.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種抗體被可檢測性標記。
26.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種抗體未被可檢測性標記，并且其中對抗體結(jié)合抗原決定簇的檢測是間接進行。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述惡性疾病選自腺癌、間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌和非小細胞肺癌。
28.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測所述抗體與所述抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種抗體，以確定所述生物樣品中存在選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，(ii)所述樣品包含受試者的細胞時的細胞表面分子，所述分子具有與所述至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇，其抗原結(jié)合位點競爭性抑制選自2H5、3D8和4H4的單克隆抗體的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。
29.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測所述抗體與所述抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種抗體，以確定所述生物樣品中存在選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，(ii)所述樣品包含受試者的細胞時的細胞表面分子，所述分子具有與所述抗體反應(yīng)的抗原決定簇，其抗原結(jié)合位點競爭性抑制單克隆抗體3D8的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。
30.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測所述至少一種抗體與所述抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原性多肽的特異抗體，以確定所述生物樣品中存在選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，(ii)所述樣品包含受試者的細胞時的細胞表面分子，所述分子具有與所述抗體反應(yīng)的抗原決定簇，其中所述至少一種抗體免疫特異性結(jié)合HE4a抗原，從而檢測惡性疾病的存在。
31.權(quán)利要求30的方法，其中HE4a抗原也與選自3D8、2H5和4H4的單克隆抗體免疫特異性反應(yīng)。
32.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測所述抗體與所述抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的抗體，以確定所述生物樣品中存在選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，(ii)所述樣品包含受試者的細胞時的細胞表面分子，所述分子具有與所述至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇，其抗原結(jié)合位點競爭性抑制選自2H5和4H4的單克隆抗體的免疫特異性結(jié)合，其中所述至少一種抗體免疫特異性結(jié)合HE4a抗原，從而檢測惡性疾病的存在。
33.權(quán)利要求32的方法，其中該HE4抗原也與單克隆抗體3D8免疫特異性反應(yīng)。
34.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以使所述至少一種固定化的第一抗體與所述HE4a抗原多肽特異結(jié)合、從而形成免疫復合物的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的固定化的第一抗體，以確定所述生物樣品中存在可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子；去除未特異性結(jié)合所述至少一種固定化的第一抗體的樣品組分；以及在足以檢測所述至少一種第二抗體與所述HE4a抗原多肽特異性結(jié)合的條件和時間下，使所述免疫復合物接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的第二抗體，其中所述至少一種第二抗體的抗原結(jié)合位點不競爭性抑制所述至少一種固定化的第一抗體的抗原結(jié)合位點，從而檢測惡性疾病的存在。
35.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足夠使所述至少一種固定化的第一抗體與所述HE4a抗原多肽結(jié)合、從而形成免疫復合物的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的固定化的第一抗體，以確定所述生物樣品中存在以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，其中所述至少一種第一抗體的抗原結(jié)合位點競爭性抑制單克隆抗體3D8的免疫特異性結(jié)合；去除未特異性結(jié)合所述至少一種固定化的第一抗體的樣品組分；以及在足以檢測所述至少一種第二抗體與所述HE4a抗原多肽特異性結(jié)合的條件和時間下，使所述免疫復合物接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的第二抗體，其中所述至少一種第二抗體的抗原結(jié)合位點不競爭性抑制單克隆抗體2H5的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。
36.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足夠使所述至少一種固定化的第一抗體與所述mesothelin相關(guān)抗原多肽結(jié)合、從而形成免疫復合物的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的固定化的第一抗體，以確定所述生物樣品中存在以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，其中所述至少一種第一抗體的抗原結(jié)合位點競爭性抑制單克隆抗體3D8的免疫特異性結(jié)合；去除未特異性結(jié)合所述至少一種固定化的第一抗體的樣品組分；以及在足以檢測所述至少一種第二抗體與所述HE4a抗原多肽特異性結(jié)合的條件和時間下，使所述免疫復合物接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的第二抗體，其中所述至少一種第二抗體的抗原結(jié)合位點不競爭性抑制單克隆抗體4H4的免疫特異性結(jié)合，從而檢測惡性疾病的存在。
37.權(quán)利要求1-36中任一項的方法，其另外包含確定所述樣品中存在至少一種惡性疾病的可溶性標志，該標志選自mesothelin相關(guān)抗原、癌胚抗原、CA125、唾液酸TN、鱗狀細胞癌抗原、組織多肽抗原和胎盤堿性磷酸酶。
38.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測所述抗體與所述抗原決定簇結(jié)合的條件和時間下，使(i)懷疑具有惡性疾病的第一位受試者的第一份生物樣品以及(ii)已知沒有惡性疾病的第二位受試者的第二份生物樣品分別接觸至少一種HE4a抗原多肽特異性的抗體，以確定所述第一份和第二份生物樣品中分別存選自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述樣品中的分子，(ii)所述第一份和第二份生物樣品各分別包含來自所述第一位和第二位受試者的細胞時的細胞表面分子，所述分子具有與所述至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇，并比較所述抗體與第一份及第二份生物樣品中所述抗原決定簇的可檢測性結(jié)合水平，從而檢測惡性疾病的存在。
39.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含檢測受試者生物樣品中存在免疫特異性結(jié)合HE4a抗原多肽的抗體。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述HE4a抗原多肽包含具有選自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13氨基酸序列的多肽。
41.HE4a抗原多肽特異性的抗體，其包含特異性結(jié)合HE4a抗原多肽的單克隆免疫球蛋白可變區(qū)，其中所述HE4a抗原多肽包含具有選自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO11和SEQ ID NO13氨基酸序列的多肽。
42.權(quán)利要求41的抗體，它是融合蛋白質(zhì)。
43.權(quán)利要求41的抗體，它是單鏈抗體。
44.權(quán)利要求41的抗體，其中所述HE4a抗原多肽被糖基化。
45.權(quán)利要求41的抗體，其選自(i)特異性結(jié)合SEQ ID NO11所示HE4a抗原多肽序列、但不特異性結(jié)合SEQ ID NO9所示多肽序列的抗體，(ii)特異性結(jié)合SEQ ID NO9所示多肽序列、并特異性結(jié)合SEQ ID NO11所示HE4a多肽序列的抗體。
46.權(quán)利要求41的抗體，其選自單克隆抗體2H5、3D8和4H4。
47.篩選受試者中存在惡性疾病的方法，其包含在足以檢測以可溶性形式天然存在于所述樣品中的抗體與所述HE4a多肽結(jié)合的條件和時間下，使受試者的生物樣品接觸可檢測性標記的HE4a多肽，從而檢測惡性疾病的存在。
48.分離的核酸分子，其選自(a)編碼包含HE4a抗原多肽以及至少一種融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)的核酸分子，該多肽包含選自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQID NO11和SEQ ID NO13所示氨基酸序列的氨基酸序列；以及(b)能夠在中度嚴謹性條件下與(a)中核酸分子雜交、并編碼HE4a多肽的核酸分子，其中該分離的核酸分子不是包含SEQ ID NO9所示核酸序列的核酸分子。
49.反義寡核苷酸，其包含與權(quán)利要求48的核酸分子互補的至少15個連續(xù)核苷酸。
50.融合蛋白質(zhì)，其包含與融合結(jié)構(gòu)域融合的HE4a多肽序列。
51.權(quán)利要求50的融合蛋白質(zhì)，其中所述融合結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白或其變體或片段。
52.權(quán)利要求50的融合蛋白質(zhì)，其中與HE4a多肽融合的多肽序列可由蛋白酶切割。
53.權(quán)利要求50的融合蛋白質(zhì)，其中所述多肽序列是具有配基親和力的親和標記多肽。
54.重組表達構(gòu)建體，其包含至少一種與權(quán)利要求48的核酸可操作連接的啟動子。
55.權(quán)利要求54的表達構(gòu)建體，其中所述啟動子是被調(diào)節(jié)的啟動子。
56.權(quán)利要求54的表達構(gòu)建體，其中所述HE4a多肽被表達為與另一種核酸序列的多肽產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)。
57.權(quán)利要求56的表達構(gòu)建體，其中所述另一種核酸序列的多肽產(chǎn)物是免疫球蛋白恒定區(qū)。
58.權(quán)利要求54的重組表達構(gòu)建體，其中該表達構(gòu)建體是重組病毒表達構(gòu)建體。
59.包含權(quán)利要求54-58中任一項的重組表達構(gòu)建體的宿主細胞。
60.權(quán)利要求59的宿主細胞，其中該宿主細胞是原核細胞。
61.權(quán)利要求59的宿主細胞，其中該宿主細胞是真核細胞。
62.產(chǎn)生重組HE4a多肽的方法，其包含培養(yǎng)包含重組表達構(gòu)建體的宿主細胞，該構(gòu)建體包含至少一種與權(quán)利要求48的核酸序列可操作連接的啟動子。
63.權(quán)利要求62的方法，其中該啟動子是被調(diào)節(jié)的啟動子。
64.產(chǎn)生重組HE4a多肽的方法，其包含培養(yǎng)利用權(quán)利要求58的重組病毒表達構(gòu)建體感染的宿主細胞。
65.檢測樣品中HE4a表達的方法，其包含(a)使權(quán)利要求49的反義寡核苷酸接觸包含編碼具有SEQ IDNO11所示氨基酸序列的HE4a多肽的核酸序列、或其片段或變體的樣品；以及(b)檢測樣品中可與該反義寡核苷酸雜交的HE4a多肽編碼核酸的量，從而檢測樣品中HE4a的表達。
66.權(quán)利要求65的方法，其中使用聚合酶鏈式反應(yīng)來測定可與該反義寡核苷酸雜交的HE4a多肽編碼核酸的量。
67.權(quán)利要求65的方法，其中使用雜交分析來測定可與該反義寡核苷酸雜交的HE4a多肽編碼核酸的量。
68.權(quán)利要求65的方法，其中所述樣品包含RNA或cDNA制備物。
69.治療惡性疾病的方法，其包含給予有此需要的患者包含HE4a抗原多肽特異性抗體的組合物，所述抗體包含特異性結(jié)合具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a抗原多肽的單克隆免疫球蛋白可變區(qū)。
70.治療惡性疾病的方法，其包含給予有此需要的患者包含具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a抗原多肽、或其片段的組合物。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述組合物誘導患者產(chǎn)生能夠特異性結(jié)合具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的抗體。
72.權(quán)利要求70的方法，其中所述組合物誘導患者能夠特異性識別具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的T淋巴細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測惡性疾病的組合物和方法，并涉及可溶性及細胞表面形式的HE4a多肽、包括卵巢癌過表達的HE4a的發(fā)現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明提供了HE4a的編碼核酸序列，還提供了通過檢測HE4a多肽特異性抗體與以可溶性和/或細胞表面形式天然存在于受試者樣品中的分子的反應(yīng)性、通過使用HE4a核酸序列進行雜交篩選來篩查該受試者中存在的惡性疾病的方法、及其它相關(guān)益處。
文檔編號C07K16/30GK1813188SQ02819268
公開日2006年8月2日 申請日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月29日
發(fā)明者M·舒莫爾, I·赫爾斯特龍, K·E·赫爾斯特龍, J·A·萊德貝特, M·海登-萊德貝特 申請人:太平洋西北研究院