專利名稱：肽基多聚體靶向的造影介質(zhì)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于診斷成像的造影介質(zhì)，根據(jù)涉及肽靶向的多聚體造影介質(zhì)，其中，肽的作用是尋靶基團以及是一個或多個螯合物在肽的氨基和羧基末端的連接點。
背景技術：
診斷成像技術如磁共振成像(MRI)、X-射線、核放射性藥物成像、紫外-可見-紅外線光成像和超聲，已多年用于醫(yī)學診斷。人們用添加的造影介質(zhì)來改善或增加成像的分辨率或提供特定的診斷信息。
為了有效，造影介質(zhì)必須與成像技術中所用的電磁輻射的波長相干涉，改變組織的物理特性來得到改變了的信號或在放射性藥物的情況中自身提供放射源。MRI和光學成像方法是獨特的成像技術，因為它們產(chǎn)生對化學環(huán)境敏感的復雜信號。雖然無論這些試劑在血漿中是游離的、或是結(jié)合于蛋白質(zhì)或其它靶點、或被捕獲于骨骼中，從X-射線或放射性核素試劑得到的信號都是保持相同的，但一些MRI和光學成像的造影介質(zhì)在不同的生理環(huán)境中有不同的信號特性。一種光學染料在結(jié)合時可表現(xiàn)出其吸光度、反射率、熒光、磷光、化學發(fā)光、散射或其它光學特性的變化。重要的是，造影介質(zhì)必須充分靈敏且存在的濃度足夠高，從而能夠觀察到信號的變化。
釓或其它順磁性離子和有機配體形成的絡合物被廣泛用于增強和改善MRI對比度。釓絡合物通過增加在MRI過程中能與造影介質(zhì)接觸的水分子中的氫核的核磁馳豫速率提高對比度(Caravan，P.等，R.B.Chem.Rev.99，2293(1999))。相對未與造影介質(zhì)接觸的其它水分子中的氫核，這些水分子中氫核的馳豫速率增加了。馳豫速率的這一改變導致改進了影像的對比度。此外，在特定水分子氫核群中馳豫率(relaxivity)的這一增加可導致在給定的時間內(nèi)收集更多影像數(shù)據(jù)的能力。這反過來改善了信噪比。
還可用光進行成像，在該情況下選擇光學染料來提供信號。特別地，600-1300nm(可見到近紅外)范圍內(nèi)的光相對容易通過生物組織，并可被用于成像目的。透過的、被散射的、被反射的或被再發(fā)射(熒光)的光被檢測并產(chǎn)生影像。染料吸光度、反射系數(shù)或熒光特性的變化，包括吸收峰數(shù)目的增加或減少或其最大波長的變化，可在與生物靶標的結(jié)合時發(fā)生，因此提供了額外的組織對比度。一些情況下，例如診斷接近身體表面的疾病，也可使用UV或可見光。
需要可將足夠濃度的成像部分輸送到靶標以改善成像過程的靈敏度的造影介質(zhì)，以及在體內(nèi)有足夠的半衰期的造影介質(zhì)。
概述本發(fā)明基于用于MR、光學和放射性核素成像的肽和肽靶向的多聚體造影介質(zhì)，其中單獨的肽的作用是尋靶基團以及是一個或多個螯合物在肽的N-和C-末端的連接點，連接是直接的或通過任選的中間連接基。意想不到的是，本發(fā)明的造影介質(zhì)對生物靶標如血纖蛋白保持結(jié)合親和性和高馳豫率。本發(fā)明的試劑在體內(nèi)施用后有足夠的半衰期，這樣就可進行有效的成像研究。
一方面，本發(fā)明以純化的肽為特征，該肽含有氨基酸序列P*-Y*-X1*-L*(SEQ IDNO1)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1*是G或D或G或D的非天然衍生物；L*是亮氨酸或其非天然衍生物；且其中至少P*、Y*、X1*和L*之一是各個氨基酸的非天然衍生物。X1*可以是G或D和L*可以是亮氨酸。在一些實施方案中，P*是脯氨酸或4-羥脯氨酸和Y*是酪氨酸或在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。本發(fā)明的化合物可包括與溶血栓劑結(jié)合的這種肽。
在另一方面，本發(fā)明以純化的肽為特征，所述肽含有氨基酸序列X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(SEQ ID NO2)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1選自W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)和Y(3*)，其中F(3/4*)是在3或4位被選自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸，且其中Y(3*)是在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸；X2選自E、H、dE、S、H(Bzl)、2-Pal、Dpr和Th；X3選自G和D；X4選自H、F、Y和W；X5選自I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal和F(3/4*)，其中F(3/4*)是在3或4位被選自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸；X6選自N、Q、I、L和V或X6不存在；其中至少X1，X2，X5，P*和Y*之一是氨基酸的非天然衍生物。例如，P*可以是脯氨酸或4-羥脯氨酸和Y*可以是酪氨酸或在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。所述純化的肽能夠在非還原條件下形成二硫鍵和對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。在一些實施方案中，所述肽含有二硫鍵。本發(fā)明的化合物可包括與溶血栓劑結(jié)合的這種肽。
本發(fā)明還以純化的肽為特征，所述肽含有選自W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO4)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO5)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO6)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO7)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO8)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO9)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO10)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ IDNO11)、F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO12)、Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO13)、W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO14)、W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO15)和F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO16)的氨基酸序列。所述肽能夠在非還原條件下形成二硫鍵和在一些實施方案中，所述肽含有二硫鍵。這些肽可對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。本發(fā)明的化合物可包括與溶血栓劑結(jié)合的這種肽。
在一些實施方案中，P*是脯氨酸；Y*是酪氨酸；X1選自W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)和Y(3*)，其中F3/4*是在3或4位被選自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸，且其中Y3*是在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸；X2選自dE，H(Bzl)，2-Pal，Dpr和Th；X3選自G和D；X4選自H、F、Y和W；X5選自I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal和F(3/4*)，其中F3/4*是在3或4位被選自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸，其中至少X1，X2或X5之一是非天然氨基酸衍生物；和X6選自N、Q、I、L和V或X6不存在。這種肽能夠在非還原條件下形成二硫鍵，在一些實施方案中，所述肽含有二硫鍵。所述肽可對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。
在其它實施方案中，本發(fā)明以純化的肽為特征，所述肽含有氨基酸序列C-P*-Y*-X1-L-C(SEQ ID NO3)，其中X1是G或D，P*是脯氨酸或其非天然衍生物4-羥脯氨酸；Y*是酪氨酸或在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物；條件是，至少P*或Y*之一是各個氨基酸的非天然衍生物。所述純化的肽能夠在非還原條件下形成二硫鍵并可對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。在一些實施方案中，所述肽含有二硫鍵。本發(fā)明的化合物可包括與溶血栓劑結(jié)合的這種肽。
本發(fā)明還以純化的肽為特征，所述肽含有氨基酸序列C-D-Y-Y-G-T-C-X10(SEQ ID.NO17)，其中X10選自n(癸基)G、n(4-PhBu)G、MeL、Bpa、Bip、Me-Bip、F(4*)、F(3-Me)、F(3，4-二氟)、Amh、Hfe、Y(3，5-二-碘)、Pff、1Nal、d1Nal和MeL，其中F(4*)是在4位被選自Et、CF3、I和iPr的部分取代的苯丙氨酸。純化的肽可包含氨基酸序列C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(SEQ ID.NO18)，其中X11選自D、dD、βD、Inp、Nip、Me-D、dC、Cop和Cmp。例如，所述肽可有以下氨基酸序列L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-dD(SEQ ID NO19)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-D(SEQ ID NO20)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D(SEQ ID NO21)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD(SEQ ID NO22)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Inp(SEQ ID NO23)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp(SEQ IDNO24)或L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D(SEQ ID NO25)。所述純化的肽能夠在非還原條件下形成二硫鍵并可對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。在一些實施方案中，所述肽含有二硫鍵。本發(fā)明的化合物可包括與溶血栓劑結(jié)合的這種肽。
在另一方面，本發(fā)明以制造MR顯影劑的方法為特征。所述方法包括使帶有N-末端胺官能團的肽與連接基-亞單元部分反應以形成含有C-末端胺官能團和N-末端胺官能團的修飾的肽；使連接基部分共價結(jié)合到C-末端胺官能團和N-末端胺官能團以形成前體MR顯影劑；和將前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。所述連接基-亞單元部分可以選自 和 其中，n是1-4的整數(shù)；m是選自1-12的整數(shù)；R是脂肪基或芳基。所述連接基部分可以選自
其中，m是1-4的整數(shù)；n是0-4的整數(shù)；LG是離去基團；R’和R”獨立選自氫和化學保護基。
所述連接基部分也可選自 其中，LG是離去基團；和R1和R2獨立選自氫和化學保護基。所述LG可以選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐。所述活性酯可以選自五氟苯酚(Pfp)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰鈉鹽(NHSS)、2-硫代噻唑烷-1-基和羥基苯并三唑(OBT)。所述鹵化物可以選自F，Cl，Br和I。所述化學保護基可以選自Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、芐基和烯丙基。
將前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑可包括使前體顯影劑與前體螯合部分反應以在前體螯合部分和前體MR顯影劑的連接基部分之間形成共價鍵，所述前體螯合部分含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分；將結(jié)合的前體螯合部分的多個羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成多個羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。所述前體螯合部分可以選自
和 其中，Y是能夠能夠與所述連接的連接基部分形成共價鍵的合成部分，且其中每個X分別是O-或O-前體，這樣，在X轉(zhuǎn)變成O-后就能夠與其鄰近的羰基形成羧酸鹽部分，R1是不帶電荷的化學部分、脂肪基烷基或環(huán)烷基或其不帶電荷的取代的形式。所述合成部分選自羧酸、活性酯、酸酰鹵、酸酐、鹵代烷、異氰酸酯和異硫氰酸酯，其中O-前體選自-OH、-OMe、OEt、OtBu、O芐基和O-烯丙基。所述前體螯合部分也可選自 和 其中，LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團，且其中每個R分別是選自OH，-O-Me，O-Et，O-tBu，O-芐基和O-烯丙基的O-或O-前體，這樣，在R轉(zhuǎn)變成O-后就能夠與其鄰近的羰基形成羧酸鹽部分。
所述前體螯合部分還可選自 其中，n是1-4的整數(shù)；R選自負電荷和能夠轉(zhuǎn)化成負電荷的帶有負電荷的前體；和X是選自-Cl，-Br，-I，-MsO，-TsO和-TfO的化學離去基團。
所述前體螯合部分還可選自
其中，R選自負電荷和能夠轉(zhuǎn)化成負電荷的帶有負電荷的前體；X是選自-Cl，-Br，-I，-MsO，-TsO和-TfO的化學離去基團。所述帶有負電荷的前體選自-H，-Me，-Et，-t-Bu，-芐基和-烯丙基。
在一些實施方案中，所述連接基部分可與前體螯合部分共價綴合，所述共價綴合物含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分。將前體MRI顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑可包括將多個共價綴合物的羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。所述順磁性金屬離子可以選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。Gd(III)是特別有用的順磁性離子。
所述共價綴合物選自
和 其中，n是1-4的整數(shù)；LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團；和R1，R2，R3，R4和R5獨立選自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保護的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
所述共價綴合物選自 其中，LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團；R1，R2，R3和R4選自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保護的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
所述共價綴合物選自合成子1
和合成子2 所述共價綴合物選自 其中，R是-tBu基，LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團。
本發(fā)明的方法還可包括，在將連接基部分共價附到C-和N-末端胺官能團之前，使連接基-亞單元與肽的N-末端胺官能團反應以得到肽的衍生的N-末端胺官能團。
所述連接基-亞單元選自 和 其中，堿基選自腺苷、鳥苷、胸腺嘧啶和胞嘧啶；LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團；R是脂肪或芳香部分。所述連接基-亞單元選自 其中，n分別為0-3的整數(shù)；R是脂肪基或芳基；LG是選自OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團。
所述連接基-亞單元也可選自 和 其中，n分別是1或2；R是脂肪基或芳基；LG是選自OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團。
在另一方面，本發(fā)明以制造MR顯影劑的方法為特征。所述方法包括使氨基酸殘基共價結(jié)合到連接基-亞單元部分以形成肽的C-末端，其中所述連接基-亞單元部分共價連接到樹脂上；在樹脂上從共價結(jié)合的C-末端到肽的N-末端殘基合成肽，所述N-末端殘基包括N-末端胺官能團；從樹脂上切下肽以產(chǎn)生帶有C-末端胺官能團的肽；將連接基部分共連接到肽的C-末端胺官能團和N-末端胺官能團以形成前體MR顯影劑；和將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)化成MR顯影劑。所述方法還包括在從樹脂上切下肽之前使連接基-亞單元附到共價綴合到N-末端胺官能團以制造衍生的N-末端胺官能團。所述連接基部分可共價結(jié)合到前體螯合部分，所述共價綴合物含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分將前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑可包括使前體顯影劑與前體螯合部分反應以在前體螯合部分和前體MR顯影劑的連接基部分之間形成共價鍵，所述前體螯合部分含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分；將結(jié)合的前體螯合部分的多個羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成多個羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。
將前體MRI顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑還可包括將多個共價綴合物的羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。所述順磁性金屬離子可以選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。Gd(III)是特別有用的順磁性金屬離子。
在另一方面，本發(fā)明以制造MR顯影劑的方法為特征，所述方法包括使帶有C-末端羧酸鹽官能團的肽與連接基-亞單元部分反應以形成具有C-末端羧酸鹽官能團和N-末端羧酸鹽官能團的修飾的肽；使連接基部分共價結(jié)合到修飾的肽的C-末端和N-末端羧酸鹽官能團以形成前體MR顯影劑；和將前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。所述連接基-亞單元部分可以選自 和 其中，LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團；R為脂肪基或芳基。所述連接基部分可以選自
其中，m是1-4的整數(shù)；n是0-4的整數(shù)；R獨立選自-H，-Me，-Et，-Bz和-tBu；和R1和R2獨立選自氫或化學保護基。
所述連接基部分選自 其中，R1和R2獨立選自氫和化學保護基，所述化學保護基選自Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、芐基和烯丙基。
將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑還包括使前體MR顯影劑與前體螯合部分反應以在前體螯合部分和前體MR顯影劑的連接基部分之間形成共價鍵，所述前體螯合部分包括多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分；將結(jié)合的前體螯合部分的多個羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成多個羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。所述連接基部分共價結(jié)合到前體螯合部分，所述共價綴合物含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠被轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分。
將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑還包括將多個共價綴合物的羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。
所述共價綴合物可選自
和 其中，n是1-4的整數(shù)；R1，R2，R3，R4和R5獨立選自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保護的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。所述共價綴合物是 將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑還包括使前體顯影劑與螯合部分反應，其中所述螯合部分含有順磁性金屬離子，以在螯合部分和前體MR顯影劑的連接基部分之間形成共價鍵以制造MR顯影劑。合適的順磁性金屬離子如上所述。
在另一方面，本發(fā)明以造影介質(zhì)為特征，所述造影介質(zhì)在生物高分子(如肽)的-CO2R和NHR末端含有金屬螯合物的造影介質(zhì)，其中，R獨立選自氫，烷基，脂肪基和離去基團。所述造影介質(zhì)可在生物高分子的CO2R和NHR末端含有兩個金屬螯合物。所述生物高分子對血纖蛋白有特異的結(jié)合親合性。所述肽能夠在非還原條件下形成二硫鍵，在一些實施方案中，包括二硫鍵。所述造影介質(zhì)可含有以下結(jié)構(gòu)
其中，螯合物代表金屬螯合物；連接基代表連接基部分；連接基-亞單元代表連接基-亞單元部分；m獨立為1-10的整數(shù)；p獨立為0-5的整數(shù)；s獨立是0或1；R1是氨基酸側(cè)鏈或其衍生物；R2獨立是氫或脂肪基。該造影介質(zhì)也可具有結(jié)構(gòu)4-55中任一所述的結(jié)構(gòu)。
在另一方面，本發(fā)明以改變肽的穩(wěn)定性的方法為特征，所述肽帶有N-末端胺官能團的肽。所述方法包括使所述肽與連接基-亞單元部分反應以形成具有C-末端胺官能團的肽；和使連接基部分共連接到肽的C-末端胺官能團和N-末端胺官能團以形成修飾的肽。所述方法還包括使修飾的肽與帽化部分反應以在帽化部分和修飾的肽的連接基部分之間形成共價鍵。所述方法還包括使修飾的肽與前體螯合部分反應以在前體螯合部分和修飾的肽的連接基部分之間形成共價鍵，所述前體螯合部分含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分。在將結(jié)合的前體螯合部分的多個羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成多個羧酸鹽部分后，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；順磁性金屬離子可與多個羧酸鹽部分配位。所述的方法還包括測定所述修飾的肽的穩(wěn)定性或測定所述未修飾的肽的穩(wěn)定性和比較所述修飾的肽的穩(wěn)定性與所述未修飾的肽的穩(wěn)定性。修飾的肽的穩(wěn)定性相對于未修飾的肽的穩(wěn)定性有所改進(如相對于未修飾的肽的穩(wěn)定性增加了10倍、20倍或30倍)。所述穩(wěn)定性采用大鼠肝臟勻漿測定進行。
在另一方面，本發(fā)明以具有以下結(jié)構(gòu)的修飾的肽為特征 其中，螯合物前體代表螯合物前體部分；連接基代表連接基部分；連接基-亞單元代表連接基-亞單元部分；m獨立為1-10的整數(shù)；p獨立為1-5整數(shù)；s獨立是0或1；R1是氨基酸側(cè)鏈或其衍生物；R2選自H和脂肪基。
再在另一方面，本發(fā)明以具有以下結(jié)構(gòu)的修飾的肽為特征 其中，連接基代表連接基部分；連接基-亞單元代表連接基-亞單元部分；p獨立為0-5的整數(shù)；s獨立是0或1；R1是氨基酸側(cè)鏈或其衍生物；R2選自H和脂肪基。
一種制造MR顯影劑的方法的特征還在于，使帶有N-末端胺官能團的肽與連接基-亞單元部分反應以形成在其N-末端和C-末端都有胺官能團的修飾的肽或使帶有C-末端羧酸鹽官能團的肽與連接基-亞單元部分反應以形成在其C-末端和N-末端都有羧酸鹽官能團的修飾的肽；和將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括使螯合部分共價綴合到修飾的肽，其中所述螯合部分含有順磁性金屬離子，以制造MR顯影劑。將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑還包括使連接基部分共價綴合到螯合物部分以形成共價綴合物，其中所述螯合部分含有順磁性金屬離子；以及使共價綴合物與修飾的肽反應以形成MR顯影劑。合適的順磁性金屬離子如上所述。
在另一方面，本發(fā)明以制造MR顯影劑的方法為特征，所述方法包括使氨基酸殘基共價結(jié)合到連接基-亞單元部分以形成肽的C-末端，其中所述連接基-亞單元部分共價結(jié)合到樹脂；在樹脂上從肽的共價結(jié)合的C-末端到N-末端殘基合成肽，所述N-末端殘基包括N-末端胺官能團；從樹脂上切下肽以制造帶有C-末端胺官能團的肽；將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括使螯合部分共價結(jié)合到修飾的肽，其中所述螯合部分含有順磁性金屬離子，以制造MR顯影劑。將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑還包括使連接基部分共價結(jié)合到螯合物部分以形成共價綴合物，其中所述螯合部分含有順磁性金屬離子；以及使共價綴合物與修飾的肽反應以形成MR顯影劑。合適的順磁性金屬離子如上所述。
除非另有說明，這里所用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所述技術領域的一般技術人員的常規(guī)理解有著同樣的含義。盡管可用與這里所述方法類似或等價的方法和材料來實踐本發(fā)明，但下面還是描述了合適的方法和材料。這里提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考資料在此全文并入以供參考。當發(fā)生沖突時，本說明書，包括定義，將進行控制。此外，這些材料、方法和實施例僅是為了舉例而不是進行限制。
通過以下詳細描述和權(quán)利要求將顯見本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。
附圖簡述

圖1提供了非天然氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了20MHz 35℃下，在Tris緩沖的鹽水(TBS)或溶于TBS的10mg/ml血纖蛋白中每Gd的馳豫率。
圖3顯示了血栓中造影介質(zhì)的積累。
圖4A是血栓的影像。圖4B是帶有淤血的血栓的影像。
詳細描述定義在本文中沒有明顯定義的常用化學縮寫可以在“美國化學協(xié)會文體指南(TheAmerican Chemical Society Style Guide)”第二版；American Chemical Society，華盛頓特區(qū)(1997)，“作者指南2001(2001 Guidelines to Authors)”J.Org.Chem.66(1)，24A(2001)，“肽類科學中的縮寫速覽及其應用(A Short Guide toAbbreviations and Their Use in Peptide Science)”J.Peptide.Sci.5，465-471(1999)。
出于本申請的目的，術語“化學保護基”或“保護基”是指任何通過一個或多個按反應順序進行的合成化學步驟與分子臨時共價結(jié)合以防止不希望的反應發(fā)生的化學部分。通常的保護基策略描述在“有機合成中的保護基(Protecting Groups in OrganicSynthesis)，第三版”，P.Wuts和T.Greene，_1999 John Wiley & Sons公司。
出于本申請的目的，術語“離去基團”是指任何在親核取代或加成-消除反應順序中被親核體取代的化學部分。含有離去基團的分子可在化學反應中被分離或可在原位作為暫的中間體形成。
出于本申請的目的，術語“脂肪基”描述了任何無環(huán)或環(huán)狀的、飽和或不飽和、分支或不分支的碳化合物，不包括芳香化合物。
術語“烷基”包括飽和的脂肪基，包括直鏈烷基(如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)，支鏈烷基(異丙基，叔丁基，異丁基等)，環(huán)烷基(脂環(huán)族)基團(環(huán)丙基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基、環(huán)辛基)，烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。術語烷基還包括烷基，所述烷基的烴主鏈的一個或多個碳原子被氧原子、氮原子、硫原子或磷原子替代。在一些實施方案中，直鏈或支鏈烷基的主鏈含有6個或6個以下碳原子(如直鏈為C1-C6，支鏈為C3-C6)，更優(yōu)選是有4個或4個以下。同樣，優(yōu)選的環(huán)烷基的環(huán)結(jié)構(gòu)中含有3-8個碳原子，更優(yōu)選是環(huán)結(jié)構(gòu)中有5或6個碳。術語C1-C6包括含有1-6個碳原子的烷基。
此外，術語“烷基”包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者是指烷基部分烴主鏈的一個或多個碳原子上的氫被取代基取代。這種取代基可以包括，例如，鏈烯基、炔基、鹵素、羥基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸鹽、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲?；碗寤?、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸鹽、硫酸酯、烷基亞磺?；⒒腔?、氨磺酰基、亞磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或芳基部分或雜芳基部分。環(huán)烷基可進一步被取代，例如被上述取代基取代?！胺蓟榛辈糠质潜环蓟〈耐榛?如苯基甲基(芐基))。術語“烷基”還包括天然和非天然氨基酸的側(cè)鏈。術語“n-烷基”是指直鏈(即未分支的)未取代的烷基。
術語“鏈烯基”包括像上述烷基那樣被取代或未被取代的含有至少一個雙鍵和至少兩個碳原子的脂肪基。例如，術語“鏈烯基”包括直鏈鏈烯基(如乙烯基(ethylenyl)、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)，支鏈鏈烯基，環(huán)鏈烯基(脂環(huán)族)基團(環(huán)丙烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)辛烯基)，烷基或鏈烯基取代的環(huán)鏈烯基和環(huán)烷基或環(huán)鏈烯基取代的鏈烯基。術語鏈烯基還包括烴主鏈的一個或多個碳原子被氧原子、氮原子、硫原子或磷原子替代的鏈烯基。在一些實施方案中，直鏈或支鏈鏈烯基的主鏈有6個或6個以下碳原子(如直鏈為C2-C6，支鏈為C3-C6)。同樣，環(huán)鏈烯基的環(huán)結(jié)構(gòu)中可有3-8個碳原子，優(yōu)選在其環(huán)結(jié)構(gòu)中有5或6個碳。術語C2-C6包括含有2-6個碳原子的鏈烯基。
此外，術語鏈烯基包括“未取代的鏈烯基”和“取代的鏈烯基”，后者是指烴主鏈的一個或多個碳上的氫被取代基取代的鏈烯基部分。這種取代基包括，例如，烷基、炔基、鹵素、羥基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸鹽、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸鹽、硫酸酯、烷基亞磺?；?，磺基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基，疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或芳基部分或雜芳基部分。
術語“炔基”包括在長度和可能的取代上與上述烷基類似的不飽和的脂肪基，但含有至少一個三鍵和兩個碳原子。例如，術語“炔基”包括直鏈炔基(如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)，支鏈炔基和環(huán)烷基或環(huán)鏈烯基取代的炔基。術語炔基還包括烴主鏈的一個或多個碳原子被氧原子、氮原子、硫原子或磷原子替代的炔基。在一些實施方案中，直鏈或支鏈炔基的主鏈有6個或6個以下碳原子(如直鏈為C2-C6，支鏈為C3-C6)。術語C2-C6包括含有2-6個碳原子的炔基。
通常，術語“芳基”包括5元和6元單環(huán)芳香基，它可以含有0-4個雜原子，例如苯、苯基、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、異噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、異噁唑、吡啶、哌嗪、噠嗪和嘧啶等。此外，術語“芳基”包括多環(huán)芳基，如三環(huán)、二環(huán)，如萘、苯并噁唑、苯并二噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亞甲二氧苯基、喹啉、異喹啉、萘啶(napthridine)，吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、去氮雜嘌呤(deaza嘌呤)或吲哚嗪。那些在環(huán)結(jié)構(gòu)中含有雜原子的芳基也被稱為“芳基雜環(huán)”、“雜環(huán)”、“雜芳基”或“雜芳族化合物”。芳基可在一個或多個環(huán)位置上被取代基取代。
出于本申請的目的，“DTPA”是指含有二亞乙基三胺構(gòu)成的亞結(jié)構(gòu)的化合物，其中，兩個伯胺分別共價連接到兩個乙?；?，仲胺帶有一個共價連接的乙?；?，結(jié)構(gòu)如下 其中，X是能夠與金屬陽離子配位的雜原子電子供體基團，優(yōu)選是O-、OH、NH2、OPO32-或NHR或OR，其中R是任何脂肪基。當每個X基都是叔-丁氧基(tBu)時，此結(jié)構(gòu)可被稱為“DTPE”(“E”表示酯)。
出于本申請的目的，“DOTA”是指含有1，4，7，11-四氮雜環(huán)十二烷亞結(jié)構(gòu)的化合物，其中，每個胺都帶有一個共價連接的乙?；?，有以下結(jié)構(gòu) 其中，X如上述定義。
出于本申請的目的，“NOTA”是指含有1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷亞結(jié)構(gòu)的化合物，其中，每個胺都帶有一個共價連接的乙?；?，有以下結(jié)構(gòu) 其中，X如上述定義。
出于本申請的目的，“DO3A”是指含有1，4，7，11-四氮雜環(huán)十二烷亞結(jié)構(gòu)的化合物，其中，四個胺中有三個分別帶有一個共價連接的乙酰基，其余的胺具有不帶電荷的取代基，結(jié)構(gòu)如下
其中，X如上述定義，R1是不帶電荷的化學部分，優(yōu)選是氫、任何脂肪基、烷基或環(huán)烷基及其不帶電荷的衍生物。優(yōu)選的螯合物“HP”-DO3A中，R1＝-CH2(CHOH)CH3。
在上述四個結(jié)構(gòu)中，所指出的次乙基上的碳被稱為“主鏈”碳?？捎谩癰bDTPA”來表示DTPA分子中化學鍵的位置(“bb”表示“主鏈”)。注意，當用在這里時，bb(CO)DTPA-Gd表示C＝O部分與DTPA的次乙基主鏈碳原子結(jié)合。
術語“螯合配體”、“螯合部分”和“螯合物部分”可以指任何能夠與金屬離子配位的多配位基的配體，包括DTPA(和DTPE)、DOTA、DO3A或NOTA分子或如這里進一步定義的任何其它合適的多配位基的螯合配體，它與金屬離子配位或能夠直接或在除去保護基后與金屬離子配位，或是用于合成造影介質(zhì)的試劑，所述試劑帶有或不帶有合適的保護基，并包括幾乎所有最終將與最后的金屬絡合物的金屬離子配位的原子。術語“螯合物”實際上是指金屬-配體絡合物，應該知道多配位基的配體最終將與在醫(yī)學上有用的金屬離子配位。
術語“特異的結(jié)合親和性”在這里是指造影介質(zhì)能夠被特定的生物組分以大于其它組分的程度被攝入、保留或結(jié)合的能力。有此特性的造影介質(zhì)被稱為“靶向”“目標”組分。沒有此特性的造影介質(zhì)被稱為“非特異性”或“非靶向”試劑。結(jié)合基團對目標的特異結(jié)合親和性以平衡離解常數(shù)“Kd”表示。
術語“馳豫率”在這里是指每毫摩(mM)濃度的順磁性離子或造影介質(zhì)MRI量1/T1或1/T2的增加，如果造影介質(zhì)含有多種順磁性離子則這些量可以不同，其中T1是縱向或自旋點陣馳豫時間，T2是水的氫核或其它成像或光譜核的橫向或自旋-自旋馳豫時間，包括水以外分子中的氫核。馳豫率的單位是mM-1s-1。
術語“開放配位位點”在這里是指通常被水或溶劑分子占據(jù)的金屬離子上的位點。
當用在這里時，術語“純化的”是指已經(jīng)與它通常結(jié)合的天然產(chǎn)生的有機分子分離的肽，或者，當提到化學合成的肽時，是指已經(jīng)與化學合成中出現(xiàn)的任何其它有機分子分離的肽。通常，當多肽干重的至少70％(如70％，80％，90％，95％或99％)不含任何其它蛋白質(zhì)或有機分子時該多肽被認為是“純化的”。
當用在這里時，術語″肽″是指含有約2-75個氨基酸長度的氨基酸鏈(如3-50個氨基酸)。
當用在這里時，術語“生物高分子”是指在生物系統(tǒng)中天然形成的聚合物。一些生物高分子可由一組確定的構(gòu)成亞單元和連接這些亞單元的常規(guī)的官能度構(gòu)成，例如肽通常是由一組氨基酸(天然和非天然氨基酸)由連接此亞單元的酰胺鍵構(gòu)成的。
術語“多聚體”在這里是指造影介質(zhì)或其含有至少兩個共價結(jié)合的螯合物的亞單元或其合成前體。
當用在這里時，術語“天然”或“天然產(chǎn)生的”氨基酸是指20種最常見的氨基酸之一。經(jīng)過修飾的提供檢測標記(如放射性標記、光學標記或染料)的天然氨基酸被認為是天然氨基酸。天然氨基酸用它們的標準一個字母或三個字母的縮寫表示。
術語“非天然氨基酸”或“非天然”是指天然氨基酸(包括D構(gòu)型)的任何衍生物和β和γ氨基酸衍生物。某些氨基酸，如羥脯氨酸，在這里被歸為非天然氨基酸，可在自然界的一些生物體或特定蛋白質(zhì)中找到。
術語“穩(wěn)定的”在這里是指具有足以進行制造的穩(wěn)定性并能將化合物的完整性保持足夠長的時間的化合物，在這段時間內(nèi)該化合物對這里詳細描述的目的是安全有效的。代表性地，這種化合物在40℃或更低溫度下，在沒有水蒸氣或其它化學反應條件下至少可穩(wěn)定一周。取代基和本發(fā)明可想像到的變化的組合只是能產(chǎn)生穩(wěn)定化合物的那些。
術語“靶結(jié)合”和“結(jié)合”在這里是指造影介質(zhì)與靶點的非共價相互作用。這些非共價相互作用相互無關，可以是疏水的、親水的、偶極-偶極、π-重疊、氫鍵、靜電相互作用或路易斯酸-堿作用。
術語“帽化部分”是指螯合物、有機染料、造影介質(zhì)、溶血栓劑或穩(wěn)定化處理部分。合適的穩(wěn)定化處理部分是生物惰性的，即不具有生物活性。
造影介質(zhì)通常，本發(fā)明涉及MRI、光學和放射性核造影介質(zhì)，包括尋靶聚合物(如肽)，其中N-和C-末端氨基酸都直接或通過任選的間隔連接基-亞單元和連接基頭與至少一個順磁性(用于核磁共振成像)或放射性(用于放射性核素成像)金屬離子螯合物或光學染料(用于光學成像)綴合。如這里進一步舉例的，所述連接基或連接基-亞單元可以分支，因此肽的各個末端可有多個螯合物或染料連接，即形成多聚體。本發(fā)明的化合物可含有一個或多個不對稱碳原子，因此可產(chǎn)生外消旋體和外消旋混合物、單一對映體、非對映混合物和各個非對映體。這些化合物所有的這些異構(gòu)形式都包括在本發(fā)明之內(nèi)。除非另有說明，每個立構(gòu)的碳可以是R或S構(gòu)型的。盡管本申請中特別例舉的化合物有特定的立體化學構(gòu)型，但在任何給定的手性中心有相反立體化學的化合物或它們的混合物也包括在內(nèi)。應該理解，本發(fā)明的化合物在溶液中、藥物組合物中和體內(nèi)可以有各種構(gòu)象和離子形式。盡管這里描述的特別優(yōu)選的本發(fā)明的化合物有著特定的構(gòu)象和離子形式，但本發(fā)明不限于此。
本發(fā)明的新型肽基多聚體作為靶向造影介質(zhì)有以下優(yōu)點。
1.所述化合物可通過一個尋靶肽將兩個或多個帽化部分(如螯合物、有機染料或溶血栓劑)輸送到靶點，這樣就可以觀察到足夠強的組織對比，這一部分是由于靶點周圍成像部分的濃度較高。
2.本發(fā)明的這種MRI造影介質(zhì)在與靶點結(jié)合時還有較高的馳豫率，這是由于當與靶點結(jié)合時受體誘導的磁性增強(RIME)效應以及這種肽限制各個螯合物局部運動的能力。
3.所述化合物對一個或多個靶點有高親和性。
4.由于這種化合物相對較容易用這里所述的方法合成，且每個分子只需要一個肽，所以可以更經(jīng)濟地將多個金屬離子或有機染料輸送到靶點。
5.由于減少了酶的代謝作用(如被肽酶切割除去)本發(fā)明的化合物可具有較高的體內(nèi)穩(wěn)定性(即較長的半衰期)。
本發(fā)明肽基多聚體的這些優(yōu)點使它們成為有效的靶向造影介質(zhì)。
下式可說明本發(fā)明所預期的MRI和放射性核素造影介質(zhì)的化學結(jié)構(gòu) 其中，各個m分別滿足1≤m≤10，螯合物代表金屬螯合物，p獨立為0-5的整數(shù)；s獨立是1或0；R1是包括非天然氨基酸側(cè)鏈在內(nèi)的任何氨基酸側(cè)鏈；R2是任何脂肪基或氫；n是3-50之間的整數(shù)(包括3和50)?；蛘撸琑1和R2可以一起形成一個環(huán)結(jié)構(gòu)(包括脯氨酸及其取代形式)。連接基，如果有的話，可以是不同的。
MRI優(yōu)選的金屬離子的原子序數(shù)為21-29，39-47或57-83，更加優(yōu)選的是原子序數(shù)為21-29，42，44或57-83的金屬離子的順磁性形式。特別優(yōu)選的順磁性金屬離子選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)和Eu(II和III)。Gd(III)特別有用。需要注意的是，當用在這里時，術語“Gd”包括金屬釓的離子形式；這種離子形式可寫作GD(III)、GD3+、gado等，與所預期的離子形式?jīng)]有不同。
對于放射性核素顯影劑，放射性核素90Y、99mTc、111In、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、97Ru、188Re、177Lu、199Au、203Pb和141Ce特別有用。還描述了具有有用光學特性的金屬絡合物。見Murru等，J.Chem.Soc.Chem.Comm.1993，1116-1118。用于光學成像螯合物、鑭系螯合物如La(III)、Ce(III)、Pr(III)、Nd(III)、Pn(III)、Sm(III)、Eu(III)、Gd(III)、Tb(III)、Dy(III)、Ho(III)、Er(III)、Tm(III)、Yb(III)和Ln(III)是合適的。Eu(III)和Tb(III)特別有效。
在顯影劑通過身體包括與靶組織結(jié)合時，金屬螯合物不應解離到任何顯著程度(significant degree)。游離的金屬離子的顯著釋放會導致中毒，這通常是無法接受的。
在一個實施方案中，當提及造影介質(zhì)的上述結(jié)構(gòu)時，m是2，n，s，R1和R2如上述定義，所述連接基部分含有 “螯合物”優(yōu)選是bb(CO)DTPA·Gd。
在另一個實施方案中，當提及造影介質(zhì)的上述結(jié)構(gòu)時，m是2，n、s、R1和R2如上述定義，所述連接基部分含有 “螯合物”部分可以是bb(CO)DTPA·Gd。
出于闡述的目的，本發(fā)明預期的造影介質(zhì)如下，其中指出了各個亞單位
其中，R＝氨基酸側(cè)鏈，這樣所述肽對生物靶點有親和性，m＝金屬離子(對MRI為順磁性，對放射性核素成像為反射性核素，對光學成像為熒光、冷光或吸收)。
本發(fā)明光學造影介質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)如下 其中，1≤m≤10，p獨立為0-5的整數(shù)，n是3-50，R1是包括非天然氨基酸側(cè)鏈在內(nèi)的任何氨基酸側(cè)鏈，R2是任何脂肪基或氫?；蛘逺1和R2一起形成環(huán)結(jié)構(gòu)(包括脯氨酸及其衍生物。肽的N-和C-末端氨基酸直接或通過任選的連接基(如p＝0或1)與光學染料結(jié)合。所述連接基部分可以是不同的。
所述光學染料可以是有機染料或合適的金屬螯合物。已經(jīng)描述了適合光學成像的有機染料，其中包括，例如，熒光卟啉和熒光酞菁染料[例如參見美國專利No.5,641,878]、顆粒物質(zhì)[例如參見WO 96/23524]和聚甲炔染料[例如參見WO 97/13490]。通常使用的光學有機染料有熒光素、若丹明[例如參見Kojima H等，Anal.Chem.73，1967-1973(2001)]、四甲基若丹明[如Anal.Biochem.223，39(1994)]和得克薩斯紅[如Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，3546(1988)]。熒光素和冷光鑭系螯合物特別有效。
靶點和靶結(jié)合肽本發(fā)明造影介質(zhì)的肽部分對生物靶標顯示特異性結(jié)合，其每一末端都可作為一個或多個螯合物的連接點。通常，生物靶點以低濃度(如微摩或更少)存在且無法用現(xiàn)有的單節(jié)顯性釓絡合物MRI造影介質(zhì)有效成像。然而，本發(fā)明的肽基多聚體MRI造影介質(zhì)在靶位點提供了較高的試劑濃度以及高馳豫率以使這些靶點可以成像。類似地，本發(fā)明的肽基多聚體放射性核素造影介質(zhì)可將多個放射性核素輸送到靶點，這樣就可有效改善成像。雖然未局限于任何特定機制，人們認為尋靶使顯影劑在要成像的靶位點上濃度增加，并通過RIME效應使MRI造影介質(zhì)在結(jié)合階段的馳豫率增加，同時通過使結(jié)合的肽剛性化而限制了局部螯合物的運動。
造影介質(zhì)的靶點可存在于任何身體區(qū)室、細胞、器官或組織或它們的組成成份。優(yōu)選的靶點是與診斷和治療有關的位點，即與疾病狀態(tài)有關的位點。特別優(yōu)選的靶點是與體液有關的位點，尤其是與血液、血漿、淋巴液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的液體有關的位點。其它優(yōu)選的靶點是以高濃度存在的蛋白質(zhì)和受體或有大量配體結(jié)合位點的受體。這些靶蛋白質(zhì)包括酶和糖蛋白。
人血清白蛋白(HSA)和血纖蛋白是MRI造影介質(zhì)的有效靶點。為進行血管郁血(blood pool)成像，血清白蛋白是優(yōu)選的靶點。由于HSA以高濃度存在于血清中(約0.6mM)并與許多分子以高親和性結(jié)合，因此是血池造影介質(zhì)優(yōu)選的靶血漿蛋白質(zhì)。HSA是心血管成像優(yōu)選的靶點；參見1997年7月24日提交的美國專利申請No.08/875,365和WO 96/23526。
為對血栓進行成像，血纖蛋白是優(yōu)選的靶點，因為它存在于所有的血凝塊中，且它無需用常規(guī)的溶血栓劑處理即可成為靶點。為了解與包括血纖蛋白結(jié)合肽的靶結(jié)合部分有關的細節(jié)可參見PCT專利申請WO 01/09188。
其它蛋白質(zhì)靶點包括但不限于α酸糖蛋白、血纖蛋白原、骨膠原、血小板GPIIb/IIIa受體、趨化肽受體、促生長素抑制素受體、血管活性腸肽(VIP)受體、鈴蟾肽/胃泌素釋放肽受體等整聯(lián)蛋白受體。
用于本發(fā)明的合適的肽包括能夠特異性結(jié)合上述靶點的那些。其中包括進行血栓成像的靶向血小板GPIIb/IIIa受體的含有RGD的肽，進行感染/炎癥成像的靶向白細胞的趨化肽，進行腫瘤成像的靶向somastatin受體的奧曲肽和P-829肽，進行腫瘤成像的靶向VIP受體的血管活性腸肽(VIP)，進行腫瘤成像的靶向鈴蟾肽/胃泌素釋放肽受體的鈴蟾肽類似物，和進行腫瘤成像的靶向整聯(lián)蛋白v3(玻連蛋白受體)的含有RGD的肽。
原則上，任何對生物靶點具有親和性的肽都可用作本發(fā)明的造影介質(zhì)。所述肽可以是線性或環(huán)狀的。通常，不可溶的親脂性肽不適合藥理學應用，但由于在肽的兩個末端加入親水的金屬螯合物可增加溶解度所以這種肽是適合本發(fā)明的。為易于合成和降低費用，優(yōu)選這種肽有3-50個氨基酸(如3-30個、3-20個、3-15個、5-30個、5-20個、5-15個、10-12個氨基酸)。
在本發(fā)明的尋靶肽中，可使用各種氨基酸。合適的氨基酸包括天然和非天然氨基酸。帶有許多不同保護基適合直接用于固相肽合成的氨基酸是商業(yè)上可獲得的。除了20中最常見的天然氨基酸，以下非天然氨基酸或氨基酸衍生物也可作來構(gòu)成本發(fā)明的尋靶肽(括號里為常用的縮寫，見圖1)-丙氨酸(-Ala)、γ-氨基丁酸(GABA)、2-氨基丁酸(2-Abu)、α，β-二氫-2-氨基丁酸(-Abu)、1-氨基環(huán)戊烷-1-羧酸(ACPC)、氨基異丁酸(Aib)、2-氨基-噻唑啉-4-羧酸，5-氨基纈草酸(5-Ava)、6-氨基己酸(6-Ahx)、8-氨基辛酸(8-Aoc)、11-氨基十一烷酸(11-Aun)、12-氨基月桂酸(12-Ado)、2-氨基苯甲酸(2-Abz)、3-氨基苯甲酸(3-Abz)、4-氨基苯甲酸(4-Abz)、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸(Statine，Sta)、氨基羥基乙酸(Aoa)、2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘-2-羧酸(Atc)、4-氨基-5-環(huán)己基-3-羥基戊酸(ACHPA)、對-氨基苯丙氨酸(4-NH2-Phe)、二苯丙氨酸(Bip)、對-溴代苯丙氨酸(4-Br-Phe)、鄰-氯代苯丙氨酸(2-Cl-Phe)、間-氯代苯丙氨酸(3-Cl-Phe)、對-氯代苯丙氨酸(4-Cl-Phe)、間-氯代酪氨酸(3-Cl-Tyr)、對-苯甲酰苯丙氨酸(Bpa)、叔丁基甘氨酸(Tle)、環(huán)己基丙氨酸(Cha)、環(huán)己基甘氨酸(Chg)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、2，4-二氨基丁酸(Dbu)、3，4-二氯代苯丙氨酸(3，4-Cl2-Phe)、3，4-二氟代苯丙氨酸(3，4-F2-Phe)、3，5-二碘代酪氨酸(3，5-I2-Tyr)、鄰-氟代苯丙氨酸(2-F-Phe)、間-氟代苯丙氨酸(3-F-Phe)、對-氟代苯丙氨酸(4-F-Phe)、間-氟代酪氨酸(3-F-Tyr)、高絲氨酸(Hse)、高苯丙氨酸(Hfe)、高酪氨酸(Htyr)、5-羥基色氨酸(5-OH-Trp)、羥脯氨酸(Hyp)、對-碘代苯丙氨酸(4-I-Phe)、3-碘代酪氨酸(3-I-Tyr)、二氫吲哚-2-羧酸(Idc)、異哌啶酸(Inp)、間-甲基酪氨酸(3-Me-Tyr)、1-萘基丙氨酸(1-Nal)、2萘基丙氨酸(2-Nal)、對-硝基苯丙氨酸(4-NO2-Phe)、3-硝基酪氨酸(3-NO2-Tyr)、正亮氨酸(Nle)、正纈氨酸(Nva)、鳥氨酸(Orn)、鄰-磷酪氨酸(H2PO3-Tyr)、八水吲哚-2-羧酸(Oic)、青霉胺(Pen)、五氟苯丙氨酸(F5-Phe)、苯基甘氨酸(Phg)、2-哌啶酸(Pip)、炔丙基甘氨酸(Pra)、焦谷氨酸(pGlu)、肌氨酸(Sar)、四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)和噻唑烷-4-羧酸(硫代脯氨酸，Th)。氨基酸的立體化學可在名稱或縮寫之前用“D”或“d”或“L”或“l(fā)”表示。此外，可使用αN-烷基化氨基酸，以及帶有含胺側(cè)鏈的氨基酸(如Lys和Orn)，其中的胺已被?；蛲榛?。
本發(fā)明的肽可含有通式P*-Y*-X1*-L*(SEQ ID NO1)，其中P*是脯氨酸或脯氨酸的非天然衍生物，Y*是酪氨酸或其非天然衍生物，X1*是甘氨酸或天冬氨酸或甘氨酸或天冬氨酸的非天然衍生物，L*是亮氨酸或其非天然衍生物。代表性地，至少P*、Y*、X1*或L*之一是各個氨基酸的非天然衍生物。例如，X1*可以是甘氨酸或天冬氨酸，L*可以是亮氨酸，且至少P*或Y*之一可以是非天然衍生物，如羥脯氨酸或在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸。
本發(fā)明的肽還可含有通式X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(SEQ ID NO2)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1is W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)或Y(3*)。F(3/4*)可以是在3或4位被選自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸。Y(3*)可以是a在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸。X2可以是E、H、dE、S、H(Bzl)、2-Pal、Dpr或Th；X3可以是G或D；X4可以是H、F、Y或W；X5可以是I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal或F(3/4*)，其中F(3/4*)是在3或4位被選自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸；X6可以是N、Q、I、L或V或不存在。代表性地，至少X1，X2，X5，P*和Y*之一是氨基酸的非天然衍生物。例如，P*可以是脯氨酸，Y*是在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。或者P*可以是脯氨酸的非天然衍生物，如4-羥脯氨酸和Y*可以是酪氨酸。這種肽可在非還原條件下形成二硫鍵。
可與血纖蛋白結(jié)合的肽的另一個例子含有通式C-P*-Y*-X1-L-C(SEQ ID NO3)，其中X1是G或D，P*是脯氨酸或其非天然衍生物4-羥脯氨酸；Y*是酪氨酸或在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。代表性地，至少P*或Y*之一是各個氨基酸的非天然衍生物。例如，所述肽可包括以下序列W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO4)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO5)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO6)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO7)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO8)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO9)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO10)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO11)、F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO12)、Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO13)、W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO14)、W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q(SEQ IDNO15)或F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO16)。這種肽可在非還原條件下形成二硫鍵。
根據(jù)WO 01/09188或WO 01/08712中所述的標準合成方法，合成了具有表1所示序列的肽(通過質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu))、環(huán)化并測定其對血纖蛋白DD(E)片段的親和性。每個肽的Kd≤10μM(“-”表示平截)。
表1Kd(μM)X1X2C P(4-OH) Y* X3L C X4X5X6相比DD(E)≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-Cl) D L C H IL≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-Cl) D L C H I≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H Bpa≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Hfe≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Bpa≤0.1 Y(3-Cl)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Y D-EC Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ
Kd(μM)X1X2C P(4-OH) Y* X3L C X4X5X6相比DD(E)≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H IL≤0.1 F(4-OMe) H(Bzl) C Hyp Y(3-Cl) D L C H Bpa≤0.1 F H C Hyp Y(3-Cl) D L C H I≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 3Pal H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 4Pal H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-F) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Y(3-I) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H IL≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-Cl) D L C H Bpa L≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H Bpa L≤0.1 F H(Bzl) C Hyp Y(3-Cl) D L C H IL≤0.1 1Nal H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 MTyr H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-OMe) H(Bzl) C Hyp Y(3-I) D L C H Bpa≤0.1 F(4-OMe) H(Bzl) C Hyp Y(3-Cl) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C 3Pal I≤0.1 F(4-I) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-Br)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-Me)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-CF3) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-CN)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Y(3-NO2) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Y(2-F) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-CH2NH2) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-NH2) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(34-F2) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 DopaMe2H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(2-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(3-Me)H C Hyp Y(3-I) D L C H I
Kd(μM)X1X2C P(4-OH) Y* X3L C X4X5X6相比DD(E)≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(3-CF3)≤0.1 F(3-CF3) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(3-OMe)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Hfe H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 nTyrH C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 W E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H I L≤0.1 F H C Hyp Y(3-Cl) D L C H I L≤0.1 F(4-OMe)H(Bzl) C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Nle≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Tle≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(4-CF3)≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Bip≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(4-Et)≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(4-OMe)≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(3-OMe)≤0.1 F(F5) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-F) D L C H I L≤0.1 W E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.2 T D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.2 F H C PY(3-Cl) D L C H I L≤0.2 Y(26-Me)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.2 W E C Hyp Y(3-Cl) G L C H I Q≤0.2 D-F D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.2 Y E C Hyp Y(3-Cl) G L C Y I Q≤0.2 W E C Hyp Y(3-Cl) G L C F I Q≤0.2 H D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.2 F H C Hyp Y(3-I) D L C H I L≤0.2 W E C PYG L C W I Q
Kd(μM)X1X2C P(4-OH) Y* X3L C X4X5X6相比DD(E)≤0.2 F HC Hyp Y(3-I) D L C H nVal≤0.2 F HC Hyp Y(3-I) D L C H Phg≤0.2 F HC Hyp Y(3-I) D L C H F(3-Me)≤0.2 F HC Hyp Y(3-I) D L C 4Pal I≤0.2 S D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ≤0.3 W EC Hyp Y(3-Cl) G L C Y IQ≤0.3 Y EC Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ≤0.3 F D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ≤0.3 F HC PYD L C H IL≤0.3 F HC Hyp Y(3-I) D L C H IL≤0.3 F HC Hyp YD L C H Bpa≤0.4 F HC Hyp Y(3-Cl) G L C H IL≤0.4 S(Bzl)HC PYD L C H IL≤0.4 H EC Hyp Y(3-Cl) G L C H IQ≤0.4 F(4-OMe) HC Hyp YD L C H IL≤0.4 F HC Hyp Y(3-I) D L C Bpa I≤0.4 AdHC Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.5 F HC Hyp Y(3-Cl) F L C H IL≤0.5 F EC Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ≤0.5 F HC Hyp Y(3-Cl) 2-Nal L C H IL≤0.5 F HC Hyp YD L C H IL≤0.5 Hfe HC Hyp YD L C H IL≤0.5 Bip HC Hyp YD L C H IL≤0.5 W EC PYG L C W IQ≤0.5 F(4-OMe) WC Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.5 F HC Hyp Y(3-I) D L C 2Pal I≤0.5 F HC Hyp Y(3-I) D L C Taz I≤0.5 F HC Hyp Y(3-I) D L C Dht I≤0.5 GuHC Hyp Y(3-I) D L C H I
肽還可有通式C-D-Y-Y-G-T-C-X10(SEQ ID.NO17)，其中X10是n(癸基)G、n(4-PhBu)G、MeL、Bpa、Bip、Me-Bip、F(4*)、F(3-Me)、F(3，4-二氟)、Amh、Hfe、Y(3，5-二-碘)、Pff、1Nal、d1Nal或MeL，其中F(4*)是在4位被選自Et、CF3、I或iPr的部分取代的苯丙氨酸。在一些實施方案中，肽可包括額外的殘基，X1、P*和/或X11，以得到通式C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(SEQ ID.NO18)或X1-P*-C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(SEQ ID.NO26)，其中X1是任何天然或非天然氨基酸，P*是脯氨酸或其非天然衍生物，X11是D，dD，βD，Inp，Nip，Me-D，Cop或Cmp。例如，肽可含有序列L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-dD(SEQ ID NO19)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-D(SEQID NO20)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D(SEQ ID NO21)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD(SEQ ID NO22)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Inp(SEQ ID NO23)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp(SEQ ID NO24)或L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D(SEQ ID NO25)。
用標準合成方法合成了具有SEQ ID NO26所示結(jié)構(gòu)的肽(通過質(zhì)譜確定結(jié)構(gòu))，合成方法如WO 01/09188或WO 01/08712中提到的方法，并測定了它們對血纖蛋白DD(E)片段的親和性。各個肽的Kd≤10μM(表2)。
表2X01X10X11L n(癸基)GdDL n(癸基)GDL MeL InpL Bip DL Bip dDL Me-Bip DL MeL CmpL Bip DL L DChaBip D可用已知方法測定肽與如HSA或血纖蛋白等靶點的親和性。例如，可用血纖蛋白DD(E)片段評定肽對血纖蛋白的親和性，血纖蛋白含有55kD(片段E)和190kD(片段DD)的亞基。DD(E)片段可被生物素化并通過抗生物素蛋白固定到固體基質(zhì)(如多孔平板)。所述肽可與固定的DD(E)片段一起培養(yǎng)在合適的緩沖液中，并用已知的方法進行檢測這種結(jié)合。例如參見WO 01/09188。
N-和C-末端連接基-亞單元和連接基如果存在的話，連接基-亞單元和連接基被用于共價結(jié)合帽化部分，帽化部分如螯合物、溶血栓劑以及肽兩個端點的其它基團。連接基-亞單元部分可以(i)將C-末端羧酸鹽官能度轉(zhuǎn)化成胺官能團或?qū)-末端胺官能度轉(zhuǎn)化成羧酸鹽官能團；或(ii)在肽末端和連接基(如果存在的話)或或帽化基團之間提供間隔部分或基團。在一個實施方案中，肽可以與連接基-亞單元反應形成修飾的具有C-末端胺官能團和N-末端胺官能團的肽。在另一個實施方案中，肽可以與連接基-亞單元反應形成修飾的具有N-末端羧酸鹽官能團和C-末端羧酸鹽官能團的肽。在另一個實施方案中，肽可以由與樹脂結(jié)合的C-末端連接基-亞單元合成，將肽從樹脂切下后，就制得了帶有C-末端胺官能團的肽。在另一個實施方案中，連接基-亞單元可被用作間隔基團而不改變末端官能團。連接基-亞單元可以是多個官能團以與連接基部分或帽化部分結(jié)合?？刹捎枚喾N反應類型，包括?；?、還原性胺化、親核置換反應、尿素形成、硫脲形成和化學選擇結(jié)合，以將所述連接基-亞單元與肽、連接基和/或帽化部分化學結(jié)合。采用連接基-亞單元的一個優(yōu)點是在肽上產(chǎn)生了類似的官能團，因此利于以后的合成。
所述連接基部分可用來將一個或多個帽化部分結(jié)合到肽末端。所述連接基可分支或不分支，并可包含多個共前體螯合物和螯合物結(jié)合的官能團。所述連接基的化學結(jié)構(gòu)可能會影像造影介質(zhì)的物理和藥理特性，如親和力、穩(wěn)定性、血液半衰期、馳豫率和血漿蛋白質(zhì)結(jié)合。所述連接基可被烷基、芳基、鏈烯基或炔基取代。如果在各個末端存在連接基，則它通常是相對較小且剛性的MRI造影介質(zhì)。例如，連接基的分子量可小于約350(如小于約200)。
C-末端連接基-亞單元部分和C-和N-末端連接基的一個例子有如下結(jié)構(gòu) 可用連接基-亞單元(如二胺合成子)將肽的C-末端羧酸鹽轉(zhuǎn)變成胺官能團以形成在肽的各個末端具有胺官能團的肽，該肽上可結(jié)合其余的連接基部分。這種經(jīng)過修飾而具有C-末端胺官能團的肽的例子是
其中，n＝1-4。
許多二胺C-末端連接基-亞單元可方便地來自固相樹脂 以下樹脂(R)是商業(yè)上從Nova Biochem獲得的
一些情況下，以下連接基-亞單元可被用作N-末端胺官能團的間隔基團 和 其中，“堿基”是嘌呤或嘧啶堿基(“Ad”＝腺苷，“Gu”＝鳥苷，“Th”＝胸腺嘧啶，“Cy”＝胞嘧啶)，“LG”是離去基團，如OH、活性酯、鹵化物或酸酐。
此外，可使用αN-烷基化氨基酸以及帶有含有氨基的側(cè)鏈的氨基酸(如Lys和Orn)，其中的肽分子已被酰化或烷基化，如下所示 其中，n分別為0-3的整數(shù)；R是脂肪基或芳基；LG是選自OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團。
更多的連接基-亞單元包括
和 其中，n分別是1或2；R是脂肪基或芳基；LG是選自OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團。
當采用酰胺鍵構(gòu)成策略時，其中一個肽分子有兩個末端氨基，有用的連接基部分的例子包括 其中，每個m獨立為1-4的整數(shù)，n獨立為0-4的整數(shù)，LG是離去基團，R’或R”獨立為氫或化學保護基。
連接基部分還可以有分支點以結(jié)合兩個以上的螯合物。例如，當采用酰胺鍵構(gòu)成策略時，包含帶有離去基團LG的羰基(例如，羧酸或活性酯)和三個或多個被保護的胺的連接基可與肽的胺反應以生成帶有三個或多個末端胺的分子。以下基于羰基的連接基試劑可以含有三個或多個胺官能團
其中，LG是離去基團(如-OH，活性酯如五氟苯酚(Pfp)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰鈉鹽(NHSS)、2-硫氧代噻唑烷-1-基和羥基苯并三唑(HBT)和R1和R2優(yōu)選獨立為氫或化學保護基(如Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、芐基或烯丙基)。
在其它實施方案中，肽N-末端的胺官能團可通過與環(huán)狀酸酐(連接基-亞單元部分)反應被轉(zhuǎn)換成N-末端羧酸鹽官能團，從而用N-末端羧酸鹽官能團制得了修飾的肽 用來將N-末端胺轉(zhuǎn)化成羧酸鹽官能團的其它連接基-亞單元的例子包括 其中R是任何脂肪基或芳基。
然后，上述例子中的兩個末端羧酸鹽可同時與下面所示的連接基部分的氨基反應形成前體MR顯影劑。在這里實施例中，所述前體MR顯影劑是在兩個末端通過酰胺鍵都衍生有連接基的肽分子
對于制造前體MR顯影劑有用的其它以兩個羧酸鹽結(jié)束的連接基部分的特例是 其中每個m獨立是1-4(包括1和4)，n獨立是0-4(包括1和4)(如n＝1或2)，R是氫或合適的化學保護基，如甲基、乙基、芐基或叔丁基。在這些例子中，在結(jié)合所述連接基-亞單元后，所述保護基可被除去，并可用標準方法，例如酰胺鍵形成，連接螯合部分或前體螯合部分。
當采用酰胺鍵形成策略時，其中所述肽分子以兩個羧酸鹽結(jié)束，以下連接基適合引入三個或多個胺官能團 其中R1和R2獨立為氫或化學保護基如OS、Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、芐基或烯丙基。
包括酰胺鍵形成的連接基策略是有效的，因為它們通常和肽上的保護基兼容。如上所述，肽、連接基和連接基-亞單元可通過形成其它類型的鍵(例如親核取代、還原氨基化和硫脲形成)相互共價連接。
連接基還會影像造影介質(zhì)的特性，如親和性、藥代動力學特性、體內(nèi)穩(wěn)定性和馳豫率。
或者，包括連接基部分和螯合或螯合前體部分的共價綴合物可與帶有合適的末端官能度的肽直接反應。能夠與末端羧酸鹽基團反應的這種共價綴合物的一個例子是 其中，n＝1-4，R1，R2，R3，R4和R5獨立是乙酸酯基團、乙酰胺基團或乙酰氧基團。
這種共價綴合物的另一個例子具有如下結(jié)構(gòu) 其中R1，R2，R3，R4和R5獨立是乙酸酯基團、乙酰胺基團或乙酰氧基團。
可有效將兩個末端都帶有羧酸鹽官能團的修飾的肽轉(zhuǎn)化成前體顯影劑的共價綴合物的一個例子具有如下結(jié)構(gòu)
能夠與修飾的肽上的胺官能團反應的共價綴合物的例子有 其中，LG是離去基團，n＝1-4，R1，R2，R3，R4和R5獨立是乙酸酯基團、乙酰胺基團或乙酰氧基團，和 其中，LG是離去基團，其中R1，R2，R3，R4和R5獨立是乙酸酯基團、乙酰胺基團或乙酰氧基團。
特別有用的合成多聚體造影介質(zhì)的共價綴合物具有如下結(jié)構(gòu)，下文稱為“合成子#1” 另一種有效的合成多聚體的共價綴合物具有如下結(jié)構(gòu)，下文稱為“合成子#2” 在以下含有上述肽的本發(fā)明的MRI造影介質(zhì)的例子中，闡述了N-末端連接基對MRI造影介質(zhì)的馳豫率的影像
在這里例子中，“螯合物”被稱為bb-DTPA-Gd(III)。
上述“連接基-亞單元”有以下結(jié)果(每個Gd(III)離子的馳豫率是在20MHz和35℃下測定的，單位是mM-1s-1)
如上所述，結(jié)構(gòu)15和16與結(jié)構(gòu)32類似，除了N-末端連接基-亞單元不同。實驗結(jié)果顯示，連接基可影響馳豫率以及本發(fā)明的造影介質(zhì)的其它特征。
螯合部分和試劑螯合部分是與金屬離子絡合的螯合配體。這些螯合部分包括能夠形成連接基、連接基-亞單元和/或修飾的肽的結(jié)合點的合成部分。一個或多個螯合部分可共價綴合修飾的肽各個末端的官能團。在一個實施方案中，所述螯合物結(jié)合連接基-亞單元。在另一個實施方案中，所述螯合物結(jié)合連接基部分。在其它實施方案中，所述螯合物可與連接基部分結(jié)合以在共價綴合物與修飾的肽結(jié)合之前形成共價綴合物。
前體螯合部分是尚未與金屬離子絡合的螯合配體。螯合配體可以有保護基或者可以是螯合配體的前體。前體螯合部分包括形成連接基、連接基-亞單元和/或修飾的肽的結(jié)合點的合成部分。前體螯合部分可通過與金屬離子絡合轉(zhuǎn)變成螯合部分。一個或多個前體螯合物部分可共價結(jié)合修飾的肽各個末端的官能團。在一個實施方案中，所述前體螯合物結(jié)合連接基-亞單元。在另一個實施方案中，所述前體螯合物結(jié)合連接基部分。在其它實施方案中，所述前體螯合物可與連接基部分結(jié)合以在共價綴合物與修飾的肽結(jié)合之前形成共價綴合物。
本發(fā)明的前體螯合物部分和螯合物部分可具有任何以下結(jié)構(gòu) 或
其中X是能夠與金屬陽離子配位的雜原子電子供體基團，如O-、OH、NH2、OPO32-、NHR或OR，其中R是任何脂肪基；R1是不帶電荷的化學部分，選自氫、任何脂肪基、烷基或環(huán)烷基或其不帶電荷的取代形式(如醇類)；Y是合成部分(如能夠形成結(jié)合點或就是結(jié)合點，修飾的肽、連接基和/或連接基-亞單元的官能團可直接結(jié)合或通過羰基、亞甲基、亞甲基-氧基、硫代羰基結(jié)合)。可使用帶有配位金屬離子的部分(螯合部分)或不帶有配位金屬離子的部分(前體螯合部分)。
多種螯合配體可用于本發(fā)明的造影介質(zhì)。這種螯合配體包括但不限于DTPA、DOTA、NOTA和DO3A的衍生物。對于MRI，金屬螯合物如二亞乙基三胺五乙酸釓(DTPA·Gd)，四胺1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N_-四乙酸釓(DOTA·Gd)和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸釓(DO3A·Gd)特別有效。特別有用的螯合物包括bb(CO)DTPA·Gd。在應用MRI時可用其它金屬取代Gd(III)。
已經(jīng)合成的用來制造多聚體螯合物的功能性螯合物的例子包括pNCS-Bz-DTPA[Martin，V.等，Bioconjugate Chem.6，616-23，1995]和Gd(4-NCS-苯基)-氨基-羰基甲基-DO3A[Ramachandran，R.等，Invest.Rad.1998，33(11)，779-797]。為在與靶結(jié)合時馳豫率最優(yōu)，經(jīng)常需要使螯合物的運動最小，因此需要最小數(shù)目的將靶與螯合配體結(jié)合的共價鍵。以下是試劑的例子，包括用來與胺官能團或連接基-亞單元或連接基結(jié)合的具有主鏈羰基的螯合配體，其中“LG”是離去基團(如活性酯)，R代表容易被除去以形成O-的基團(-OtBu，如羧酸鹽)，從而與鄰近的羰基形成羧酸鹽與螯合配體主鏈結(jié)合的羰基 人們發(fā)現(xiàn)與螯合配體最接近的羰基的化學基序構(gòu)成了一類高馳豫率的MRI造影介質(zhì)。
本發(fā)明還涉及對于合成以下結(jié)構(gòu)的MRI造影介質(zhì)有用的中間體 和 其中，R1，R2，R3，R4和R5可以是任何被保護的或不被保護的乙酰基配體，它適合形成具有合適形成常數(shù)的順磁性金屬的螯合物，包括 和 其中P是任何保護基，包括芐基和叔丁基。LG是“離去基團”，代表-OH和其酯的形式，包括NHS酯、五氟苯酚和其它活性酯。
在特別有用的實施方案中，LG是-OH，R1，R2，R3，R4和R5是CH2CO2OtBu，下文稱為“合成子#3”，其結(jié)構(gòu)如下 或者，可用以下試劑來合成本發(fā)明的造影介質(zhì) (參閱Syn.Comm.30，3755(2000))本發(fā)明還提供了制造化合物的方法。尤其是一種可簡化合成子#3的制備的新型氧化反應，合成子#3是螯合配體的優(yōu)選實施方案。合成子#3的合成可通過兩種不同的合成途徑實現(xiàn)，這兩種途徑都從羥基甲基-二亞乙基三胺開始。一種途徑包括兩個合成步驟(烷基化然后再氧化)，另一種途徑包括六個步驟(保護、氧化、酯化、去保護、烷基化和水解)。這兩種途徑都能制得高化學純度和光學純度的合成子#3(參閱以下實施例)。
美國專利No.5,637,759揭示了通過用硫代苯氧基鈉選擇性水解從2，3-二氨基丙酸和氮雜-賴氨酸合成合成子#1。本發(fā)明描述的方法可避免使用這種有毒的試劑。
造影介質(zhì)的合成肽基造影介質(zhì)的合成包括以下步驟。首先可合成有或沒有C-末端連接基-亞單元的尋靶肽，通常采用固相肽合成法。對于這里所描述的環(huán)肽，受保護的線性肽可在溶液中或樹脂上環(huán)化。未受保護的肽也可在溶液中或樹脂上環(huán)化。C-末端連接基-亞單元可方便地來自固相合成樹脂，N-末端連接基或N-末端連接基-亞單元可在固相合成時與肽結(jié)合。通常，在環(huán)化后，所述連接基-亞單元-螯合物前體部分就與所述肽結(jié)合。保護基被除去以得到配體前體，然后制備螯合物。本發(fā)明的放射性核素化合物是用市售的放射性核素(例如，Nycomed Amersham Boston的99mTc，產(chǎn)品編號#RX-290195，NEN Life Science產(chǎn)物的111In，產(chǎn)品編號#NEZ304或NEN Life Science產(chǎn)物的153Gd，產(chǎn)品編號#NEZ142)，通過在含水介質(zhì)中反應，通常在pH4-6反應1小時，從配體前體制備的。如果是光學造影介質(zhì)，可用有機染料代替螯合物前體。
造影介質(zhì)的結(jié)構(gòu) [合成與32類似]









造影介質(zhì)的特性與母體的肽(即沒有結(jié)合任何螯合物的肽)、有一個或多個螯合物與N-末端結(jié)合的肽或有一個或多個螯合物與C-末端結(jié)合的肽相比，本發(fā)明的化合物對內(nèi)源性酶的降解作用更加穩(wěn)定。為評估體內(nèi)穩(wěn)定性，將實驗化合物與大鼠肝臟勻漿一起培養(yǎng)。一段時間后，將反應物淬火并離心，通過液相色譜-質(zhì)譜法分析上清液以定量剩余的化合物的量。
本發(fā)明的化合物也可結(jié)合人血清白蛋白或血纖蛋白等靶。例如，至少10％(如至少50％、80％、90％、92％、94％或96％)的造影介質(zhì)可以生理相關濃度的藥物和尋靶結(jié)合所需的靶。造影介質(zhì)與靶如HSA或血纖蛋白結(jié)合的程度可用各種平衡結(jié)合方法估算。例如，與HSA的結(jié)合可通過超濾測定。為測量與血纖蛋白的結(jié)合，可在微量滴定板的孔中形成血纖蛋白凝塊并與靶基團接觸。在培養(yǎng)足以建立平衡的時間后，吸取上清液(不溶的血纖蛋白結(jié)合成孔底部凝膠狀的凝塊)。然后測定上清液中未結(jié)合的靶基團的濃度。在這兩種方法中，結(jié)合的造影介質(zhì)的濃度是作為開始的總靶基團濃度與結(jié)合測定后未結(jié)合的靶基團濃度之差測定的。結(jié)合比例是結(jié)合的靶基團的濃度與總靶基團濃度之比。
作為尋靶結(jié)合(如與血纖蛋白結(jié)合)的結(jié)果，本發(fā)明的化合物可具有較高的馳豫率，這就可以得到較好的圖象分辨率。結(jié)合馳豫率的升高通常有1.5-倍或更多(如馳豫率至少升高2、3、4、5、6、7、8、9或10倍)。通常使用馳豫率升高7-8倍、9-10倍或者甚至10倍以上的尋靶造影介質(zhì)。代表性地，馳豫率是用NMR分光計測定的。20MHz 37℃下，MRI造影介質(zhì)的馳豫率優(yōu)選為至少10mM-1s-1/順磁性金屬離子(如至少15、20、25、30、35、40或60mM-1s-1/順磁性金屬離子。20MHz 37℃下，造影介質(zhì)的馳豫率大于60mM-1s-1特別有效。
如這里所述，靶向造影介質(zhì)可顯示升高的凝塊攝取?？赏ㄟ^比較血液凝塊和血液對試劑的攝取來確定血纖蛋白-靶向試劑攝取的特異性。參見實施例11可了解更多細節(jié)。血纖蛋白-靶向造影介質(zhì)的特異性也可用MRI和觀察凝塊信號的增強來證實。
本發(fā)明的肽和造影介質(zhì)的應用本發(fā)明的肽可用來改善血栓栓塞疾病治療的療效。目前使用的溶血栓劑治療的缺點包括出血風險大、無法恢復血流、停止治療后血栓重新形成、治療開始和凝塊溶解之間有滯后。將本發(fā)明的血纖蛋白尋靶肽與溶血栓劑(如蛋白質(zhì)溶血栓劑，例如人或細菌來源的纖溶酶原激活物)綴合可得到改善的治療指數(shù)。這種綴合可局部活化纖溶酶原或增加tPA的內(nèi)源水平。例如，血纖蛋白尋靶肽可與人纖溶酶原激活物，其中包括重組組織類型的纖溶酶原激活物(tPA)、尿激酶原和尿激酶(都有單鏈和雙鏈形式)，細菌衍生的纖溶酶原激活物，包括鏈激酶、葡萄球菌激酶，以及動物衍生的纖溶酶原激活物，包括吸血蝙蝠纖溶酶原激活物綴合。此外，血纖蛋白尋靶肽可與纖維溶解酶如銅斑蛇纖溶酶(copperhead snake fibrolase)綴合，這種酶具有直接的纖溶活性。這種酶和蛋白質(zhì)可在商業(yè)領域獲得、從天然來源或組織提取或用重組方法制備。
根據(jù)MRI造影介質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可用已知方法用上述同種類型的連接基連接或融合本發(fā)明的組合物。與蛋白質(zhì)的綴合可通過標準化學技術實現(xiàn)，包括形成酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵和硫酯鍵。例如，血纖蛋白結(jié)合肽可通過在血纖蛋白結(jié)合肽或連接基和蛋白質(zhì)表面的賴氨酸殘基之間形成酰胺鍵而直接或通過連接基與蛋白質(zhì)結(jié)合。這些表面賴氨酸殘基通常遠離酶的催化位點。因此，連接部分不會影像酶的催化活性。在一個步驟中可達到多重連接。血纖蛋白尋靶肽與溶血栓劑或纖溶劑的比例可通過調(diào)節(jié)連接化學的化學計量加以控制。多重連接對于適當調(diào)節(jié)強血纖蛋白結(jié)合配體特別有效，因為可通過所謂的“親和力”獲得較高的結(jié)合親和性。特別地，可用偶聯(lián)劑或活性酯在賴氨酸和血纖蛋白結(jié)合部分或連接基之間形成酰胺鍵。以下流程顯示了尿激酶通過連接基部分和多個血纖蛋白結(jié)合肽化學連接形成的雜交分子的一個例子。表面賴氨酸殘基的數(shù)目和血纖蛋白結(jié)合分子的數(shù)目是說明性的?；蛘撸捎弥亟MDNA技術將血纖蛋白尋靶肽引入雜交分子。
在一些實施方案中，本發(fā)明的肽可與帶有連接基的溶血栓劑結(jié)合，所述連接基包含酶切割位點，例如通常在凝固級聯(lián)中被酶切割的酶切割位點，如Xa因子、凝血酶或纖溶酶切割位點等。在凝塊位置上將其從結(jié)合有本發(fā)明組合物的凝塊上切下之前，所述溶血栓劑不會被活化，因此在遠離凝塊的位置上發(fā)生的不希望的出血事件的風險可被最小化。此外，溶血栓劑部分可與靶向肽的多聚體造影介質(zhì)結(jié)合，這樣就可鑒定、成像并溶解凝塊。
用這里所述方法制造的造影介質(zhì)可以同樣的方式用作常規(guī)的MRI造影介質(zhì)，且它可用來有效診斷深層血管血栓形成、肺栓子、冠狀動脈血栓形成、頸動脈和和顱骨內(nèi)血栓形成、心房和心室血栓癥、主動脈弓血栓癥和高危斑塊。當將血栓成像時，某些MR技術和脈沖序列是優(yōu)選的以提高血栓和背景血液以及組織的對比度。這些技術包括但不限于用來制造黑色背景的黑色血液血管造影術序列，如快速自旋回聲序列(fast spin echo sequence)和和流量殘缺梯度回聲序列(flow-spoiled gradientecho sequence)。這些方法還包括獨立流量(flow independent)技術，該技術可增強對比度的差異，這是由于增強對比的血栓和血液以及組織之間的T1差異，比如反向回收(inversion-recovery)制備的序列或飽和-回收(saturation-recovery)制備的序列，它可提高血栓和背景組織之間的對比度。T2技術的制備方法被證明也是有效的。最后，磁化強度轉(zhuǎn)移技術被證明也可用本發(fā)明試劑提高對比度。
本發(fā)明的組合物，包括肽、與溶血栓劑綴合的肽和肽靶向的多聚體造影介質(zhì)，可用常規(guī)方法制成藥物組合物。當用在這里時，本發(fā)明的化合物可包括其藥學上可接受的衍生物?！八帉W上可接受的”是指可用于動物而沒有不可接受的不良影響的化合物或組合物?！八帉W上可接受的衍生物”是指任何藥學上可接受的本發(fā)明化合物的鹽、酯、酯的鹽或其它衍生物，在用于接受者后，它能夠提供(直接或間接)本發(fā)明的化合物或其活性代謝物或殘基。其它衍生物是指那些當將這種化合物施用給哺乳動物時可提高本發(fā)明化合物的生物利用度的物質(zhì)(如使口服給藥的化合物更容易被吸收進血液)，或是可提高母體化合物到生物區(qū)室(如大腦或淋巴系統(tǒng))的運輸從而增加對母體化合物的接觸量的物質(zhì)。藥學上可接受的本發(fā)明化合物的鹽包括衍生自此領域已知的藥學上可接受的無機和有機酸和堿的抗衡離子。
本發(fā)明的藥物組合物可用任何途徑施用，包括口服和非消化道給藥。非消化道給藥包括但不限于皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、間質(zhì)內(nèi)、鞘內(nèi)和腔內(nèi)給藥。當靜脈內(nèi)給藥時，藥物組合物可以推注形式給予，每次兩個或多個劑量，或恒量或非線性流注。因此，本發(fā)明的組合物可被制成適合任何途徑施用的制劑。
代表性地，靜脈內(nèi)施用的組合物是無菌等滲含水緩沖液中的溶液。必要時，所述這還包括增溶劑、穩(wěn)定劑和局部麻醉劑如利多卡因以減輕注射位點的疼痛。通常，這些成分可分別提供，如裝在試劑盒中，或混合在一起成為單位劑型，如凍干粉末或無水濃縮物。所述組合物可保存在密封容器中，如以活性單位標明活性劑的量的安瓿或小袋，它可用含有無菌藥用級“注射用水”、鹽水或其它合適的靜脈內(nèi)液體的灌輸瓶來分配。當通過注射施用組合物時，可提供裝有注射用無菌水或鹽水的安瓿，從而可在給藥前將成分混合。本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明的化合物和其藥學上可接受的鹽以及任何藥學上可接受的成分、賦形劑、載體、佐劑或媒介物。
造影介質(zhì)優(yōu)選以可注射組合物的形式給予患者。給予造影介質(zhì)的方法優(yōu)選是腸道外給藥，即靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、間質(zhì)內(nèi)或腔內(nèi)給藥?？捎门c其它診斷劑或治療劑類似的方式將本發(fā)明的藥物組合物用于哺乳動物，包括人。用藥劑量以及用藥模式取決于各種因素，包括年齡、體重、性別、患者的狀況和遺傳因素，并最終由醫(yī)生根據(jù)不同劑量的實驗加以決定，然后如這里述進行成像。通常，診斷靈敏度或治療有效性所需的劑量約為0.001-50,000μg/kg，優(yōu)選在0.01-25.0μg/kg體重之間。最佳劑量將根據(jù)這里的描述憑經(jīng)驗確定。
至于溶血栓劑的治療狀況，施用的物質(zhì)的量將取決于血栓癥狀的嚴重性和凝塊的位置和大小。將采用的精確劑量和用藥模式可根據(jù)情況有主治醫(yī)生確定。通常，合并的組合物/溶血栓劑結(jié)合物的劑量將按照單獨溶血栓劑的常規(guī)劑量，盡管加入這里所述的組合物可提高血纖蛋白/凝塊結(jié)合物的親和性，從而可降低標準溶血栓劑的劑量。預計可用于這種治療的特定的溶血栓劑(用實施例的劑量和給藥方法)如下鏈激酶 100-300萬國際單位，30分鐘-3小時阿尼普酶 30單位；2-5分鐘 注射tPA(野生型) 50-150mg；灌輸，最多6小時雙鏈尿激酶(40-100mg)；灌輸，最多6小時單鏈尿激酶(scuPA) 300-1200萬國際單位(30-100mg；灌輸，最多5小時雜交纖溶酶原激活物和衍生物 20-100mg；注射或灌輸纖溶酶原激活物的突變蛋白10-100mg；注射或灌輸以下實施例將進一步描述本發(fā)明，這些實施例不是要限制本發(fā)明的范圍，該范圍如權(quán)利要求書所述。
實施例以下實施例將進一步闡述本發(fā)明的幾種高馳豫率造影介質(zhì)的合成、鑒定性和使用。以下實施例中所述的特定參數(shù)是為了闡述本發(fā)明的實踐，它們不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。那些精通此領域的技術人員將了解或能夠知道使用這里所述的多種常規(guī)實驗方法、與特定實施方案等價的實施方案和方法。這種實施方案被認為包括在權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
實施例1-肽基MR顯影劑的合成C-末端結(jié)合了連接基-亞單元部分的肽(P-[連接基-亞單元部分])。用標準Fmoc法和二氨基三苯甲基樹脂制備了二氨基未被保護的肽。在樹脂或溶液中用三氟乙酸鉈將該肽環(huán)化。從樹脂上切下后，通過RP-HPLC(C-18柱，H2O/CH3CN/TFA)純化未被保護的肽。
連接基部分在Boc-Dpr(Boc)-OH.DCHA(1當量)和五氟苯酚(1.2當量)的二氯甲烷溶液中加入PS-碳二亞胺(1.2-1.5當量)。將混合物在室溫下振蕩3-5h。當LC-質(zhì)量結(jié)果證實反應完全后，過濾除去樹脂并減壓蒸發(fā)溶劑以得到粗制的白色泡沫狀的連接基部分(Boc-Dpr(Boc)-OPft(N-α-Boc-N-β-Boc-L-二氨基丙酸五氟苯酯，356-128)。
前體MR顯影劑在P-[連接基-亞單元部分](1當量)和所述連接基部分{Boc-Dpr(Boc)-Opft}(2.2當量)的DMF溶液中加入DIPEA(4-6當量)。將混合物在室溫下攪拌。當LC-質(zhì)量結(jié)果證實反應完全后，減壓除去溶劑。然后在室溫下將粗產(chǎn)物在TFA、水和苯甲醚的混合物(90％/5％/5％)中攪拌3h。加入二乙醚并形成白色沉淀，通過RP-HPLC(C-18柱，H2O/CH3CN/TFA)純化該沉淀以得到白色固體狀的前體MR顯影劑(四氨基-肽(？)。
前體螯合部分DOTAGA-Opft。在DOTAGA-OH(1當量)和五氟苯酚(1.2當量)的二氯甲烷溶液中加入PS-碳二亞胺(1.2-1.5當量)。將混合物在室溫下振蕩3-5h。當LC-質(zhì)量結(jié)果證實反應完全后，過濾除去樹脂并減壓蒸發(fā)溶劑以得到白色泡沫狀的粗制前體螯合部分。
MR顯影劑.在前體MR顯影劑(1當量)和前體螯合部分(4.0當量)的DMF溶液中加入DIPEA(4.0當量)。將混合物在室溫下攪拌。當LC-質(zhì)量結(jié)果證實反應完全后，減壓除去溶劑。
然后在室溫下將粗產(chǎn)物在TFA、苯酚、甲磺酸、苯甲醚和二氯甲烷的混合物(90％/2.5％/2.5％/2.5％/2.5％)中攪拌15分鐘。加入二乙醚并有白色沉淀形成，收集作為粗產(chǎn)物。
將粗產(chǎn)物與溶于去離子水的GdCl3·H2O反應以形成粗制的MR顯影劑，用RP-HPLC(C-18柱，乙醇/50mmol AcONH4)將其純化。將適當?shù)募壏趾喜?，并減壓除去乙醇，然后用乙酸鈉處理合并的級分以進行鹽交換。凍干后，在Waters Sep-Pak_C-18柱上，以水和乙醇∶水(50∶50)洗脫，通過反相色譜除去過量的鹽。合并合適的級分，減壓除去乙醇，然后將溶液凍干以得到白色固體狀的所需的肽MR顯影劑。
用類似的方法來合成其它MR顯影劑。
實施例2-合成螯合物前體部分(合成子#3)的方法
合成合成子#3的方法A 將具有指定立體化學結(jié)構(gòu)的三鹽酸羥基甲基-二亞乙基三胺(25.15g)(光學純起始物料Syn.Comm.29(14)，2377-2391(1999)，外消旋起始物料Coll.Czech.Chem.Comm.34，630-634(1969))溶于去離子水/1，4-二噁烷的混合物，用氫氧化鈉水溶液將溶液的pH調(diào)至8-9。將二-叔丁基二碳酸酯(3.5當量)溶于二噁烷并在10-20℃之間加入。將反應混合物在室溫下攪拌12-20小時。然后用水稀釋反應混合物并用乙酸乙酯提取。然后用水、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉溶液提取有機提取物。用硫酸鈉干燥有機提取物，過濾并在真空下濃縮以得到油狀物，通過硅膠色譜用乙酸乙酯∶己烷的混合物純化該物質(zhì)。純化產(chǎn)物的總產(chǎn)量為30.11g。1HNMR(300MHz)5.18(d，J＝7.9Hz，1H)，4.76(bs，1H)，3.8-3.0(m，10H)，1.47-1.42(2s，27H)。MS(m/Z)456.4[M+Na]+。
步驟b-羥基的氧化[基于Zhao等在J.Org.Chem.64，2564-2566(1999)中描述的氧化過程]
將BOC-保護的三胺(29.94g)溶于乙腈。加入磷酸鹽緩沖液(300mL)，其中含有21.6g NaH2PO4，21.6g Na2HPO4和足量的去離子水至500mL體積，然后加入2，2，6，6-四甲基哌啶基-1-氧(TEMPO)(0.07當量)。劇烈振蕩此混合物并加熱至35℃。將亞氯酸鈉(2.0當量)溶于去離子水(100mg/ml)。加入亞氯酸鈉溶液和漂白水(0.02當量，約0.25％的次氯酸鈉水溶液)同時保持恒溫。加入氧化劑后，將反應物攪拌24小時。在加入TEMPO(0.07當量)并將反應混合物攪拌24小時。將反應物冷卻至室溫。加入水并用2.0N的NaOH水溶液將pH調(diào)至8。加入冷的亞硫酸鈉水溶液(300mL)同時保持恒定的pH。用小量甲基叔丁基醚提取該溶液并靜置。用2.0N的HCl水溶液將含水層酸化至pH3-4，并用小體積的甲基叔丁基醚提取兩次。將有機提取物與上述經(jīng)過靜置的提取物合并并在真空下濃縮。所得產(chǎn)物無需純化即可用于下面的步驟3。1HNMR(300MHz)5.8(bs，1H)，5.3(m，1H)，4.4(M，1H)，3.6-3.2(m，6H)，1.47-1.43(2s，27H)。MS(m/Z)470.2[M+Na]+。
步驟c-羧酸的芐基-保護 將羧酸起始物料(178g)溶于無水DMF。加入碳酸銫(2.0當量)并將溶液攪拌30分鐘。在室溫下逐滴加入芐基溴(1.1當量)。將反應混合物在惰性氣體下攪拌18小時。用水稀釋反應混合物并用乙酸乙酯提取兩次。合并有機層并依次用飽和碳酸氫鈉和氯化鈉溶液洗滌。將有機層濃縮成油狀(270g)，通過硅膠色譜用乙酸乙酯∶己烷純化。1H NMR(300MHz)7.3(s，5H)，5.6和5.15(2bs，1H)，5.1(s，2H)，4.5(bs，1H)，4.0-4.1(m，1H)，3.5-3.2(m，6H)，1.45和1.4(2s，27H)。MS(m/Z)560.3[M+Na]+。
步驟d和e-胺的去保護和烷基化
在1∶1乙腈∶4N HCl水溶液中攪拌BOC-保護的三胺(250g)約2.0小時。在真空下除去乙腈并將剩下的溶液凍干以得到殘余物，將此殘余物立即溶于DMF和二異丙基胺(足量以使pH升至8)。加入叔丁基溴乙酸酯(12.0當量)。加入完成后將反應混合物加熱至50℃并攪拌18小時。反應結(jié)束后加入水使反應混合物的體積增加一倍，然后用乙酸乙酯提取兩次。將有機提取物合并并依次用水、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉溶液洗滌。在真空下將有機溶液濃縮成油狀并通過硅膠色譜用乙酸乙酯∶己烷純化。純化產(chǎn)物的總產(chǎn)量為190g。MS(m/Z)809.5[M+Na]+。
步驟f-羧酸鹽的去保護 在不銹鋼反應器中加入芐酯(157g)、10％鈀/碳(19.8g)和乙酸乙酯，在45psi下氫化12小時。通過Celite_過濾并在真空下濃縮以得到油狀物。將該油狀物溶于乙酸乙酯/己烷并通過硅膠色譜純化以得到DTP羧酸戊-叔丁酯(產(chǎn)率82％)。MS(m/Z)719.5[MH]+。當將此試劑用于用其它手性元素合成造影介質(zhì)時，未觀察到非對映異構(gòu)體，因此可知這種物質(zhì)被光學純化至用普通質(zhì)子NMR進行檢測的最小限度。
合成合成子#3的方法B 將醇(參見Syn.Comm.29(14)，2377-2391(1999)，用于從羥基甲基-二亞乙基三胺開始合成)起始物料(105.0g)、乙腈(1.0L)、磷酸鹽緩沖液(1.0L，將100mg NaH2PO4和10mg Na2HPO4溶于1.0mL水然后用H3PO4將pH調(diào)至4.5)和TEMPO(7.0g)合并并加熱至45-50℃。在此溶液中加入亞氯酸鈉(29.8g溶于298mL水)和次氯酸鈉(744μL)溶液并將溫度保持在45-50℃。劇烈攪拌反應混合物4-10小時。將反應混合物冷卻至室溫，分離成兩層。分離有機層，將其與飽和氯化鈉水溶液合并并攪拌15分鐘。分離有機層，在真空下濃縮以得到油狀物(171g)，通過柱層析，用己烷∶異丙醇(加有0.1％三乙胺乙胺)純化該油狀物，總共得到81g油狀產(chǎn)物。MS(m/Z)719.5[MH]+。用此方法制得的物質(zhì)的光學純度和上面相同。
實施例3-用于固相合成具有C-末端胺官能團的修飾肽的樹脂所述肽通過固相合成方法來制備。在所述固相合成方法中，根據(jù)要合成的肽的類型(如C-末端處需要的官能團，所述保護或未保護的的肽)以及所用的合成方法(例如Fmoc或BOC化學、手動或自動合成，連續(xù)流反應器或間歇反應器)選擇所述連接基和樹脂。例如，在合成C-末端有羧基的肽時，將保護氨基酸連接到不同的樹脂如HMPB樹脂、2-氯代三苯甲基氯樹脂和SUSRIN樹脂。另一方面，在合成C-末端具有氨基的肽時，將二胺連接到三苯甲基樹脂上?？梢允褂盟鼍郾揭蚁?PS)樹脂進行間歇合成，而聚乙二醇(PEG)改性樹脂適于連續(xù)流合成及間歇合成。許多三苯甲基PS樹脂，包括1，3-二-(氨基甲基)-苯三苯甲基PS樹脂可以從市場購得。若所需三苯甲基PS樹脂不能購得，則可以使用和用于PEG樹脂類似的步驟將二胺連接到三苯甲基PS樹脂上。
在實施例中說明了1，3-二-(氨基甲基)-苯三苯甲基樹脂的合成。其它二胺可以以類似方式連接到三苯甲基樹脂上。
制備1，3-二-(氨基甲基)-苯三苯甲基PEG樹脂。
首先，三苯甲基醇樹脂(25g，NovaSyn TGT樹脂，NovaBiochem)置于漏斗中，并用DMF、CH2Cl2和甲苯洗滌。在除去所有溶劑之后，將所述材料轉(zhuǎn)移到裝有回流冷凝器的燒瓶中。加入甲苯(250mL)和乙酰氯(25mL)，并將所述漿液加熱至70℃，并攪拌1.0小時。再加入一部分乙酰氯(25ml)，并在70℃下將所述漿液攪拌2.0小時。過濾所述漿液，隨后用甲苯和CH2Cl2洗滌所述樹脂。
其次，將剛制備的三苯甲基氯樹脂和THF(250mL)置于燒瓶中。往所述漿液中加入1，3-二-(氨基甲基)-苯(10當量，以0.23mmol/g的樹脂取代度計)，并在室溫下攪拌所述混合物18.0小時。過濾所述漿液，依次用水、DMF、CH2Cl2、甲醇和CH2Cl2洗滌樹脂。在真空條件(室溫，1-5mmHg)下將所述樹脂干燥至恒重(25.4g)。使用定量茚三酮步驟進行所述取代化學計量法。
實施例4-合成共價綴合物(合成子#1，#2，#4和#5)合成合成子#1的方法 2，3-二-叔-丁氧基羰基氨基丙酸芐酯往2，3-二-叔-丁氧基羰基氨基丙酸(3.04g)的乙腈(25ml)溶液中加入碳酸銫溶液(6.5g)和水。在室溫下攪拌所述混合物40分鐘。在真空條件下除去所述溶劑。往所述固體殘留物中加入DMF(50ml)。在室溫下，在15分鐘內(nèi)加入芐基溴(1.43ml)和DMF(5.0ml)的溶液。將所述混合物攪拌18小時，然后用乙酸乙酯(100ml)和水(50ml)稀釋所述混合物，并攪拌15分鐘。分離所述各層，并經(jīng)過硫酸鈉干燥所述有機層。過濾所述混合物，并在真空條件下濃縮濾液，制得油狀物(3.6g)。通過用乙酸乙酯/己烷進行柱色譜分離純化所述油狀物，制得油狀物(1.8g)。MS(m/Z)[M+Na]+＝417.1HNMR(300MHz)1.4(s，9H)，2.4(m，2H)，4.4(m，1H)，4.8(m，1H)，6.5(m，1H)，7.3(m，5H)。
2，3-二氨基-丙酸三鹽酸鹽在室溫下攪拌2，3-二-叔-丁氧基羰基氨基丙酸芐酯(1.8g)、4N鹽酸水溶液(40ml)和乙腈(50ml)的溶液18小時。在真空條件下除去所述溶劑，并用乙酸乙酯(100ml)和水(50ml)稀釋所述混合物，攪拌15分鐘。分離各層，并將所述水層蒸干(1.23g泡沫/漿液)。1HNMR(300MHz)3.2-3.5(m，2H)，4.2-4.35(m，1H)，5.13-5.25(q，2H，J＝11.8，3.1Hz)。
2，3-二-羧基-DTPA丙酸芐酯將2，3-二氨基-丙酸三鹽酸鹽(6.65g)、bb(CO)DTPE(40.0g，“合成子3”)、HOBt(8.5g)、DIC(9.0ml)、二異丙基乙基胺(15.0ml)、CH2Cl2(400ml)和DMF(200ml)的溶液攪拌48小時。用二氯甲烷(500ml)和水(250ml)稀釋所述混合物，然后攪拌15分鐘。分離各層，用飽和碳酸鈉(250ml)、飽和氯化鈉(250ml)洗滌所述有機層，并經(jīng)過硫酸鈉干燥。過濾所述混合物，并在真空條件下濃縮所述濾液，制得油狀物。使用乙酸乙酯和己烷通過硅膠色譜法將所述油狀物純化，制得28.0g材料。MS(m/Z)[M+2]+＝798；[M+1]+＝1595。
2，3-二-羧基-DTPA丙酸在50psi下，在乙酸乙酯/三乙胺(10∶3)中，使用10％鈀/碳(6.0g)催化劑進行2，3-二-羧基-DTPA丙酸芐酯(17.0g)的氫化反應24小時。用氮氣沖洗所述反應器，并通過硅藻土_過濾所述混合物，在減壓條件下濃縮制得16.0g油狀物。MS(m/Z)[M+2]+＝753；[M+1]+＝1504。
合成合成子#2的方法 N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-二亞乙基三胺在室溫下，往二亞乙基三胺(3.16ml)、乙腈(700ml)和二異丙基乙基胺(10.4ml)溶液中加入溶于乙腈中的預反應的(30min)bb(CO)DTPE(42.0g，“合成子3”)、HOBt(7.9g)、EDC(11.2g)和二異丙基乙基胺(10ml)。攪拌所述反應物16.0小時，然后在減壓條件下濃縮。將所述油狀物和乙酸乙酯混合，用水和飽和氯化鈉水溶液提取，然后濃縮。使用己烷/異丙醇/三乙胺通過硅膠色譜法將所述油狀物純化，制得22.5產(chǎn)物。MS(m/Z)[M+H]+＝1503。
N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-N2-(芐氧基羰基甲基)-二亞乙基三胺將2-溴乙酸芐酯(2.54g)加入上述胺化合物(13.5g)、乙腈(200ml)和碳酸鈉(1.18g)的溶液中。將所述混合物升溫至60℃，并攪拌15小時。將所述反應混合物冷卻至室溫，并在減壓條件下濃縮。加入乙酸乙酯和水，分離各層。用飽和氯化鈉水溶液洗滌所述有機層，然后下減壓條件下濃縮，制得油狀物(14.5g)。MS(m/Z)[M]+＝1651。
N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-N2-(乙酸)-二亞乙基三胺在50psi下，在乙酸乙酯/三乙胺(49∶1)中，在10％鈀/碳(3.5g)存在下進行芐酯(14g)的氫化反應16.0小時。通過硅藻土_過濾所得混合物，并在真空中濃縮制得12.08g油狀物。MS(m/Z)[M+H]+＝1561。
合成合成子#4 N1，N3-二-丁氧基羰基-二亞乙基三胺在室溫下往二亞乙基三胺(2.12g，20.6mmol)和三乙胺(30.0g，41.3mmol)的THF(100mL)溶液中加入Boc-ON(10.65g，43.3mmol)。將所述混合物攪拌過夜。往所述混合物中加入700mL乙醚，然后用磷酸鹽緩沖劑(pH＝3，100mmol)提取。將所述水溶液堿化至pH＝11，并用二氯甲烷提取。分離所述有機層，并經(jīng)過無水硫酸鈉干燥。過濾所述鹽，并在減壓條件下除去所述溶劑，制得所示無色油狀化合物(5.55g)。MS(m/Z)[M+H]+＝304.1。
N1，N3-二-丁氧基羰基-N2-(芐氧基羰基乙基)-二亞乙基三胺在室溫下，往上述化合物(1.0g，3.30mmol)的甲醇(40mL)溶液中加入丙烯酸芐酯(1.07g，6.59mmol)。將所述混合物回流3天。在減壓條件下除去所述溶劑，制得黃色液體，它包含所示化合物和丙烯酸芐酯。MS(m/Z)[M+H]+＝466.1。
N2-(芐氧基羰基乙基)-二亞乙基三胺在室溫下，往上述化合物和丙烯酸芐酯(1.0g)在二氯甲烷(25mL)中的混合物中加入TFA(13.8mL)。在室溫下攪拌所述混合物3小時，然后往所述混合物中加入1N HCl和水。分離所述水層，并凍干，制得所示化合物(420mg)，為粘性固體。MS[m/Z][M+H]+＝266.2。
N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-N2-(芐氧基羰基乙基)-二亞乙基三胺往上述化合物、“合成子3”、HOBt和二異丙基乙基胺的CH2Cl2和DMF溶液中加入DIC。在室溫下攪拌所述混合物48小時。用二氯甲烷和水稀釋所述混合物，然后攪拌15分鐘。分離各層，用飽和碳酸鈉，飽和氯化鈉洗滌所述有機層，并經(jīng)過硫酸鈉干燥。過濾所述混合物，并在真空中濃縮所述濾液，制得油狀物。使用乙酸乙酯和己烷通過硅膠色譜法將所述油狀物純化，制得所示化合物。
N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-N2-(丙酸)-二亞乙基三胺將上述化合物、10％鈀/碳、乙酸乙酯和三乙胺加入所述氫化反應器中。用氮氣然后用氫氣沖洗所述反應器。在氫氣(50psi)條件下振蕩所述混合物24小時。用氮氣沖洗所述反應器，并通過硅藻土_過濾所述混合物，在減壓條件下濃縮所述濾液，制得油狀產(chǎn)物。
合成合成子#5 甲基3-(芐基氨基)-2-((芐基氨基)甲基)-丙酸酯在室溫下攪拌過程中，將溶于乙腈(20mL)中的甲基-2-(溴甲基)-丙烯酸酯(1.00g，5.6mmol，1.0當量)滴加到芐基胺(1.83mL，16.8mmol，1.5當量)的無水乙腈(10mL)溶液中。16小時后，加入乙醚(100mL)，過濾所述白色固體(氫溴酸芐基胺)。在減壓條件下濃縮所述濾液，制得1.90g粗油。將所述油溶于乙酸乙酯(150mL)中，并用H2O和NaCl鹽水洗滌。干燥所述有機層(MgSO4)，并在減壓條件下蒸發(fā)。通過快速色譜法(己烷∶乙酸乙酯)將所得透明油純化制得1.38g(79％)產(chǎn)物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.68(s，2H)，2.79-2.90(m，5H)，3.68(s，3H)，3.75(s，3H)，7.21-7.32(m，10H)。
3-(氨基)-2-(氨基甲基)-丙酸甲酯將3-(芐基氨基)-2-((芐基氨基)甲基)-丙酸甲酯(2.27g，7.3mmol，1.0eq)溶于二氯甲烷(20mL)，并加入4.0mL4M HCl在二噁烷中的溶液。在室溫下攪拌所述溶液20分鐘，并在減壓條件下蒸發(fā)溶劑，制得白色粉末，將所述白色粉末溶于50ml MeOH中。在氬氣條件下，在0℃下加入催化劑(10％鈀/碳催化劑，750mg)，并在45psi H2條件下振蕩所述混合物18小時，然后通過硅藻土_進行過濾。在分離所述MeOH之后，分離所述產(chǎn)物(1.47g)，在減壓條件下蒸發(fā)。1HNMR(300MHz，D2O)δ3.25-3.43(m，5H)，3.82(s，3H)。
3-(BOC-氨基)-2-(BOC-氨基甲基)-丙酸甲酯在0℃下，在二噁烷/Na2CO3水溶液中使二胺(1.44g)和二碳酸二叔丁酯(3.22g，14.8mmol，1.05當量)反應1小時，然后在室溫下反應18小時。然后用0.5N KHSO4將所述混合物酸化(pH＝4)，并在減壓條件下蒸發(fā)二噁烷。用乙酸乙酯提取所述水性部分，用MgSO4干燥，并在減壓條件下濃縮，制得粗油，它通過快速色譜法(己烷∶乙酸乙酯)進行純化，制得1.86g(80％)所需產(chǎn)物。NMR(300MHz，CDCl3)δ1.41(s，18H)，2.66-2.78(m，1H)，3.10-3.27(m，2H)，3.50-3.62(m，2H)，3.68(s，3H)，5.17-5.27(bt，2H)。
3-(BOC-氨基)-2-(BOC-氨基甲基)-丙酸將甲酯(1.50g)溶于15mLTHF/H2O的2∶1混合物中。在0℃下加入LiOH·H2O(0.95g)。在0℃到室溫之間攪拌所述混合物44小時。在減壓條件下蒸發(fā)THF，并用EtOAc提取所述水溶液。使用0.5M KHSO4水溶液將所述水層酸化至pH＝3，并用EtOAc提取。用30mL H2O洗滌所述混合的有機部分，并干燥(MgSO4)。在減壓條件下蒸發(fā)所述溶劑，制得1.32g(92％)產(chǎn)物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.40(s，18H)，2.66(s，1H)，3.27-3.47(m，4H)，5.42(s，1H)。
3-(BOC-氨基)-2-(BOC-氨基甲基)-丙酸芐酯在室溫下，在包含Cs2CO3(2.07g)的無水DMF中使酸(1.01g)和芐基溴(0.45mL)反應。在減壓條件下蒸發(fā)DMF，在H2O和EtOAc之間分離所述殘留物。用鹽水洗滌所述有機層，并干燥(MgSO4)。在減壓條件下蒸發(fā)所述溶劑，并通過在硅膠上進行快速色譜法(己烷/EtOAc 95∶5到9∶1-85∶15)，將所述殘留物純化。產(chǎn)率1.16g(90％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.42(s，18H)，2.79(定量，1H，5.6Hz)，3.1-3.3(m，2H)，3.5-3.65(m，2H)，5.13(s，2H)，5.15-5.28(m，1H)，7.30-7.40(m，5H)。MS431.15(M+1)。
3-氨基-2-氨基甲基-丙酸芐酯二鹽酸鹽將3-(BOC-氨基)-2-(BOC-氨基甲基)-丙酸芐酯(1.15g)溶于5mL 4M HCl的二噁烷溶液。在0℃下攪拌所述混合物6小時，并在減壓條件下蒸發(fā)所述二噁烷。用乙醚研磨所述殘留物，并過濾制得未純化的二胺二鹽酸鹽(0.81g)。1HNMR(300MHz，MeOD)δ3.1-3.3(m，5H+CHD2OD)，3.55(s，二噁烷)，5.19(s，2H)，5.15-5.28(m，1H)，7.20-7.40(m，5H)MS209.00(M+1)。
3-(N-BB(CO)DTPE甲酰胺)-2-(NBB(CO)DTPE甲酰胺)甲基-丙酸芐酯在0℃下，將酸(2.00g，2.8mmol，1.5當量)溶于5mL無水二氯甲烷。使所述二胺(0.26g)、HOAt(0.32g)和二異丙基乙基胺(0.65mL)和HATU(0.88g)反應2小時。加入三胺樹脂(0.5g)、異氰酸酯樹脂(0.5g)和HATU(0.42g)，并在室溫下攪拌所述反應混合物16小時。過濾所述樹脂，并蒸發(fā)所述濾液。在H2O和EtOAc之間分離所述殘留物。用水、飽和NaHCO3和鹽水(20mL)洗滌所述有機層，并干燥(MgSO4)。在減壓條件下蒸發(fā)所述溶劑，并通過在硅膠上進行快速色譜法(己烷/丙酮/Et3N)，將所述殘留物純化。制得產(chǎn)物(1.13g)。MS1607.95(M+1)和1629.95(M+Na)。
3-(N-BB(CO)DTPE甲酰胺)-2-(N-BB(CO)DTPE甲酰胺)甲基-丙酸將芐酯(0.90g，0.56mmol)溶于30mL EtOAc中，加入Et3N(1mL)。加入10％鈀/碳催化劑，在45psi氫氣下振蕩所述混合物15小時。過濾所述催化劑，并蒸發(fā)所述溶劑，制得產(chǎn)物(0.82g)。MS759.55(M+2H/2)。
實施例5-合成結(jié)合血纖蛋白的MR顯影劑

肽的構(gòu)成將3.39g 1，3-二-(氨基甲基)-苯三苯甲基NovaSyn TGT樹脂(所測取代度＝0.59mmol)置于標準肽柱上，并加到肽合成器上。使用標準Fmoc步驟進行所述合成方法。在使用DMF中的乙酸酐、6％二異丙基乙基胺偶合所述第一氨基酸之后，進行封端。當完成所述合成時，從所述柱上取出所述樹脂，并置于反應器中。用CH2Cl2清洗所述樹脂一次，并過濾。然后，用1％三氟乙酸的CH2Cl2溶液處理所述樹脂，并置于機械振蕩器上10分鐘。通過所述反應容器過濾所述混合物，并收集所述濾液。用三乙胺將所述混合濾液的pH調(diào)至約8，并在真空條件下濃縮所述溶液，形成油狀物。在用水沉積之后，過濾所述白色固體，并用水和二乙醚清洗。通過抽濾干燥所述固體、在DMF中提取，并用乙腈稀釋。在冰浴中冷卻所述溶液，并用1.5g三氟乙酸鉈處理2.0小時。使用三乙胺將所述溶液的pH調(diào)至8，然后在真空條件下濃縮。往所述油狀物中加入水，通過抽濾收集所得沉積物。用水和二乙醚洗滌所述固體，制得2.7g粗制的具有C-末端胺官能團的修飾的肽。通過觀察為1792.8[M+Na]+An的m/Z，證實H2N-Leu-Pro-Cys-Asp-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Cys-Bip-Asp-CO-NHCH2C6H4CH2NH2(SEQ ID NO21)的合成實施例。通過制備HPLC來純化所述修飾的肽?；旌项愃萍兌?98-100％)的級分，并無需中和進行凍干。
將修飾的肽(3.2g)和共價綴合物(上述合成子#2)(3.95g)溶于二氯甲烷中。滴加二異丙基乙胺，直到pH9，并且同時往所述混合物中加入二異丙基碳酰亞胺(2當量)和HOBt(2當量)。攪拌2分鐘之后，滴加二異丙基乙胺，直到pH9。在室溫下攪拌所述混合物2小時。再一次性加入預先活化的合成子#2(同時加入二異丙基碳酰亞胺，二異丙基乙胺，和HOBt)。在真空條件下除去所述溶劑，并將殘留物溶于乙酸乙酯中，依次用0.1N鹽酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉水溶液洗滌。經(jīng)過硫酸鈉干燥所述有機層，過濾，并在減壓條件下濃縮，制得淡黃色泡沫材料(7.8g)。將所述泡沫材料溶于二氯甲烷，并通過快速色譜法(二氯甲烷∶甲醇洗提液)進行純化，制得白色固體(5.6g)。在室溫下，在TFA、水和三乙基硅烷(90％/5％/5％，30ml)的混合物中攪拌所述白色固體。將所述混合物加熱至40℃，并攪拌2小時。將所述溶液濃縮至體積為3-5ml，然后冷卻至室溫。加入二乙醚，形成白色沉淀。攪拌所述混合物10分鐘，過濾收集所述固體，并用二乙醚洗滌。在真空條件下干燥所述固體，形成白色固體T(4.0g)。將所述固體溶于水∶乙腈(20ml，4∶1比例)的混合物中，并通過制備HPLC純化，制得白色固體，前體MR顯影劑(1.6g)。
在蒸餾去離子水中，在加入1MNaOH將所述pH調(diào)至約6的條件下，使前體MR顯影劑(1g)和1當量的GdCl3·6H2O反應。使用蒸餾去離子水和50∶50(v∶v)甲醇∶水洗提液，通過反相色譜法(Waters Sep-Pak_C-18)純化所述釓絡合物。將合適的級分混合，并在50℃下，在減壓條件下除去所述甲醇，并凍干形成811mg的MR顯影劑。
作為上述合成方法32的替代方法，所述肽可以如以下所述的流程在樹脂上環(huán)化
可任選用耐胃膜例如異丁烯酸聚合物(Eudragit)或纖維素衍生物例如纖維素乙酰鄰苯二甲酸酯和鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素對依據(jù)本發(fā)明獲得的口服固體劑型例如片劑、膠囊、基質(zhì)顆?；蛐⌒突w進行常規(guī)包衣加工。
本發(fā)明組合物保證了肝素或肝素衍生物控制釋放到最后一部分小腸和結(jié)腸內(nèi)，其中肝素對腸粘膜和粘膜下層的抗血栓形成、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和內(nèi)皮調(diào)節(jié)活性為活動期和復發(fā)的潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、乙狀結(jié)腸炎、直腸炎和非特異性腸炎性疾病提供了有效治療。
對于所涉及的治療應用，肝素的合適劑量可以為每單次給藥5-1000mg，每天給藥1-3次，日劑量優(yōu)選為5-1000mg。
下列實施例更詳細地舉例說明本發(fā)明。
實施例1-7用于在結(jié)腸中控制釋放的肝素片劑每個片劑的定性-定量組成


實施例7-合成血結(jié)纖蛋白的光學造影介質(zhì)以上述類似的方法合成以下各光學造影介質(zhì)。流程X顯示了一般實施例，其中往相同的肽中加入兩個相同的光學燃料。
包含5-羧基四甲基若丹明的化合物(3A)將所述肽1(177mg，0.10mmol)和5-羧基四甲基若丹明琥珀酰亞胺基酯A(111mg，0.21mmol)溶于二氯甲烷(20mL)和DMF(20mL)中。滴加二異丙基乙基胺，直到pH9。攪拌所述混合物過夜，然后，在減壓條件下除去溶劑。通過硅膠快速柱色譜法(洗提液二氯甲烷/甲醇)純化所述殘留物，制得化合物2A。
往化合物2A中加入TFA、H2O和三乙基硅烷(比例90/5/5，5mL)的溶液。在室溫下振蕩所述混合物3小時，然后將所述反應混合物溶液傾倒到50mL乙醚中，沉積所述粗產(chǎn)物。通過離心分離將所述溶劑分離之后，收集所述粗產(chǎn)物，然后使用反相HPLC進行純化，制得化合物3A。

包含5-羧基熒光素-的化合物(3B)以類似于合成3A的步驟，使用肽1(177mg，0.10mmol)和5-羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯B(99.4mg，0.21mmol)合成3B。
包含Texas Red_-x的化合物(3C)以類似于合成3A的步驟，使用肽1(177mg，0.10mmol)和Texas Red_-X琥珀酰亞胺基酯C(172mg，0.21mmol)合成3C。
實施例8-測量造影介質(zhì)和目標物的結(jié)合性通過各種平衡結(jié)合方法，評價本發(fā)明造影介質(zhì)和目標物如HSA或血纖蛋白的結(jié)合程度。例如，可以通過超濾測量對HAS的結(jié)合性。在使用超濾進行的典型結(jié)合性測量方法中，在pH7.4的緩沖劑中將造影介質(zhì)和4.5％重量/體積HAS混合。將所述樣品加入裝有30kDa分子量截止過濾器(Millipore Ultrafree MC Low BindingRegeneratedCellulose 30KDa分子量截止過濾器產(chǎn)品編號UFC3 LTK00)的市售離心分離設備中，所述過濾器可以滲透所述尋靶基團，但是不能滲透HSA。通過在截止過濾器上進行2000xg離心分離20分鐘，過濾少量(5-10％)樣品體積，測量濾液中所述樣品中的未結(jié)合的目標組分的濃度。
為了測量對血纖蛋白的結(jié)合性，可以在微量滴定板的小孔中形成血纖蛋白凝塊，并和所述目標組分接觸。在孵化足夠時間以建立平衡之后，通過抽吸除去上層清液(所述不溶的血纖蛋白仍舊作為膠粘的凝塊結(jié)在小孔的底部)。然后測量上層清液中未結(jié)合的目標組分的濃度。
在兩種方法中，確定結(jié)合的造影介質(zhì)濃度，作為起始存在的總目標組分濃度和結(jié)合試驗之后所述未結(jié)合目標組分濃度的差。所述結(jié)合的分數(shù)是所述結(jié)合的目標組分的濃度除以總目標組分的濃度。
如上所述，檢查造影介質(zhì)對可溶血纖蛋白DD(E)片段的親合性，并記錄在表4中。表4中化合物編號是指在詳細說明中所述的結(jié)構(gòu)。在生物試驗中，在多次測量中的數(shù)據(jù)存在不超過20％的差錯頻率。
表4化合物對血纖蛋白的親和性化合物 Kd，DD(E)，μM

化合物 Kd，DD(E)，μM

實施例9-造影介質(zhì)的穩(wěn)定性使用大鼠肝臟勻漿評價其穩(wěn)定性，所述均漿包含細胞內(nèi)和細胞外酶，并且表示對肽鍵來說尤其苛刻的化學環(huán)境。將剛制備的大鼠肝臟勻漿(630μL)置于玻璃試管中，并在37℃的水浴中孵化4分鐘。在37℃下，往所述大鼠肝臟勻漿中加入70μL 1mM的試驗化合物溶液。在時間點0、5、15、30和60分鐘時，取出100μL等份反應混合物，并在微量管中和100μL甲醇混合，來停止所述反應。以10,000rpm速度將所述停止反應的混合物離心分離3分鐘，形成沉積蛋白質(zhì)小丸。通過LC-MS分析所述上層清液，通過將單離子MS峰的面積和一系列標準比較，確定殘留試驗化合物的量。通過繪出信號殘留百分數(shù)的對數(shù)對時間的圖來確定半衰期(T1/2)。使用指數(shù)曲線擬合法將所述數(shù)據(jù)擬合，其中T1/2＝ln2/斜度。
測試了以下化合物的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。化合物5在肽的C-和N-末端處均具有螯合物，由于耐受肽鏈端解酶的水解，其半衰期顯著增大。通過用螯合物將一端改性，不能使半衰期出現(xiàn)可比較的增加，即使當其另一末端用非天然有機部分封端時，例如在化合物3(在N-末端處包含聯(lián)苯基)。
結(jié)構(gòu)1半衰期＝＜2min，游離N-和酰胺化C-末端 結(jié)構(gòu)2半衰期＝10min，綴合到螯合物上的N-末端和酰胺化C-末端。
結(jié)構(gòu)3半衰期＝9min，綴合到螯合物上的C-末端和用對-(苯基)苯甲酸?；腘-末端。
結(jié)構(gòu)5半衰期＝65min，N-和C-末端均綴合到螯合物上。
令人驚奇的是，以上數(shù)值說明，通過將釓螯合物綴合到C-和N-末端上可以最顯著地增大肽的半衰期。
實施例10-造影介質(zhì)的馳豫率使用在0.47 Tesla(20MHz H-1 Larmor頻率)和37℃下操作的BrukerNMS-120Minispec NMR光譜儀或在35℃下操作的Konig-Brown應力松弛計(20MHz，H-1Larmor頻率)測量本發(fā)明MRI造影介質(zhì)的馳豫率。使用儀器軟件，通過反向恢復脈沖序列測量水質(zhì)子的T1。通過測量分別包含0、20、30和40μM Gd(III)的目標物的多溶劑溶液(例如，剛聚合的血纖蛋白原的均勻分散的凝膠，10mg/mL)的T1來確定馳豫率。在37℃下孵化所述樣品至少15分鐘，確保在進行T1測量前溫度保持平衡。通過誘導耦合等離子體-質(zhì)譜儀(ICP-MS)確定所述樣品的Gd(III)含量。通過繪制馳豫速率(1/T1)(以s-1計)對Gd(III)濃度(以mM計)的圖，可以確定所述馳豫率(每個Gd(III)離子)。線性數(shù)據(jù)擬合的斜率就是馳豫率。在沒有目標物存在下也按類似的方式測量所述化合物的的馳豫率，只是沒有存在目標物。
相比沒有生物目標物存在下的馳豫率，本發(fā)明的化合物顯示出在結(jié)合血纖蛋白時馳豫率增大(圖2)。
實施例11-造影介質(zhì)的凝塊攝取按照以下所述方法確定血栓(血凝塊)的造影介質(zhì)吸收麻醉600g豚鼠(Hartley雄性)。在腹部打開一切口，并分離所述下腔靜脈(IVC)，并使所述脈管恢復10分鐘。夾住1cm的IVC，并將人類凝血酶(50μL，4單位)注入所述脈管中，促進血栓形成。打開下面的夾鉗并關閉，使部分血液流到該段中。2-3分鐘后，移走夾子。使所述血栓在動物中老化30分鐘。這時，通過頸靜脈注入所述造影介質(zhì)，劑量為2μmol/kg的化合物32，并用70μCi111In進行放射性同位素示蹤。在注入試劑化合物32之后立即通過頸靜脈注入非特異對照物，它包含劑量為2μmol/kg的Gd(DTPA)，并混有70μCi99mTcDTPA。30分鐘后，進行抽血，處死該動物，并除去所述血栓。將所述血液樣品稱重，并使用PackardCobra IIγ計數(shù)器進行計數(shù)。也將所述血栓稱重并計數(shù)。在128-165keV檢測由99mTc產(chǎn)生的計數(shù)，而在390-500keV探測由111In的衰變產(chǎn)生的計數(shù)。僅具有99mTc或111In的對照物實驗證實了來自99mTc的放射性在用于111In的探測能量下可以忽略，反之亦然。將所述反射性衰變數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為每克組織的起始劑量％，％ID/g，并且用圖表示三個實驗的平均值。預先進行111In的放射性同位素標記將合適放射化學量的111In Cl3(New England Nuclear)加入血纖蛋白靶向造影介質(zhì)中。通過加入1M HCl，將pH調(diào)至4。在45℃下將所述樣品加熱1小時。通過加入1MNaOH將pH調(diào)至中性。通過γ-檢測的HPLC可知，所述標記試劑化合物32的純度＞95％。
血纖蛋白-特異試劑顯示出凝塊吸收顯著增大。圖3顯示了一種試劑，即化合物32在血栓中的積聚。相比較99mTcDTPA，存在特異的凝塊吸收，在血栓中所述試劑的濃度比周圍血液中的濃度高。
可以使用MRI來實證凝塊吸收的特異性。在活的有機體內(nèi)用試劑對血栓進行成像的步驟如下麻醉600g豚鼠(Hartley雄性)。在咽喉處打開一切口，并分離出一條頸靜脈。用血管鉗分離出一端1cm的頸靜脈。將剛剛從動物上抽出的血液(50μL)和人類的血栓(50μL，4單位)混合，并注入到夾住的脈管段中。注入之后4分鐘，移走所述夾鉗，使所述血栓老化30分鐘。以6μmol/kg的劑量將試劑，即化合物32注入，并使用殘缺傾斜方法(TR＝36，TE＝5，翻轉(zhuǎn)角＝30°)在1.5T時將豚鼠的咽喉區(qū)域成像。相對于血液來說，所述血栓顯得明亮。
實施例12-在有黑色血液以及沒有黑色血液的條件下用靶向造影介質(zhì)獲得血栓的MR成像用克他命(50mg/kg)，乙酰丙嗪(2.5mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)試劑的混合液麻醉2.5kg雌性New Zealand白鼠并用巴比妥鈉(約35mg/kg，按所需的)維持麻醉。將i.v.導尿管(24g)置于耳靜脈和耳動脈中。分離所述頸靜脈和頸動脈。通過將18g的針置于脈管的上部，在頸動脈中形成器官狹窄效果，然后，縫合3-0針。然后將針移走。然后，用微脈管夾子將5mm的動脈部分末梢截斷，形成器官狹窄效果。然后沿5mm部分輾壓所述動脈兩次。釋放所述最接近的脈管夾子，使血液流入所述片段中約3秒。重新加上夾子，再次沿5mm的部分輾壓所述動脈兩次。4分鐘后，移走夾子。用微脈管夾子分離5mm頸靜脈片段。通過注入100μL 3.7單位的凝血酶、0.06 MCaCl2、兔子全血的混合物，形成血栓。4分鐘后移走夾子。
將血栓老化50分鐘。通過耳靜脈注入1.0mL血栓鈀向試劑(結(jié)構(gòu)III，5mM，2μmol/kg)的溶液。10分鐘后，將該動物置于General Electric Signa LxCVi 1.5 teslascanner中，并使用3D RF殘缺傾斜響應序列(SPGRTR＝39ms，TE＝3.1ms，翻轉(zhuǎn)角＝40°，視野＝8Cm，獲得頻帶寬＝31.25kH)獲得第一MRI數(shù)據(jù)。施加化學脂肪飽和以及40mm空間下級和上級飽和帶。這一掃描之后(8分鐘之后)立即使用具有40mm空間下級和上級飽和帶的相同參數(shù)獲得第二MRI數(shù)據(jù)，形成“黑血”成像。
圖4A顯示了第一數(shù)據(jù)最大的強度投影(MIP)。由投影長對時間的影響部分提高所述血管。圖4B顯示了第二數(shù)據(jù)的MIP，其中通過使用上級和下級飽和帶抑制來自內(nèi)流血液的信號。在圖4A和4B中，通過使用尋靶造影介質(zhì)識別固定鈀(血栓)明顯很方便。
實施例13-合成光學造影介質(zhì)用NMP/乙醚/NMP洗滌所述NovaSyn TGR樹脂(0.20mmol/g，100mg，20μmol)。使用PyBOP/HOBt/DIEA活化劑，通過標準固相方法組裝所述肽。偶合所述最后氨基酸殘基之后，使用哌啶的DMF(20體積％，2.0mL)的溶液處理所述結(jié)合樹脂的肽10分鐘，除去Fmoc保護基。使用NMP/乙醚/NMP徹底地洗滌所述樹脂，并用熒光素-5-異硫氰酸酯(23.4mg，60μmol)和二異丙基乙基胺(11.6mg，15.7μL，90μmol)的DMF(1.5mL)溶液處理12小時。使用NMP/乙醚/NMP徹底地洗滌所述樹脂，并在4℃下用T1(TFA)3(18.7mg，34.5μmol)的DMF(1.5mL)溶液處理3小時。這一處理之后，洗滌所述樹脂，并用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5，2.0mL)的混合液處理2小時。通過往清除混合液中加入乙醚來沉積所述粗制的肽，并使用VydacC-18柱通過制備HPLC進行純化。以這種方式形成結(jié)構(gòu)A-N，并確定它們血纖蛋白DD(E)片段的親合性(表5)。
結(jié)構(gòu)

表5光學靶向造影介質(zhì)對血纖蛋白的親和性。
ID Kd(μM)對比DD(E) 氟 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13D 0.061 氟 Ahx W F H C Hyp Y(3-I) D L CHIJ 0.055 氟 QW E C P YG L C WIQK 0.06 氟 WF H C P YD L C HIL
E 0.09 氟 Ahx G G F HC Hyp Y(3-I) D L C H IC 0.097氟 Ahx G F H CHyp Y(3-I) D L C H IB 0.099氟 Ahx F H C Hyp Y(3-I) D L C H IH 0.119氟 K W F H CHyp Y(3-I) D L C H IG 0.124氟 K G F H CHyp Y(3-I) D L C H II 0.127氟 K G G F HC Hyp Y(3-I) D L C H IA 0.136氟 β-A F H C Hyp Y(3-I) D L C H IF 0.212氟 K F H C Hyp Y(3-I) D L C H I具有光學探頭的肽的N-末端標記可以調(diào)節(jié)所述光學造影介質(zhì)的結(jié)合親和性。例如，當和肽的熒光素、4-甲氧基香豆素和四甲基若丹明衍生物(QWECPYGLCWIQ(SEQIDNO27)；Kd＝3μM)比較時，觀察到以下的Kd’s(表6)表6

實施例14-血纖蛋白鈀向的尿激酶按照以下所述步驟制備血纖蛋白鈀向的尿激酶。按照固相步驟制備所述具有Gly-Gly二肽連接基的血纖蛋白結(jié)合肽。用乙?；鶎⑺鲭牡腘-末端封端，并將C-末端羧酸轉(zhuǎn)化成琥珀酰亞胺活性酯。通過在水性緩沖劑中以合適比例混合尿激酶和所述活化肽來獲得直接化學結(jié)合，并緩慢攪拌所述溶液30分鐘。
可通過HPLC純化血纖蛋白鈀向的尿激酶。評價對血纖蛋白的結(jié)合性。相對血纖蛋白原，化合物1選擇性結(jié)合血纖蛋白。
使用Collen等(J.Clin.Invest.1983，71，368-376)中兔子的頸靜脈模型進行溶解血栓試驗。通過在1分鐘內(nèi)注入丸劑(由20％的總劑量組成)以及肝素丸劑(300單位/kg)來給予化合物(2mg/kg)。在接著的60分鐘內(nèi)連續(xù)注入剩余的劑量，并且在接著的180分鐘內(nèi)連續(xù)注入肝素(60單位/kg/小時)。在3小時時，處死該動物，并分析凝塊。化合物1比單獨的scuPA在凝塊溶解中效力更強。在3小時時，在具有2mg/kg化合物1的條件下，相比相等劑量的單獨scuPA，消耗更少的血纖蛋白原和α2-抗纖維蛋白溶酶，證實化合物1比單獨的scuPA具有更強的血纖蛋白特異性。
其它實施方案可以理解，由于已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明，上面的描述只是為了闡述而不是要限制本發(fā)明的范圍，其范圍由權(quán)利要求書確定。其它方面、優(yōu)點和修改在以下權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.制造MR顯影劑的方法，其特征在于，所述方法包括a)使帶有N-末端胺官能團的肽與連接基-亞單元部分反應以形成帶有C-末端胺官能團和所述N-末端胺官能團的修飾的肽；b)使連接基部分共價連接到C-末端胺官能團和N-末端胺官能團以形成前體MR顯影劑；和c)將前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述連接基-亞單元部分選自 和 其中n是1-4的整數(shù)；m是1-12的整數(shù)；和R是脂肪基或芳基。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述連接基部分選自 其中m是1-4的整數(shù)；n是0-4的整數(shù)；LG是離去基團；和R’和R”獨立選自氫和化學保護基。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述連接基部分選自 其中LG是離去基團；和R1和R2獨立選自氫和化學保護基。
5.如權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法，其中，LG選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐，且其中所述化學保護基選自Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、芐基和烯丙基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述活性酯選自五氟苯酚(Pfp)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺鈉鹽(NHSS)、2-硫代噻唑烷-1-基和羥基苯并三唑(OBT)。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述鹵化物選自F，Cl，Br和I。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括(a)使前體顯影劑與前體螯合部分反應以在前體螯合部分和前體MR顯影劑的連接基部分之間形成共價鍵，所述前體螯合部分包括多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分；(b)將結(jié)合的前體螯合部分的多個羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成多個羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和(c)將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述前體螯合部分選自 和 其中，Y是能夠能夠與所述已連接的連接基部分形成共價鍵的合成部分，且其中每個X分別是O-或O-前體，這樣，在X轉(zhuǎn)變成O-后就能夠與其鄰近的羰基形成羧酸鹽部分，R1是不帶電荷的化學部分、脂肪基烷基或環(huán)烷基或其不帶電荷的取代的形式。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述合成部分選自羧酸、活性酯、酸酰鹵、酸酐、鹵代烷、異氰酸酯和異硫氰酸酯，其中O-前體選自-OH、-OMe、OEt、OtBu、O芐基和O-烯丙基。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，前體螯合部分選自 和 其中，LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團，且其中每個R分別是選自OH，-O-Me，O-Et，O-tBu，O-芐基和O-烯丙基的O-或O-前體，這樣，在轉(zhuǎn)變成O-后R就能夠與其鄰近的羰基形成羧酸鹽部分。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述前體螯合部分選自 其中n是1-4的整數(shù)；R選自負電荷和能夠轉(zhuǎn)化成負電荷的帶有負電荷的前體；和X是選自-Cl，-Br，-I，-MsO，-TsO和-TfO的化學離去基團。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述前體螯合部分選自 其中R選自負電荷和能夠轉(zhuǎn)化成負電荷的帶有負電荷的前體；和X是選自-Cl，-Br，-I，-MsO，-TsO和-TfO的化學離去基團。
14.如權(quán)利要求12或13所述的方法，其中，所述帶有負電荷的前體選自-H，-Me，-Et，-t-Bu，-芐基和-烯丙基。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述連接基部分與前體螯合部分共價綴合，所述共價綴合物含有多個含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述共價綴合物選自 和 其中，n是1-4的整數(shù)；LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團；和R1，R2，R3，R4和R5獨立選自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保護的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述共價綴合物選自 其中LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團；和R1，R2，R3和R4選自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保護的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述共價綴合物選自合成子1 和合成子2
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述共價綴合物選自 其中R是-tBu基，LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括a)將多個共價綴合物的羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和b)將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。
21.如權(quán)利要求8或權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子是Gd(III)。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括在步驟b)之前使連接基-亞單元與肽的N-末端胺官能團反應以得到肽的衍生的N-末端胺官能團。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述連接基-亞單元選自 和 其中堿基選自腺苷、鳥苷、胸腺嘧啶和胞嘧啶；LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團；和R是脂肪或芳香部分。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述連接基-亞單元選自 其中n分別為0-3的整數(shù)；R是脂肪基或芳基；和LG是選自OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述連接基-亞單元選自 和 其中，n分別是1或2；R是脂肪基或芳基；和LG是選自OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團。
27.制造MR顯影劑的方法，其特征在于，所述方法包括a)將氨基酸殘基共價結(jié)合到連接基-亞單元部分以形成肽的C-末端，其中所述連接基-亞單元部分共價連接到樹脂上；b)在樹脂上從一肽的共價結(jié)合的C-末端到N-末端殘基合成肽，所述N-末端殘基包括N-末端胺官能團；c)從樹脂上切下肽以制造帶有C-末端胺官能團的肽；d)將連接基部分共價結(jié)合到肽的C-末端胺官能團和N-末端胺官能團以形成前體MR顯影劑；和e)將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)化成MR顯影劑。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述方法還包括在步驟c)之前使連接基-亞單元附到共價連接到N-末端胺官能團以制造衍生的N-末端胺官能團。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括a)使前體MR顯影劑與前體螯合部分反應以在前體螯合部分和前體MR顯影劑的連接基部分之間形成共價鍵，所述前體螯合部分包括多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分；b)將結(jié)合的前體螯合部分的多個羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成多個羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和c)將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述連接基部分共價綴合到前體螯合部分，所述共價綴合物含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括a)將多個共價綴合物的羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和b)將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子是Gd(III)。
34.制造MR顯影劑的方法，其特征在于，所述方法包括a)使帶有C-末端羧酸鹽官能團的肽與連接基-亞單元部分反應以形成具有C-末端羧酸鹽官能團和N-末端羧酸鹽官能團的修飾的肽；b)使連接基部分共價連接到修飾的肽的C-末端和N-末端羧酸鹽官能團以形成前體MR顯影劑；和c)將前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述連接基-亞單元部分選自 和 其中LG是選自-OH、活性酯、鹵化物和酸酐的離去基團；和R是脂肪基或芳基。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述連接基部分選自 其中m是1-4的整數(shù)；n是0-4的整數(shù)；R獨立選自-H，-Me，-Et，-Bz和-tBu；和R1和R2獨立選自氫或化學保護基。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述連接基部分選自 其中，R1和R2獨立選自氫和化學保護基，所述化學保護基選自Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、芐基和烯丙基。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括a)使前體MR顯影劑與前體螯合部分反應以在前體螯合部分和前體MR顯影劑的連接基部分之間形成共價鍵，所述前體螯合部分包括多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分；b)將結(jié)合的前體螯合部分的多個羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成多個羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和c)將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。
39.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述連接基部分共價綴合到前體螯合部分，所述共價綴合物含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠被轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括a)將多個共價綴合物的羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和b)將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位以制造MR顯影劑。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述共價綴合物選自 和 其中n是1-4的整數(shù)；和R1，R2，R3，R4和R5獨立選自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保護的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述共價綴合物是
43.如權(quán)利要求1、27或34所述的方法，其中，將所述前體MR顯影劑轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括(a)使前體顯影劑與螯合部分反應，其中所述螯合部分含有順磁性金屬離子，以在螯合部分和前體MR顯影劑的連接基部分之間形成共價鍵以制造MR顯影劑。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子是Gd(III)。
46.在生物高分子的-CO2R和NHR末端含有金屬螯合物的造影介質(zhì)，其特征在于，R獨立選自氫，烷基，脂肪基和離去基團。
47.如權(quán)利要求46所述的造影介質(zhì)，在生物高分子的CO2R和NHR末端含有兩個金屬螯合物。
48.如權(quán)利要求46所述的造影介質(zhì)，其中，所述生物高分子對血纖蛋白有特異的結(jié)合親合性。
49.如權(quán)利要求46所述的造影介質(zhì)，其中，所述生物高分子是肽。
50.如權(quán)利要求49所述的造影介質(zhì)，其中，所述肽能夠在非還原條件下形成二硫鍵。
51.如權(quán)利要求50所述的造影介質(zhì)，其中，所述肽含有二硫鍵。
52.如權(quán)利要求46所述的造影介質(zhì)，所述造影介質(zhì)有以下結(jié)構(gòu) 其中螯合物代表金屬螯合物；連接基代表連接基部分；連接基-亞單元代表連接基-亞單元部分；m獨立為1-10的整數(shù)；p獨立為0-5的整數(shù)；s獨立是0或1；R1是氨基酸側(cè)鏈或其衍生物；和R2獨立是氫或脂肪基。
53.如權(quán)利要求52所述的造影介質(zhì)，所述造影介質(zhì)具有選自以下的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)4 結(jié)構(gòu)5 結(jié)構(gòu)6 結(jié)構(gòu)7 結(jié)構(gòu)8 結(jié)構(gòu)9 結(jié)構(gòu)10 結(jié)構(gòu)11 結(jié)構(gòu)12 結(jié)構(gòu)13 結(jié)構(gòu)14 結(jié)構(gòu)15 結(jié)構(gòu)16 結(jié)構(gòu)17 結(jié)構(gòu)18 結(jié)構(gòu)19 結(jié)構(gòu)20 結(jié)構(gòu)21 結(jié)構(gòu)22 結(jié)構(gòu)23 結(jié)構(gòu)24 結(jié)構(gòu)25 結(jié)構(gòu)26 結(jié)構(gòu)27 結(jié)構(gòu)28 結(jié)構(gòu)29 結(jié)構(gòu)30 結(jié)構(gòu)31 和結(jié)構(gòu)32 其中，Gd是順磁性金屬離子Gd(III)，其中Gd(III)配位到DTPA部分；且其中DTPA部分在DTPA部分的次乙基碳或乙酸基碳上共價連接到含有C(＝O)基的部分。
54.如權(quán)利要求52所述的造影介質(zhì)，所述造影介質(zhì)具有選自以下的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)33 結(jié)構(gòu)34 結(jié)構(gòu)35 結(jié)構(gòu)36 結(jié)構(gòu)37 結(jié)構(gòu)38 結(jié)構(gòu)39 結(jié)構(gòu)40 和結(jié)構(gòu)41
55.如權(quán)利要求52所述的造影介質(zhì)，所述造影介質(zhì)具有選自以下的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)42 結(jié)構(gòu)43 結(jié)構(gòu)44 結(jié)構(gòu)45 結(jié)構(gòu)46 結(jié)構(gòu)47 結(jié)構(gòu)48 結(jié)構(gòu)49 和結(jié)構(gòu)50
56.改變肽的穩(wěn)定性的方法，所述肽帶有N-末端胺官能團，其特征在于，所述方法包括a)使所述肽與連接基-亞單元部分反應以形成具有C-末端胺官能團的肽；和b)使連接基部分共連接到肽的C-末端胺官能團和N-末端胺官能團以形成修飾的肽。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，還包括使修飾的肽與前體螯合部分反應以在前體螯合部分和修飾的肽的連接基部分之間形成共價鍵，所述前體螯合部分含有多個羧酸鹽前體基團，所述羧酸鹽前體基團能夠轉(zhuǎn)化成羧酸鹽部分。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，所述方法還包括(a)將結(jié)合的前體螯合部分的多個羧酸鹽前體基團轉(zhuǎn)化成多個羧酸鹽部分，所述羧酸鹽部分能夠與順磁性金屬離子配位；和(b)將順磁性金屬離子與多個羧酸鹽部分配位。
59.如權(quán)利要求57所述的方法，還包括測定所述修飾的肽的穩(wěn)定性。
60.如權(quán)利要求57所述的方法，還包括a)測定所述未修飾的肽的穩(wěn)定性；和b)比較所述修飾的肽的穩(wěn)定性與所述未修飾的肽的穩(wěn)定性。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述修飾的肽的穩(wěn)定性相對于未修飾的肽的穩(wěn)定性有所提高。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述修飾的肽的穩(wěn)定性相對于未修飾的肽的穩(wěn)定性增加了10倍。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述修飾的肽的穩(wěn)定性相對于未修飾的肽的穩(wěn)定性增加了20倍。
64.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述修飾的肽的穩(wěn)定性相對于未修飾的肽的穩(wěn)定性增加了30倍。
65.如權(quán)利要求59或權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述穩(wěn)定性采用大鼠肝臟勻漿測定進行。
66.一種具有以下結(jié)構(gòu)的修飾的肽 其中螯合物前體代表螯合物前體部分；連接基代表連接基部分；連接基-亞單元代表連接基-亞單元部分；m獨立為1-10的整數(shù)；p獨立為1-5整數(shù)；s獨立是0或1；R1是氨基酸側(cè)鏈或其衍生物；和R2選自H和脂肪基。
67.一種具有以下結(jié)構(gòu)的修飾的肽 其中連接基代表連接基部分；連接基-亞單元代表連接基-亞單元部分；p獨立為0-5的整數(shù)；s獨立是0或1；R1是氨基酸側(cè)鏈或其衍生物；和R2選自H和脂肪基。
68.一種制造MR顯影劑的方法，其特征在于，所述方法包括a)使帶有N-末端胺官能團的肽與連接基-亞單元部分反應以形成在其N-末端和C-末端都有胺官能團的修飾的肽；和b)將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。
69.制造MR顯影劑的方法，其特征在于，所述方法包括a)使帶有C-末端羧酸鹽官能團的肽與連接基-亞單元部分反應以形成在其C-末端和N-末端都有羧酸鹽官能團的修飾的肽；和b)將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。
70.制造MR顯影劑的方法，其特征在于，所述方法包括a)使氨基酸殘基共價結(jié)合到連接基-亞單元部分以形成肽的C-末端，其中所述連接基-亞單元部分共價結(jié)合到樹脂；b)在樹脂上從肽的共價結(jié)合的C-末端到N-末端殘基合成肽，所述N-末端殘基包括N-末端胺官能團；c)從樹脂上切下肽以制造帶有C-末端胺官能團的肽；d)將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑。
71.如權(quán)利要求68、權(quán)利要求69或權(quán)利要求70所述的方法，其中，將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括使螯合部分共價結(jié)合到修飾的肽，其中所述螯合部分含有順磁性金屬離子，以制造MR顯影劑。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子是Gd(III)。
74.如權(quán)利要求68、權(quán)利要求69或權(quán)利要求70所述的方法，其中，將修飾的肽轉(zhuǎn)變成MR顯影劑包括a)使連接基部分共價結(jié)合到螯合部分以形成共價綴合物，其中所述螯合部分含有順磁性金屬離子；和b)使共價綴合物與修飾的肽反應以形成MR顯影劑。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
76.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，所述順磁性金屬離子是Gd(III)。
77.如權(quán)利要求56所述的方法，還包括使修飾的肽與帽化部分反應以在帽化部分和修飾的肽的連接基部分之間形成共價鍵。
78.一種純化的肽，所述肽含有氨基酸序列P*-Y*-X1*-L*(SEQ ID NO1)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1*是G或D或G或D的非天然衍生物；L*是亮氨酸或其非天然衍生物；和其中，至少P*、Y*、X1*和L*之一是各個氨基酸的非天然衍生物。
79.如權(quán)利要求78所述的純化的肽，其中，X1*是G或D，其中L*是亮氨酸。
80.如權(quán)利要求79所述的純化的肽，其中，P*是脯氨酸或4-羥脯氨酸，且其中Y*是酪氨酸或在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。
81.一種純化的肽，所述肽含有氨基酸序列X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(SEQ ID NO2)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1選自W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)和Y(3*)，其中F(3/4*)是在3或4位被選自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸，且其中Y(3*)是在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸；X2選自E、H、dE、S、H(Bzl)、2-Pal、Dpr和Th；X3選自G和D；X4選自H、F、Y和W；X5選自I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal和F(3/4*)，其中F(3/4*)是在3或4位被選自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸；X6選自N、Q、I、L和V或X6不存在；且其中至少X1，X2，X5，P*和Y*之一是氨基酸的非天然衍生物。
82.如權(quán)利要求81所述的純化的肽，其中，P*是脯氨酸或4-羥脯氨酸，且Y*是酪氨酸或在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。
83.如權(quán)利要求80或81所述的純化的肽，所述肽還能夠在非還原條件下形成二硫鍵。
84.如權(quán)利要求83所述的純化的肽，所述肽含有二硫鍵。
85.如權(quán)利要求84所述的純化的肽，所述肽對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。
86.如權(quán)利要求82所述的純化的肽，包含選自以下的氨基酸序列W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO4)Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO5)Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO6)W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO7)W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO8)Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO9)Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO10)W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO11)F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO12)Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO13)W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO14)W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO15)，和F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO16)。
87.如權(quán)利要求86所述的純化的肽，所述肽還能夠在非還原條件下形成二硫鍵。
88.如權(quán)利要求87所述的純化的肽，所述肽含有二硫鍵。
89.如權(quán)利要求86所述的純化的肽，所述肽對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。
90.如權(quán)利要求81所述的純化的肽，其中P*是脯氨酸；Y*是酪氨酸；X1選自W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)和Y(3*)，其中F3/4*是在3或4位被選自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸，且其中Y3*是在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸；X2選自dE，H(Bzl)，2-Pal，Dpr和Th；X3選自G和D；X4選自H、F、Y和W；X5選自I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal和F(3/4*)，其中F3/4*是在3或4位被選自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸，其中至少X1，X2或X5之一是非天然氨基酸衍生物；和X6選自N、Q、I、L和V或X6不存在。
91.如權(quán)利要求90所述的純化的肽，所述肽還能夠在非還原條件下形成二硫鍵。
92.如權(quán)利要求90所述的純化的肽，所述肽包含二硫鍵。
93.如權(quán)利要求91所述的純化的肽，所述肽對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。
94.一種化合物，所述化合物含有與溶血栓劑結(jié)合的如權(quán)利要求78所述的肽。
95.一種純化的肽，所述肽含有氨基酸序列C-P*-Y*-X1-L-C(SEQ ID NO3)，其中X1是G或D，P*是脯氨酸或其非天然衍生物4-羥脯氨酸；Y*是酪氨酸或在3位被選自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物；和條件是，至少P*或Y*之一是各個氨基酸的非天然衍生物。
96.如權(quán)利要求95所述的純化的肽，其特征在于，所述肽還能夠在非還原條件下形成二硫鍵。
97.如權(quán)利要求95所述的純化的肽，其特征在于，所述肽含有二硫鍵。
98.如權(quán)利要求96所述的純化的肽，其特征在于，所述肽對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。
99.一種化合物，所述化合物含有與溶血栓劑結(jié)合的如權(quán)利要求95所述的肽。
100.一種純化的肽，所述肽含有氨基酸序列C-D-Y-Y-G-T-C-X10(SEQ ID.NO17)，其中X10選自n(癸基)G、n(4-PhBu)G、MeL、Bpa、Bip、Me-Bip、F(4*)、F(3-Me)、F(3，4-二氟)、Amh、Hfe、Y(3，5-二-碘)、Pff、1Nal、d1Nal和MeL，其中F(4*)是在4位被選自Et、CF3、I和iPr的部分取代的苯丙氨酸。
101.一種純化的肽，所述肽含有氨基酸序列C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(SEQ ID.NO18)，其中X11選自D、dD、βD、Inp、Nip、Me-D、dC、Cop和Cmp。
102.如權(quán)利要求101所述的純化的肽，所述肽含有選自以下的氨基酸序列L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-dD(SEQ ID NO19)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-D(SEQ ID NO20)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D(SEQ ID NO21)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD(SEQ ID NO22)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Inp(SEQ ID NO23)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp(SEQ ID NO24)，和L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D(SEQ ID NO25)。
103.如權(quán)利要求101或權(quán)利要求102所述的純化的肽，所述肽還能夠在非還原條件下形成二硫鍵。
104.如權(quán)利要求103所述的純化的肽，所述肽含有二硫鍵。
105.如權(quán)利要求101所述的純化的肽，所述肽對血纖蛋白有特異的結(jié)合親和性。
106.一種化合物，所述化合物含有與溶血栓劑結(jié)合的如權(quán)利要求101所述的肽。
全文摘要
描述了肽和肽靶向的多聚體造影介質(zhì)，以及制造和使用造影介質(zhì)的方法。
文檔編號C07K5/117GK1599577SQ02819255
公開日2005年3月23日 申請日期2002年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月30日
發(fā)明者Z·張, P·D·卡拉凡, T·J·麥克姆利, A·科羅德澤吉, S·納爾, J·C·阿梅迪奧, S·杜馬斯, X·王, W·－C·孫, A·L·尼弗羅斯金, S·K·科尼爾 申請人:埃匹克斯醫(yī)療股份有限公司