專利名稱：血栓成像用的放射性標(biāo)記化合物的制作方法
本申請(qǐng)是1995年6月1日提交的、申請(qǐng)?zhí)枮?5194303.30-4、題目為“血栓成像用的放射性標(biāo)記化合物”的分案申請(qǐng)。
發(fā)明的背景由于上述這些原因，體內(nèi)血栓快速定位法非常受歡迎且優(yōu)選使用無損傷性的方法?，F(xiàn)時(shí)鑒定DVT部位的方法是靜脈造影術(shù)和與之相對(duì)照的加強(qiáng)性B超。選擇哪種方法應(yīng)取決于血栓的預(yù)測部位。不過，這兩種方法均使病人感覺不舒服，而且前一種方法是損傷性的。此外，這兩種方法對(duì)許多病例是不適用的或產(chǎn)生不正確的鑒定結(jié)果。
現(xiàn)時(shí)診斷PE的方法包括X-光胸透、心電圖(EKG)、動(dòng)脈氧壓、肺活量(最大吸氣量和最大呼氣量)以及肺血管造影術(shù)。除了最后一種無損害方法之外，其它的方法均不能提供確切的診斷結(jié)果。
在核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里，可以確定某些病灶的部位或大致確定其范圍。其方法是內(nèi)服少量的放射性標(biāo)記的示蹤化合物(稱作放射性示蹤物或放射性藥物)，然后檢測其分布情況。檢測這些放射性藥物的方法一般稱為成像術(shù)或放射性成像術(shù)。
放射性成像術(shù)中所使用的多種放射性核素包括67Ga、68Ga、99mTc(Tc-99m)、111In、123I、125I和169Yb。其中，優(yōu)選的Tc-99m和111In為單光子發(fā)射的放射性核素，優(yōu)選的68Ga為正電子發(fā)射的放射性核素。優(yōu)選Tc-99m是因?yàn)樗话l(fā)射α或β粒子射線而發(fā)射大約140KeV的γ射線，而且半衰期為6小時(shí)以及用鉬-99/锝99m發(fā)生器能就地即刻很方便地得到它。
γ射線示蹤物內(nèi)服后，優(yōu)先與血栓的某個(gè)組分而不是其它組織進(jìn)行特異性結(jié)合，這樣便能進(jìn)行外閃爍照相成像，確定與血栓相結(jié)合的示蹤物的位置從而確定血栓的位置。血栓是由血細(xì)胞(高活化的血小板)陷于交聯(lián)的血纖維蛋白中形成的。活化的血小板是非常好的血栓成像的目標(biāo)物，因?yàn)榛罨难“逶谘h(huán)血中(包含未活化的血小板)通常是不存在的。
活化的血小板在其細(xì)胞表面表達(dá)GPIIb/IIIa受體。這種受體的正常配體為血纖維蛋白(Plow等，1987，Perspectives in Inflammation，Neoplasia andVascular Cell Biology，PP.267-275)。不過，已經(jīng)研制了一些合成性的小分子類似物(可能但并不一定是肽)可以和這種受體結(jié)合(實(shí)例包括Klein等，1992，美國專利5,0136,069和Egbertson等，1992，歐洲專利申請(qǐng)EPA0478328A1)。在這些合成性分子中盡管許多只以低的親合力結(jié)合，但其它分子卻具有較高親合力(參閱Egbertson等，ibid)。
現(xiàn)有技術(shù)中，人們開始嘗試用放射性示蹤物來成像血栓。這些包括用111In或99mTc標(biāo)記的自體固有的血小板和用123I與125I標(biāo)記的纖維蛋白原(后者用γ閃爍探針檢測，優(yōu)于γ照相)。用于標(biāo)記血栓的其它一些放射性標(biāo)記物包括血纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶原激活劑、肝素、纖維結(jié)合蛋白、纖維蛋白片段E1以及抗纖維蛋白和抗血小板的單克隆抗體(參閱Knight，1990，Sem.Nucl.Med.2052-67)。
現(xiàn)有技術(shù)中，一些化合物具有與血小板GPIIb/IIIa受體相結(jié)合的能力。
Ruoslahti和Pierschbacher，美國專利4,578,079，描述了序列為X-Arg-Gly-Asp-R-Y的肽，其中X和Y為H或一種氨基酸，R為Thr或Cys，這種肽能夠與血小板相結(jié)合。
Ruoslahti和Pierschbacher，美國專利4,792,525，描述了序列為Arg-Gly-Asp-X的肽，其中X是Ser、Thr或Cys，這種肽能夠與血小板相結(jié)合。
Klein等，1992，美國專利5,086,069公開了與GPIIb/IIIa受體相結(jié)合的鳥嘌呤衍生物。
Pierschbacher等，1989，PUT/US88/04403公開了構(gòu)象上被限制的包含RGD的肽，用來抑制細(xì)胞在培養(yǎng)基上的附著。
Nutt等，1990，歐洲專利申請(qǐng)90202015.5公開了作為血纖維蛋白原受體拮抗劑的環(huán)狀RGD多肽。
Nutt等，1990，歐洲專利申請(qǐng)90202030.4公開了作為血纖維蛋白原受體拮抗劑的環(huán)狀RGD多肽。
Nutt等，1990，歐洲專利申請(qǐng)90202031.2公開了作為血纖維蛋白原受體拮抗劑的環(huán)狀RGD多肽。
Nutt等，1990，歐洲專利申請(qǐng)90202032.0公開了作為血纖維蛋白原受體拮抗劑的環(huán)狀RGD多肽。
Nutt等，1990，歐洲專利申請(qǐng)90311148.2公開了作為血纖維蛋白原受體拮抗劑的環(huán)肽。
Nutt等，1990，歐洲專利申請(qǐng)90311151.6公開了作為血纖維蛋白原受體拮抗劑的環(huán)肽。
Ali等，1990，歐洲專利申請(qǐng)90311537.6公開了作為血纖維蛋白原受體拮抗劑的環(huán)肽。
Barker等，1991，PCT/US90/03788公開了用來抑制血小板聚集的環(huán)肽。
Pierschbacher等，1991，PCT/US41/02356公開了作為血纖維蛋白原受體拮抗劑的環(huán)肽。
Duggan等，1992，歐洲專利申請(qǐng)92304111.5公開了血纖維蛋白原受體拮抗劑。
Garland等，1992，歐洲專利申請(qǐng)92103861.8和92108214.5公開了作為血小板聚集抑制劑的苯甲酰胺衍生物。
Bondinell等，1993，國際專利申請(qǐng)PCT/US92/0546公開了二環(huán)的血纖維蛋白原拮抗劑。
Blackburn等，國際專利申請(qǐng)PCT/US92/0878，公開了非肽性整合抑制劑，與GPIIb/IIIa受體特異性結(jié)合。
Egbertson等，1992，歐洲專利申請(qǐng)0478328A1公開了酪氨酸衍生物，與GPIIb/IIIa受體結(jié)合具有高親合力。
Ojima等，1992，204th Meeting，Amer.Chem.Soc.Abst.44公開了抑制血小板聚集的合成性的多支鏈的RDGF肽。
Hartman等，1992，J.Med.Chem.354640-4642描述了酪氨酸衍生物，與GPIIb/IIIa受體結(jié)合具有高親合力。
用來成像血栓的放射性標(biāo)記的肽在現(xiàn)有技術(shù)中已見報(bào)導(dǎo)。
Stuttle，1990，PCT/GB90/00933公開了包含3～10個(gè)氨基酸的放射性標(biāo)記的肽，肽序列為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，能夠與體內(nèi)RGD結(jié)合部位相結(jié)合。
Rodwell等，1991，PCT/US91/03116公開了“分子識(shí)別單元”，與“效應(yīng)物區(qū)域結(jié)構(gòu)”相結(jié)合的軛合物。
現(xiàn)有技術(shù)中，放射性標(biāo)記肽的螯合劑的使用以及用Tc-99m來標(biāo)記肽的方法在共同待批的美國專利申請(qǐng)07/653,012、07/807,062、07/871,282、07/886,752、07/893,981、07/955,466、08/019,864、08/073,577、08/210,822、08/236,402和08/241,625中公開了。另外，現(xiàn)有技術(shù)中用閃爍照相成像肽來成像血栓的放射性標(biāo)記肽在共同待批的美國專利申請(qǐng)07/886,752、07/893,981和08/044,825以及國際專利申請(qǐng)PCT/US92/00757、PCT/US92/10716、PCT/US93/02320、PCT/US93/03687、PCT/US93/04794、PCT/US93/05372、PCT/US93/06029、PCT/US93/09387、PCT/US94/01894、PCT/US94/03878和PCT/US94/05895中公開了。這些文獻(xiàn)在此均引用作為參考。
被放射性標(biāo)記物標(biāo)記的分子要求體積小(以便增強(qiáng)血液和背景組織的清晰度)、是合成的(以便實(shí)施常規(guī)化生產(chǎn)，并容易驗(yàn)收)、高親合力、和特異性結(jié)合。這些分子用方便易得的放射性標(biāo)記核素(優(yōu)選Tc-99m)來進(jìn)行標(biāo)記從而對(duì)體內(nèi)的血栓進(jìn)行成像。為了滿足技術(shù)上的需要，本發(fā)明提供了一些合成性小分子化合物，這些化合物可與活化的血小板GPIIb/IIIa受體結(jié)合并且被一些方便易得的放射性同位素標(biāo)記，該放射性同位素優(yōu)選Tc-99m、111In和68Ga。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一些放射性標(biāo)記的(優(yōu)選Tc-99m、111In和68Ga)合成性小分子化合物，與GPIIb/IIIa受體結(jié)合具有高親合力，可作為閃爍照相成像劑對(duì)體內(nèi)血栓進(jìn)行無損傷成像。因此本發(fā)明提供了閃爍照相血栓成像劑，即放射性標(biāo)記的試劑。具體而言，本發(fā)明提供了制備血栓成像劑的試劑，這種試劑用锝-99m(Tc-99m)、111In和68Ga進(jìn)行標(biāo)記，其中優(yōu)選用Tc-99m。本發(fā)明中每一試劑都包括一特異性結(jié)合物，包括肽但并不只限于肽，它與血小板糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)受體結(jié)合具有高親合力，而且與放射性標(biāo)記的復(fù)合物共價(jià)結(jié)合。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為達(dá)到最佳成像效果，該試劑必須能夠與GPIIb/IIIa受體結(jié)合且具有足夠高的親合力以致能夠抑制腺苷二磷酸(ADP)誘導(dǎo)的人體內(nèi)血小板的聚集作用。用血小板聚集作用的標(biāo)準(zhǔn)測定法來測定(參見，下文實(shí)施例3)，當(dāng)試劑以不超過1μM的濃度存在時(shí)，其抑制率可達(dá)50％。
運(yùn)用小分子化合物具有顯著的商業(yè)效益。該化合物的分子量優(yōu)選少于1000道爾頓。這種小分子化合物很容易生產(chǎn)。而且它們很可能不具有“致免疫性”，并且能夠很快地從脈管系統(tǒng)中清除掉，這就使得血栓成像更快更好。相反，大的分子如抗體片段或其它生物合成的肽，其分子重量超過10,000道爾頓，生產(chǎn)成本高，而且很可能具有“致免疫性”以及從血液中清除掉的速度較慢，這樣就不利于體內(nèi)血栓的快速診斷。
本發(fā)明也提供了一些試劑，其中特異性結(jié)合物為線性或環(huán)狀的肽，具有4～100個(gè)氨基酸的氨基酸序列，分子量不超過約10,000道爾頓。
另一方面，本發(fā)明提供了制備血栓成像劑用的試劑，它能夠被放射性標(biāo)記從而能夠?qū)Σ溉閯?dòng)物體內(nèi)的血栓進(jìn)行成像。這種試劑含有一種特異性結(jié)合的化合物，它能夠與血小板GPIIb/IIIa受體特異性結(jié)合，而且與Tc-99m的復(fù)合部分共價(jià)結(jié)合，該部分的化學(xué)式為IC(pgp)s-(氨基酸)-C(pgp)s其中C(pgp)s是被保護(hù)的半胱氨酸，(氨基酸)是任何不含硫羥基的初級(jí)α-或β-氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該氨基酸為甘氨酸。
另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備血栓成像劑的可被放射性標(biāo)記的試劑，用來對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血栓進(jìn)行成像。它包括一種特異性結(jié)合化合物，它與血小板GP(IIb/IIIa)受體特異性結(jié)合而且與Tc-99m的復(fù)合部分(含一個(gè)單一的硫羥基)共價(jià)結(jié)合，其結(jié)構(gòu)式IIA-CZ(B)-{(C(R1R2)}n-X其中A為H、HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC或R4；B為H、SH或NHR3、-N(R3)-(氨基酸或肽)或R4；R1、R2、R3和R4各自為H或者直鏈、支鏈或環(huán)狀的低級(jí)烷基；n為0、1或2；其中(肽)為含有2～10個(gè)氨基酸的肽；而且(1)B為-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)時(shí)，X為SH和n為1或2；(2)X為NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)時(shí)，B為SH和n為1或2；(3)B為H或R4時(shí)，A為HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC，X為SH和n為0或1；(4)A為H或R4時(shí)，當(dāng)B為SH，則X為-NHR3、或-N(R3)-(氨基酸或肽)，和當(dāng)X為SH時(shí)則B為NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)；(5)X為H或R4時(shí)，A為HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B為SH；(6)Z為甲基時(shí)，X為甲基，A為HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B為SH以及n為0；(7)B為SH和X為SH時(shí)，n不為0；以及其中硫羥基部分為還原形式并其中氨基酸為任何不含硫羥基的初級(jí)α-或β-氨基酸。
在本發(fā)明這方面的一些具體實(shí)施方案中，放射性標(biāo)記的復(fù)合物的通式為IIa.-(氨基酸)1-(氨基酸)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}，IIb.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-x}-(氨基酸)1-(氨基酸)2，IIc.-(初級(jí)α，ω或β，ω-二氨基酸)-(氨基酸)1-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}，或IId.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(氨基酸)1-(初級(jí)α、β-或β、γ-二氨基酸)其中(氨基酸)1和(氨基酸)2各自為任何天然的、被修飾的、被取代的或被改變的不含硫羥基的α-或β-氨基酸；A為H、HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC或R4；B為H、SH或NHR3、-N(R3)-(氨基酸或肽)或R4；Z是H或R4；X為SH或NHR3，-N(R3)-(氨基酸或肽)或R4；R1、R2、R3和R4各自為H或者直鏈、支鏈或環(huán)狀的低級(jí)烷烴；n為整數(shù)，可為0、1或2；(肽)為含有2～10個(gè)氨基酸的肽；而且(1)B為-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)時(shí)，X為SH和n為1或2；(2)X為-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)時(shí)，B為SH和n為1或2；(3)B為H或R4時(shí)，A為HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和X為SH以及n為0或1；(4)A為H或R4時(shí)，當(dāng)B為SH則X為-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)以及當(dāng)X為SH時(shí)則B為-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)；(5)X為H或R4時(shí)，A為HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B為SH；(6)Z為-CH3時(shí)，X為-CH3，A為HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B為SH以及n為0；以及(7)B為SH時(shí)，X為SH和n不為0；其中硫羥基都為還原態(tài)形式。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備血栓成像劑的可被放射性標(biāo)記的試劑，用來對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血栓進(jìn)行成像。它包括一個(gè)特異性結(jié)合化合物，與血小板GPIIb/IIIa受體特異性結(jié)合而且與放射性標(biāo)記的復(fù)合部分共價(jià)結(jié)合。其通式III. -CO-(氨基酸) CO-特異性結(jié)合化合物(出于本發(fā)明的目的，放射性標(biāo)記的結(jié)合部分的結(jié)構(gòu)是指以吡啶甲酸(Pic)為基礎(chǔ)的部分)；IV.特異性結(jié)合化合物-HN (氨基酸)-NH-CH2 (出于本發(fā)明的目的，放射性標(biāo)記的結(jié)合部分的結(jié)構(gòu)是指以吡啶甲胺(Pica)為基礎(chǔ)的一些部分)；其中X為H或保護(hù)基；(氨基酸)為不含硫羥基的初級(jí)α-或β-氨基酸；放射性標(biāo)記的復(fù)合部分與特異性結(jié)合化合物共價(jià)結(jié)合，而且這種放射性標(biāo)記的復(fù)合部分與放射性標(biāo)記物都是電中性的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該氨基酸為甘氨酸，X為乙酰氨基甲基保護(hù)基團(tuán)。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性結(jié)合化合物通過一種氨基酸(最優(yōu)選甘氨酸)與放射性標(biāo)記的復(fù)合部分共價(jià)結(jié)合。
另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備血栓成像劑的可被放射性標(biāo)記的試劑，用來對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血栓進(jìn)行成像。它包括一個(gè)特異性結(jié)合化合物，該化合物與血小板受體GPIIb/IIIa特異性結(jié)合，而且與一個(gè)雙氨基雙硫羥基的放射性標(biāo)記的復(fù)合部分共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明這一實(shí)施方案中的這種雙氨基雙硫羥基部分是選自以下這組通式的結(jié)構(gòu) 其中每個(gè)R5分別為H、CH3或C2H5；每個(gè)(pgp)s分別為硫羥基保護(hù)基或H；m、n和p分別為2或3；A為直鏈或環(huán)狀的低級(jí)烷基、芳基、雜環(huán)基、或者它們的組合或取代的衍生物；X為特異性結(jié)合傾化合物。 其中每個(gè)R5分別為H、低級(jí)烷基(含1～6個(gè)碳)、苯基或者被低級(jí)烷基或烷氧基取代的苯基；m、n和p分別為1或2；A為直鏈或環(huán)狀的低級(jí)烷基、芳基、雜環(huán)基或者它們的組合或取代的衍生物；V為H或CO-(氨基酸或肽)；R6為H、(氨基酸)或肽或特異性結(jié)合的化合物；條件為如果V為H，則R6為氨基酸或肽或特異性結(jié)合的化合物；如果R6為H，則V為氨基酸或肽或特異性結(jié)合的化合物，其中(氨基酸)是任何一個(gè)不含硫羥基的初級(jí)α-或β-氨基酸。(出于本發(fā)明的目的，具有這些結(jié)構(gòu)的放射性標(biāo)記結(jié)合部分稱為“BAT”部分)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性結(jié)合化合物可通過一個(gè)氨基酸(優(yōu)選甘氨酸)與放射性標(biāo)記的復(fù)合部分共價(jià)結(jié)合。
在上述提及的一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性結(jié)合化合物為一個(gè)含有4～100個(gè)氨基酸的肽。該放射性標(biāo)記物最優(yōu)選的實(shí)例為锝-99m。
本發(fā)明提供的一些試劑可以制備成其中特異性結(jié)合化合物或放射性標(biāo)記的復(fù)合部分是與一個(gè)多價(jià)連接部分共價(jià)連接的形式。本發(fā)明中這種多價(jià)連接部分至少包括2個(gè)相同的連接官能團(tuán)，能夠與特異性結(jié)合化合物或標(biāo)記的復(fù)合部分共價(jià)結(jié)合。優(yōu)選的連接官能基團(tuán)為一級(jí)或二級(jí)胺、羥基、羧酸基或活潑的硫羥基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些多價(jià)連接部分包括二琥珀酰亞胺基甲基醚(BSME)、4-(2，2-二甲基乙?；?苯甲酸(DMAB)、三(琥珀酰亞胺基乙基)胺(TSEA)、三(乙酰氨基乙基)胺、二-(乙酰氨基乙基)醚、二-(乙酰氨基甲基)醚、N-{2-(N′，N′-二(2-琥珀酰亞胺基乙基)氨基乙基)}-N6，N9-二(2-甲基-2-巰丙基)-6，9-二氮雜壬酰胺(BAT-BS)、α，∈-二乙酰基賴氨酸、賴氨酸和1，8-二-乙酰氨基-3，6-二氧雜辛烷。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合肽是一個(gè)環(huán)肽，該環(huán)肽包含序列-Amp-Gly-Asp-；更優(yōu)選的是，特異性結(jié)合肽包括下式的環(huán)肽結(jié)構(gòu)域 其中A是親脂的D-α-氨基酸，或N-烷基-L-α-氨基酸或L-脯氨酸；X是含有能夠帶正電荷的側(cè)鏈的L-α-氨基酸；和R各自分別為H、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基烷基；進(jìn)一步優(yōu)選的是其中A是D-酪氨酸或D-苯丙氨酸，和X為L-(S-(3-氨基丙基)半胱氨酸或L-4-脒基苯丙氨酸。
本發(fā)明也包括閃爍照相成像劑，該成像劑是本發(fā)明的試劑與Tc-99m、111In和68Ga(優(yōu)選Tc-99m)的復(fù)合物。本發(fā)明也包括對(duì)本發(fā)明的該試劑進(jìn)行放射性標(biāo)記而得到這種閃爍照射成像劑的方法。本發(fā)明提供的用Tc-99m放射性標(biāo)記的復(fù)合物可通過本發(fā)明提供的-些試劑和Tc-99m在還原劑存在下進(jìn)行反應(yīng)而形成。優(yōu)選的還原劑包括(但不限于)連二亞硫酸根離子、二價(jià)錫離子和二價(jià)鐵離子。本發(fā)明的復(fù)合物也可以通過本發(fā)明提供的一些試劑與一個(gè)預(yù)還原的Tc-99m復(fù)合物進(jìn)行配體交換而形成。
本發(fā)明也提供了用于制備Tc-99m放射標(biāo)記的閃爍照相成像劑的試劑盒。這些試劑盒包括一個(gè)密閉的管形瓶，瓶內(nèi)放入預(yù)定量的本發(fā)明試劑和用Tc-99m對(duì)該試劑進(jìn)行放射性標(biāo)記的足夠量的還原劑。
本發(fā)明提供了肽的體外化學(xué)合成法來制備本發(fā)明的肽試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽是用固相肽合成法來合成的。
本發(fā)明提供了Tc-99m放射性標(biāo)記的閃爍照相成像劑的使用方法，通過體內(nèi)γ-射線閃爍照相來對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血栓進(jìn)行顯影。這種方法包括服用有效劑量的Tc-99m標(biāo)記的本發(fā)明試劑和監(jiān)測Tc-99m標(biāo)記物發(fā)射的γ射線從而確定哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血栓部位。
下面將對(duì)某些優(yōu)選的實(shí)施方案和權(quán)利要求進(jìn)行較為詳盡的描述，從中可使本發(fā)明中特別優(yōu)選的實(shí)施方案得以充分體現(xiàn)。
圖2說明了用本發(fā)明的Tc-99m放射標(biāo)記的肽對(duì)病人腓腸的深部靜脈血栓進(jìn)行閃爍照相成像的情況。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一些試劑，包括肽試劑，用來制備對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)血栓進(jìn)行成像的放射性標(biāo)記的血栓成像劑。這種試劑包括一個(gè)放射性標(biāo)記的結(jié)合部分，其與特異性結(jié)合化合物共價(jià)結(jié)合。該特異性結(jié)合化合物能與血小板受體GP IIb/IIIa相結(jié)合，從而能夠抑制血漿(含豐富的血小板)中的血小板的聚集。當(dāng)試劑濃度不超過1μM時(shí)，抑制率達(dá)50％即IC50＝1μM。出于本發(fā)明的目的，這種所謂血栓成像劑是指本發(fā)明的實(shí)施方案中包含的一種特異性結(jié)合化合物，該化合物是與放射性標(biāo)記的復(fù)合部分共價(jià)結(jié)合并用放射性核素(優(yōu)選Tc-99m、111In和68Ca，最優(yōu)選Tc-99m)經(jīng)過放射標(biāo)記的。
我們以前已發(fā)現(xiàn)，為了獲得最佳成像效果，本發(fā)明所公開的成像試劑必須能夠與血小板受體GPIIb/IIIa受體相結(jié)合而且具有高親合力，從而在標(biāo)準(zhǔn)測定法中(見實(shí)施例3)當(dāng)濃度達(dá)0.3μM時(shí)(IC50≤0.3μM)抑制了腺苷二磷酸(ADP)誘導(dǎo)的血小板的聚集作用。本發(fā)明在美國專利申請(qǐng)08/044,825和國際專利申請(qǐng)PCT/US94/03878中公開了。這兩者的公開文本在此均全面引用作參考。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，使用象本發(fā)明中所公開的IC50≤1μM的放射性標(biāo)記的閃爍照相成像劑能夠得到高質(zhì)量的體內(nèi)閃爍照相成像圖。
用Tc-99m標(biāo)記是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@個(gè)同位素的核和放射活性，能使它制得理想的閃爍照相成像劑。這個(gè)同位素具有140Kev的單光子能和6γ時(shí)的半衰期，而且很容易通過99Mo-99mTc發(fā)生器來制得。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，優(yōu)選的放射性核素(Tc-99m、Ga-67、In-111)與現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它核素(125I)相比都是無毒的。
本發(fā)明提出的Tc-99m復(fù)合部分和與這些部分共價(jià)結(jié)合的化合物包含一個(gè)與硫羥保護(hù)基{(pgp)s}共價(jià)結(jié)合的硫羥基。這些硫羥保護(hù)基可以是相同的或不相同，并且可以(但不限于)下列這些-CH2-芳基(芳基是苯基或者烷基或烷氧基取代的苯基)；-CH-(芳基)2，(芳基是苯基或者烷基或烷氧基取代的苯基)；-C-(芳基)3，(芳基是苯基或者烷基或烷氧基取代的苯基)；-CH2-(4-甲氧基苯基)；-CH-(4-吡啶基)(苯基)2；-C(CH3)3；-9-苯基芴基-CH2NHCOR(R是不取代的或取代的烷基或芳基)；-CH2-NHCOOR(R是非取代的或取代的烷基或芳基)；-CONHR(R是非取代的或取代的烷基或芳基)；-CH2-S-CH2-苯基優(yōu)選的保護(hù)基為-CH2-NHCOR，其中R是含1～8個(gè)碳原子的低級(jí)烷基、苯基或者低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)烷氧基、羧基或低級(jí)烷氧基羰基取代的苯基。最優(yōu)選的保護(hù)基為乙酰胺基甲基。
本發(fā)明每個(gè)特異性結(jié)合肽的實(shí)施方案含有一個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明中所稱的氨基酸傾向于包括所有的L-和D-、初級(jí)α-或β-氨基酸，天然的和非天然的。本發(fā)明提供的特異性結(jié)合肽其氨基酸序列如下所示但并不只限于此(下面肽中除了另外注明之外氨基酸均為L-氨基酸)CH2CO.YD.Apc.GDC GGGCH2CO.YD.Apc.GDC KGCH2CO.YD.Apc.GDC GGCH2CO.YD.Apc.GDCCH2CO.YD.Apc.GDC KCH2CO.YD.Amp.GDCCH2CO.YD.Amp.GDC K和O-(4-哌啶基)丁基酪氨酸。
本發(fā)明中特異性結(jié)合肽可以體外化學(xué)合成。而且在肽合成器上一般可以很方便地制得。在體外化學(xué)合成過程中，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)能合成本發(fā)明的肽，其中放射性標(biāo)記的結(jié)合部分與肽共價(jià)結(jié)合。特異共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)能確定，這是在合成過程中與特異性結(jié)合部分共價(jià)結(jié)合的這種肽的優(yōu)點(diǎn)。
在肽的合成期間，本發(fā)明的放射性標(biāo)記的結(jié)合部分可引入到特異性靶肽上。包含吡啶甲酸的{(Pic-)，如Pic-Gly-Cys(保護(hù)基)-}的放射性標(biāo)記復(fù)合部分可以通過作為在該合成中的最后一個(gè)殘基(即氨基端)而合成出來。另外，包含吡啶甲酸的放射性標(biāo)記的結(jié)合部分可以與賴氨酸的∈-氨基共價(jià)結(jié)合而得到。例如，αN(Fmoc)-Lys-∈N{Pic-Gly-Cys(保護(hù)基)}，它可位于肽鏈的任何部位。這一序列的優(yōu)點(diǎn)是提供了一個(gè)容易結(jié)合到靶肽中的模式。
同樣，包含吡啶甲胺(Pica)的放射性標(biāo)記的結(jié)合部分{-Cys(保護(hù)基)-Gly-Pica}，在肽合成期間，可以通過包含{-Cys(保護(hù)基)-Gly-}序列的肽鏈羧基端而合成出來。當(dāng)肽從該樹脂上解離后，該羧基端被活化了可與吡啶甲胺偶聯(lián)。這種合成路線要求活性的側(cè)鏈功能基必須被保護(hù)從而在連接吡啶甲胺時(shí)不參于反應(yīng)。
下面實(shí)例中提供了包含Pic-Gly-Cys和-Cys-Gly-Pica螯合劑的小分子合成肽的例子。本發(fā)明指出，事實(shí)上這些螯合物可以和任何能夠與體內(nèi)血栓特異性結(jié)合的肽相結(jié)合，結(jié)果產(chǎn)生了Tc-99m放射性標(biāo)記的肽，為中性復(fù)合物。
本發(fā)明也提供了一些與Tc-99m標(biāo)記的雙胺雙硫羥螯合劑(BAT)相結(jié)合的特異性結(jié)合的小分子合成肽。本發(fā)明指出，這些螯合劑可以與任何能夠和體內(nèi)血栓特異性結(jié)合的肽相結(jié)合，結(jié)果產(chǎn)生了一種Tc-99m放射性標(biāo)記的肽，為中性復(fù)合物。在下面實(shí)施例中提到了包含BAT螯合劑作為放射性標(biāo)記部分的合成性小分子肽的例子。
在形成本發(fā)明試劑的锝復(fù)合物過程中，該锝復(fù)合物(優(yōu)選高锝酸鹽)是在還原劑存在下與該試劑進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選的還原劑為連二亞硫酸根離子、亞錫離子和亞鐵離子；最優(yōu)選還原劑為氯化亞錫。合成這種復(fù)合物的方法是用一個(gè)試劑盒，它含一個(gè)密閉的管形瓶，瓶內(nèi)裝有預(yù)定量的要被標(biāo)記的本發(fā)明試劑和足夠量的還原劑，用Tc-99m對(duì)該試劑進(jìn)行標(biāo)記。另外，這種復(fù)合物也可以通過本發(fā)明的試劑與預(yù)先形成的锝復(fù)合物以及已知作為轉(zhuǎn)移配體的另一化合物一起進(jìn)行反應(yīng)而制得。這種過程就是配體交換過程，在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。這種標(biāo)記的復(fù)合物可以通過使用轉(zhuǎn)移配體(如酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽或甘露糖醇)來形成。本發(fā)明中有用的Tc-99m高锝酸鹽包括一些堿性金屬鹽如鈉鹽、胺鹽或低級(jí)烷基胺鹽。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了制備锝標(biāo)記的試劑的試劑盒。將適量試劑置入管形瓶里，瓶中含足夠量的還原劑(如氯化亞錫)以便用Tc-99m對(duì)該試劑進(jìn)行標(biāo)記；還包括適量的上述轉(zhuǎn)移配體(如酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽或甘露糖醇)；以及一些傳統(tǒng)的藥用佐劑；如調(diào)節(jié)滲透壓的藥用鹽、緩沖劑和防腐劑等類似物。該試劑盒中的組分可以為液體狀態(tài)、冷凍狀態(tài)或干燥狀態(tài)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒的這些組分為冷凍干燥的形式。
本發(fā)明的放射性標(biāo)記的血栓成像試劑在下邊實(shí)例4所描述的那樣，可以這樣合成出來在一個(gè)管形瓶里加入適量Tc-99m和Tc-99m復(fù)合物，然后在合適的反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)。
本發(fā)明提供的放射性標(biāo)記的閃爍照相成像劑具有合適量的放射性。在形成Tc-99m放射性復(fù)合物時(shí)，溶液的放射活性濃度一般優(yōu)選在0.01mCi/mL～100mCi/mL之間。
本發(fā)明提供的血栓成像劑在被Tc-99m標(biāo)記之后可用來對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血栓進(jìn)行成像。根據(jù)本發(fā)明，Tc-99m標(biāo)記的試劑的給藥量為注射一個(gè)單位劑量。本發(fā)明中提供的Tc-99m標(biāo)記的試劑可以通過任何一種傳統(tǒng)的靜脈注射介質(zhì)(如鹽水或血漿)來進(jìn)行靜脈注射。一般來說，給藥的單位劑量的放射活性約0.01mCi～約100mCi，優(yōu)選的放射活性范圍為1mCi～20mCi。每單位劑量注射的溶液約0.01mL～10mL。靜脈注射給藥后幾分鐘便能進(jìn)行體內(nèi)血栓成像。不過，如果需要的話，在放射性標(biāo)記的肽試劑被注入病人體內(nèi)之后可在1小時(shí)或更長時(shí)間之后進(jìn)行血栓成像。在大多數(shù)情況下，將所注射的足夠劑量的藥在特定區(qū)域累積起來，然后在約0.1小時(shí)內(nèi)成像并拍攝一些閃爍照相圖片。根據(jù)本發(fā)明，為了診斷的目的，任何傳統(tǒng)的閃爍照相成像的方法都可以使用。
相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員也認(rèn)識(shí)到，血栓通常在動(dòng)脈硬化斑塊中出現(xiàn)；整合受體(可與本發(fā)明中的閃爍照相試劑相結(jié)合)可在某些腫瘤中出現(xiàn)；另外，這種整合受體在感染部位，與伴隨或刺激白細(xì)胞定位的細(xì)胞粘連過程有關(guān)。由此認(rèn)識(shí)到，閃爍照相成像劑作為一種成像劑還具備另一個(gè)用途，即用來成像GPIIb/IIIa受體的表達(dá)部位，包括動(dòng)脈硬化斑塊、腫瘤和感染部位。
在下述的實(shí)例中將更全面地說明制備和標(biāo)記這些復(fù)合物的方法。這些實(shí)例對(duì)上述方法及其有用結(jié)果的某些方面進(jìn)行了說明。這些實(shí)施例是舉例而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例1固相肽合成法固相肽合成(SPPS)的合成量為0.25毫摩爾(mmol)，合成儀為“應(yīng)用性生物系統(tǒng)模型431A肽合成儀”，用9-芴基甲氧基羰?；?Fmoc)進(jìn)行氨基-端保護(hù)，與雙環(huán)己基碳化二酰亞胺/羥基苯并三唑或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/羥基苯并三唑(HBTV/HOBT)進(jìn)行偶聯(lián)，然后加入鄰-羥基甲基苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)樹脂與C-端羧酸結(jié)合，或用Rink酰胺樹脂與C-端酰胺結(jié)合。連接樹脂的產(chǎn)物用一種溶液將其脫開，該溶液組成為三氟乙酸或50/50三氯乙酸/二氯甲烷，含或不含水、苯硫基甲烷、乙二硫醇、和三乙基硅烷，它們的比例為100/5/5/2.5/2，室溫下進(jìn)行，時(shí)間為1.5～3小時(shí)。
條件合適的話，在N-端引入乙?；?。其方法是用20％v/v乙酸酐在NMP(N-甲基吡咯烷基二壬烷酮)中對(duì)結(jié)合在樹脂上的肽的N-端游離的氨基進(jìn)行處理，時(shí)間為30分鐘。在SPPS過程中制備支鏈肽涉及到從賴氨酸的α-和∈-氨基(Nα(Fmoc)Nε(Fmoc)-賴氨酸)開始的肽鏈合成。條件合適的話，可引入2-氯乙?；?-溴乙酰基，在SPPS合成過程中，使用合適的2-鹵代乙酸作為最后一個(gè)殘基被偶聯(lián)上；或?qū)Y(jié)合在樹脂上的N端游離氨基用2-鹵代乙酸/二異丙基碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺或2-鹵代乙酸酐/二異丙基乙基胺在NMP中進(jìn)行處理。條件合適的話，對(duì)HPLC純化的2-鹵代乙?；碾倪M(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。溶液濃度為0.1～1.0mg/mL，pH＝8，含或不含磷酸鹽、碳酸氫鹽或0.5～1.0mM的EDTA，攪拌0.5～48小時(shí)，然后用乙酸酸化，冷凍干燥和HPLC純化。條件合適的話，Cys-Cys二硫鍵進(jìn)行環(huán)合。用等分的0.006M K3Fe(CN)6溶液對(duì)前體半胱氨酸游離的巰基肽進(jìn)行處理，直至有穩(wěn)定的黃色沉淀析出來。溶液濃度為0.1mg/mL，緩沖體系pH＝7。過量的氧化劑用過量的半胱氨酸進(jìn)行還原處理，所得混合物進(jìn)行冷凍干燥和HPLC純化。
條件合適的話，將肽上的巰基氯乙?；苌闪蛎?。其方法是用含單一巰基的肽，在濃度為2～50mg/mL、溶劑為水/乙腈或THF或DMF，pH＝10條件下，與適量(例如0.5mol當(dāng)量制備二聚物，0.33mol當(dāng)量制備三聚物)的氯乙酰基多價(jià)連接物進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間為0.5～24小時(shí)。然后用乙酸進(jìn)行中和，蒸干，而且如果需要的話，用10mL TFA和0.2mL三乙基硅烷凈化劑進(jìn)行脫保護(hù)，時(shí)間為30～90分鐘。溶液濃縮后用乙醚重結(jié)晶，所得產(chǎn)品用制備型HPLC純化。
條件合適的話，制備BSME加成物。方法是用含單一巰基的肽(在50mM磷酸鈉緩沖液中的5～50mg/mL濃度，pH7～8)與在乙腈中預(yù)溶解的0.5mol當(dāng)量的BMME(雙-馬來酰亞胺甲基醚)在室溫下進(jìn)行1～18小時(shí)反應(yīng)。然后將溶液濃縮并用HPLC純化產(chǎn)品。
條件合適的話，制備TSEA加成物。用含單一巰基的肽(在DMF中的濃度為10～100mg/mL或在50mM的磷酸鈉(pH8/乙腈或THF中的濃度為5～50mg/mL)，與在乙腈或DMF中預(yù)溶解的0.33mol等當(dāng)量的THFA(三(2-馬來酰亞胺基)胺；如美國專利08/044,825所公開的那樣，參考文獻(xiàn)中引用)進(jìn)行反應(yīng)，加或不加1mol等當(dāng)量的三乙醇胺，室溫?cái)嚢杓s1～18小時(shí)，所得的包含加成物的反應(yīng)混合物進(jìn)行濃縮然后用HPLC進(jìn)行純化。
條件合適的話，制備BAT-BS加合物。用含單一巰基的肽(在50mM磷酸鈉(pH8)/乙腈或THF中的濃度為2～50mg/mL)和在乙腈或THF中預(yù)溶解的0.5mol等當(dāng)量的BAT-BM(N-{2-(N′，N′-二(2-馬來酰亞胺基-乙基)氨基乙基)}-N9-(叔-丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基巰基丙基)-6，9-二氮壬烷酰胺；如美國專利08/044,825所公開的那樣，參考文獻(xiàn)中引用)進(jìn)行反應(yīng)，室溫?cái)嚢杓s1～18小時(shí)，溶液蒸干，用10mLTFA和0.2mL三乙基硅烷對(duì)(BAT-BS)-肽軛合物進(jìn)行1小時(shí)脫保護(hù)處理，溶液濃縮，產(chǎn)品用乙醚重結(jié)晶，然后用HPLC純化。
肽的粗產(chǎn)品用制備型高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行純化。使用的柱子為一個(gè)Waters Dalta Pak C18的柱子，用0.1％三氟乙酸水溶液(用乙腈進(jìn)行極性改變)進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液蒸去乙腈，然后冷凍干燥。每一個(gè)產(chǎn)品用快原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)和電子散射質(zhì)譜(ESMS)進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例2用Tc-99m標(biāo)記的一般方法在實(shí)施例2中，0.1mg肽試劑樣品溶于0.1mL水中或50mM的磷酸鉀緩沖液或0.1M的碳酸氫鈉緩沖液中或10％羥基丙基環(huán)糊精(HPLD)中。每一種緩沖液pH值為5～10。組建一個(gè)Glucoscan管形瓶(E.I.Dupont deNemours，Inc.，Wilmington，DE)來制備Tc-99m萄糖酸鹽。其方法是管形瓶內(nèi)加入1.0mL Tc-99m高锝酸鈉(放射活性達(dá)200mCi)，然后室溫靜置15分鐘。25μL的Tc-99m葡糖酸鹽加入到肽試劑中，反應(yīng)溫度為室溫或100℃，時(shí)間為5～30分鐘，然后用0.2μm濾器進(jìn)行過濾。
Tc-99m標(biāo)記的肽的純度由HPLC的使用條件決定。其使用條件一個(gè)Waters Deltapure RP-18，5μ，150mm×1.9mm的分析柱，裝載每一個(gè)放射性標(biāo)記的肽；洗脫時(shí)溶劑流動(dòng)速度為1mL/min；進(jìn)行梯度洗脫，溶劑從10％溶劑A(0.1％ CF3COOH/H2O)到40％溶劑B90(0.1％ CF3COOH/90％CH3CN/H2O)整個(gè)洗脫時(shí)間為20分鐘。
Tc-99m標(biāo)記的肽的純度由HPLC的使用條件(見表1附注)決定。放射性組分通過連有積分記錄儀的連機(jī)放射性檢測器進(jìn)行檢測。在這些條件下，Tc-99m葡糖酸鹽和Tc-99m高锝酸鹽在1～4分鐘之間被洗脫下來，而放射性標(biāo)記的肽被洗脫下來的時(shí)間長得多。
下表介紹了根據(jù)實(shí)施例1所描述的方法來制備Tc-99m標(biāo)記肽的一些成功的例子。
表1
*角標(biāo)是指如下一些標(biāo)記條件1、將肽溶解在50毫摩爾磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中并在室溫下標(biāo)記。
2、將肽溶解在50毫摩爾磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中并在100℃下標(biāo)記。
3、將肽溶解在水中并在室溫下標(biāo)記。
4、將肽溶解在水中并在100℃下標(biāo)記。
5、將肽溶解在50毫摩爾磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中并在100℃下標(biāo)記。
6、將肽溶解在50毫摩爾磷酸鉀緩沖液(pH5.0)中并在室溫下標(biāo)記。
7、將肽溶解在50∶50的乙醇/水的混合液中并在100℃下標(biāo)記。
8、將肽溶解在0.9％的氯化鈉溶液中并在室溫下標(biāo)記。
**HPLC方法一般方法溶劑A ＝0.1％CF3COOH/H2O溶劑B70＝0.1％CF3COOH/70％CH3CN/H2O溶劑B90＝0.1％CF3COOH/90％CH3CN/H2O溶劑流速＝1毫升/分鐘Vydak柱＝帶有防護(hù)柱的Vydak218TP54RP-18，5μ×220毫米×4.6毫米分析柱Brownlee柱＝Brownlee Seri-5 RP-18，5μ×220毫米×4.6毫米分析柱Waters柱＝Waters Delta-Pak C18.5微米，150毫米×39毫米分析柱Waters 2柱＝Waters Nova-Pak C18.5微米，100毫米×8毫米徑向壓縮柱方法1Brownlee柱100％A至100％B70，10分鐘方法2Vydak柱 100％A至100％B90，10分鐘方法3Vydak柱 100％A至100％B70，10分鐘方法4Waters柱 100％A至100％B90，10分鐘方法5Waters柱 100％A至100％B90，10分鐘方法6Waters 2柱100％A至100％B90，10分鐘***用十二烷磺酸鈉聚乙酰胺凝膠電泳分析法進(jìn)行鑒定氨基酸單字母縮寫見G.Zubay，Biochemistry(2d.ed.)，1988(MacMillen Publishing；NewYork)P.33；劃線表明在被連結(jié)的取代氨基酸之間的硫羥鍵的形成，肽通過每一個(gè)肽中的未保護(hù)的半胱氨酸殘基的游離巰基與BSH、ETAC、BSME、TSEA、(BAT-Bs)或包含(CH2CO)-的連接物相結(jié)合；AC＝乙?；籅Z＝苯甲?；籔ic＝甲代吡啶基(吡啶-2-羰基)；Acm＝乙酰氨基甲基；Mob＝4-甲氧基芐基；Apc＝L-(S-(3-氨基丙基)半胱氨酸)；Hly＝高賴氨酸；FD＝D-苯基丙氨基酸；YD＝D-酪氨酸；ma＝2-巰基乙酸；mmp＝2-巰基-2-甲基丙酸；BAT＝N6，N9-二(2-巰基-2-甲基丙基)-6，9-二氮壬酸；ETAC＝4-(O-CH2CO-Gly-Gly-Cys。酰胺基)乙酰苯基丙酮；BAT-BS＝N-{2-N′，N′-二(2-琥珀酰亞胺基乙基)氨基乙基}-N5，N9-二(2-巰基-2-甲基丙基)-6，9-二氮壬雜酰胺；BSME＝二-琥珀酰亞胺基甲基醚；TSEA＝三-(2-琥珀酰亞胺基乙基)胺；NES＝N-乙基琥珀酰亞胺；BSH＝1，6-二-琥珀酰亞胺基己烷；Amp＝4-脒基苯基丙氨酸。a＝由電子散射質(zhì)譜(ESMS)進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例3血小板聚集抑制試驗(yàn)血小板聚集作用的研究基本上是按照Zucker(1989，Memods in Enzymol.169117-133)所描述的方法開展的。大體上，血小板凝集抑制試驗(yàn)是用人的新鮮血小板富集的血漿(含300,000血小板/毫升)加入或不加入一般公認(rèn)的抑制血小板凝集的化合物進(jìn)行的。加入二磷酸腺苷溶液(直至最終濃度為10～15mmol)可誘導(dǎo)血小板凝集作用，可由Bio/Data凝集儀(Bio/Data Corp.，Horsham，PA)檢測控制。血小板聚集作用抑制劑的濃度范圍從0.1～500μg/mL。血小板凝集作用降低50％時(shí)所需的抑制劑濃度(定義為IC50)可在“抑制劑的濃度-血小板凝集程度”曲線圖上測出。RGDS多肽的抑制曲線可通過每一批血小板試驗(yàn)繪出。
這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表II。在表II中，試驗(yàn)的化合物如下(RGDS為陽性對(duì)照)P47 ＝AcSYGRGDVRGDFKCAcmGCAcmP97 ＝GRGDVRGDFKCAcmGCAcm酰胺P32 ＝CAcmGCAcmRRRRRRRRRGDVP143 ＝CH2CO-YDRGDCGGCAcmGCAcm酰胺P245 ＝CH2CO-YD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGFDPRPG酰胺P63 ＝AcSYGRGDVRGDFKCTCCAP98 ＝GRDGVRGDFCAcmGCAcm酰胺P81 ＝CH2CO-YDRGDCCAcmGCAcm酰胺P154 ＝CH2CO-YDApcGDCGGGCAcmGCAcm酰胺P381 ＝(CH2CO-YDApcGDCKGCAcmGCAcmGGC-酰胺)2-BSMEP317 ＝(CH2CO-YDApcGDCGGCAcmGCAcmGGC-酰胺)3-TSEAP246 ＝CH2CO-YDApcGDCGGCAcmGCAcmGGC-酰胺P357 ＝(CH2CO-YDApcGDCGGCAcmGCAcmGGC-酰胺)2-(BAT-BS)P667 ＝(CH2COYD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGC酰胺)2(CH2CO)2K(N∈-K)GC酰胺P747 ＝(CH2COYD.Amp.GDCGGCAcmGCAcmGGC酰胺)2(CH2CO)2K(N∈-K)GC酰胺P748 ＝(CH2COYD.Amp.GDCKGCG酰胺)2(CH2CO)2K(N∈-K)GC酰胺(氨基酸的單字母縮寫見G.Zubay，Biochemistry(2d，ed.)，1988(MacMillen Publishing；New Yrok)P.33；AC＝乙?；?；Acm＝乙酰胺基甲基；Apc＝L-(S-(3-氨基丙基)半胱氨酸；YD＝D-酪氨酸；BSME＝雙-琥珀酰亞胺基甲基醚；TSEA＝三-(琥珀酰亞胺基乙基)胺；(BAT-BS)＝N-{2-(N′，N′-二(2-琥珀酰亞胺基乙基)氨基乙基}-N6，N9-二(2-甲基-2-巰基丙基)-6，9-二氮雜壬酰胺；多肽通過每一個(gè)肽中的未保護(hù)半胱氨酸殘基的游離巰基與BSME、TSEA、(BAT-BS)或者包含(CH2CO)-的連接物相結(jié)合。(…)2K代表括弧部分與賴氨酸的每個(gè)氨基(即α-氨基和側(cè)鏈氨基)之間的共價(jià)結(jié)合。(Nε-K)代表賴氨酸殘基的∈-氨基上而不是通常所指的α-氨基上的共價(jià)結(jié)合。
表II
1n＝1；2n＝2；2n＝3；4n＝4；5n＝9*對(duì)DVT犬模型注射每一種Tc-99m標(biāo)記的試劑，約4小時(shí)后的(股靜脈血栓中的注射劑量的百分?jǐn)?shù)％)/(血液中注射劑劑量的百分?jǐn)?shù)％)的比例。**在腺苷二磷酸(ADP)誘導(dǎo)下，人的血漿(富含血小板)中血小板的聚集作用降低50％時(shí)的試劑濃度。
這些結(jié)果表明作為閃爍照相成像劑，IC50≤約1μM的化合物比IC50約大于1μM的化合物更有效。
實(shí)施例4
體內(nèi)深部靜脈血栓閃爍照相成像已開展的一系列實(shí)驗(yàn)包括了對(duì)本發(fā)明中的閃爍照相成像劑中一個(gè)具體實(shí)例(P280)進(jìn)行試驗(yàn)性的臨床研究。P280化學(xué)結(jié)構(gòu)(CH2CO.YDApc GDC GGCAcmGCAcmGGC.酰胺)2-BSME這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)選用了9個(gè)病人(男6人，女3人)，年齡30～60歲，體重63～100Kg。每一個(gè)病人都呈現(xiàn)深度靜脈血栓的臨床病癥，而且經(jīng)過體檢，超聲波檢查和/或與之相對(duì)照的靜脈造影術(shù)的診斷確證。
供研究的每一個(gè)病人，均給以靜脈注射時(shí)約含0.25mg多肽的10-20mCiTc-99m標(biāo)記的P280。4小時(shí)后，用一個(gè)裝有高分辨的準(zhǔn)直管的廣角γ照相機(jī)進(jìn)行閃爍照相顯影。γ照相顯影在注射的同時(shí)便開始進(jìn)行。注射后1小時(shí)，2小時(shí)和4小時(shí)，先后獲得一些顯影圖片。
這些研究的結(jié)果在

圖1和圖2中給以顯示了。圖1顯示了大腿下部血管中的血栓部位，圖2顯示了小腿血管中的血栓的部位。在每一個(gè)圖中，血栓定位部位用一個(gè)箭頭標(biāo)示出來了。除了迅速有效地顯示深部靜脈血栓的部位外。這些閃爍照相成像劑還可以迅速地從血液中清除掉，從而使得血循環(huán)中的殘留劑量約低于10％的注射劑量。與動(dòng)物研究相一致的是，至少有60-70％的注射劑量被腎臟清除掉了。血栓成像在注射后15～30分鐘就已很明顯，并在注射后4～24小時(shí)仍保持一定的可見度。與深部靜脈血栓臨床診斷密切相關(guān)的血栓造影術(shù)在上述提及的傳統(tǒng)臨床診斷方法基礎(chǔ)上做出，供研究的9個(gè)病人中8個(gè)病人的血栓顯影效果很好。那個(gè)未能被顯影的病人其血栓臨床表現(xiàn)期較長(42天)，這種血栓很可能已靜止，從而使得血小板在其表面不能再周轉(zhuǎn)。最后，在這些病人中均未發(fā)現(xiàn)Tc-99m標(biāo)記的P280有毒性或其它不良反應(yīng)。
這些結(jié)果表明，本發(fā)明中的這種閃爍照相成像劑代表了一種用于人體內(nèi)深部靜脈血栓顯影的安全而有效的診斷試劑。
應(yīng)該指出的是，前面所陳述的重點(diǎn)在于本發(fā)明中某些特定的具體實(shí)施方案；另外，所有被改進(jìn)的或改換的類似物均屬本發(fā)明范圍之內(nèi)，如下邊所附的權(quán)利要求中所陳述的那樣。
權(quán)利要求
1.一種化合物，包括一個(gè)環(huán)肽，其分子量低于10,000道爾頓，并與血小板糖蛋白IIb/IIIa受體相結(jié)合且能抑制人的富含血小板血漿中血小板的聚集作用，當(dāng)濃度大于0.3μM至1μM時(shí)，其抑制率為50％(IC50)，其中該環(huán)肽包含序列-Amp-Gly-Asp-。
2.一種權(quán)利要求1的化合物，其中所述環(huán)肽包含通式 其中 A為親脂的D-α-氨基酸，或N-烷基-L-α-氨基酸或L-脯氨酸；和每一個(gè)R分別為H、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基烷基。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中所述環(huán)肽的結(jié)構(gòu)式為CH，CO.YD.Amp.GDC或CH，CO.YD.Amp.GDCK.
4.權(quán)利要求3的化合物，其還包括O-(4-哌啶基)丁基酪氨酸。
5.一種化合物，結(jié)構(gòu)式為CH2CO-YDAmpGDCKGCG酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血栓成像用的放射性標(biāo)記化合物，包括一個(gè)環(huán)肽，其分子量低于10,000道爾頓，并與血小板糖蛋白IIb/IIIa受體相結(jié)合且能抑制人的富含血小板血漿中血小板的聚集作用，當(dāng)濃度大于0.3μm至1μm時(shí)，其抑制率為50％(IC
文檔編號(hào)C07K7/08GK1401661SQ0212228
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期1995年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月3日
發(fā)明者理查德·T·迪安, 約翰·利斯特-詹姆斯, 埃德加·R·西維特羅, 威廉·麥克布萊德 申請(qǐng)人:迪亞太德公司