專利名稱：具有抗病毒、抗癌活性的氨基糖肽類新化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一系列新的氨基糖肽類抗生素和其藥學(xué)上可接受的酸的鹽；本發(fā)明也涉及這一系列新化合物的制備方法及生產(chǎn)方法；本發(fā)明還涉及這一系列化合物在制造抗病毒、抗腫瘤藥物上的用途。
該系列新化合物屬水溶性氨基糖肽類化合物，為博萊霉素族抗生素中博萊霉素A5和博萊霉素A6的衍生物。已知的博萊霉素族抗生素是日本科學(xué)家Umezawa及其合作者于1966年從輪枝鏈霉菌發(fā)酵液中首次分離得到的，博萊霉素族的抗生素大多具有抗腫瘤活性。大量研究表明該類化合物具有的斷裂DNA，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的作用是其具有抗腫瘤活性的關(guān)鍵。該類抗生素中，首先應(yīng)用于臨床的是博萊霉素(Blenoxan，布蘭諾克塞，以A2、B2為主)，在臨床上對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌、惡性淋巴癌、頭頸癌等具有優(yōu)良的治療效果。隨后相繼用于臨床的還有日本的匹萊霉素(Pepleomycin，PEP)和我國(guó)的平陽(yáng)霉素(博萊霉素A5)。目前在我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的還有博安霉素(博萊霉素A6)。許鴻章等1999年就發(fā)酵得到的博萊霉素A6的衍生物博寧(bonin)已申請(qǐng)了中國(guó)專利(CN 1231340)，據(jù)報(bào)道有較低的毒副作用。博萊霉素族抗生素具有如下結(jié)構(gòu) 其中主要組分的R基團(tuán)分別為A1-NH(CH2)3S(O)CH3A2-NH(CH2)3S(CH3)2A5-NH(CH2)3NH(CH2)4NH2A6-NH(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2B2-NH(CH2)4NHC(＝NH)NH2B4-NH(CH2)4NH(CH2)4NHC(＝NH)NH2博寧-NH(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCOCH3近年又有報(bào)道，博萊霉素類化合物還具有抗病毒活性，特別是具有抗HIV病毒活性引起了人們極大興趣。N.A.Georgioa等報(bào)道(Inter.J.of Antimicro.Agents，18，(2001)513-518)博萊霉素與抗HIV藥物AZT等合用，可極大提高治療效果，降低治療成本，有可能成為新抗病毒藥物或成為HIV藥物組合治療方案用藥組分之一。然而博萊霉素類化合物作用機(jī)理為斷裂DNA、從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，主要為細(xì)胞毒作用，藥物作用的特異選擇性不強(qiáng)，毒副作用較大，特別是它的肺毒性，能導(dǎo)致不可逆的肺纖維化，限制了博萊霉素類化合物的應(yīng)用。因此提高該類化合物的治療效果，降低毒副作用，拓寬其應(yīng)用范圍具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
自從博萊霉素發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者及研究機(jī)構(gòu)就從各方面對(duì)博萊霉素進(jìn)行了廣泛的研究，其中包括博萊霉素類化合物結(jié)構(gòu)研究、藥理研究、代謝研究、構(gòu)效關(guān)系研究、作用機(jī)理研究、分子識(shí)別及靶向特異性研究等基礎(chǔ)研究和大量的以博萊酶素為先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造研究。然而對(duì)博萊霉素結(jié)構(gòu)改造主要基于發(fā)酵的方法，由于博萊酶素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，采用合成的方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造非常困難，研究的人較少，且合成過(guò)程復(fù)雜，工業(yè)前景黯淡。因此，目前國(guó)內(nèi)外臨床上應(yīng)用的這類化合物均是采用微生物發(fā)酵得來(lái)的，發(fā)酵采用的是鏈霉菌屬厭氧微生物及其變種。微生物發(fā)酵的方法涉及到菌種的提取、優(yōu)化、保持等，同時(shí)不同的鏈霉菌屬變種對(duì)不同的博萊霉素化合物其發(fā)酵單位不同；另外得到的發(fā)酵產(chǎn)物組成復(fù)雜，含量低，分離、提取、純化產(chǎn)物困難。采用發(fā)酵的辦法對(duì)博萊霉素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，特別是對(duì)博萊霉素進(jìn)行專一性結(jié)構(gòu)改造尤為困難，同時(shí)受發(fā)酵條件的影響結(jié)構(gòu)改造的范圍也受到很大限制。基于上述原因，嚴(yán)重限制了博萊霉素新衍生物出現(xiàn)的速度，影響了更為有效、安全的博萊霉素類藥物的出現(xiàn)。要解決這一問(wèn)題，尋找簡(jiǎn)便易行的化學(xué)合成方法來(lái)對(duì)博萊霉素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造無(wú)疑是理想的選擇。
本發(fā)明的目的是利用化學(xué)合成的方法制備一系列新的氨基糖肽類抗生素(博萊霉素A5、A6新衍生物)，該類化合物具有較好的抗病毒、抗腫瘤活性和較低的毒副作用，特別是具有優(yōu)良的抗HIV活性。本發(fā)明的合成方法具有操作簡(jiǎn)單，原料易得的特點(diǎn)，具有良好的工業(yè)化前景。
本發(fā)明確切地講涉及式(I)的化合物和式(II)的化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸的鹽。 式(I) 式(II)其中R1、R2所代表的基團(tuán)為氫原子或COR3，R1、R2代表的基團(tuán)可以相同也可以不同，但至少有一個(gè)為COR3。
其中R3代表氫原子、烴基、烷氧基、芳基、環(huán)烷烴基、雜環(huán)基、胍基烴基、氨基烴基等的一種或幾種基團(tuán)(對(duì)于式(II)，當(dāng)R2＝H時(shí)，R3≠CH3)。
以上所代表的化合物及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽等。
——“烴基”被定義為直鏈或支鏈的飽和或不飽和的基團(tuán)，環(huán)狀和非環(huán)狀基團(tuán)，芳香和非芳香基團(tuán)，雜環(huán)和非雜環(huán)基團(tuán)；——“烷氧基”被定義為各烴基部分可以是直鏈或支鏈的基團(tuán)，可以是飽和或不飽和的烴基，也可以是含芳基、雜環(huán)、環(huán)烷基的烴基；——“芳基”被定義為苯基、萘基，各自任選地被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代，取代基選自鹵素、羥基、氰基、硝基，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基、氨基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基氨基；——“環(huán)烷基”被定義為連接有飽和或不飽和直鏈或支鏈烷基側(cè)鏈的飽和或不飽和的環(huán)狀烷基，和不含側(cè)鏈的環(huán)狀烷基。在這里環(huán)狀烷基包括飽和和不飽和的環(huán)狀烷基，環(huán)的大小是指三元環(huán)、四元環(huán)、五元環(huán)、六元環(huán)等。
——“雜環(huán)基”被定義為飽和或不飽和的單一或二環(huán)基團(tuán)，具有芳族和非芳族特征，具有5至12個(gè)環(huán)原子，含有1-3個(gè)相同或不同的雜原子，雜原子可以是氧、氮和硫中的一種或幾種。雜環(huán)同時(shí)被理解為可以任意的被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的取代基取代，取代基可以是鹵素、羥基、直鏈或支鏈(C1-C6)烴基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧烴基、硝基和氨基(任意被一個(gè)或兩個(gè)直鏈或支鏈(C1-C6)烴基取代)。
在雜環(huán)中，可以象征性而不加任何限制地提到吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、4-H-吡喃4-酮、吡嗪基、嘧啶基、異惡唑基、四唑基、吡咯基、吡唑基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，2，3-噻二唑基……。
——“胍基烴基”定義為烴基基團(tuán)的末端含有胍基，胍基的數(shù)量可以是1-3個(gè)，烴基的含義如前面所定義。
——“氨基烴基”定義為烴基基團(tuán)的末端或中間碳上連有氨基，連有氨基的數(shù)量可以是1-5個(gè)，所連接氨基上的氫可以任意被一個(gè)或兩個(gè)直鏈或支鏈(C1-C6)烴基。烴基的含義如前面所定義。
在藥學(xué)上可接受的酸的鹽是指鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸、碳酸等無(wú)機(jī)酸和甲酸、乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、酒石酸以及葡萄糖酸等有機(jī)酸形成的鹽。
作為一種優(yōu)化，本發(fā)明涉及的取代基團(tuán)變化為R2＝H，R1＝COR3，R3代表氫原子、C1-C6的直鏈烷基和烯基、C1-C10的支鏈烷基和烯基。
作為一種優(yōu)化，本發(fā)明涉及的取代基團(tuán)變化為R2＝H，R1＝COR3，R3代表-R4O5，這里R4和R5分別代表C1-C6的直鏈烷基和烯基、C1-C10的支鏈烷基和烯基、苯和取代苯基、雜環(huán)和取代雜環(huán)基。R4和R5可以相同也可以不同。
作為一種優(yōu)化，本發(fā)明涉及的取代基團(tuán)變化為R2＝H，R1＝COR3，R3代表苯基和取代苯基、萘基和取代萘基等芳香基團(tuán)，取代基位置可以是芳環(huán)上任意位置，取代基的個(gè)數(shù)為1-4，取代基的種類包括鹵素、羥基、氰基、硝基，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、直鏈或支鏈烷氧基(C1-C6)、氨基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基氨基等，多個(gè)取代基可以相同也可以不同。
作為一種優(yōu)化，本發(fā)明涉及的取代基團(tuán)變化為R2＝H，R1＝COR3，R3代表連接有(C1-C6)的飽和或不飽和直鏈或支鏈烴基側(cè)鏈的飽和或不飽和的環(huán)狀烴基，和不含側(cè)鏈的環(huán)狀烴基。在這里環(huán)狀烴基的大小是指三元環(huán)、四元環(huán)、五元環(huán)、六元環(huán)等，環(huán)的個(gè)數(shù)為1-3。
作為一種優(yōu)化，本發(fā)明涉及的取代基團(tuán)變化為R2＝H，R1＝COR3，R3代表雜環(huán)基，雜環(huán)基為飽和或不飽和的單一或二環(huán)基團(tuán)，具有芳族和非芳族特征，具有4至12個(gè)環(huán)原子，含有1-3個(gè)相同或不同的雜原子，雜原子可以是氧、氮和硫中的一種或幾種。雜環(huán)可以是帶有和不帶有取代基的雜環(huán)，取代基可以是一個(gè)或多個(gè)相同或不同的取代基，取代基可以是鹵素、羥基、直鏈或支鏈(C1-C6)烴基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧烴基、硝基、氧代和氨基(任意被一個(gè)或兩個(gè)直鏈或支鏈(C1-C6)烴基取代)等。
作為一種優(yōu)化，本發(fā)明涉及的取代基團(tuán)變化為R2＝H，R1＝COR3，R3代表基團(tuán)的末端含有胍基的烴基基團(tuán)，胍基的數(shù)量可以是1-3個(gè)，烴基可以是C1-C6的直鏈或支鏈烷基和烯基、C1-C6直鏈或支鏈的烷氧基、C1-C6直鏈或支鏈的氨基烷基、含苯基和取代苯基取代基以及含雜環(huán)和取代雜環(huán)取代基的C1-C6的直鏈或支鏈烷基和烯基。
作為一種優(yōu)化，本發(fā)明涉及的取代基團(tuán)變化為R2＝H，R1＝COR3，R3代表末端或中間碳上連有氨基的烴基基團(tuán)，連有氨基的數(shù)量可以是1-5個(gè)，所連接氨基上的氫可以任意被一個(gè)或兩個(gè)C1-C6的直鏈或支鏈的烴基取代，也可以不取代，連接氨基的烴基基團(tuán)可以是C1-C6的直鏈或支鏈烷基和烯基、C1-C6直鏈或支鏈的烷氧基、含苯基和取代苯基取代基以及含雜環(huán)和取代雜環(huán)取代基的C1-C6的直鏈或支鏈烷基和烯基、苯基和取代苯基、雜環(huán)和取代雜環(huán)基等。
按照本發(fā)明，對(duì)于式(I)和式(II)優(yōu)選的化合物是當(dāng)R2＝H；R1＝COR3時(shí)，R3＝-H；-CH3(僅對(duì)式I)；-CH2CH3；-(CH2)2CH3；-(CH2)2CH3的化合物。
當(dāng)R2＝H；R1＝COR3時(shí)R3＝-C6H6；-C6H6-p-CH3的化合物。
當(dāng)R2＝H；R1＝COR3時(shí)，R3＝-C5H5N的化合物。
當(dāng)R2＝H時(shí)，R1＝-C(＝NH)NH2的化合物。
當(dāng)R2＝H；R1＝COR3時(shí)，R3＝-CH2NHC(＝NH)NH2；-(CH2)3NHC(＝NH)NH2的化合物。
當(dāng)R2＝H；R1＝COR3時(shí)，R3＝-CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2的化合物。
優(yōu)選化合物以及它們與藥學(xué)上可接受的酸所形成的加成鹽構(gòu)成本發(fā)明的完整內(nèi)容的一部分。
按照本發(fā)明，對(duì)于式(I)和式(II)化合物的制備方法，其特征在于分別使用博萊霉素A5和博萊霉素A6的銅配合物作為原料 博萊霉素A5 博萊霉素A6按照有機(jī)合成中DCC縮合形成酰氨鍵的方法和條件，與RCOOH反應(yīng)得到式(I)化合物和式(II)化合物的銅配合物或式(I)化合物和式(II)化合物的銅配合物的衍生物。這里R為前面所定義的R3或含有反應(yīng)活性基團(tuán)保護(hù)基的R3的衍生物。
采用經(jīng)典的脫除反應(yīng)活性基團(tuán)保護(hù)基的方法，脫除式(I)化合物和式(II)化合物的銅配合物的衍生物中的保護(hù)基團(tuán)，得到式(I)化合物和式(II)化合物的銅配合物。
采用文獻(xiàn)脫銅方法進(jìn)行脫銅處理，并采用層析色譜、吸附色譜技術(shù)對(duì)所得化合物進(jìn)行分離純化，最后得到式(I)化合物和式(II)化合物。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，包含至少一種式(I)化合物或式(II)化合物或這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽作為活性成分，單獨(dú)或結(jié)合一種或幾種藥學(xué)上可接受的、惰性的、無(wú)毒的賦形劑或載體。
在按照本發(fā)明的藥物組合物中，可以特別提到適用于口服、胃腸外(靜脈內(nèi)、肌肉或皮下)，經(jīng)皮或透皮、經(jīng)鼻、直腸、經(jīng)舌的那些，特別是片劑或糖衣丸、膠囊劑、錠劑、栓劑、皮膚凝膠、可注射制劑等。
本發(fā)明化合物具有明顯的抗HIV活性、抗癌活性。含有至少一種式(I)化合物或式(II)化合物或這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸的鹽作為活性成分化合物的藥物組合因此可以用于病毒的治療、癌癥治療等，特別是用于HIV病毒的治療。部分化合物體外細(xì)胞篩選抗腫瘤、HIV-1病毒活性結(jié)果列于表1和表2表1部分化合物體外細(xì)胞篩選抗腫瘤活性(IC50，μM)
表2部分化合物體外細(xì)胞篩選抗HIV-1活性(IC50，μM)
下列實(shí)施例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明而不是用來(lái)限制本發(fā)明。
所用原料和(或)試劑均為已知的產(chǎn)品，或者是按照已知操作制備的產(chǎn)品。
實(shí)施例和合成步驟中所述化合物的結(jié)構(gòu)是按照常規(guī)的光譜技術(shù)(紅外，UV、NMR、MS)測(cè)定的。
實(shí)施例1N1-[3-[[4-[[2-氨基-5-[(氨基亞氨甲基)氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備(化合物1)步驟ANα-硝基-精氨酸制備室溫下將100克L-精氨酸鹽酸鹽緩慢加入到200毫升濃硫酸中，室溫?cái)嚢枋蛊淙芙猓瑴p壓抽出HCl氣體，至反應(yīng)液不鼓泡，得澄清溶液。攪拌下緩慢加入50克粉狀硝酸銨，15分鐘后減壓脫出氣泡，反應(yīng)物攪拌下傾入碎冰的，得水溶液，水溶液用濃氨水調(diào)PH＝6.8，置冰箱中冷卻結(jié)晶，抽濾，沉淀分別用水、乙醇、乙醚洗滌數(shù)次，干燥，產(chǎn)物在水中重結(jié)晶，得產(chǎn)物98克，收率86.5％，熔點(diǎn)255℃(dec.)。
步驟BNα-硝基-N-芐氧羰基-精氨酸制備
5.8克Nα-硝基-精氨酸溶于26.4ml 1N NaOH水溶液中，冰鹽浴中，0℃以下滴加7克芐氧羰酰氯和26.4ml 1N NaOH水溶液，加畢后，反應(yīng)1小時(shí)，用HCl調(diào)PH＝2-3，得油狀產(chǎn)物，冰箱中放置使其結(jié)晶，過(guò)濾，產(chǎn)物用甲醇-水混合溶劑重結(jié)晶，收率52％，熔點(diǎn)127-128。
步驟CN1-[3-[[4-[[2-[(芐氧羰基)氨基]-5-[[(Nα-硝基)氨基，亞氨甲基]氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物制備42毫克Nα-硝基-N-芐氧羰基-精氨酸加入100毫升反應(yīng)瓶中，冰水浴冷卻，加入10毫升甲醇，攪拌使其溶解，然后加入50毫克DCC，保持0℃以下反應(yīng)30分鐘，然后滴加90毫克博萊霉素銅配合物的5毫升甲醇溶液，加畢后于0℃反應(yīng)48小時(shí)。所得反應(yīng)液減壓濃縮，過(guò)濾除去不溶物，母液用硅膠H進(jìn)行柱層析分離，洗脫劑為甲醇∶10％乙酸銨∶10％氨水＝100∶9∶1，所得產(chǎn)物經(jīng)濃縮、冷凍干燥得蘭色固體，為目標(biāo)化合物，用于下一步分離。熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，加熱分解。
步驟D N1-[3-[[4-[[2-[(芐氧羰基)氨基]-5-[[(Nα-硝基)氨基，亞氨甲基]氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨步驟C所得的N1-[3-[[4-[[2-[(芐氧羰基)氨基]-5-[[(Nα-硝基)氨基，亞氨甲基]氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物中加入10毫升15％EDTA溶液，25-30℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)，加入到大孔吸附樹(shù)脂柱吸附，用蒸餾水洗滌，然后用甲醇-鹽酸混合溶劑解吸附，所得甲醇-鹽酸洗脫液40℃以下減壓濃縮，最后產(chǎn)物冷凍干燥，得目標(biāo)化合物白色蓬松固體82毫克，收率73％，熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，加熱分解。
步驟E N1-[3-[[4-[[2-氨基-5-[(氨基亞氨甲基)氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備步驟D所得的N1-[3-[[4-[[2-[(芐氧羰基)氨基]-5-[[(Nα-硝基)氨基，亞氨甲基]氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨用10毫升甲醇溶解，加入氫化反應(yīng)瓶中，然后加入10毫克10％鈀-碳催化劑，于2個(gè)大氣壓下催化氫解，2小時(shí)后，過(guò)濾，固體水洗，溶液減壓濃縮，用大孔吸附樹(shù)脂柱吸附，用蒸餾水洗滌，然后用甲醇-鹽酸混合溶劑解吸附，所得甲醇-鹽酸洗脫液40℃以下減壓濃縮，最后產(chǎn)物冷凍干燥，得目標(biāo)化合物白色蓬松固體66毫克。收率65％，熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，加熱分解；紫外吸收光譜呈現(xiàn)博萊霉素類化合物的特征吸收曲線，F(xiàn)AB-MS1597(M++1)實(shí)施例2N1-[3-[[4-[[(1-苯基-1-羰基)甲基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備(化合物2)步驟AN1-[3-[[4-[[(1-苯基-1-羰基)甲基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物的制備13毫克苯甲酸加入100毫升反應(yīng)瓶中，冰水浴冷卻，加入10毫升甲醇，攪拌使其溶解，然后加入50毫克DCC，保持0℃以下反應(yīng)30分鐘，然后滴加90毫克博萊霉素A5銅配合物的5毫升甲醇溶液，加畢后于0℃反應(yīng)48小時(shí)。所得反應(yīng)液減壓濃縮，過(guò)濾除去不溶物，母液用硅膠H進(jìn)行柱層析分離，洗脫劑為甲醇∶10％乙酸銨∶10％氨水＝100∶9∶1，所得產(chǎn)物經(jīng)濃縮、冷凍干燥得蘭色固體，為目標(biāo)化合物，用于下一步分離。
步驟BN1-[3-[[4-[[(1-苯基-1-羰基)甲基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備步驟A所得的N1-[3-[[4-[[(1-苯基-1-羰基)甲基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物中加入10毫升15％EDTA溶液，25-30℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)，加入到大孔吸附樹(shù)脂柱吸附，用蒸餾水洗滌，然后用甲醇-鹽酸混合溶劑解吸附，所得甲醇-鹽酸洗脫液40℃以下減壓濃縮，最后產(chǎn)物冷凍干燥，得目標(biāo)化合物白色蓬松固體78毫克，收率80.3％。熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，加熱分解；紫外吸收光譜呈現(xiàn)博萊霉素類化合物的特征吸收曲線，F(xiàn)AB-MS1545(M++1)實(shí)施例3 N1-[3-[[4-[[(1-羰基)乙基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備(化合物3)步驟AN1-[3-[[4-[[(1-羰基)乙基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物的制備操作同實(shí)施例2中的步驟A，以乙酸代替實(shí)施例2中步驟A中的苯甲酸，乙酸的投料量為7.2毫克。
步驟BN1-[3-[[4-[[(1-羰基)乙基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備操作同實(shí)施例2的步驟B，原料為步驟A得到的N1-[3-[[4-[[(1-羰基)乙基]氨基]-丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物。目標(biāo)化合物白色蓬松固體65毫克，收率71.4％。熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，加熱分解；紫外吸收光譜呈現(xiàn)博萊霉素類化合物的特征吸收曲線，F(xiàn)AB-MS1483(M++1)實(shí)施例4N1-[3-[4-[(氨基亞氨甲基)氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備(化合物4)步驟AN1-[3-[4-[(氨基亞氨甲基)氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物的制備130毫克甲基異硫脲硫酸鹽加入100毫升反應(yīng)瓶中，冰水浴冷卻，加入5毫升甲醇，攪拌使其溶解，然后加入10％氨水O.5毫升，隨后保持0℃以下迅速加入90毫克博萊霉素A5銅配合物的5毫升甲醇溶液，加畢后于0℃反應(yīng)48小時(shí)。所得反應(yīng)液減壓濃縮，除去溶劑甲醇，加入5毫升水溶解反應(yīng)物，加入到大孔吸附樹(shù)脂柱吸附，用蒸餾水洗滌，除去未反應(yīng)的甲基異硫脲和無(wú)機(jī)鹽等，然后用甲醇-鹽酸混合溶劑解吸附，所得甲醇-鹽酸洗脫液40℃以下減壓濃縮，產(chǎn)物冷凍干燥，冷凍干燥產(chǎn)物用甲醇溶解，用硅膠H進(jìn)行柱層析分離，洗脫劑為甲醇∶10％乙酸銨∶10％氨水＝10∶9∶1，洗脫產(chǎn)物經(jīng)濃縮、冷凍干燥得蘭色固體，為目標(biāo)化合物，用于下一步脫銅精制。
步驟BN1-[3-[4-[(氨基亞氨甲基)氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備操作同實(shí)施例2的步驟B，原料為步驟A得到的N1-[3-[4-[(氨基亞氨甲基)氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物。目標(biāo)化合物白色蓬松固體41毫克，收率43.7％。熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，加熱分解；紫外吸收光譜呈現(xiàn)博萊霉素類化合物的特征吸收曲線，F(xiàn)AB-MS1482(M++1)實(shí)施例5N1-[3-[4-[[(4-氨基-1-羰基)丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備(化合物5)步驟AN-芐氧羰基-氨基丁酸的制備3克氨基丁酸溶于15ml2N NaOH水溶液中，冰鹽浴中，0℃以下滴加10克芐氧羰酰氯和25ml 2N NaOH水溶液，維持反應(yīng)液pH大于9，加畢后，反應(yīng)1小時(shí)，加入乙醚30毫升萃取除去未反應(yīng)的芐氧羰酰氯，水相加入30毫升乙酸乙酯，攪拌下用HCl調(diào)pH＝2-3，分出乙酸乙酯層，再用乙酸乙酯萃取2次，合并酯層，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，過(guò)濾，蒸除乙酸乙酯，得油狀產(chǎn)物，冰箱中放置使其結(jié)晶。稱重的白色結(jié)晶6克，收率86.4％，直接用于下一步反應(yīng)。
步驟B N1-[3-[4-[[[4-(芐氧羰基)氨基-1-羰基]丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物的制備操作同實(shí)施例1中的步驟D，以N-芐氧羰基-氨基丁酸代替實(shí)施例1中步驟A中的Nα-硝基-N-芐氧羰基-精氨酸，N-芐氧羰基-氨基丁酸的投料量為30毫克。
步驟C N1-[3-[4-[[[4-(芐氧羰基)氨基-1-羰基]丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備操作同實(shí)施例1的步驟D，原料為步驟C得到的N1-[3-[4-[[[4-(芐氧羰基)氨基-1-羰基]丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨銅配合物。目標(biāo)化合物為白色蓬松固體。
步驟D N1-[3-[4-[[(4-氨基-1-羰基)丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨的制備(A5-BN)操作同實(shí)施例1的步驟E，原料為步驟D得到的N1-[3-[4-[[[4-(芐氧羰基)氨基-1-羰基]丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博萊霉素酰氨。目標(biāo)化合物為白色蓬松固體，稱重68毫克，收率72.9％。熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，加熱分解；紫外吸收光譜呈現(xiàn)博萊霉素類化合物的特征吸收曲線，F(xiàn)AB-MS1525(M++1)實(shí)施例6N1-[3-[[4-[[1-(3-吡啶基)-1-羰基]甲基]氨基]丁基]氨基]丙基-博萊霉素酰氨的制備(化合物6)步驟AN1-[3-[[4-[[1-(3-吡啶基)-1-羰基]甲基]氨基]丁基]氨基]丙基-博萊霉素酰氨銅配合物的制備操作同實(shí)施例2中的步驟A，以異煙酸代替實(shí)施例2中步驟A中的苯甲酸，異煙酸的投料量為13毫克。
步驟BN1-[3-[[4-[[1-(3-吡啶基)-1-羰基]甲基]氨基]丁基]氨基]丙基-博萊霉素酰氨的制備操作同實(shí)施例2的步驟B，原料為步驟A得到的N1-[3-[[4-[[1-(3-吡啶基)-1-羰基]甲基]氨基]丁基]氨基]丙基-博萊霉素酰氨銅配合物。所得目標(biāo)化合物為白色蓬松固體78毫克，收率81.7％。熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，加熱分解；紫外吸收光譜呈現(xiàn)博萊霉素類化合物的特征吸收曲線，F(xiàn)AB-MS1546(M++1)本發(fā)明化合物的藥理研究。
實(shí)施例8 抗癌篩選試驗(yàn)分別用KB、Hela、HL-60、BGC-823及BEL-7402腫瘤細(xì)胞株采用MTT法或SRB法進(jìn)行試驗(yàn)。
MTT法分別將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60、BGC-823、Bel-7402、KB及Hela細(xì)胞以1×104個(gè)/mL濃度接種于96孔板，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入滅菌處理的待篩選化合物，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加20μL含5mg/mL MTT的SBS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。棄去上層液，室溫晾干。每孔中分別加入200μL酸化異丙醇溶液溶解紫色殘留物，于570nm處酶標(biāo)儀上測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率和IC50。
SRB法分別將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60、Bel-7402、BGC-823、KB及Hela細(xì)胞以1×104個(gè)/mL濃度接種于96孔板，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。加入滅菌處理的化合物，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，棄去上清液，每個(gè)小孔中加入100μl 10％TCA(三氯醋酸)，靜置5分鐘后，于4℃放置1小時(shí)固定。然后倒掉固定液，每個(gè)小孔用水洗5遍。室溫干燥后，每孔加入0.4％SRB 100μl，室溫放置10分鐘后，用1％HOAc(醋酸)洗5遍，空氣干燥，加入10mM Tris 200μl/每孔，振蕩溶解，于540nm單波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率和IC50實(shí)施例9抑制HIV-1復(fù)制體外實(shí)驗(yàn)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MT4細(xì)胞配成濃度為40×105個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液，每孔100微升加入96孔板。待測(cè)藥物過(guò)濾除菌，用RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行系列稀釋(1.0μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.0625μM、0.03125μM)，每孔50μL加入96孔板中。再加滴度分別是100TCID50和1000TCID50(tissue cultured infection dose)的HIV-1 50μL，每種藥物濃度和病毒滴度組合做4復(fù)孔。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(AZT+MT4細(xì)胞+HIV-1)、陰性對(duì)照(水+MT4細(xì)胞+HIV-1)、藥物毒性對(duì)照(藥物+MT4細(xì)胞)和空白對(duì)照(MT4細(xì)胞+HIV-1)。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)7天。每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)第三天每孔補(bǔ)加50μL新鮮培養(yǎng)基，第六天觀察細(xì)胞病變(CPE)。
全部實(shí)驗(yàn)按照操作規(guī)程在生物安全3級(jí)(BSL-3)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，重復(fù)兩次。計(jì)算抑制率和IC50。
權(quán)利要求
1.式(I)的化合物和式(II)的化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸的鹽。 式(I) 式(II)其中R1、R2所代表的基團(tuán)為氫原子或COR3，R1、R2代表的基團(tuán)可以相同也可以不同，但至少有一個(gè)為COR3。這里R3代表氫原子、烴基、烷氧基、芳基、環(huán)烷烴基、雜環(huán)基、胍基烴基、氨基烴基等的一種或幾種基團(tuán)(對(duì)于式(II)，當(dāng)R2＝H時(shí)，R3≠CH3)。本專利包括以上所代表的化合物及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽?！盁N基”被定義為直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的基團(tuán)；環(huán)狀或非環(huán)狀基團(tuán)；芳香或非芳香基團(tuán)；雜環(huán)或非雜環(huán)基團(tuán)；——“烷氧基”被定義為各烷氧基部分可以是直鏈或支鏈的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以是飽和或不飽和的烴基，也可以是含芳基、雜環(huán)、環(huán)烷基的烴基；——“芳基”被定義為苯基、萘基、四氫萘基、二氫萘基、茚基或2，3-二氫茚基，各自任選地被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代，取代基選自鹵素、羥基、氰基、硝基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基、氨基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基氨基；——“環(huán)烷基”被定義為連接有飽和或不飽和直鏈或支鏈烷基側(cè)鏈的飽和或不飽和的環(huán)狀烷基、不含側(cè)鏈的環(huán)狀烷基。在這里環(huán)狀烷基包括飽和和不飽和的環(huán)狀烷基，環(huán)的大小是指三元環(huán)、四元環(huán)、五元環(huán)、六元環(huán)等；——“雜環(huán)基”被定義為飽和或不飽和的單環(huán)或二環(huán)基團(tuán)，具有芳族和非芳族特征，具有5至12個(gè)環(huán)原子，含有1-3個(gè)相同或不同的雜原子，雜原子可以是氧、氮和硫中的一種或幾種。雜環(huán)同時(shí)被理解為可以任意的被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的取代基取代，取代基可以是鹵素、羥基、直鏈或支鏈(C1-C6)烴基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧烴基、硝基、氧代和氨基(任意被一個(gè)或兩個(gè)直鏈或支鏈(C1-C6)烴基取代)。在雜環(huán)中，可以象征性而不加任何限制地提到吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、4-H-吡喃4-酮、吡嗪基、嘧啶基、異惡唑基、四唑基、吡咯基、吡唑基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，2，3-噻二唑基……?！半一鶡N基”定義為烴基基團(tuán)的末端含有胍基，胍基的數(shù)量可以是1-3個(gè)，烴基的含義如前面所定義；——“氨基烴基”定義為烴基基團(tuán)的末端或中間碳上連有氨基，連有氨基的數(shù)量可以是1-5個(gè)，所連接氨基上的氫可以任意被一個(gè)或兩個(gè)直鏈或支鏈(C1-C6)烴基。烴基的含義如前面所定義；
2根據(jù)權(quán)力要求1的式(I)的化合物和式(II)的化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸的鹽是指鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸、碳酸等無(wú)機(jī)酸和甲酸、乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、酒石酸以及葡萄糖酸等有機(jī)酸形成的含結(jié)晶水或不含結(jié)晶水的鹽；
3根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)的化合物，其特征在于R3是代表C1-C6直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的烴基基團(tuán)，環(huán)狀和非環(huán)狀烴基基團(tuán)，芳香和非芳香烴基基團(tuán)，雜環(huán)和非雜環(huán)烴基基團(tuán)。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
4根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表C1-C6的直鏈烷基和烯基、C1-C10的支鏈烷基和烯基。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
5根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表氫原子。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
6根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表-R4OR5，這里R4和R5分別代表C1-C6的直鏈烷基和烯基、C1-C10的支鏈烷基和烯基、苯和取代苯基、雜環(huán)和取代雜環(huán)基。R4和R5可以相同也可以不同。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
7根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表苯基和取代苯基、萘基和取代萘基等芳香基團(tuán)，取代基位置可以是芳環(huán)上任意位置，取代基的個(gè)數(shù)為1-4，取代基的種類包括鹵素、羥基、氰基、硝基，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、直鏈或支鏈烷氧基(C1-C6)、氨基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基氨基等，多個(gè)取代基可以相同也可以不同。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
8根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表連接有(C1-C6)的飽和或不飽和直鏈或支鏈烴基側(cè)鏈的飽和或不飽和的環(huán)狀烴基，和不含側(cè)鏈的環(huán)狀烴基。在這里環(huán)狀烴基的大小是指三元環(huán)、四元環(huán)、五元環(huán)、六元環(huán)等，環(huán)的個(gè)數(shù)為1-3。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
9根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表雜環(huán)基，雜環(huán)基為飽和或不飽和的單一或二環(huán)基團(tuán)，具有芳族和非芳族特征，具有4至12個(gè)環(huán)原子，含有1-3個(gè)相同或不同的雜原子，雜原子可以是氧、氮和硫中的一種或幾種。雜環(huán)可以是帶有和不帶有取代基的雜環(huán)，取代基可以是一個(gè)或多個(gè)相同或不同的取代基，取代基可以是鹵素、羥基、直鏈或支鏈(C1-C6)烴基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧烴基、硝基、氧代和氨基(任意被一個(gè)或兩個(gè)直鏈或支鏈(C1-C6)烴基取代)等。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
10根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表基團(tuán)的末端含有胍基的烴基基團(tuán)，胍基的數(shù)量可以是1-3個(gè)，烴基可以是C1-C6的直鏈或支鏈烷基和烯基、C1-C6直鏈或支鏈的烷氧基、C1-C6直鏈或支鏈的氨基烷基、含苯基和取代苯基取代基以及含雜環(huán)和取代雜環(huán)取代基的C1-C6的直鏈或支鏈烷基和烯基。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
11根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表末端或中間碳上連有氨基的烴基基團(tuán)，連有氨基的數(shù)量可以是1-5個(gè)，所連接氨基上的氫可以任意被一個(gè)或兩個(gè)C1-C6的直鏈或支鏈的烴基取代，也可以不取代，連接氨基的烴基基團(tuán)可以是C1-C6的直鏈或支鏈烷基和烯基、C1-C6直鏈或支鏈的烷氧基、含苯基和取代苯基取代基以及含雜環(huán)和取代雜環(huán)取代基的C1-C6的直鏈或支鏈烷基和烯基、苯基和取代苯基、雜環(huán)和取代雜環(huán)基等。所得到的這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
12根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝COR3R3＝-H；-CH3(僅對(duì)式I)；-CH2CH3；-(CH2)2CH3；-(CH2)2CH3；這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
13根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝COR3R3＝-C6H5；這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
14根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝COR3；R3＝-C5H5N；它們的異構(gòu)體以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
15根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝-C(＝NH)NH2這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽；
16根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝COR3R3＝-CH2NHC(＝NH)NH2；-(CH2)3NHC(＝NH)NH2；這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽。
17根據(jù)權(quán)力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H； R1＝COR3R3＝-CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2；這些化合物以及這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽。
18式(I)化合物和式(II)化合物的制備方法，其特征在于使用博萊酶素A5和博萊酶素A6的銅配合物作為原料 博萊霉素A5 博萊霉素A6按照有機(jī)合成中DCC縮合形成酰胺鍵的方法和條件，與RCOOH反應(yīng)得到式(I)化合物和式(II)化合物的銅配合物或式(I)化合物和式(II)化合物的銅配合物的衍生物。這里R為前面所定義的R3或含有反應(yīng)活性基團(tuán)保護(hù)基的R3的衍生物。采用經(jīng)典的脫除反應(yīng)活性基團(tuán)保護(hù)基的方法，脫除式(I)化合物、式(II)化合物的銅配合物的衍生物中的R3基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)，得到式(I)化合物和式(II)化合物的銅配合物。采用文獻(xiàn)脫銅方法脫銅，并采用層析色譜技術(shù)對(duì)所得化合物進(jìn)行分離純化，最后得到式(I)化合物和式(II)化合物；
19藥物組合物，包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至17任意一項(xiàng)的式(I)化合物或這些化合物所形成的在藥學(xué)上可接受的酸鹽作為活性成分，單獨(dú)或結(jié)合一種或幾種藥學(xué)上可接受的、惰性的、無(wú)毒的賦形劑或載體；
20根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至17任意一項(xiàng)的活性成分，用于抗病毒、抗癌治療；
全文摘要
采用化學(xué)合成方法得到的如圖所示的化合物其中R
文檔編號(hào)C07H15/00GK1390846SQ0212084
公開(kāi)日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月5日
發(fā)明者楊銘, 徐志棟, 王敏, 肖蘇龍, 許鴻章 申請(qǐng)人:北京大學(xué)