專利名稱：透明質(zhì)酸低聚糖級(jí)分及含有該物質(zhì)的藥品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸低聚糖(以下稱為“HA低聚糖”)及其新的級(jí)分。
而且本發(fā)明也涉及以這種HA低聚糖為有效成分的藥品(特別是用于熱沖擊蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)劑、細(xì)胞死亡抑制劑、細(xì)胞障礙抑制劑，或細(xì)胞、組織保護(hù)劑(特別是器官保存劑、潰瘍處置劑、及肝臟障礙處置劑、IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑，或IL-8產(chǎn)生抑制劑)。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(以下稱為“HA”)，其活性或功能隨其分子大小發(fā)生變化是已知的。例如，分子量為120萬的HA具有NF-κb的鈍化作用、血管新生抑制作用等[High molecular weight hyaluronic acid inhibitsadvanced glycation endproduct-induced NF-kappaB activation andcytokine expression.Neumann A，Schinzel R，Palm D，Riederer P，MunchG.FEBS Lett 1999 Jun 25；453(3)283-7；Feinberg RN，Beebe DC.Hyaluronate in vasculogenesis.Science 2201177-1179，1983.]，分子量為50萬以下的HA據(jù)報(bào)道具有與此相反的活性[Noble PW，McKee CM，Cowman M，Shin HS.Hyaluronan fragments activate an NF-kappaB/I-kappaB alpha autoregulatory loop in murine macrophages.J Exp Med1832373-2378，1996.；West DC，Shaw DM.Tumour hyaluronan inrelation to angiogenesis and metastasis.InLaurent TC，ed.The chemistry，biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives.Londonportland press，1998227.]。
這些事實(shí)充分表示HA低聚糖可能具有多樣的活性，或根據(jù)HA低聚糖的大小有可能發(fā)現(xiàn)其特殊的活性。從而，組合大小不同的HA低聚糖時(shí)，可能會(huì)發(fā)揮出相加或相乘的效果，與此相反，對(duì)于某一大小的HA低聚糖的活性，也要考慮其他大小的HA低聚糖產(chǎn)生拮抗劑的作用。
此時(shí)，首先在面向HA低聚糖的藥品開發(fā)的活性研究階段中，使用各種大小的HA低聚糖混合的級(jí)分時(shí)，不僅不能確定哪種大小的HA低聚糖為活性主體，而且也有某一大小的HA低聚糖的活性可能被不同大小的HA低聚糖抵消，有可能錯(cuò)過隱藏在HA低聚糖中的重要生理活性或功能。
另外，將某一大小的HA低聚糖作為藥品使用時(shí)，有必要盡量排除影響該HA低聚糖發(fā)揮功能的其他大小的低聚糖，而且，作為藥品需要實(shí)際上不含非必要物質(zhì)的高純度的級(jí)分。
如上所述，在新的藥品研制與提供中，需要實(shí)質(zhì)上由單一大小的HA低聚糖構(gòu)成、且實(shí)質(zhì)上不含其他大小的HA低聚糖或其他雜質(zhì)的高純度HA低聚糖級(jí)分。
另一方面，熱沖擊蛋白質(zhì)(以下稱為Hsp)也稱為應(yīng)力蛋白質(zhì)，是一種防御因各種應(yīng)力反應(yīng)所產(chǎn)生的障礙的蛋白質(zhì)，已知多種家庭。其中之一的Hsp70族熱沖擊蛋白質(zhì)，可以抑制因熱沖擊、過氧化氫、重金屬、氨基酸類似物、缺糖等環(huán)境應(yīng)力產(chǎn)生的因子，或發(fā)熱、炎癥、缺血、病毒感染、代謝疾病、心肥大癥、氧化應(yīng)力、細(xì)胞組織障礙、癌基因或致癌物質(zhì)等應(yīng)力因子而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，和異常蛋白質(zhì)的產(chǎn)生等，同時(shí)通過使蛋白質(zhì)的功能再生等，可以防止細(xì)胞障礙或細(xì)胞死亡。
關(guān)于這些內(nèi)容，在日本專利申請(qǐng)平9-227386號(hào)公報(bào)中，記載了將HA作為有效成分的應(yīng)力蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)劑。在該公報(bào)中，記載了作為其活性成分優(yōu)選2～20糖的HA(第3頁)，暗示10糖以下的HA參與應(yīng)力蛋白質(zhì)表達(dá)的增強(qiáng)或誘導(dǎo)(第6頁)。進(jìn)而也記載了表示HA不飽和二糖增強(qiáng)應(yīng)力蛋白質(zhì)的表達(dá)，抑制細(xì)胞死亡的實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例2)。
但是對(duì)于本發(fā)明涉及的各種低聚糖，沒有具體的公開，而且對(duì)于下述在HA4糖中特異發(fā)現(xiàn)的極其顯著的應(yīng)力蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)，也沒有任何公開或暗示。
而且，從前述應(yīng)力蛋白質(zhì)的功能，可以推測應(yīng)力蛋白質(zhì)參與細(xì)胞、組織的保護(hù)。
關(guān)于這些內(nèi)容，在日本專利申請(qǐng)平11-246301號(hào)公報(bào)中，記載了含有HA和/或生理學(xué)上允許的鹽的移植用的器官保存溶液。在該公報(bào)中，記載了HA的平均分子量優(yōu)選10萬以上，但是對(duì)于HA低聚糖及其發(fā)揮的優(yōu)良效果并沒有說明或暗示。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供具有4糖～60糖大小的HA低聚糖，特別是，實(shí)質(zhì)上由單一大小的HA低聚糖構(gòu)成、不含其他大小的HA低聚糖或其他雜質(zhì)的級(jí)分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供將這樣的HA低聚糖作為有效成分的藥品，特別是，提供效果更好的Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑、細(xì)胞死亡抑制劑及細(xì)胞障礙抑制劑。進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于提供優(yōu)良的細(xì)胞、組織保護(hù)劑，利用該物質(zhì)的器官保存劑、潰瘍處置劑、肝臟疾病處置劑、IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑及IL-8產(chǎn)生抑制劑。
本發(fā)明者為了解決上述課題潛心研究的結(jié)果是，將選自4糖～60糖的HA低聚糖，及這些低聚糖的混合物，通過特殊方法進(jìn)行分離分級(jí)，得到了實(shí)質(zhì)上由目標(biāo)大小的低聚糖構(gòu)成、且不含其他大小的低聚糖與其他雜質(zhì)的新的級(jí)分。
也就是說，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的低聚糖，而且，特征是具有下述(1)～(6)中所示理化性質(zhì)的級(jí)分(以下稱為“本發(fā)明級(jí)分”)。
(1)將該級(jí)分，利用凝膠過濾色譜法，以下面(a)及(b)所述的檢測方法進(jìn)行分析，其結(jié)果，不論用哪一種方法都表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上單一的峰，且該峰的面積如下面(a)及(b)所述。
(a)利用210nm吸收檢測時(shí)，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為85％以上。
(b)利用差示折射計(jì)檢測時(shí)，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為98％以上。
(2)將該級(jí)分，利用陰離子交換色譜法，以210nm吸收檢測分析時(shí)，表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上單一的峰，而且，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為90％以上。
(3)將該級(jí)分進(jìn)行熒光標(biāo)記之后，通過電泳進(jìn)行分析時(shí)，表現(xiàn)出單一的譜帶，而且，沒有檢測出其他大小的HA低聚糖的譜帶。
(4)將構(gòu)成該級(jí)分的HA低聚糖的單一同位素分子量或平均分子量的理論值設(shè)定為1時(shí)，該級(jí)分的質(zhì)譜分析的實(shí)測值為0.997～1.003(相對(duì)值)。
(5)構(gòu)成該級(jí)分的HA低聚糖中的碳(C)、氫(H)及氮(N)的各自含量比的理論值(重量％)，與通過該級(jí)分的元素分析得到的各元素的實(shí)測值(重量％)之差，均在±1(重量％)范圍內(nèi)。
(6)實(shí)質(zhì)上不含蛋白質(zhì)、DNA及內(nèi)毒素。
進(jìn)而，本發(fā)明級(jí)分優(yōu)選具有下面(7)所示的理化性質(zhì)。
(7)該級(jí)分的1H-NMR及13C-NMR測定結(jié)果，與下面式(1)所示的HA低聚糖的結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生矛盾。
式(1) (式中，n表示1～29的整數(shù)，M表示質(zhì)子或一價(jià)陽離子，Ac表示乙?；?本發(fā)明級(jí)分中含有的HA低聚糖的大小優(yōu)選選自4糖～20糖，更加優(yōu)選選自4糖～16糖，進(jìn)一步優(yōu)選選自4糖～14糖，特別優(yōu)選4糖。
另外，本發(fā)明者研究了本發(fā)明的低聚糖作為藥品的可能性，其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)規(guī)定大小的HA低聚糖具有極其顯著的Hsp表達(dá)增強(qiáng)作用、細(xì)胞死亡抑制作用及細(xì)胞障礙抑制作用，利用這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了解決上述課題的Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑、細(xì)胞死亡抑制劑及細(xì)胞障礙抑制劑。
而且本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的低聚糖發(fā)揮優(yōu)越的細(xì)胞、組織保護(hù)作用，從而提供了細(xì)胞、組織保護(hù)劑，進(jìn)而提供利用該物質(zhì)的器官保存劑、潰瘍處置劑、肝障礙處置劑、IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑及IL-8產(chǎn)生抑制劑。
也就是說，本發(fā)明提供將本發(fā)明的低聚糖作為有效成分的藥品(醫(yī)藥組合物，以下稱為“本發(fā)明藥品”)。這種藥品，優(yōu)選為Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑、細(xì)胞死亡抑制劑、細(xì)胞障礙抑制劑，或細(xì)胞、組織保護(hù)劑。
而且細(xì)胞、組織保護(hù)劑，優(yōu)選作為器官保存劑、潰瘍處置劑、肝障礙處置劑、IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑、或IL-8產(chǎn)生抑制劑使用。
本發(fā)明藥品及這些藥劑，優(yōu)選將選自4糖～20糖大小的HA低聚糖作為有效成分，更優(yōu)選將選自4糖～16糖大小的HA低聚糖作為有效成分，進(jìn)一步更加優(yōu)選將選自4糖～14糖大小的HA低聚糖作為有效成分，特別優(yōu)選HA4糖作為有效成分。
如上所述，以往存在關(guān)于HA低聚糖的生理活性、功能的報(bào)告。但是使用從分子大小、分子結(jié)構(gòu)、純度(其他分子大小的混入程度，蛋白質(zhì)、DNA等其他成分的混入程度，內(nèi)毒素含量)等多種角度保證的HA低聚糖的例子，至今還沒有出現(xiàn)，也就是說，在以往的HA低聚糖的生理活性、功能的報(bào)告中，沒有否定混入物的影響。對(duì)此在本發(fā)明中，得到了實(shí)質(zhì)上不含蛋白質(zhì)、DNA等其他成分的HA低聚糖，進(jìn)而得到實(shí)質(zhì)上不含其他分子大小的特定大小的HA低聚糖的級(jí)分，明確了這些物質(zhì)的生理活性、功能。
下面，詳細(xì)說明本發(fā)明。
<1>本發(fā)明的低聚糖本發(fā)明的低聚糖，是具有選自4糖～60糖大小的HA低聚糖。
所謂“HA低聚糖”，是由與HA的構(gòu)成二糖組成相同的組成構(gòu)成的低聚糖。具體來說，是作為HA的構(gòu)成單糖的葡糖醛酸(GlcA)與N-乙?；咸前?GlcNAc)交替地以配糖鍵結(jié)合的低聚糖。
即，前述式(1)所示結(jié)構(gòu)不僅表示非還原末端為葡糖醛酸的低聚糖，也包括非還原末端為N-乙?；咸前返腍A低聚糖。
處在非還原末端上的糖，可以是飽和糖(單糖中的碳碳鍵不包括雙鍵)，也可以是不飽和糖(單糖中的碳碳鍵包括雙鍵)。在以下的說明中，GlcA表示飽和葡糖醛酸，ΔGlcA表示不飽和葡糖醛酸。
其中尤其優(yōu)選處在非還原末端上的糖為飽和糖，具體來說，優(yōu)選下面式(2)所示的HA低聚糖。
GlcA(-GlcNAc-GlcA)n-GlcNAc (2)(式中，GlcA表示葡糖醛酸殘基，GlcNAc表示N-乙?；咸前窔埢?，-表示配糖鍵，n表示1～29的整數(shù))在上式(2)中GlcA-GlcNAc的配糖鍵優(yōu)選β1→3鍵，GlcNAc-GlcA的配糖鍵優(yōu)選β1→4鍵。
其中，特別優(yōu)選下式(1)所示的HA低聚糖。
式(1) (式中，n表示1～29的整數(shù)，M表示質(zhì)子或一價(jià)陽離子，Ac表示乙?；?如后述實(shí)施例所示，處在非還原末端上的糖為不飽和糖時(shí)，也表現(xiàn)出有意義的生理活性，這些也是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。作為一具體例，可以例舉下式所示的HA低聚糖。 (式中，Ac表示乙?；?在上式所示的非還原末端中含有不飽和糖的HA低聚糖相當(dāng)于后述實(shí)施例中使用的ΔHA4。
而且，本發(fā)明的低聚糖可以是鹽的形式，也可以是電離的狀態(tài)。作為鹽，有例如堿金屬鹽(鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽、銨鹽等無機(jī)堿的鹽，或二乙醇胺鹽、環(huán)己胺鹽、氨基酸鹽、半乳糖胺鹽、葡糖胺鹽等有機(jī)堿的鹽。其中優(yōu)選堿金屬鹽，特別優(yōu)選鈉鹽。
本發(fā)明的低聚糖的來源沒有特別的限定。例如，雞冠、臍帶、豬皮、牛皮、魚類及其他動(dòng)物的皮、大動(dòng)脈等，或通過分解處理(例如酶分解、化學(xué)分解、加熱處理、超聲波處理等)從產(chǎn)生HA的微生物中分離、純化的HA的步驟制備的物質(zhì)。而且，也可以是通過合成(例如化學(xué)合成或酶合成)的步驟制備的物質(zhì)。
作為酶分解法，可以例舉將分解透明質(zhì)酸酶(來自睪丸)、透明質(zhì)酸酶(來自鏈霉菌)、透明質(zhì)酸酶SD、軟骨素酶AC I，軟骨素酶ACIII，軟骨素酶ABC，內(nèi)葡萄糖苷酸酶(來自水蛭)等HA的酶作用于HA的方法(參考新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座“糖質(zhì)II-蛋白多糖與粘多糖”244-288頁，1991年發(fā)行，東京化學(xué)同人)。為了得到上式(1)所示的低聚糖，作為分解HA的酶，優(yōu)選使用水解酶。
作為化學(xué)分解法，可以例舉堿分解法或二甲亞砜法(DMSO法)。堿分解法，具體來說，例如通過在HA的溶液中加入1N氫氧化鈉等堿，經(jīng)數(shù)小時(shí)加溫使其低分子化，之后加入鹽酸等酸中和的方式進(jìn)行。作為DMSO法，可以例舉Nagasawa等的方法(Carbohyd.Res.，141，99-110頁，1985)。而且，也可以通過鹽酸或硫酸進(jìn)行水解。
作為超聲波處理法，可以例舉在Biochem.，33，6503-6507頁(1994)等中記載的方法。
作為合成制備方法，可以例舉Glycoconjugate J.，453-439頁(1993)，國際公開WO93/20827等記載的方法。
這樣制備的本發(fā)明的低聚糖，可以純化到所需的純度。例如下面說明，可以純化到實(shí)質(zhì)上由單一大小的本發(fā)明的低聚糖構(gòu)成，且不含其他大小HA低聚糖及其他雜質(zhì)的程度。
<2>本發(fā)明級(jí)分本發(fā)明級(jí)分，為含有本發(fā)明的低聚糖的級(jí)分，是具有下述理化性質(zhì)的物質(zhì)。
通過前述<1>記載的方法可以得到本發(fā)明的低聚糖(含有本發(fā)明的低聚糖的級(jí)分。與“本發(fā)明級(jí)分”不同)，但是在得到的級(jí)分中混有多種大小的HA低聚糖。另一方面，本發(fā)明級(jí)分是實(shí)質(zhì)上由單一大小的HA低聚糖構(gòu)成，且不含其他大小HA低聚糖及其他雜質(zhì)的級(jí)分。本發(fā)明級(jí)分可以通過以下方法制備。
將通過前述<1>記載的方法得到的級(jí)分(混有各種大小低聚糖的級(jí)分)，加載到強(qiáng)堿性陰離子交換劑的柱上。作為強(qiáng)堿性陰離子交換劑，可以例舉含有三甲銨基、三甲基銨甲基、β-羥乙基二甲銨基、2-羥丙氨基、二乙基-(2-羥丙基)氨乙基、二甲基乙醇銨基等的陰離子交換劑，但是優(yōu)選含有三甲基銨甲基的陰離子交換劑。
柱的大小可以根據(jù)施加量等適當(dāng)設(shè)定，小規(guī)模制備時(shí)優(yōu)選柱的直徑為1～5cm，柱的長度為50～150cm。而且，優(yōu)選組合使用2個(gè)以上的這種柱。
將混有多種大小HA低聚糖的級(jí)分加載到這樣的柱上時(shí)，級(jí)分中含有的HA低聚糖與柱中的強(qiáng)堿性陰離子交換劑離子結(jié)合。
結(jié)合的HA低聚糖，根據(jù)鹽的濃度梯度可以洗脫。用于洗脫的鹽沒有特別的限定，可以使用NaCl、KCl、LiCl等，優(yōu)選使用NaCl。
另外鹽的濃度梯度，優(yōu)選鹽濃度從0～0.1M左右上升至0.5M左右。而且優(yōu)選鹽的濃度梯度為直線，優(yōu)選以0.1M/40～50小時(shí)的增大鹽濃度，更加優(yōu)選以0.1M/45～50小時(shí)的速度上升鹽濃度。
另外流速優(yōu)選80～100ml/小時(shí)，更加優(yōu)選85～95ml/小時(shí)。
通過選擇這樣的色譜條件，在強(qiáng)堿性陰離子交換劑上離子結(jié)合的HA低聚糖，從大小小的開始依次洗脫。由此可以知道HA低聚糖與強(qiáng)堿性離子交換劑的結(jié)合力大致與HA低聚糖的大小成比例，其結(jié)果，因鹽濃度梯度的負(fù)荷，從結(jié)合力弱的低聚糖(大小小的低聚糖)開始被依次洗脫。本發(fā)明級(jí)分，是通過利用這樣的強(qiáng)堿性陰離子交換劑與HA低聚糖的結(jié)合、洗脫特性首次提供的。根據(jù)這個(gè)方法，利用高分離能，且通過1次柱操作，可以簡單分離各種大小的HA低聚糖，可以有效制備實(shí)質(zhì)上由單一大小的HA低聚糖構(gòu)成，且不含其他大小的HA低聚糖或其他雜質(zhì)的高純度的HA低聚糖級(jí)分(本發(fā)明級(jí)分)。
本發(fā)明級(jí)分中含有的HA低聚糖，優(yōu)選選自4糖～20糖大小，更加優(yōu)選選自4糖～16糖大小，進(jìn)一步優(yōu)選選自4糖～14糖大小，特別優(yōu)選4糖。
這樣得到的本發(fā)明級(jí)分，可以再次附加在上述色譜步驟中。而且，也可以附加在濃縮、脫鹽、及其他處理中。
本發(fā)明級(jí)分的保存、流通形態(tài)沒有特殊的限定，可以是溶液狀態(tài)、凍結(jié)狀態(tài)、凍干狀態(tài)中的任意一種。
而且，本發(fā)明級(jí)分中的HA低聚糖可以是鹽的形態(tài)，也可以是電離狀態(tài)。作為鹽，有例如堿金屬鹽(鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽、銨鹽等無機(jī)堿的鹽，或二乙醇胺鹽、環(huán)己胺鹽、氨基酸鹽、半乳糖胺鹽、葡糖胺鹽等有機(jī)堿的鹽。其中尤其優(yōu)選堿金屬鹽，特別優(yōu)選鈉鹽。本發(fā)明級(jí)分用于后述本發(fā)明藥品時(shí)，這些鹽中可以使用醫(yī)學(xué)上允許使用的鹽。此時(shí)也特別優(yōu)選鈉鹽。
這樣得到的本發(fā)明級(jí)分，其特征在于滿足下面(1)～(6)所示的所有理化性質(zhì)。另外，下面的理化性質(zhì)所示的數(shù)值等，根據(jù)試驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)條件、環(huán)境、使用設(shè)備、試驗(yàn)者的熟練度、及其他因素等可能會(huì)有一些變化。從而該數(shù)值，沒有嚴(yán)格被限定于數(shù)據(jù)上，應(yīng)該考慮到根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件等測定結(jié)果可能存在差異(本領(lǐng)域技術(shù)人員常識(shí)范圍中的數(shù)值差異；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)定為同一級(jí)分程度的數(shù)值差異)。
(1)利用凝膠過濾色譜法，以下面(a)及(b)所述檢測方法進(jìn)行分析，其結(jié)果，不論用哪一種方法都表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上單一的峰，且該峰的面積如下面(a)及(b)所述，(a)基于210nm的吸收檢測時(shí)，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為85％以上。這個(gè)相對(duì)面積，優(yōu)選90％以上，更加優(yōu)選95％以上。
(b)利用差示折射計(jì)(下面也略稱為[RI])檢測時(shí)，相對(duì)級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為98％以上。
該理化性質(zhì)，表示該級(jí)分由實(shí)質(zhì)上單一大小的HA低聚糖分子構(gòu)成。而且，表示實(shí)質(zhì)上不含其他雜質(zhì)。
另外，本發(fā)明中所謂“實(shí)質(zhì)上單一”，并不是“完全單一”的含義，而是“本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)定為單一”的含義。例如，一般，難以達(dá)到大小較大的低聚糖中完全不含其他大小的低聚糖，這可以說是本技術(shù)領(lǐng)域的常識(shí)。因此，在大小較大的低聚糖級(jí)分的色譜分析或質(zhì)譜分析等中，除了大小較大的低聚糖產(chǎn)生的主峰之外，即使存在其他大小的低聚糖產(chǎn)生的小峰，在考慮低聚糖大小時(shí)，也認(rèn)定是實(shí)質(zhì)上單一的峰。從而，這樣的情況下可以稱為“實(shí)質(zhì)上單一的峰”。
(2)將該級(jí)分，利用陰離子交換色譜法，以210nm吸收檢測分析時(shí)，表示出實(shí)質(zhì)上單一的峰，而且，相對(duì)級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為90％以上。這個(gè)相對(duì)面積，優(yōu)選在95％以上。
這個(gè)理化性質(zhì)，表示這個(gè)級(jí)分由具有實(shí)質(zhì)上單一電荷的HA低聚糖分子構(gòu)成，即由均質(zhì)的HA低聚糖構(gòu)成。而且，表示實(shí)質(zhì)上不含其他雜質(zhì)。
另外，例如式(1)所示，在HA低聚糖分子中存在規(guī)則的羧基，這個(gè)基團(tuán)在溶液中電離成-COO-離子。從而，可以說一定大小的HA低聚糖分子中含有的-COO-離子數(shù)是一定的。因此，構(gòu)成級(jí)分的HA低聚糖的電荷實(shí)質(zhì)上單一，也說明由實(shí)質(zhì)上單一大小的HA低聚糖構(gòu)成。
(3)將該級(jí)分進(jìn)行熒光標(biāo)記之后，通過電泳進(jìn)行分析時(shí)，表示出單一的譜帶，而且，沒有檢測出其他大小的HA低聚糖的譜帶。
這個(gè)結(jié)果說明即使通過色譜法以外的方法(電泳法)進(jìn)行分析，也可以明確這個(gè)級(jí)分由實(shí)質(zhì)上單一大小的HA低聚糖分子構(gòu)成，也支持色譜法分析的結(jié)果。而且，表示實(shí)質(zhì)上不含其他雜質(zhì)。
(4)將構(gòu)成該級(jí)分的HA低聚糖的單一同位素分子量或平均分子量理論值設(shè)定為1時(shí)，該級(jí)分的質(zhì)譜分析的實(shí)測值均為0.997～1.003(相對(duì)值)。這個(gè)相對(duì)值，優(yōu)選0.998～1.002的范圍，更加優(yōu)選0.999～1.001的范圍。
這個(gè)結(jié)果說明構(gòu)成級(jí)分的HA低聚糖，其分子量(質(zhì)量)也實(shí)質(zhì)上單一，而且，暗示實(shí)質(zhì)上不含其他雜質(zhì)。
(5)構(gòu)成該級(jí)分的HA低聚糖中的碳(C)、氫(H)及氮(N)的各自含量比的理論值(重量％)，與通過該級(jí)分的元素分析得到的各元素的實(shí)測值(重量％)之差，均在±1(重量％)范圍內(nèi)。
另外，HA低聚糖為鈉鹽時(shí)，更加優(yōu)選對(duì)于鈉(Na)同樣為±1(重量％)。
這個(gè)結(jié)果說明構(gòu)成級(jí)分的HA低聚糖，其元素組成也實(shí)質(zhì)上單一，而且，實(shí)質(zhì)上不含其他雜質(zhì)。
(6)實(shí)質(zhì)上不含蛋白質(zhì)、DNA及內(nèi)毒素。
本發(fā)明級(jí)分中蛋白質(zhì)的含量，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知常用的蛋白質(zhì)測定法進(jìn)行測定，但優(yōu)選勞利(Lowry)法。通過這種方法沒有檢測出蛋白質(zhì)時(shí)(在檢測界限以下時(shí))，判斷實(shí)質(zhì)上不含蛋白質(zhì)。
本發(fā)明級(jí)分中的DNA含量，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知常用的DNA測定法進(jìn)行測定，但優(yōu)選閾值(threshold)法。通過這種方法沒有檢測出DNA時(shí)(在檢測界限以下時(shí))，判斷實(shí)質(zhì)上不含DNA。
本發(fā)明級(jí)分中的內(nèi)毒素含量，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知常用的內(nèi)毒素測定法進(jìn)行測定，但優(yōu)選使用鱟屬變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物成分的鱟試驗(yàn)法。通過這種方法沒有檢測出內(nèi)毒素時(shí)(在檢測界限以下時(shí))，判斷實(shí)質(zhì)上不含內(nèi)毒素。
本說明書中的所謂“實(shí)質(zhì)上不含”，并不是雜質(zhì)“一個(gè)分子也不存在”的含義，而是表示本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)定不含雜質(zhì)的程度(通過上述檢測方法檢測不出的程度)。即使將來分析技術(shù)進(jìn)步而可以檢測到分子單位，這個(gè)“實(shí)質(zhì)上不含”，也應(yīng)以本申請(qǐng)記載內(nèi)容為基礎(chǔ)解釋。
進(jìn)而，本發(fā)明級(jí)分的一個(gè)優(yōu)選形式中，含有的實(shí)質(zhì)上單一大小的HA低聚糖在非還原末端上具有飽和葡糖醛酸，此時(shí)本發(fā)明級(jí)分進(jìn)一步具有下面(7)所述性質(zhì)。
(7)該級(jí)分的1H-NMR及13C-NMR測定結(jié)果，與下面式(1)所示的HA低聚糖的結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生矛盾。
式(1) (式中，n表示1～29的整數(shù)，M表示質(zhì)子或一價(jià)陽離子，Ac表示乙酰基)這個(gè)結(jié)果說明構(gòu)成級(jí)分的HA低聚糖為上式所示HA低聚糖，其分子結(jié)構(gòu)也實(shí)質(zhì)上單一，而且，實(shí)質(zhì)上不含其他雜質(zhì)。
<3>本發(fā)明藥品本發(fā)明藥品，為以本發(fā)明的低聚糖為有效成分的藥品。
作為本發(fā)明藥品的有效成分的本發(fā)明的低聚糖，或其優(yōu)選的形態(tài)等，如同前述<1>所述。
其中，作為本發(fā)明的低聚糖，其大小優(yōu)選選自4糖～20糖(HA4糖～HA20糖)，更加優(yōu)選使用前式(2)中的n為選自1～9的整數(shù)的物質(zhì)，特別優(yōu)選使用前式(1)中的n為選自1～9的整數(shù)的物質(zhì)。
更加優(yōu)選，使用選自4糖～16糖大小的本發(fā)明的低聚糖(HA4糖～HA16糖)，更加優(yōu)選使用前式(2)中的n為選自1～7的整數(shù)的物質(zhì)，特別優(yōu)選使用前式(1)中的n為選自1～7的整數(shù)的物質(zhì)。
更加優(yōu)選，使用選自4糖～14糖大小的本發(fā)明的低聚糖(HA4糖～HA14糖)，更加優(yōu)選使用前式(2)中的n為選自1～6的整數(shù)的物質(zhì)，特別優(yōu)選前式(1)中的n為選自1～6的整數(shù)的物質(zhì)。
其中作為本發(fā)明的低聚糖，優(yōu)選使用4糖物質(zhì)(HA4糖)，更加優(yōu)選使用前式(2)中的n為1的物質(zhì)，特別優(yōu)選使用前式(1)中的n為1的物質(zhì)。通過使用HA4糖，可以發(fā)揮各種優(yōu)良的藥理作用。
另外，前式(1)及(2)表示在非還原末端上含有葡糖醛酸的本發(fā)明的低聚糖，但根據(jù)本發(fā)明藥品的具體用途，可以使用在非還原末端上含有不飽和葡糖醛酸的低聚糖，此時(shí)優(yōu)選其大小也同上所述。
更加優(yōu)選，作為本發(fā)明藥品的有效成分使用本發(fā)明級(jí)分。以制劑使用的本發(fā)明級(jí)分及其優(yōu)選的形態(tài)，如上述<2>記載。而且，本發(fā)明級(jí)分中含有的HA低聚糖的優(yōu)選大小，也同上述。
通過使用本發(fā)明級(jí)分，可以提高本發(fā)明藥品中的HA低聚糖所含比例，而且可以制備實(shí)質(zhì)上不含作為藥品禁止混入的物質(zhì)的本發(fā)明藥品。
本發(fā)明藥品可以通過公知的方法進(jìn)行制劑化。制劑化時(shí)，在對(duì)于本發(fā)明藥品的有效成分HA低聚糖不會(huì)帶來負(fù)面影響，而且在不影響本發(fā)明藥品效果的范圍內(nèi)，可以使用通常藥品中所使用的其他藥品活性成分，或常用的穩(wěn)定劑、乳化劑、滲壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、止痛劑、著色劑、賦形劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑等。
進(jìn)而，本發(fā)明藥品，優(yōu)選含有本發(fā)明級(jí)分作為有效成分，但是將具有選自4糖～60糖大小的HA低聚糖作為有效成分，這樣的HA低聚糖至少含有有效量也可行，在不影響本發(fā)明藥品效果的范圍內(nèi)，即使含有其他分子大小的HA低聚糖，或超出低聚糖范圍大小的HA，也不會(huì)受影響。
本發(fā)明藥品，優(yōu)選用作Hsp的表達(dá)增強(qiáng)用途、細(xì)胞死亡抑制用途、細(xì)胞障礙抑制用途，或細(xì)胞、組織保護(hù)用途的藥品，根據(jù)這些用途可以制備以下制劑。
Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑本說明書中所謂“表達(dá)增強(qiáng)”的術(shù)語，具有“表達(dá)量增加”及“活性增強(qiáng)”的雙層含義。因此，本說明書中所謂“熱沖擊蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)劑”(Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑)的術(shù)語，具有“增加熱沖擊蛋白質(zhì)(Hsp)的表達(dá)量的制劑”及“增強(qiáng)Hsp活性的制劑”的雙層含義。
(1)Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑的給藥方法、劑型等本發(fā)明藥品用作Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑時(shí)，HA低聚糖中特別優(yōu)選使用4糖物質(zhì)。這樣，可以發(fā)揮極其優(yōu)良的Hsp表達(dá)增強(qiáng)作用。
Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑的給藥方法，只要在HA低聚糖發(fā)揮Hsp表達(dá)增強(qiáng)效果的范圍內(nèi)沒有特別的限定，例如注射(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)等)、經(jīng)鼻、經(jīng)口、經(jīng)皮、吸入等。而且，根據(jù)這樣的給藥方法可以選擇適當(dāng)?shù)膭┬?，例如可以采用注射?溶液、懸濁液、乳濁液、使用時(shí)溶解用的固形劑等)、片劑、膠囊劑、液劑、顆粒劑、散劑、脂化劑、軟膏劑、硬膏劑、洗劑、糊劑、貼劑、凝膠劑、坐劑、外用散劑、噴劑、吸入散劑等。
Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑中的HA低聚糖(特別是HA4糖)的含量沒有特別的限定，但是例如將Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑作為注射劑提供時(shí)，優(yōu)選0.1～10％(w/v)。
例如Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑作為注射劑提供時(shí)，其形態(tài)，可以是溶液、凍結(jié)物、或凍干物中任何一種。將其填充、密封在細(xì)頸瓶、小藥水瓶、注射器等適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，以該形態(tài)流通或保存，可以作為注射劑進(jìn)行給藥。
如上所述，作為Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑的有效成分，特別優(yōu)選HA4糖，但是另外，含有其他分子大小的HA低聚糖也沒有影響。而且從后面的實(shí)施例中可以看出，HA4糖具有特殊的極其顯著的Hsp表達(dá)增強(qiáng)作用，所以僅僅增加在Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑中的HA4糖含量，就可以得到很好的效果，而且可以減少維持與其他分子大小的HA低聚糖相同效果的給藥量。從而，Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑中的HA低聚糖特別優(yōu)選實(shí)質(zhì)上只由4糖構(gòu)成，優(yōu)選不添加HA4糖以外的HA低聚糖。
(2)Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑的給藥對(duì)象等期待Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑，對(duì)Hsp產(chǎn)生的防御作用所暗示的細(xì)胞障礙或細(xì)胞死亡等引起的疾病中的很多疾病會(huì)產(chǎn)生效果，例如心臟疾病(心肌梗塞等)、尿細(xì)管障礙、循環(huán)器官疾病、腦疾病(腦中風(fēng)等)、神經(jīng)疾病等血管狹窄或缺血導(dǎo)致的缺血性疾病，后天性免疫不全綜合癥、免疫抑制劑或抗癌劑的給藥引起的胸腺細(xì)胞的障礙，末梢T細(xì)胞的減少、免疫不全癥等免疫關(guān)聯(lián)疾病、肝炎、潰瘍性大腸炎等炎癥、外傷、細(xì)菌感染癥、病毒感染癥、阿爾茨海默病、糖尿病、肥大癥、川崎病、精神分裂癥、發(fā)熱、代謝疾病、癌等。
而且不僅是細(xì)胞障礙或細(xì)胞死亡引起的疾病，對(duì)于期待Hsp的細(xì)胞、組織保護(hù)作用的對(duì)象，也可以適用Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑。對(duì)于這一點(diǎn)，在后面的“細(xì)胞、組織保護(hù)劑”中詳細(xì)說明。
被給用Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑的動(dòng)物，優(yōu)選脊椎動(dòng)物，特別優(yōu)選哺乳動(dòng)物，特別優(yōu)選人?？梢詫⑦@些疾病的預(yù)防，進(jìn)行的抑制(防止惡化)，癥狀的改善或治療等為目的給用Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑，但優(yōu)選作為預(yù)防藥物進(jìn)行給藥。
Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑中HA低聚糖、特別是HA4糖的配合量、一次給藥量、給藥間隔等，增強(qiáng)劑的給藥方法、給藥形態(tài)、使用目的等，應(yīng)該根據(jù)患者的具體癥狀、年齡、性別、體重等個(gè)別確定，沒有特別的限定，但作為HA4糖的臨床給藥量，例示成人1人一次300～7500mg。而且Hsp表達(dá)增強(qiáng)的給藥間隔，可以是一日一次，也可以一日分成2～3次。
Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑，也可以用作與應(yīng)力蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用有關(guān)的實(shí)驗(yàn)用試驗(yàn)藥品。
細(xì)胞死亡抑制劑細(xì)胞死亡抑制劑，是利用Hsp的表達(dá)增強(qiáng)作用的用途之一。即，HA低聚糖(特別是HA4糖)，不僅具有Hsp表達(dá)增強(qiáng)作用，實(shí)際上也發(fā)揮細(xì)胞死亡抑制作用，所以將其應(yīng)用于細(xì)胞死亡抑制的目的。
可以適用該細(xì)胞死亡抑制劑的疾病，只要是通過Hsp的表達(dá)增強(qiáng)可以抑制細(xì)胞死亡疾病，則沒有特別的限定，Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑的說明優(yōu)選已經(jīng)例舉的疾病。
被給用該細(xì)胞死亡抑制劑的動(dòng)物、給藥目的、HA低聚糖(特別是HA4糖)的配合量、給藥量、給藥間隔等，與Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑相同。
細(xì)胞障礙抑制劑
HA低聚糖(特別是HA4糖)不僅具有Hsp的表達(dá)增強(qiáng)作用，實(shí)際上也發(fā)揮細(xì)胞障礙抑制作用，所以將其應(yīng)用于細(xì)胞障礙抑制的目的。
可以適用該細(xì)胞障礙抑制劑的疾病，只要是通過Hsp的表達(dá)增強(qiáng)可以抑制細(xì)胞障礙疾病，則沒有特別的限定，Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑的說明優(yōu)選已經(jīng)例舉的疾病。
被給用該細(xì)胞障礙抑制劑的動(dòng)物、給藥目的、HA低聚糖(特別是HA4糖)的配合量、給藥量、給藥間隔等，與Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑相同。
細(xì)胞、組織保護(hù)劑HA低聚糖(特別是HA4糖)不僅具有Hsp的表達(dá)增強(qiáng)作用，實(shí)際上也發(fā)揮細(xì)胞、組織保護(hù)作用，所以將其應(yīng)用于細(xì)胞、組織保護(hù)的目的。
該細(xì)胞、組織保護(hù)劑，可以適用于期待Hsp的細(xì)胞、組織保護(hù)作用的對(duì)象。例如，可以用于需要細(xì)胞、組織保護(hù)的的疾病等，或取出生物體外的細(xì)胞、組織保護(hù)等。
作為需要細(xì)胞或組織保護(hù)的疾病，可以例舉消化性潰瘍(胃、十二指腸潰瘍等)、胃炎、肝障礙(肝炎等)、潰瘍性大腸炎、缺血性心疾病、心肌炎、腦中風(fēng)、腦梗塞等。
該細(xì)胞、組織保護(hù)劑，具體來說，優(yōu)選用作以下制劑。
(1)潰瘍處置劑、肝障礙處置劑前述細(xì)胞、組織保護(hù)劑，通過用作處置潰瘍的制劑，可以作為潰瘍處置劑，通過用作處置肝障礙的制劑，可以作為肝障礙處置劑。另外，本發(fā)明中所述“處置”的含義在于，以疾病的預(yù)防、維持(防止惡化)、減輕(癥狀的改善)及治療為目的，對(duì)于患有該疾病的動(dòng)物進(jìn)行給藥，“處置劑”為用于該處置的藥劑。
(2)IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑、IL-8產(chǎn)生抑制劑前述細(xì)胞、組織保護(hù)劑，可以用于IL-10減少引起的疾病，或需要促進(jìn)產(chǎn)生IL-10的疾病等。通過將細(xì)胞、組織保護(hù)劑用作促進(jìn)產(chǎn)生IL-10的制劑，可以作為IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑。
而且，該細(xì)胞、組織保護(hù)劑，可以用于IL-8增加引起的疾病，或需要抑制產(chǎn)生IL-8的疾病等。通過將細(xì)胞、組織保護(hù)劑用作抑制產(chǎn)生IL-8的制劑，可以作為IL-8產(chǎn)生抑制劑。
作為這種制劑的給藥對(duì)象的動(dòng)物，或給藥目的等，與Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑的說明相同。
(3)器官保存劑前述細(xì)胞、組織保護(hù)劑，可以用于保護(hù)取出生物體外的細(xì)胞、組織的目的。通過將該細(xì)胞、組織保護(hù)劑用作保存取出生物體外的細(xì)胞或組織的制劑，可以作為例如器官保存劑。具體來說，通過用該器官保存劑灌流為移植而取出的器官(肝臟、腎臟、心臟、肺等)，或在該器官保存劑中保存、保持等，可以抑制該器官的細(xì)胞、組織傷害(浮腫、細(xì)胞死亡等)。
在細(xì)胞、組織保護(hù)劑中的HA低聚糖配合量、一次給藥(使用)量、給藥間隔等，根據(jù)給藥(使用)方法、形態(tài)、目的等具體的狀況可以個(gè)別確定。
例如將細(xì)胞、組織保護(hù)劑作為潰瘍處置劑、肝障礙處置劑、IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑、IL-8產(chǎn)生抑制劑等對(duì)人給藥時(shí)，作為HA低聚糖(特別是HA4糖)的臨床給藥量，可以例舉每一成人一次120～6000mg。
將該細(xì)胞、組織保護(hù)劑，作為保護(hù)取出生物體外的細(xì)胞、組織目的使用時(shí)，可以將其作為液劑、灌注用劑、使用時(shí)溶解用的固形劑等而制劑化。作為器官保存劑使用時(shí)，根據(jù)保存或保持的器官大小、保存時(shí)間、溫度等具體狀況，可以個(gè)別確定HA低聚糖(特別是HA4糖)的配合量。
該細(xì)胞、組織保護(hù)劑中HA低聚糖(特別是HA4糖)的濃度也沒有特別的限定，但是作為例如注射劑(溶液)或保存器官的液劑提供時(shí)，優(yōu)選1ng/ml～1mg/ml。
細(xì)胞、組織保護(hù)劑作為注射劑、或液劑提供時(shí)，其形態(tài)可以是溶液、凍結(jié)物、或凍干物中的任何一種。將其填充、密封在細(xì)頸瓶、小藥水瓶、注射器等適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，以該形態(tài)流通或保存，可以作為注射劑進(jìn)行給藥。
進(jìn)而，本發(fā)明不僅包括上述制劑，也包括在活體外或在活體內(nèi)將HA低聚糖(特別是HA4低聚糖)作用于細(xì)胞或生物體組織等適用對(duì)象，在該適用對(duì)象中增強(qiáng)Hsp的表達(dá)，抑制細(xì)胞死亡，抑制細(xì)胞障礙，或保護(hù)細(xì)胞、組織(例如，保存器官，處置潰瘍，處置肝障礙，促進(jìn)IL-10產(chǎn)生，或抑制IL-8產(chǎn)生)的方法。
圖1為表示HA4在凝膠過濾色譜法中的洗脫曲線。上段的縱軸表示210nm吸收，下段的縱軸表示RI吸收。而且橫軸始終表示洗脫時(shí)間。
圖2為表示HA6在凝膠過濾色譜法中的洗脫曲線。縱軸及橫軸的說明與圖1相同。
圖3為表示HA8在凝膠過濾色譜法中的洗脫曲線。縱軸及橫軸的說明與圖1相同。
圖4為表示HA10在凝膠過濾色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖1相同。
圖5為表示HA12在凝膠過濾色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖1相同。
圖6為表示HA14在凝膠過濾色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖1相同。
圖7為表示HA4在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線?？v軸表示210nm吸收，橫軸表示洗脫時(shí)間。
圖8為表示HA6在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線。縱軸及橫軸的說明與圖7相同。
圖9為表示HA8在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖7相同。
圖10為表示HA10在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線。縱軸及橫軸的說明與圖7相同。
圖11為表示HA12在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖7相同。
圖12為表示HA14在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖7相同。
圖13為表示HA48在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖7相同。
圖14為表示HA50在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖7相同。
圖15為表示HA52在陰離子交換色譜法中的洗脫曲線?？v軸及橫軸的說明與圖7相同。
圖16為表示熒光標(biāo)記低聚糖的電泳結(jié)果的圖。
圖17為表示HA4的質(zhì)譜的圖。
圖18為表示HA6(上段)、HA8(中段)及HA10(下段)的質(zhì)譜的圖。
圖19為表示HA6(上段)、HA8(中段)及HA10(下段)的反褶積結(jié)果的圖。
圖20為表示HA12(上段)、HA14(中段)及HA16(下段)的質(zhì)譜的圖。
圖21為表示HA12(上段)、HA14(中段)及HA16(下段)的反褶積結(jié)果的圖。
圖22為表示HA48(上段)、HA50(中段)及HA52(下段)的質(zhì)譜的圖。
圖23為表示HA48(上段)、HA50(中段)及HA52(下段)的反褶積結(jié)果的圖。
圖24為表示HA4的1H-NMR光譜的圖。
圖25為表示HA4的13C-NMR光譜的圖。
圖26為表示HA6的1H-NMR光譜的圖。
圖27為表示HA6的13C-NMR光譜的圖。
圖28為表示HA8的1H-NMR光譜的圖。
圖29為表示HA8的13C-NMR光譜的圖。
圖30為表示HA10的1H-NMR光譜的圖。
圖31為表示HA10的13C-NMR光譜的圖。
圖32為表示HA12的1H-NMR光譜的圖。
圖33為表示HA12的13C-NMR光譜的圖。
圖34為表示HA14的1H-NMR光譜的圖。
圖35為表示HA14的13C-NMR光譜的圖。
圖36為表示HA16的1H-NMR光譜的圖。
圖37為表示HA16的13C-NMR光譜的圖。
圖38為表示HA48的1H-NMR光譜的圖。
圖39為表示HA50的1H-NMR光譜的圖。
圖40為表示HA52的1H-NMR光譜的圖。
圖41為表示熱沖擊后HA4糖引起的HSF1活化的圖。
圖42為表示熱沖擊后HA4糖誘導(dǎo)的Hsp72的表達(dá)的圖。
圖43為表示各種HA低聚糖對(duì)由缺乏血清誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(編程性細(xì)胞死亡)的抑制程度的圖。
圖44為表示HA4糖對(duì)于器官浮腫的抑制效果的圖。
圖45為表示HA4糖對(duì)于細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮的抑制效果的圖。
圖46為表示由HA4糖獲得的減少TUNEL染色細(xì)胞數(shù)的圖。
圖47為表示HA4糖對(duì)于細(xì)胞、組織障礙的抑制效果的圖。
圖48為表示HA4糖對(duì)于胃潰瘍的抑制效果的圖。
圖49為表示HA4糖對(duì)肝障礙的抑制效果(GOT活性)的圖。
圖50為表示HA4糖對(duì)肝障礙的抑制效果(白血球數(shù))的圖。
圖51為表示HA4糖促進(jìn)IL-10產(chǎn)生的效果的圖。
圖52為表示HA4糖抑制IL-8產(chǎn)生的效果的圖。
具體實(shí)施例方式
下面，通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。
以下，將HA4糖級(jí)分略記為“HA4”，將HA6糖級(jí)分略記為“HA6”，將HA8糖級(jí)分略記為“HA8”。[實(shí)施例1]本發(fā)明的低聚糖及本發(fā)明級(jí)分的制備與理化性質(zhì)1.本發(fā)明的低聚糖及本發(fā)明級(jí)分的制備以從雞冠分離、純化的HA的鈉鹽為原料，通過以下方法制備了本發(fā)明的低聚糖及本發(fā)明級(jí)分。另外，作為原料的HA的鈉鹽，通過使用醋酸纖維素膜的電泳(電泳緩沖液吡啶-甲酸緩沖液，電流15mA，電泳時(shí)間30分鐘)表現(xiàn)出單一的譜帶，沒有檢測出HA以外的粘多糖(軟骨素、硫酸-4-軟骨素、硫酸-6-軟骨素、硫酸軟骨素E、硫酸軟骨素D、肝素、硫酸類肝素、硫酸皮膚素)。(制備例1)利用透明質(zhì)酸酶的分解將HA的鈉鹽25g溶解于含有0.15M NaCl的的0.1M磷酸緩沖液(pH5.3)1.IL中。在所得溶液中，添加來自牛睪丸的透明質(zhì)酸酶(5.342單位/mg；生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)200mg，在37℃下反應(yīng)9小時(shí)。
反應(yīng)之后，以10,000rpm離心分離30分鐘后回收上清液。將回收的上清液，加載到具有作為陰離子交換基的三甲基銨甲基的強(qiáng)堿性陰離子交換劑的Dowex1×2(100～200目)(Dow chemical制造)離子交換柱(φ1.5×123cm)上，通過NaCl的直線濃度梯度(0.01M～0.50M)洗脫。通過利用咔唑法(carbazole method)檢測所得到級(jí)分中的糖醛酸，篩選了含有HA低聚糖的級(jí)分。將適當(dāng)?shù)募?jí)分匯集并進(jìn)行濃縮，利用Sephadex G-10(Pharmacia制造；φ3×124)進(jìn)行脫鹽，之后實(shí)施凍干。
得到的級(jí)分的凍干重量，表示在以下的括號(hào)內(nèi)。
HA4(330mg)、HA6(1210mg)、HA8(305mg)、HA10(1625mg)、HA12(685mg)、HA14(620mg)、HA16(430mg)、HA18(210mg)、HA20(202mg)、HA22(819mg)、HA24(197mg)、HA26(187mg)、HA28(159mg)、HA30(137mg)、HA32(122mg)、HA34(102mg)、HA36(91mg)、HA38(89mg)、HA40(65mg)、HA42(76mg)、HA44(61mg)、HA46(58mg)、HA48(46mg)、HA50(48mg)、HA52(21mg)。(制備例2)利用軟骨素酶ACI的分解將HA的鈉鹽8g溶解于含有0.1％牛血清白蛋白的0.1M乙酸緩沖液(ph6.0)500ml中。
在所得溶液中，添加軟骨素酶ACI(生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)32單位，在37℃下反應(yīng)6小時(shí)。
反應(yīng)之后，以10,000rpm離心分離30分鐘后回收上清液。將回收的上清液，加載到Dowex1×2(100～200目)(Dow chemical制造)離子交換柱(φ4.5×123cm)上，通過NaCl的直線濃度梯度(0.01M～0.50M)洗脫。通過利用咔唑法檢測所得級(jí)分中的糖醛酸，篩選了含有HA低聚糖的級(jí)分。將適當(dāng)?shù)募?jí)分匯集后進(jìn)行濃縮，利用Sephadex G-10(Pharmacia制造；φ3×124)進(jìn)行脫鹽，之后實(shí)施凍干。
所得級(jí)分的凍干重量，表示在以下的括號(hào)內(nèi)。其中[Δ]表示非還原末端糖為不飽和糖。
ΔHA4(133mg)、ΔHA6(133mg)、ΔHA8(84mg)、ΔHA10(109mg)、ΔHA12(100mg)、ΔHA14(101mg)、ΔHA16(73mg)、ΔHA18(31mg)、ΔHA20(9mg)。(制備例3)DMSO法將HA的鈉鹽10g溶解于含有10％的0.1M HCl的二甲基亞砜(DMSO)3L中。在105℃下加熱處理16小時(shí)。
處理之后，加載到Dowex1×2(100～200目)(Dow chemical制造)離子交換柱(φ3.0×78cm)上進(jìn)行了色譜分析。洗脫通過NaCl的直線濃度梯度(0.01M～0.50M)進(jìn)行。通過利用咔唑法檢測所得到級(jí)分中的糖醛酸，篩選了含有HA低聚糖的級(jí)分。將適當(dāng)?shù)募?jí)分匯集后進(jìn)行濃縮，利用Sephadex G-10(Pharmacia制造；φ3×124)進(jìn)行脫鹽，之后實(shí)施凍干。
得到的級(jí)分的凍干重量，表示在以下的括號(hào)內(nèi)。
HA2(50mg)、HA4(1100mg)、HA6(232mg)、HA8(1015mg)、HA10(1033mg)、HA12(459mg)。
將這樣得到的各種大小的HA低聚糖，進(jìn)行了以下各種分析。
2.本發(fā)明級(jí)分的理化性質(zhì)對(duì)于上述制備例1中得到的各HA低聚糖(鈉鹽)級(jí)分，檢測了各種理化性質(zhì)。
(1)凝膠過濾色譜法分析使用的柱TSKGe12500+3000+4000pwxl(TOSOH株式會(huì)社)
溶劑0.05M NaCl流速0.6ml/分檢測波長210nm、及差示折射計(jì)(RI)試樣加載量作為HA低聚糖的量，為200μg/發(fā)射(Shot)作為試樣使用HA4(第1批)～HA14時(shí)的洗脫曲線，表示在圖1～圖6中。各圖的上段表示在210nm檢測的結(jié)果，下段表示以差示折射計(jì)檢測的結(jié)果。
從這些圖，可以看出任何級(jí)分都表示出實(shí)質(zhì)上單一的峰。
而且，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和的主HA峰的相對(duì)面積，如表1所示，基于210nm吸收檢測時(shí)均為85％以上，用差示折射計(jì)(RI)檢測時(shí)均為98％以上。
表1
(2)離子交換色譜法分析柱YMC NH2柱(株式會(huì)社YMC)溶劑使用NaH2PO4的0 M至0.8M的濃度梯度流速1ml/分檢測波長210nm試樣加載量作為HA低聚糖的量，為20μg/發(fā)射作為試樣使用HA4(第1批)～HA14及HA48～HA52時(shí)的洗脫曲線，表示在圖7～圖15中。從這些圖，可以看出任何級(jí)分都表示出實(shí)質(zhì)上單一的峰。而且，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和的主HA峰的相對(duì)面積，如表2所示均為90％以上。
表2
(3)熒光標(biāo)記凝膠電泳分析將HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14及HA16各自進(jìn)行如下處理。同時(shí)，對(duì)于HA低聚糖混合物級(jí)分(也含HA2糖；以下略記為“混合物”)也進(jìn)行了同樣的處理。
(3-1)熒光標(biāo)記低聚糖的調(diào)制將各個(gè)級(jí)分所含HA低聚糖，使用FACERN-linked OligosaccharideProfiling Kit(Glyko，Inc.，Novato，CA.U.S.A)實(shí)施了熒光標(biāo)記。
將含有大約2nmol(對(duì)于混合物，以HA2糖單位大約2nmol)HA低聚糖量的級(jí)分，在0.5mL塑料管中利用離心式凍結(jié)真空干燥器(Speedvac，AS160，SAVANT INSTRUMENTS INC.NY.U.S.A)進(jìn)行干燥。干燥后，在各管中各添加5μL的8-氨基萘-1，3，6-三磺酸二鈉鹽(ANTS)溶液(GLYKO，L2，Part#50058reconstituted OLIGO LabelingDye)，攪拌后在室溫放置15分鐘。進(jìn)而，各添加5μL的氰硼氫鈉溶液(GLYKO，L1，Part#50056Labeling Reducing Agent)，密封并在36℃下溫育16小時(shí)。
溫育之后，在離心式凍結(jié)真空干燥器上通過15分鐘，進(jìn)行部分干燥，之后加入20μL蒸餾水。
(3-2)熒光標(biāo)記低聚糖的電泳使用GLYKO O-linked Oligsaccharide Profiling Gel(GLYKO，Part#60200；交聯(lián)度為36％的聚丙烯酰胺凝膠)進(jìn)行了電泳。
將1包OLIGO Gel Running Buffer(GLYKO，Part#7000)用蒸餾水溶解使其達(dá)到1.5L，并在冰中冷卻。
凝膠盒(GLYKO，GLYKO Gel Box，Part#40026)中循環(huán)冷卻水，在其中加入已冷卻的Running Buffer，并放上凝膠。凝膠盒也用冰進(jìn)行冷卻。
各取2μL含有熒光標(biāo)記的HA低聚糖的各種級(jí)分溶液，與蒸餾水3μL和Loading Buffer(GLYKO，Part#50064)5μL混合。取2μL混合物溶液與Loading Buffer2μL混合。將該各自的4μL加載到凝膠上。各級(jí)分的加載量是使每一泳道的HA低聚糖的加載量為80pmol。
用1000V的恒定電壓電泳160分鐘，通過紫外透照器(NLM-20E型，UVP，CA，U.S.A)照射365nm的光發(fā)出的熒光，利用快速成像照相機(jī)(MAMIYA，Professional SD，f＝127mm)及快速成像底片(PolaloidRPolapan T667，iso3000，Polapoid corp.MA.U.S.A.)進(jìn)行記錄。其結(jié)果表示在圖16中。
圖16中泳道與試樣的關(guān)系如下。
泳道1混合物，泳道2HA4，泳道3HA6，泳道4HA8，泳道5HA10，泳道6HA12，泳道7HA14，泳道8HA16。
混合物表現(xiàn)出梯狀譜帶，但分級(jí)的各低聚糖級(jí)分，全都形成具有對(duì)應(yīng)于其大小的泳動(dòng)度的單一的譜帶，而且，沒有檢測出其他大小HA低聚糖的譜帶。
另外，大小越小，得到的泳動(dòng)度越大。在各級(jí)分中低聚糖譜帶的位置(泳動(dòng)位置)，與混合物表示出的梯狀譜帶的各個(gè)大小的位置幾乎一致，即使在多個(gè)大小的低聚糖的混合物中，各分子的泳動(dòng)度也沒有受到影響。
GLYKO O-linked Profiling Gel是交聯(lián)度為36％的聚丙烯酰胺凝膠。8-氨基萘-1，3，6-三磺酸二鈉鹽(ANTS)是具有三價(jià)負(fù)電荷的熒光物質(zhì)。
將不帶電荷的2-氨基吖啶酮(AMAC)作為熒光物質(zhì)時(shí)，該凝膠上的所有低聚糖都基本不動(dòng)。從而可以看出，這個(gè)高交聯(lián)度凝膠的電泳中僅HA低聚糖本身的負(fù)電荷不足，需要已結(jié)合的ANTS的電荷。而且，沒有使用公知的與糖鏈骨架結(jié)構(gòu)相互作用的硼酸，故暗示低聚糖的大小與聚丙烯酰胺的網(wǎng)目大小的相互作用影響泳動(dòng)度。
使用Glyko公司的其他凝膠(交聯(lián)度為20％或21％)，并用ANTS標(biāo)記時(shí)，HA8糖以下不能分離，或HA4糖以下與泳動(dòng)前線重疊而不能檢測出。
(4)質(zhì)譜分析通過電噴霧離子化質(zhì)譜分析法(electrospray ionization massspectrometry；ESIMS)進(jìn)行質(zhì)譜分析。
(4-1)方法
(4-1-1)分析試樣將HA4(第1批)、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14、HA16、HA48、HA50及HA52配成水溶液，使各自濃度依次達(dá)到2.6mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、6.5mg/ml、1.3mg/ml、1mg/ml、1mg/ml及1mg/ml。
另外，對(duì)于與HA低聚糖有關(guān)的分子量的理論值，以HA4糖～52糖具有下式(1)所示結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)求得。
式(1) (式中，n表示1～29的整數(shù)，M表示質(zhì)子或一價(jià)陽離子，Ac表示乙?；?(4-1-2)試藥在試驗(yàn)中使用的甲醇(和光純藥)及蒸餾水(和光純藥)是用于HPLC的，甲酸銨(和光純藥)使用了特級(jí)。
(4-1-3)儀器及器材1)HPLC系統(tǒng)Agilent1100系列二元泵、脫氣裝置、自動(dòng)取樣器(AgilentTechnologies)2)質(zhì)譜儀三重四極型質(zhì)譜儀TSQ(ThermoQuest)(4-1-4)ESIMS分析條件向質(zhì)譜儀導(dǎo)入試樣是通過向連接在質(zhì)譜儀上的HPLC系統(tǒng)中注入各試樣溶液5μL或10μL進(jìn)行的。HPLC及ESIMS的分析條件如下。
1)HPLC移動(dòng)相10mM甲酸銨水溶液/甲醇＝80/20流速0.2ml/min柱無注入量10μL2)ESIMS探針Off-axis離子模式陰離子模式離子化法ESI法(電噴霧離子化法)ESI噴霧電壓4.5kV熱毛細(xì)管溫度350℃輔助氣體35單位保護(hù)氣體(sheath gas)50psi掃描范圍m/z10-2500或10-4000掃描時(shí)間1.5秒或3秒(4-1-5)反褶積分析從觀測到的ESIMS光譜估算分子量的反褶積分析，通過分析軟件Xcalibur Bioworks(ThermoQuest)進(jìn)行。
(4-2)結(jié)果HA4～HA16的陰離子ESIMS光譜測定結(jié)果總結(jié)在表3及表4中，HA4～HA16或HA48～HA52的光譜表示在圖17～圖23中。
表3
上段觀測值下段峰的相對(duì)強(qiáng)度(％)
表4
上段觀測值下段峰的相對(duì)強(qiáng)度(％)
在以上結(jié)果中，觀測到了都被認(rèn)為來自HA低聚糖的與各種分子有關(guān)的離子，這與HA4(第1批)相當(dāng)于HA4糖，HA6相當(dāng)于HA6糖，HA8相當(dāng)于HA8糖，HA10相當(dāng)于HA10糖，HA12相當(dāng)于HA12糖，HA14相當(dāng)于HA14糖，HA16相當(dāng)于HA16糖，HA48相當(dāng)于HA48糖，HA50相當(dāng)于HA50糖，及HA52相當(dāng)于HA52糖的解釋不矛盾。
根據(jù)以上結(jié)果，單一同位素分子量的理論值設(shè)定為1時(shí)，求得了主峰的實(shí)測值的相對(duì)值。其結(jié)果表示在表5A中。另外，對(duì)于HA4使用了有關(guān)[M-H]-的實(shí)測值與理論值。
表5A
另外，將平均分子量的理論值設(shè)定為1時(shí)，求得了主峰的實(shí)測值的相對(duì)值。其結(jié)果表示在表5B中。另外，對(duì)于HA4使用了有關(guān)[M-H]-的實(shí)測值與理論值。
表5B
這些結(jié)果說明，構(gòu)成本發(fā)明級(jí)分的HA低聚糖的單一同位素分子量或平均分子量的理論值設(shè)定為1時(shí)，通過級(jí)分的質(zhì)譜分析得到實(shí)測值均在0.999～1.001(相對(duì)值)的范圍內(nèi)。
(5)元素分析將HA4(第1批)、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14及HA16各自在80℃下減壓干燥2小時(shí)，立即用元素分析器進(jìn)行測定。其結(jié)果表示在表6中。
表6試樣 元素理論值(％) 實(shí)測值(％) 誤差HA4(第1批)C 40.98 40.630.35H 5.165.20 -0.04N 3.413.34 0.07Na 5.605.48 0.12HA6 C 41.28 40.740.54H 5.115.17 -0.06N 3.443.31 0.13Na 5.645.75 -0.11HA8 C 41.44 41.410.03H 5.095.22 -0.13N 3.453.36 0.09Na 5.675.41 0.26HA10 C 41.53 41.410.12H 5.085.24 -0.16N 3.463.43 0.03Na 5.685.45 0.23HA12 C 41.59 40.960.63H 5.075.33 -0.26N 3.463.23 0.23Na 5.695.41 0.28HA14 C 41.64 41.440.20H 5.065.36 -0.30N 3.473.37 0.10Na 5.695.20 0.49這個(gè)結(jié)果說明，構(gòu)成本發(fā)明級(jí)分的HA低聚糖(鈉鹽)中的碳(C)、氫(H)、氮(N)及鈉(Na)的各自含量比的理論值(重量％)，與該級(jí)分通過元素分析而得到的各元素的實(shí)測值(重量％)之差，都在±1(重量％)范圍內(nèi)。
(6)核磁共振光譜(NMR)利用VARIAN UnityInova500型測定了HA低聚碳級(jí)分的1H-NMR及13C-NMR。測定溶劑使用了D2O。內(nèi)標(biāo)為t-BuOH(1H1.23ppm，13C32.461ppm)，測定溫度設(shè)定為23℃，進(jìn)行測定。各HA低聚糖級(jí)分的結(jié)果如下。另外，各自的光譜表示在圖24～圖40中。
(6-1)HA4(組1)的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；2.004(s，3H，NAc)，2.018，2.019(3H，NAc)，3.292-3.326(m，1H，H-2d)，3.354(dd，1H，J1，2＝7.9Hz，J2，3＝9.5Hz，H-2b)，4.027(dd，0.6H，J1，2＝3.5Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.453(d，J1，2＝7.9Hz，H-1d)，4.460(d，H-1bβ)，4.502(d，0.6H，H-1bα)，4.555(d，1H，J1，2＝8.4Hz，H-1c)，4.705(d，0.4H，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.144(d，0.6H，H-1aα)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖24中。
125MHz13C-NMRδ；24.84，25.09，25.36(NHCOCH3)，55.81(C-2aα)，57.09(C-2c)，58.44(C-2aβ)，63.40，63.57(C-6a或C-6c)，75.29，75.33(C-2bα或C-2bβ)，75.58(C-2d)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.44(C-1c)，105.80105.84，105.95(C-1bα或C-1bβ或C-1d)，177.00，177.04，177.41，177.68，177.80，178.33(羰基)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖25中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝1表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-2)HA6的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；2.002，2.010，2.017(9H，NAc)，3.291-3.368(m，3H，H-2b，H-2d和H-2f)，4.026(dd，0.6H，J1，2＝3.5Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.452，4.459(d×2，2.4H，J1，2＝7.8Hz，J1，2＝7.8Hz，H-1bβ，H-1d和H-1f)，4.500(d，0.6H，J1，2＝7.9Hz，H-1bα)，4.544，4.550(d×2，2H，J1，2＝8.5Hz，J1，2＝8.5Hz，H-1c或H-1e)，4.702(d，J1，2＝8.3Hz，H-1aβ)，5.142(d，0.6H，H-1aα)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖26中。
125MHz13C-NMRδ；24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.81(C-2aα)，57.09，57.16(C-2c或C-2e)，58.44(C-2aβ)，63.40，63.57(C-6a或C-6c或C-6e)，75.28，75.31，75.34，75.57(C-2bα或C-2bβ或C-2d或C-2f)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.40，103.45(C-1c或C-1e)，105.80，105.85，105.94，106.02(C-1bα或C-1bβ或C-1d或C-1f)，176.97，177.40，177.68，177.80，178.27(羰基)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖27中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝2表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]2-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-3)HA8的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；
2.002，2.003，2.008，2.016(12H，NAc)，3.290-3.368(m，4H，H-2b，H-2d，H-2f和H-2h)，4.025(dd，0.6H，J1，2＝3.5Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.450，4.458(d×2，3.4H，J1，2＝7.8Hz，J1，2＝7.8Hz，H-1bβ，H-1d，H-1f和H-1h)，4.500(d，0.6H，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，4.539，4.543，4.550(d×3，3H，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.5Hz，J1，2＝8.4Hz，H-1c或H-1e或H-1g)，4.702(d，0.4H，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.142(d，0.6H，H-1aα)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖28中。
125MHz13C-NMRδ；24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.82(C-2aα)，57.10，57.16(C-2c，C-2e和C-2g)，58.44(C-2aβ)，63.40，63.57(C-6a，C-6c和C-6e)，75.28，75.34，75.57(C-2b，C-2d，C-2f和C-2h)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.39，103.45(C-1c，C-1e和C-1g)，105.80，105.85，105.95，106.04(C-1b或C-1d或C-1f或C-1h)，176.93，177.40，177.68，177.80，178.27(羰基)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖29中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝3表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]3-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-4)HA10的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；
2.001，2.007，2.016(15H，NAc)，4.025(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.441-4.465(m，H-1bβ，H-1d，H-1f，H-1h和H-1j)，4.499(d，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，4.538，4.549(d×2，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.4Hz，H-1c，H-1e，H-1g和H-1i)，4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，H-1aα)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖30中。
125 MHz13C-NMRδ；24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.82(C-2aα)，57.10，57.16(C-2c，C-2e，C-2g和C-2i)，58.44(C-2aβ)，63.37，63.57(C-6a，C-6c，C-6e，C-6g和C-6i)，75.35，75.58(C-2b，C-2d，C-2f，C-2h和C-2j)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.39，103.46(C-1c，C-1e，C-1g和C-1i)，105.80，105.86，105.94，106.05(C-1b，C-1d，C-1f，C-1h和C-1j)，176.94，176.99，177.41，177.68，177.81，178.30(羰基)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖31中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝4表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]4-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-5)HA12的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；2.002，2.006，2.016(18H，NAc)，4.025(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.7Hz，H-2aα)，4.440-4.465(m，H-1bβ，H-1d，H-1f，H-1h，H-1j和H-IL)，4.498(d，
J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，4.538，4.549(d×2，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.4Hz，H-1c，H-1e，H-1g，H-1i和H-1k)，4.701(d，J1，2＝8.5Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，H-1aα)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖32中。
125MHz13C-NMRδ；24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.82(C-2aα)，57.09，57.16(C-2c，C-2e，C-2g和C-2i)，58.44(C-2aβ)，63.37(C-6a，C-6c，C-6e，C-6g和C-6i)，75.35，75.58(C-2b，C-2d，C-2f，C-2h和C-2j)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.40，103.45(C-1c，C-1e，C-1g和C-1i)，105.80，105.86，106.05(C-1b，C-1d，C-1f，C-1h和C-1j)，176.95，177.40，177.80，178.31(羰基)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖33中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝5表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]5-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-6)HA14的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；2.001，2.006，2.016(21H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.439-4.464(m，H-1bβ，H-1d，H-1f，H-1h，H-1j，H-IL和H-1n)，4.498(d，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，4.537，4.549(d×2，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.3Hz，H-1c，H-1e，H-1g，
H-1i，H-1k和H-1m)，4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，H-1aα)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖34中。
125MHz13C-NMRδ；24.84，25.09，25.34(NHCOCH3)，55.81(C-2aα)，57.09，57.15(C-2c，C-2e，C-2g和C-2i)，58.43(C-2aβ)，63.36，63.57(C-6a，C-6c，C-6e，C-6g和C-6i)，75.35，75.58(C-2b，C-2d，C-2f，C-2h和C-2j)，93.91(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.40(C-1c，C-1e，C-1g和C-1i)，105.80，105.85，105.94，106.07(C-1b，C-1d，C-1f，C-1h和C-1j)，176.95，177.40，177.67，177.80，178.30(羰基)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖35中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝6表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]6-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-7)HA16的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；2.002，2.006，2.016(24H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.434-4.464(m，H-1bβ，H-1d，H-1f，H-1h，H-1j，H-IL，H-1n和H-1β)，4.498(d，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，4.537，4.549(d×2，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.3Hz，H-1c，H-1e，H-1g，H-1i，H-1k，H-1m和H-1o)，4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，H-1aα)
作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖36中。
125MHz13C-NMRδ；24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.82(C-2aα)，57.10，57.16(C-2c，C-2e，C-2g，C-2i，C-2k，C-2m和C-2o)，5 8.44(C-2aβ)，63.37，63.57(C-6a，C-6c，C-6e，C-6g，C-6i，C-6k，C-6m和C-6o)，75.35，75.58(C-2b，C-2d，C-2f，C-2h，C-2j，C-21，C-6n和C-6p)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.40(C-1c，C-1e，C-1g，C-1i，C-1k，C-1m和C-1o)，105.80，105.86，105.95，106.08(C-1b，C-1d，C-1f，C-1h，C-1j，C-IL，C-1n和C-1p)，176.98，177.41，177.68，177.81，178.33(羰基)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖37中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝7表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]7-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-8)HA48的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；1.998，2.005，2.01 6(72H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.395-4.470(m，GlcA-單元)，4.498(d，J1，2＝8.0Hz，H-1bα)，4.537，4.610(d×2，J1，2＝8.2Hz，J1，2＝7.8Hz，GlcNAc-單元)，4.700(d，J1，2＝8.3Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，J1，2＝3.6Hz，H-1aα)
作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖38中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝23表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]23-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-9)HA50的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；2.005，2.017(75H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.390-4.470(m，GlcA-單元)，4.498(d，J1，2＝7.9Hz，H-1bα)，4.537，4.610(d×2，J1，2＝8.1Hz，J1，2＝8.1Hz，GlcNAc-單元)，4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，J1，2＝3.6Hz，H-1aα)作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖39中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝24表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]24-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(6-10)HA52的測定結(jié)果500MHz1H-NMRδ；2.005，2.017(78H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.375-4.475(m，GlcA-單元)，4.498(d，J1，2＝8.2Hz，H-1bα)，4.536，4.610(d×2，J1，2＝8.1Hz，J1，2＝8.1Hz，GlcNAc-單元)，4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，J1，2＝3.4Hz，H-1aα)
作為分析基礎(chǔ)的光譜表示在圖40中。
這些結(jié)果，與前式(1)中n＝25表示的結(jié)構(gòu)(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉-[(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸鈉)]25-(1→3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的結(jié)構(gòu))不矛盾。
(7)HA低聚糖以外的雜質(zhì)測定了各級(jí)分中以下雜質(zhì)的含量。
(7-1)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，利用BioRad ProteinAssay試劑盒(BioRad公司制造)進(jìn)行測定。
(7-2)DNADNA，利用閾值法(DNA測定裝置Threshold(美國BioRad制造))進(jìn)行測定。
(7-3)內(nèi)毒素內(nèi)毒素，利用Toxycolor System(商品名；生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)通過鱟試驗(yàn)法進(jìn)行測定。
表7
這個(gè)結(jié)果說明，本發(fā)明級(jí)分中的蛋白質(zhì)及DNA的含量都在檢測界限以下，而且內(nèi)毒素的含量也為實(shí)質(zhì)上沒有影響的程度，可以得到任何一個(gè)都實(shí)質(zhì)上不含內(nèi)毒素的結(jié)論。[實(shí)施例2]<材料等>
(1)試驗(yàn)物質(zhì)等首先，說明本實(shí)施例中使用的試驗(yàn)物質(zhì)。
試驗(yàn)物質(zhì)(以下使用括號(hào)內(nèi)的略號(hào)。而且在下式中，GlcA表示葡糖醛酸殘基，GlcNAc表示N-乙?；咸前窔埢?，Gal表示半乳糖殘基，(6S)表示6-0-硫酸酯，-表示配糖鍵，Δ表示不飽和糖)·HA飽和2糖(HA2)GlcAβ1-3GlcNAc·HA不飽和2糖(ΔHA2)ΔGlcAβ1-3GlcNAc·HA飽和4糖(HA4)GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc·HA不飽和4糖(ΔHA4)ΔGlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc·HA飽和6糖(HA6)GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc·HA不飽和6糖(ΔHA6)ΔGlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc·HA飽和8糖(HA8)GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc·HA飽和10糖(HA10)GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc·HA飽和12糖(HA12)GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc·HA飽和2～18糖的混合物(HA2-18)·HA飽和8～14糖的混合物(HA8-14)·HA(重均分子量84萬；HA84)·Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)(L4)·Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3 Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)(L4L4)HA飽和低聚糖，使用了在前述制備例1中制備的HA低聚糖級(jí)分。
另外，HA不飽和低聚糖，是通過將利用軟骨素AC-1裂解酶(軟骨素酶ACI黃；生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)處理HA而得的分解產(chǎn)物，通過與前述制備例1一樣的方法分級(jí)而得到的(參考制備例2)。
L4及L4L4，通過國際公開WO96/16973所記載的方法調(diào)制。
將試驗(yàn)物質(zhì)，以根據(jù)以下藥效藥理試驗(yàn)所定的濃度溶解于生理食鹽水。溶解于生理食鹽水之后的內(nèi)毒素濃度，任何一個(gè)都在0.3EU/ml以下，而且鐵含量任何一個(gè)都在20ppm以下。
(2)細(xì)胞、培養(yǎng)基K562細(xì)胞(JCRB0019；人的白血病細(xì)胞)、PC-12細(xì)胞(JCRB0733)K562細(xì)胞，利用含有10％牛胎兒血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
另外，PC-12細(xì)胞，利用含有10％馬血清及5％新生牛犢血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基(含有D-葡萄糖(1,000mg/l)、L-谷氨酰胺(4mM)、丙酮酸鈉(110mg/l)、碳酸氫鈉(3.7g/l))575ml中，添加了10ml的20％葡萄糖水溶液的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
<1>HSF1對(duì)磷酸化的作用已知HSF1(熱沖擊因子1)蛋白質(zhì)是Hsp70的轉(zhuǎn)錄因子(J.Biol.Chem.，271，3355-3358(1996))。而且HSF1蛋白質(zhì)，通過被磷酸化而活化，該磷酸化基于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中的譜帶位移(表觀分子量大約從66kDa移至約81kDa)進(jìn)行檢測。利用該事實(shí)，將各種大小的低聚糖作用于施加應(yīng)力的K562細(xì)胞，通過檢測上述譜帶的位移，確定了HSF1的磷酸化(活化)程度。
(1)實(shí)驗(yàn)1將HA4、ΔHA4、HA6、HA8、HA2-18及HA8-14，各自添加在含有前述細(xì)胞的培養(yǎng)液中，使其濃度達(dá)到1、10或100ng/ml，之后通過立即移至42℃的環(huán)境中而施加熱沖擊，溫育20分鐘。溫育之后，通過離心分離而回收細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE(凝膠濃度為10％)。接著使用抗HSF1單克隆抗體(Stressgene公司制造)作為一次抗體，使用羊抗鼠單克隆抗體IgG(Jackson Lab公司制造)作為二次抗體進(jìn)行免疫印跡法(Western Blotting)，檢測出了從66kDa的譜帶(沒有磷酸化的HSF1)到81kDa的譜帶(磷酸化的HSF1)的位移。
其結(jié)果，添加了HA4、ΔHA4、HA6及HA2-18的細(xì)胞中，根據(jù)HA低聚糖的添加量發(fā)現(xiàn)了向81kDa譜帶的位移。在HA8-14中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化。對(duì)于HA8反而發(fā)現(xiàn)了譜帶位移的阻礙。
(2)實(shí)驗(yàn)2為了確認(rèn)實(shí)驗(yàn)1的再現(xiàn)性，使用HA4、ΔHA4、HA8及HA84，除了培養(yǎng)液的HA添加量只設(shè)定為100ng/ml，熱沖擊在43℃下進(jìn)行之外，都與實(shí)驗(yàn)1一樣，檢測出了譜帶位移。其結(jié)果表示在圖41中。在圖41中，從左數(shù)第一泳道為在37℃條件下(沒有添加HA低聚糖)的細(xì)胞的提取物，第二泳道為在43條件下(沒有添加HA低聚糖)的細(xì)胞的提取物，最右邊泳道為作為標(biāo)準(zhǔn)將HSF1(來自細(xì)菌)以同樣的方法檢測的結(jié)果。
根據(jù)圖41，在添加了HA4及ΔHA4的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HSF1的譜帶位移，而且66及81kDa二者的HSF1本身的量也增加。另一方面，在HA8中發(fā)現(xiàn)了66kDa的HSF1的量增加，但是沒有發(fā)現(xiàn)向81kDa的譜帶位移。而且在HA84中沒有發(fā)現(xiàn)變化。
(3)實(shí)驗(yàn)3(比較實(shí)驗(yàn))為了確定在實(shí)驗(yàn)2中觀察到的作用對(duì)HA低聚糖的糖鏈骨架結(jié)構(gòu)是否特異，進(jìn)行了使用以下軟骨素低聚糖的比較實(shí)驗(yàn)。軟骨素(以下稱為Ch)，只有HA的GlcNAc被半乳糖胺殘基(GalNAc)置換這一點(diǎn)與HA不同，在為粘多糖及不含硫酸基的方面與HA相同。從而，可以說Ch是與HA結(jié)構(gòu)極其類似的物質(zhì)，對(duì)于它們的低聚糖也同樣。
·Ch飽和4糖(Ch4)GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAc·Ch飽和6糖(Ch6)GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAc·Ch飽和8糖(Ch8)GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAc這些Ch飽和低聚糖，根據(jù)Nagasawa等的方法(Carbohyd.Res.，141，99-110頁，1985)，通過將利用含有HCl的二甲亞砜(DMSO)處理Ch而得到的分解產(chǎn)物，用陰離子交換色譜法根據(jù)大小進(jìn)行分級(jí)而得到。
使用這些低聚糖，進(jìn)行了與實(shí)驗(yàn)2相同的實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果，添加任何一個(gè)Ch低聚糖的細(xì)胞中，都沒有觀察到HSF1的譜帶位移或HSF1本身量的增加。
從這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以看出，Ch低聚糖，沒有HA低聚糖中發(fā)現(xiàn)的HSF1的活化或表達(dá)增強(qiáng)作用。這個(gè)結(jié)果說明，這樣的作用是對(duì)HA低聚糖的糖鏈骨架結(jié)構(gòu)特異性的。
這些實(shí)驗(yàn)說明，HA4糖及含有該物質(zhì)的級(jí)分(HA2-18)，將HSF1極其顯著地活化。
<2>對(duì)Hsp表達(dá)的作用由于根據(jù)<1>確定了HA4糖與其他大小的HA相比可以將表達(dá)Hsp70必需的因子(HSF1)顯著活化，所以為了確定被施加應(yīng)力的K562細(xì)胞中的Hsp的表達(dá)，與使用其他大小的HA相比是否實(shí)際上由HA4糖的作用而顯著增加，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。
將HA2、ΔHA4、HA6、HA84及L4L4，各自添加在含有前述細(xì)胞的培養(yǎng)液(37℃)中，使其濃度達(dá)到1、10或100ng/ml。之后通過立即移至43℃的環(huán)境下而施加熱沖擊，溫育20分鐘。之后使其培養(yǎng)液恢復(fù)到37℃又溫育2小時(shí)，之后通過離心分離回收細(xì)胞，與上述<1>同樣地進(jìn)行SDS-PAGE。接著使用抗Hsp72單克隆抗體(Amersham公司制造)作為一次抗體，使用羊抗兔IgG單克隆抗體(Jackson Lab公司制造)作為二次抗體，進(jìn)行免疫印跡法，檢測出了Hsp72。Hsp72，為Hsp70家族成員之一，最具有代表性，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)被應(yīng)力所誘導(dǎo)及增強(qiáng)。
結(jié)果表示在圖42中。在圖42的a中最左邊的泳道為沒有施加熱沖擊(37℃)，而且沒有添加試驗(yàn)物質(zhì)，而同樣檢測Hsp72的結(jié)果，最右邊的泳道為同樣檢測標(biāo)準(zhǔn)Hsp72(來自細(xì)菌的Hsp72；bHsp72)的結(jié)果。在圖42中b為同樣檢測在沒有施加熱沖擊的細(xì)胞中添加了ΔHA4時(shí)的Hsp72表達(dá)的結(jié)果。
從圖42的a所示結(jié)果可以看出，施加熱沖擊(43℃)時(shí)(從左數(shù)第二泳道)，與37℃下沒有添加試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)(最左邊的泳道)相比，Hsp的表達(dá)被增強(qiáng)。而且，在各HA低聚糖存在下Hsp的表達(dá)進(jìn)一步被增強(qiáng)，在ΔHA4的存在下Hsp的表達(dá)特別強(qiáng)有力地被增強(qiáng)(從左數(shù)第3～5泳道)。
如上所述，添加了ΔHA4的細(xì)胞(施加了熱沖擊的細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)了Hsp的強(qiáng)表達(dá)，但添加了其他大小HA的細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)如添加ΔHA4那么強(qiáng)的Hsp72的表達(dá)增強(qiáng)。
而且在沒有施加熱沖擊的細(xì)胞中，沒有發(fā)現(xiàn)由ΔHA4增強(qiáng)Hsp72的表達(dá)。這個(gè)結(jié)果說明，HA4糖在沒有應(yīng)力的條件下對(duì)于Hsp的表達(dá)幾乎沒有影響，一旦施加應(yīng)力，極速且顯著增強(qiáng)Hsp的表達(dá)。
<3>細(xì)胞死亡的抑制作用根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，確定了HA4糖增強(qiáng)應(yīng)力下的細(xì)胞中Hsp表達(dá)的作用強(qiáng)于其他大小HA低聚糖，故為了確定HA低聚糖實(shí)際上能否更強(qiáng)有力地抑制受到應(yīng)力作用的細(xì)胞的死亡，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。
PC-12細(xì)胞在不含血清的培養(yǎng)液中發(fā)生編程性細(xì)胞死亡是已知的。
因此將ΔHA2、HA4、ΔHA4、HA6、ΔHA6、HA8、HA10、HA12、HA84、L4、L4L4，各自添加在含有PC-12細(xì)胞(不含血清)的培養(yǎng)液中，使其濃度達(dá)到100ng/ml，24小時(shí)之后將細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)將細(xì)胞染色，算出了相對(duì)于總細(xì)胞數(shù)生存細(xì)胞(沒有用臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞)數(shù)的比例。
其結(jié)果表示在圖43中。根據(jù)圖43的結(jié)果可以判斷，HA4糖，特別是HA4，與其他大小的HA低聚糖或其他種類低聚糖相比，顯著抑制細(xì)胞死亡。
<4>細(xì)胞組織保護(hù)作用1.器官保存方面的細(xì)胞、組織保護(hù)作用(1)器官保存液的調(diào)制將含有100ng/ml HA4糖的Euro-Collins液(Euro-Collins液；Am.J.Surg.，179，154-160頁(2000))作為試驗(yàn)溶液(以下記為“HA4(+)”)。作為對(duì)照，使用Euro-Collins液(以下記為“HA4(-)”)。
(2)試驗(yàn)物質(zhì)的給藥等將11周齡的SD雄性大鼠，分為“HA4(+)”使用組(n＝5)、“HA4(-)”使用組(n＝5)、及正常組(n＝5)。開腹取出器官(肝臟)之后，對(duì)于“HA4(+)”使用組及“HA4(-)”使用組，用大約40ml各溶液進(jìn)行灌流，直至因出血使整個(gè)肝臟顏色變淺，之后在37℃下溫育2小時(shí)。
(3)評(píng)價(jià)溫育之后，算出各組的器官濕重量/干重量比(組織傷害引起的浮腫程度的指標(biāo))，用光學(xué)顯微鏡觀察(肉眼觀察組織傷害程度)HE染色的組織切片，進(jìn)行染色質(zhì)濃縮圖像分析及根據(jù)TUNEL法(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyltransferase(TdT)-mediated nick end labeling method)；J.Cell.Biol.，119，493-501頁(1992))的分析(細(xì)胞死亡程度的評(píng)價(jià))。
(3-1)器官的濕重量/干重量比的結(jié)果表示在圖44中。在圖44中的*表示因p＜0.05(威廉姆斯多范圍檢驗(yàn)(Williams multiple range test))而存在顯著差異。
根據(jù)圖44的結(jié)果，“HA4(+)”使用組，與“HA4(-)”使用組相比，顯著降低了濕重量/干重量比。這個(gè)結(jié)果說明，HA4糖可以有效抑制由器官的保存引起的組織傷害而引起的浮腫。
(3-2)用光學(xué)顯微鏡觀察進(jìn)行了HE染色的組織切片，結(jié)果是，在“HA4(-)”使用組中觀察到了浮腫、組織溶解(細(xì)胞質(zhì)的消失)、核濃縮等。與此相反，在“HA4(+)”使用組中觀察到了與正常組幾乎相同的圖像，沒有觀察到在“HA4(-)”使用組中觀察到的顯著的組織傷害。
(3-3)染色質(zhì)濃縮的圖像分析作為評(píng)價(jià)細(xì)胞死亡程度的一種方法，使用進(jìn)行了HE染色的組織切片，進(jìn)行了細(xì)胞染色質(zhì)濃縮的圖像分析(Image-Pro PLUSTM Version3.0.1；Media Cybernetics制造)，比較了圖像濃度。發(fā)生細(xì)胞死亡而染色質(zhì)濃縮時(shí)，該部分被HE深染色。染色質(zhì)濃縮的細(xì)胞越多，顯微鏡圖像整體的濃度液越高，所以將其作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
其結(jié)果表示在圖45中。另外在圖45中，*表示因p＜0.05(WilliamsMultiple range test)而存在顯著差異。
(3-4)TUNEL法分析作為評(píng)價(jià)細(xì)胞死亡程度的一種方法，進(jìn)行了利用TUNEL法的DNA的片斷化程度分析。細(xì)胞發(fā)生編程性細(xì)胞死亡時(shí)，DNA會(huì)片斷化是已知的。TUNEL法為將DNA的末端染色的方法，DNA被片斷化的細(xì)胞多時(shí)，TUNEL染色的程度會(huì)增高，所以可以作為細(xì)胞死亡(編程性細(xì)胞死亡)程度的指標(biāo)。
將保存后的組織切片進(jìn)行TUNEL染色，然后用光學(xué)顯微鏡肉眼觀察，計(jì)數(shù)了每一平方厘米的TUNEL染色細(xì)胞數(shù)。同時(shí)，將各自組織切片的組織障礙程度，用“重度”、“中度”、“輕度”、“極輕度”4個(gè)階段進(jìn)行評(píng)價(jià)。而且這個(gè)評(píng)價(jià)，為了確?？陀^性而隨機(jī)進(jìn)行。前者的結(jié)果表示在圖46中，后者的結(jié)果表示在圖47中。而且在圖46中的*表示因p＜0.05(Williams multiple range test)而存在顯著差異。
從圖46的結(jié)果中可以看出，相對(duì)于在“HA4(-)”使用組中觀察到極多的TUNEL染色細(xì)胞，在“HA4(+)”使用組中TUNEL染色細(xì)胞極少，幾乎是與正常組相同的程度。而且從圖47可以看出，“HA4(-)”使用組中在80％的組織切片中觀察到了“重度”、“中度”的組織障礙，但是在“HA4(+)”使用組中沒有觀察到“重度”的組織障礙，在20％的組織切片中最多觀察到了“中度”的組織障礙。
以上結(jié)果說明，HA低聚糖(HA4糖)，在器官保存方面具有優(yōu)良的細(xì)胞、組織保護(hù)效果。
2.在對(duì)潰瘍的效果方面的細(xì)胞、組織保護(hù)作用(1)給藥用的試驗(yàn)溶液的調(diào)制將試驗(yàn)物質(zhì)溶解在羧甲基纖維素(CMC)中，作為給藥用的試驗(yàn)溶液。根據(jù)后述的給藥量，確定濃度，并使給藥液量達(dá)到10ml/kg。
另外作為陽性對(duì)照溶液，使用將已有的胃炎、胃潰瘍治療劑(teprenone、geranylgeranylacetone；商品名Selbex，Eisai)溶解在CMC中的物質(zhì)。確定濃度，使給藥量達(dá)到1mg/kg(臨床用量)，且給藥液量達(dá)到10ml/kg。作為陰性對(duì)照溶液使用了0.5％CMC。
(2)試驗(yàn)物質(zhì)的給藥等將5周齡的SD雄性大鼠，分為“陰性對(duì)照溶液”給藥組(n＝8)、“HA4 4ml/kg”給藥組(n＝8)、“HA4 20mg/kg”給藥組(n＝8)、“HA4100mg/kg”給藥組(n＝8)及[陽性對(duì)照溶液]給藥組(n＝8)。
從第一次給藥的前一天1600開始使各組鼠絕食，第二天800將上述溶液經(jīng)口給藥之后用水浸進(jìn)行限制。水浸限制一直持續(xù)到第二天的800(24小時(shí))。在這期間，在1600及2400與第一次給藥一樣將各溶液進(jìn)行給藥。
之后解剖各鼠，取出胃。取出的胃注入10％緩沖甲醛溶液使其膨脹，將褶變平滑并固定。之后，水洗除去附著在胃壁上的血液。
(3)評(píng)價(jià)利用圖像分析裝置(Image-pro PLUSTM Version3.0.1；MediaCybernetics制造)測定了產(chǎn)生黑褐色變性的潰瘍部的面積率(潰瘍面積/腺胃面積)。其結(jié)果表示在圖48中。在圖48中*及**各自表示因p＜0.05及p＜0.01(Williams multiple range test)而存在顯著差異。
從圖48中可以看出，將HA4給藥組與陰性對(duì)照溶液給藥組相比，任何一個(gè)的潰瘍部的面積率都明顯下降。特別是HA4 20mg/kg給藥組及HA4 100mg/kg給藥組，潰瘍部面積率比陽性對(duì)照溶液組還低。
以上結(jié)果說明，HA低聚糖(HA4糖)，在對(duì)潰瘍的效果方面，具有優(yōu)良的細(xì)胞、組織保護(hù)效果。而且通過HA低聚糖的經(jīng)口給藥，可以得到上述優(yōu)良的效果。進(jìn)而，這個(gè)在實(shí)驗(yàn)中將HA低聚糖(HA4糖)預(yù)先給藥之后用水浸進(jìn)行限制，并且，水浸限制開始之后到產(chǎn)生潰瘍需要一定時(shí)間，所以這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明HA低聚糖(HA4糖)具有預(yù)防效果。限制3.在對(duì)肝障礙的效果方面的細(xì)胞、組織保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)1使用四氯化碳模型的實(shí)驗(yàn)(1)給藥用試驗(yàn)溶液的調(diào)制將試驗(yàn)物質(zhì)溶解在生理食鹽水中，作為給藥用試驗(yàn)溶液。根據(jù)后述的給藥量，確定濃度，使給藥液量達(dá)到5ml/kg。
而且作為陽性對(duì)照溶液，以給藥量10mg/kg使用了FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸；Wakamoto制藥)，F(xiàn)AD對(duì)于后述四氯化碳肝障礙模型的效果被報(bào)道(藥物療法，第9卷，特集號(hào)46-53頁)。而且作為陰性對(duì)照溶液使用了生理食鹽水。
(2)試驗(yàn)物質(zhì)的給藥等將5周齡的SD雄性大鼠，分為“陰性對(duì)照溶液”給藥組(n＝8)、“HA4 2ml/kg”給藥組(n＝8)、“HA4 10mg/kg”給藥組(n＝8)、“HA450mg/kg”給藥組(n＝8)及“陽性對(duì)照溶液”給藥組(n＝8)、“正常組”(n＝8)。
從第一次給藥的前一天1600開始使各組鼠斷食，第二天800前經(jīng)口給用四氯化碳(CCl4)100mg/kg。之后在800將上述各溶液腹腔內(nèi)給藥。之后仍然保持絕食狀態(tài)，在1600及2400與第一次給藥一樣將各溶液進(jìn)行給藥。2400給藥之后進(jìn)行喂食，第二天800解剖各鼠。
(3)評(píng)價(jià)解剖之后，采集血液，測定了GOT活性及白血球數(shù)。GOT活性的測定使用臨床化學(xué)自動(dòng)分析裝置(COBAS MIRA S；日本Roche)，白血球數(shù)的測定使用了自動(dòng)血球測定裝置(Sysmex(K)-2000；Sysmex公司制造)。
前者的結(jié)果表示在圖49中，后者的結(jié)果表示在圖50中。圖49及圖50中*表示因p＜0.05(Williams multiple range test)而存在顯著差異。
根據(jù)圖49可以看出，HA4 50mg/ml給藥組與陰性對(duì)照溶液給藥組相比，發(fā)現(xiàn)了顯著的GOT活性下降。而且根據(jù)圖50可以看出，任何一個(gè)HA4給藥組，與陰性對(duì)照溶液給藥組相比，發(fā)現(xiàn)了顯著的末梢白血球數(shù)的減少，與FAD相比白血球數(shù)也有減少。這個(gè)結(jié)果說明，HA4糖在對(duì)肝障礙的效果方面具有細(xì)胞、組織保護(hù)效果。進(jìn)而，這個(gè)實(shí)驗(yàn)中將四氯化碳預(yù)先給用之后，將HA低聚糖(HA4糖)給藥，但是將四氯化碳給藥之后到因四氯化碳而產(chǎn)生肝障礙需要一定時(shí)間，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明HA低聚糖(HA4糖)具有預(yù)防效果。
而且在本實(shí)驗(yàn)中，一并測定了末梢血中的IL-10及IL-8的濃度。
IL-10，據(jù)報(bào)道與應(yīng)力蛋白質(zhì)(細(xì)胞受到應(yīng)力時(shí)被表達(dá)，具有保護(hù)細(xì)胞作用的蛋白質(zhì))的一種Hsp70相關(guān)(J.Immunol.，164(5)，2711-2717頁(2000))，而且也有IL-10抑制因伴刀豆球蛋白A引起的肝炎的報(bào)道(Autoimmunity，31(2)，75-83頁1999)。
另外，在鎘或乙醇引起的肝障礙模型中，IL-8的表達(dá)量上升是已知的(Toxicology and Applied Pharmacology，163，231-9頁(2000)，ActaGastro-Enterologica Belgica，57(3-4)，255-9頁(1994))，而且也有通過誘導(dǎo)Hsp70的表達(dá)而抑制IL-8的表達(dá)的報(bào)道(Journal of Immunology，164，5416-23頁(2000))。
末梢血中的IL-10，用IL-10 Rat ELISA(ENDOGEN公司生產(chǎn))進(jìn)行測定。IL-8，用Panatest A Series Rat CINC-1(IL-8)(株式會(huì)社Panapharm Laboratories)進(jìn)行測定。IL-10的測定結(jié)果表示在圖51中，IL-8的測定結(jié)果表示在圖52中。在圖51及圖52中的**表示因p＜0.01(Williams multiple range test)而存在顯著差異。
從圖51可以看出，血中的IL-10濃度隨HA4的給藥量增加，HA450mg/kg給藥組與陰性對(duì)照溶液給藥組相比，血中IL-10濃度顯著提高。而且從圖52可以看出，血中的IL-8濃度隨HA4的給藥量減少。
這個(gè)結(jié)果說明，HA低聚糖(HA4糖)，具有促進(jìn)IL-10產(chǎn)生的效果及抑制IL-8產(chǎn)生的效果。因此HA低聚糖(HA4糖)通過促進(jìn)IL-10產(chǎn)生或抑制IL-8產(chǎn)生，可以發(fā)揮前述細(xì)胞、組織保護(hù)效果。而且HA低聚糖(HA4糖)，對(duì)于因IL-10的減少或IL-8的增加引起的疾病，或需要促進(jìn)IL-10產(chǎn)生或抑制IL-8產(chǎn)生的疾病等，可以作為處置劑利用。實(shí)驗(yàn)2使用伴刀豆球蛋白A模型的實(shí)驗(yàn)為了確定HA低聚糖(HA4糖)對(duì)除了四氯化碳模型以外的肝障礙模型是否有效，進(jìn)行了使用伴刀豆球蛋白A模型的實(shí)驗(yàn)。
(1)給藥用溶液的調(diào)制給藥用試驗(yàn)溶液的調(diào)制、濃度、給藥量、及給藥液量等，與實(shí)驗(yàn)1相同。
而且作為陽性對(duì)照溶液，使用了給藥量5mg/kg的強(qiáng)力Neo-Minophangen C(Stronger Neo-Minophagen C；Minophagen制藥)。這個(gè)量為該藥劑的最高臨床用量。而且作為陰性對(duì)照溶液使用了生理食鹽水。
(2)試驗(yàn)物質(zhì)的給藥等將8周齡的Balb/c小鼠，分為“陰性對(duì)照溶液”給藥組(n＝12)、“HA4 2ml/kg”給藥組(n＝12)、“HA4 10mg/kg”給藥組(n＝12)、“HA450mg/kg”給藥組(n＝12)及“陽性對(duì)照溶液”給藥組(n＝12)、“正常組”(n＝8)。
將伴刀豆球蛋白A(ConA；Sigma公司)15mg/kg經(jīng)尾部靜脈給藥。之后將上述各溶液經(jīng)尾部靜脈給藥。之后飼養(yǎng)24小時(shí)。
(3)評(píng)價(jià)從腹部主動(dòng)脈采取血液，使用臨床化學(xué)自動(dòng)分析裝置(COBASMIRA S；日本Roche)測定了GPT活性及GOT活性。另外取出肝臟，用肉眼觀察了肝臟的狀態(tài)。
其結(jié)果，GPT平均值在“陰性對(duì)照溶液”給藥組中大約為5600(I.U./L)。與此相對(duì)，在“HA4 10mg/kg”給藥組及“HA4 50mg/kg”給藥組中各自大約為2200(I.U./L)及1200(I.U./L)，任何一個(gè)都比“陰性對(duì)照溶液”給藥組顯著偏低(p＜0.01；Dunnett的多重比較檢測)。另外，“陽性對(duì)照溶液”給藥組大約為4000(I.U./L)。
GOT的平均值在“陰性對(duì)照溶液”給藥組中大約為6000(I.U./L)。與此相對(duì)，在“HA4 10mg/kg”給藥組及“HA4 50mg/kg”給藥組中各自大約為2000(I.U./L)及1000(I.U./L)，任何一個(gè)都比“陰性對(duì)照溶液”給藥組顯著偏低(p＜0.01；Dunnett的多重比較檢測)。另外，“陽性對(duì)照溶液”給藥組大約為4400(I.U./L)。
肝臟的肉眼觀察結(jié)果是，“HA4 10mg/kg”給藥組及“HA450mg/kg”給藥組，與“陰性對(duì)照溶液”給藥組及“陽性對(duì)照溶液”給藥組相比，任何一組障礙程度都降低。
這些結(jié)果說明，HA低聚糖(HA4糖)對(duì)于伴刀豆球蛋白A引起的肝障礙也發(fā)揮效果，這暗示了HA低聚糖(HA4糖)對(duì)于各種肝障礙有效。進(jìn)而這個(gè)實(shí)驗(yàn)與四氯化碳模型一樣顯示，HA低聚糖(HA4糖)也具有預(yù)防效果。
從HA低聚糖本身的高安全性以及上述實(shí)施例的結(jié)果，可以推斷本發(fā)明的各種制劑的安全性。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的低聚糖，作為本發(fā)明藥品的有效成分是有用的。
本發(fā)明級(jí)分，為含有所需大小的HA低聚糖，實(shí)質(zhì)上不含其他大小低聚糖及其他雜質(zhì)的HA低聚糖級(jí)分，作為HA低聚糖的生理活性研究用試藥、分析用標(biāo)準(zhǔn)、藥品本身或其材料，是極其有用的。
以本發(fā)明的低聚糖為有效成分的藥品，特別是Hsp表達(dá)增強(qiáng)劑，從前述實(shí)施例的結(jié)果中也可以看出，特定大小的HA低聚糖，發(fā)揮其他大小的HA低聚糖所沒有的顯著的效果。進(jìn)而通過選擇這個(gè)特定大小的HA低聚糖，可以在維持與其他大小HA低聚糖的效果的同時(shí)，可以減少給藥量，在更加廉價(jià)且安全性高的制劑方面，是極其有用的。
進(jìn)而，以本發(fā)明的低聚糖為有效成分的細(xì)胞死亡抑制劑、細(xì)胞障礙抑制劑、及細(xì)胞、組織保護(hù)劑(例如器官保存劑、潰瘍處置劑、肝障礙處置劑、IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑、或IL-8產(chǎn)生抑制劑)，也如前述實(shí)施例的結(jié)果所示，發(fā)揮優(yōu)良的藥理效果，且安全性高。
權(quán)利要求
1.一種透明質(zhì)酸低聚糖，其具有選自4糖～60糖的大小。
2.一種級(jí)分，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸低聚糖，而且，具有下面(1)～(6)所述的理化性質(zhì)，(1)利用凝膠過濾色譜法，以下面(a)及(b)所述的檢測方法分析該級(jí)分時(shí)，不論用哪一種方法都表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上單一的峰，且該峰的面積如下面(a)及(b)所述，(a)基于210nm的吸收進(jìn)行檢測時(shí)，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為85％以上，(b)利用差示折射計(jì)檢測時(shí)，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為98％以上，(2)利用陰離子交換色譜法，基于210nm的吸收檢測分析該級(jí)分時(shí)，表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上單一的峰，而且，相對(duì)于級(jí)分中全部HA低聚糖的峰面積之和，前述實(shí)質(zhì)上單一的峰的相對(duì)面積為90％以上，(3)將該級(jí)分進(jìn)行熒光標(biāo)記之后，通過電泳進(jìn)行分析時(shí)，表現(xiàn)出單一的譜帶，而且，沒有檢測出其他大小的HA低聚糖的譜帶，(4)將構(gòu)成該級(jí)分的HA低聚糖的單一同位素分子量或平均分子量的理論值設(shè)定為1時(shí)，該級(jí)分的質(zhì)譜分析的實(shí)測值為0.997～1.003(相對(duì)值)，(5)構(gòu)成該級(jí)分的HA低聚糖中的碳(C)、氫(H)及氮(N)的各自含量比的理論值(重量％)，與通過該級(jí)分的元素分析得到的各元素的實(shí)測值(重量％)之差，均在±1(重量％)范圍內(nèi)，(6)實(shí)質(zhì)上不含蛋白質(zhì)、DNA及內(nèi)毒素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的級(jí)分，其特征在于，進(jìn)一步具有如下面(7)所述的理化性質(zhì)，(7)該級(jí)分的1H-NMR及13C-NMR測定結(jié)果，與下面式(1)所示的HA低聚糖的結(jié)構(gòu)不矛盾，式(1) 式中，n表示1～29的整數(shù)，M表示質(zhì)子或一價(jià)陽離子，Ac表示乙?；?br>
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的級(jí)分，其特征在于，透明質(zhì)酸低聚糖具有選自4糖～20糖的大小。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的級(jí)分，其特征在于，透明質(zhì)酸低聚糖具有選自4糖～16糖的大小。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的級(jí)分，其特征在于，透明質(zhì)酸低聚糖為4糖。
7.一種藥品，其含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸低聚糖作為有效成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥品，其中使用權(quán)利要求2或3所述的級(jí)分作為權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸低聚糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的藥品，其中所述藥品選自熱沖擊蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)劑、細(xì)胞死亡抑制劑、細(xì)胞障礙抑制劑、及細(xì)胞、組織保護(hù)劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥品，其特征在于，所述細(xì)胞、組織保護(hù)劑選自器官保存劑、潰瘍處置劑、肝障礙處置劑、IL-10產(chǎn)生促進(jìn)劑、及IL-8產(chǎn)生抑制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10任一項(xiàng)所述的藥品，其特征在于，所述的透明質(zhì)酸低聚糖具有選自4糖～20糖的大小。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至10任一項(xiàng)所述的藥品，其特征在于，所述透明質(zhì)酸低聚糖具有選自4糖～16糖的大小。
13.根據(jù)權(quán)利要求7至10任一項(xiàng)所述的藥品，其特征在于，所述透明質(zhì)酸低聚糖為4糖。
全文摘要
本發(fā)明提供具有選自4糖～60糖大小的透明質(zhì)酸低聚糖；含有該透明質(zhì)酸低聚糖、且具有特定理化性質(zhì)的級(jí)分；和含有這些物質(zhì)的藥品。本發(fā)明的透明質(zhì)酸低聚糖，作為細(xì)胞死亡抑制劑、細(xì)胞障礙抑制劑，及細(xì)胞、組織保護(hù)劑(例如器官保存劑、潰瘍處置劑、肝臟障礙處置劑、IL－10產(chǎn)生促進(jìn)劑，或IL－8產(chǎn)生抑制劑)的有效成分，發(fā)揮優(yōu)良的藥理效果，且具有很高的安全性，因而極其有用。
文檔編號(hào)C07H7/033GK1440418SQ01812432
公開日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2001年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月7日
發(fā)明者淺利晃, 栗原仁, 柴田知己, 宮崎由佳, 山之口裕子, 多和田明, 政孝浩, 松崎祐二 申請(qǐng)人:生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社