專利名稱：微生物補料分批培養(yǎng)生產肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在含培養(yǎng)基(含有有機碳源、氮源和無機鹽)的生物反應器中，通過微生物補料分批培養(yǎng)生產重組肽的方法。該培養(yǎng)通過波動補料添加有機碳源和/或通過攪拌速度的波動變化，例如以方波(square)方式或正弦波(sinus)方式來進行。該有機碳源優(yōu)選葡萄糖，該重組肽優(yōu)選生長激素。
背景人重組蛋白已經成為重要的藥物。重組DNA技術和大規(guī)模生產的結合已使那些不可能或因過于昂貴而無法從天然來源獲得的蛋白的生產成為可能。例如，通過重組DNA技術，人生長激素(hGH)、免疫干擾素、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)和人胰島素現在都有市售。
然而，在大規(guī)模生物生產中，生物體要暴露在不斷改變的環(huán)境中并要對此作出反應。已發(fā)現，當增加反應器大小時，重組蛋白生產方面的差異。例如Riesenberg D等(應用微生物生物技術，1990，3477-82)表明，當培養(yǎng)體積由15L增加到250L時，人干擾素α1的數量減少一倍。
當生物生產按比例擴大時，可能在微環(huán)境，例如濃度和梯度，方面會有差異。由于幾何和工藝參數的改變以及進料位置的選擇，預計會出現底物(例如在限制補料(補料分批)中添加的碳源，用于pH滴定的氨水和氧氣)的濃度梯度。大部分生物體會對快速環(huán)境變化作出反應并可以在幾秒或更少的時間內改變它們的新陳代謝。
以前已經研究了在發(fā)酵罐中，脈沖添加葡萄糖和波動葡萄糖濃度對產量和表達的影響。
脈沖添加葡萄糖，即當培養(yǎng)達到穩(wěn)定期時，在幾秒鐘之內添加葡萄糖會極大并非常迅速地誘導gapA基因的表達(Gschaedler，Anne等，生物技術生物工程，1999，63(6)712-720)。
已經有人研究了在發(fā)酵罐中波動葡萄糖濃度對生物量產量和醋酸鹽形成的影響。結論是，當在發(fā)酵罐中對大規(guī)模培養(yǎng)和小規(guī)模培養(yǎng)進行比較時發(fā)現，細胞對葡萄糖波動的反應引起了較低的生物量產量和較高的醋酸形成(Bylund，F等，生物生產工程，1999，20(5)377-389)。
在補料分批培養(yǎng)期間，在恰當的時間間隔內(使得在兩個連續(xù)的脈沖之間可以有明顯的饑餓期)脈沖添加生長底物(葡萄糖)對穩(wěn)定質粒和增加蛋白生產有正向效果(Cheng，Chinyuan等，生物技術生物工程，1997，56(1)23-31)。在約6小時的間隔內，重復進行脈沖添加4-5次。結果表明，此階段性葡萄糖饑餓補料策略可以保持穩(wěn)定的攜帶質粒的細胞比例和保持重組蛋白的穩(wěn)定的比生產率。相反，在補料分批培養(yǎng)期間，沒有葡萄糖饑餓，攜帶質粒細胞的比例和比生產率將持續(xù)下降，從而極大地減少產品產量并限制培養(yǎng)有效操作的持續(xù)時間。
Wang，Zhengjun等(生物技術生物工程，1993，42(1)95-102)已經表明，在YPD(富營養(yǎng)復合培養(yǎng)基)分批培養(yǎng)的末期，葡萄糖脈沖有利于殘留胞質轉化酶的運輸。
美國專利5912133公開了一種補料分批培養(yǎng)法，其中碳源濃度保持在5g/L以下的低水平并且至少在兩次補料中添加了碳源。在第一次補料之后及在第二次補料之前，碳源應該用盡。
在細胞培養(yǎng)器中，使用周期性變化的外部磁場并產生攪拌運動也是已知的方法。(DD271850)。從而使導入的材料能夠分布均勻以防局部濃度過高造成損害。
沒有一個報告公開過有機碳源以方波方式或正弦波方式重復的波動，其特征在于振幅和頻率。相反，從現有技術我們可以得出這樣的結論，在兩個連續(xù)補料之間，應該有個明顯的饑餓期(Cheng等)，或葡萄糖脈沖僅應該在分批培養(yǎng)末期進行(Wang等)。
達到高細胞密度的最常用技術是葡萄糖限制的補料分批培養(yǎng)。在補料分批生產過程中，所有的培養(yǎng)基組份(除了例如碳源)就象在分批生產過程中的那樣都過量。以底物溶液(經常是葡萄糖)向生物反應器中補料，其速率確保該底物成份是生長限制。該底物限制可以控制生長速率和糖的攝入。通過限制糖的攝入并因此限制反應速率，可以避免工程局限性，例如過量散熱和氧氣限制。葡萄糖攝入可被分成三個反應，用于合成代謝的葡萄糖、用來維持細胞的日常需要的葡萄糖消耗和用于生長的葡萄糖消耗。最后兩個反應的產率接近1.07go2g-1sugar。因此生長速率控制可用于控制與生長關聯的氧氣消耗和熱生成。此外，底物限制可用來進行代謝控制，由此可避免溢流(overflow)代謝(即如在大腸桿菌中的乙酸鹽的形成)和代謝副產物抑制。在面包業(yè)的酵母生產過程中，整個加工過程都使用糖限制以避免導致過量乙醇產生的溢流代謝(George等，生物生產工程，1998，18135-142)。以同樣的方法避免了大腸桿菌抑制性乙酸鹽的生成(參考例如Lee，S.Y.，生物技術趨勢，1996，1498-105)。
在重組蛋白的生產中，氧轉移和溶氧張力對產品的產量和質量都是非常重要的(參照例如Bhattacharya和Dubey，微生物酶學技術，1997，20355-360)。因此，當在大腸桿菌中設計高細胞密度生產時，補料分批生產通常是第一選擇。附1為操作模式圖2為按標準計算的rhGH的百分量。圖3為rhGH突變體的百分量。
本發(fā)明我們非常驚訝地發(fā)現，在補料分批培養(yǎng)中，當葡萄糖補料以波動補料和/或攪拌速度的方式改變時，可以提高rhGH的質量和產量(即減少不想要的產品)。此處所用的波動這個詞可被描述為脈沖或進行上下移動。
本發(fā)明涉及在含培養(yǎng)基(含有有機碳源、氮源和無機鹽)的生物反應器中通過微生物補料分批培養(yǎng)生產重組肽的方法。這也包括復合培養(yǎng)培養(yǎng)基。
按此表述，微生物培養(yǎng)是指生物學宿主，例如細菌、酵母或動物細胞，的培養(yǎng)。
該培養(yǎng)通過以波動補料添加有機碳源和/或通過攪拌速度的波動變化來進行。該波動補料和/或攪拌速度的波動變化可在整個培養(yǎng)過程中或在重組蛋白誘導后的生產階段進行。該波動補料可以是方波方式的或正弦波方式的。在波動期不應該有饑餓產生。添加的葡萄糖為細胞所消耗，但是要直到完全饑餓的時候才被細胞所消耗。在此過程中，該碳源永遠都不應該被耗盡，并且在培養(yǎng)過程中也不需要測量其濃度。在培養(yǎng)過程中，細胞濃度應該很高，優(yōu)選10g/L以上，更優(yōu)選20g/L以上，更更優(yōu)選為50g/L以上。無論如何，應該保持有氧條件。
本實驗中，生物量濃度在40g/L這個級別。
有機碳源優(yōu)選葡萄糖，重組肽優(yōu)選生長激素。
本領域的技術人員可以很容易地測定出每種蛋白、培養(yǎng)類型、培養(yǎng)基等的波動曲線的周期時間。波動時間的周期可以是，例如此處所舉例的那樣短至1分鐘，但長至5、10、30分鐘或更長的周期也在本發(fā)明的范圍之內。
此幅度可在約±5％到±100％之間變化，例如±20、±30、±40、±50或±60％，其也可由本領域技術人員輕松測定。
波動周期可由恒定葡萄糖添加或恒定攪拌速度的周期所阻斷。
此處的葡萄糖添加是以方波函數來加以闡述的。正弦波函數特別適合于攪拌速度。而且，也可以在正弦波和方波之間變換。
按本發(fā)明所述，碳源和氧氣的濃度分別隨補料和攪拌的波動按比例變化。
已利用在有氧補料分批培養(yǎng)方法中生產人重組生長激素(rhGH)作為模式系統(tǒng)，具體研究了底物補料對由大腸桿菌產生的重組蛋白的質量的影響。
我們的發(fā)明及該發(fā)現在Bylund、Castan、Mikkola、Veide和Larsson；生物技術與生物工程，2000，69(2)119-128一文中得到了進一步的印證。
材料與方法生物體和培養(yǎng)基大腸桿菌(W3110)(含有編碼人重組生長激素和抗生素抗性的pBR衍生質粒)被用于此培養(yǎng)。該rhGH形式為由191個氨基酸組成的、有兩個分子內二硫鍵的22kDa蛋白。該蛋白被分泌到周質并在那形成二硫鍵。
在葡萄糖無機鹽培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。所用的培養(yǎng)基Forsberg G等，生物化學雜志，1997，27212430-12438一文中有述(稍有修飾)。
培養(yǎng)基成份和蒸餾水一起在生物反應器中于121℃滅菌。滅菌之后，分別加入滅過菌的硫酸鎂、微量元素和抗生素。Breox可在需要進行泡沫控制時加入。補料液的葡萄糖濃度為590g/l。
培養(yǎng)過程與生物反應器從種子罐中將指數生長的細胞轉入生產生物反應器。接種體積為最終總體積的10％。轉移步驟之后立即開始進行葡萄糖的補料。補料方案由三個不同的階段組成首先為指數補料期；然后當達到估計的生物反應器的最大通氧能力時，補料轉為恒定速率；最后在誘導時補料速率降為其最大值的80％。
葡萄糖添加以方波函數進行，其與標準補料相疊加，如

圖1所示。
將溫度和pH控制到接近大腸桿菌生長的最適值。
所有的培養(yǎng)均在151 CF 3000 Chemap-Fermenter(瑞士)攪拌罐反應器(STR)中進行，起始體積7L。在補料期期間體積增加至9L。
分析方法5ml細胞懸液離心后，獲得的菌體部分進行抽提，得到用于產品分析的樣品。該抽提方法將周質部分的蛋白釋放出來。離心在+4℃、5000rpm進行，離心15分鐘。抽提緩沖液(/L)由Tris-HCl，0.9837g；Tris-base，0.4551g；EDTAx2H20，0.372g組成。rhGH的純度和量由疏水作用層析(HIC)進行測定。HIC以TSK苯基5PW柱(Tosoh Haas)進行。四種不同的rhGH突變體被逐漸下降的鹽梯度分離開，并以紫外線在230hm處檢出(des-Phel)-rhGH(LMW)、rhGH、(三硫化合物Cys182-Cys189)-rhGH和缺失142/143-rhGH(缺失突變體)。
結果結果如圖2和3所示。
在圖1-3中，rhGH由以下方法產生(a)標準方法，(b)振幅為標準值的±30％和頻率為1分鐘的方波方式的葡萄糖補料，(c)標準的葡萄糖補料，但其攪拌分布圖(以800-1200rpm的速率)為振幅±20％和頻率1分鐘的方波。
圖2表明了用不同方法制備rhGH時，rhGH的量。
從該實驗中我們可以清楚地看到，當以波動補料及攪拌速度波動變化的形式添加葡萄糖時，rhGH的量要高的多。
圖3表明了rhGH 22kDa總量的百分比，即在使用(a)、(b)和(c)的方法時正確形式的rhGH(黑色)和缺失突變體(白色)的量。我們可以看出，當葡萄糖被以波動補料及攪拌速度波動變化的形式添加時，正確形式的rhGH(即22kDa)的產量更高。
結論葡萄糖補料策略或攪拌分布方式的最優(yōu)化(使用方波或正弦波波動)在與有機原料未以波動補料的形式補加時相比，具有更高的蛋白產量、在更高的水平上避免蛋白水解及由此的純化更容易進行的優(yōu)點。
權利要求
1.在含有有機碳源、氮源和無機鹽的培養(yǎng)基的生物反應器中，通過微生物補料分批培養(yǎng)生產重組肽的方法，其中該培養(yǎng)通過波動補料添加有機碳源和/或通過攪拌速度的波動變化來進行。
2.權利要求1所述的方法，其中該有機碳源為葡萄糖。
3.權利要求1或2所述的方法，其中該微生物為大腸桿菌。
4.權利要求1到3中任何一項所述的方法，其中該波動補料為方波方式。
5.權利要求1到3中任何一項所述的方法，其中該波動補料為正弦波方式。
6.權利要求1到5中任何一項所述的方法，其中該重組肽為生長激素。
7.權利要求1到6中任何一項所述的方法，其中該重組肽為人生長激素。
全文摘要
本發(fā)明涉及在含培養(yǎng)基(含有有機碳源、氮源和無機鹽)的生物反應器中，通過微生物補料分批培養(yǎng)生產重組肽的方法。該培養(yǎng)通過波動補料添加有機碳源和/或通過攪拌速度的波動變化(例如，以方波方式或正弦波方式)來進行。該有機碳源優(yōu)選葡萄糖，該重組肽優(yōu)選生長激素。
文檔編號C07K14/615GK1409755SQ0081688
公開日2003年4月9日 申請日期2000年11月29日 優(yōu)先權日1999年12月9日
發(fā)明者A·卡斯唐 申請人:法馬西雅公司