相關(guān)申請的交叉引用

本專利申請要求美國臨時專利申請?zhí)?2/066,105(2014年10月20日提交)的優(yōu)先權(quán)。在先申請的完整公開內(nèi)容以引用方式全文并入本文并用于全部目的。

背景技術(shù)：

細(xì)胞內(nèi)組合庫提供了產(chǎn)生擾亂細(xì)胞生理學(xué)的新型激動劑和其它分子的巨大前景。然而，需要在大動態(tài)范圍內(nèi)定量的通用讀出機(jī)制。例如，用于鑒定溶液中激動劑的當(dāng)前選擇方法一般根據(jù)它們與受體的相互作用來改變其物理狀態(tài)，使得其激活連接到惡化報告系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。因此，每個報告系統(tǒng)需要獨(dú)立的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體的性質(zhì)取決于關(guān)于研究中的系統(tǒng)的細(xì)胞和分子生物學(xué)的具體信息。此類選擇方案不能導(dǎo)致可報告結(jié)合事件的系統(tǒng)，尤其是當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制未知時。

本領(lǐng)域中需要用于基于結(jié)合事件選擇配體的更加動態(tài)和通用的方法。本發(fā)明解決本領(lǐng)域中的這種和其它未滿足的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了用于鑒定結(jié)合天然細(xì)胞環(huán)境中的靶多肽的結(jié)合配偶體的方法。在一些方法中，靶多肽在細(xì)胞中與使用慢病毒載體的候選結(jié)合配偶體的組合庫共表達(dá)。在一些方法中，候選結(jié)合配偶體包含切割信號分子的酶，所述信號分子融合到靶多肽，允許向細(xì)胞中的合成報告系統(tǒng)發(fā)送信號。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括：(a)生成表達(dá)包含含有第一跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)的靶多肽的第一融合分子的第一構(gòu)建體，和表達(dá)各自包含連接到第二跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)的候選結(jié)合配偶體的第二融合分子的組合庫的第二構(gòu)建體，其中融合分子中的一個還包含酶，并且另一個融合分子還包含酶的底物序列和人工信號通路的活化體，(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)第一構(gòu)建體和第二構(gòu)建體以生成細(xì)胞群，其中每個細(xì)胞具有共定位于質(zhì)膜的第一融合分子和第二融合分子，(c)從細(xì)胞群中選擇其中人工信號通道被激活的細(xì)胞，并且(d)鑒定所選擇細(xì)胞中的第二融合分子。從所選擇細(xì)胞中鑒定的第二融合分子使得能夠揭示所述靶多肽的結(jié)合配偶體。

在這些方法中的一些中，第一跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)為靶多肽的天然結(jié)構(gòu)域。在一些方法中，第一跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)重組融合到靶多肽。在一些方法中，酶在其n端處連接至第二跨膜結(jié)構(gòu)域，并且底物序列在其n端處連接至第一跨膜結(jié)構(gòu)域并且在其c端處連接至活化體。在一些方法中，由酶切割底物序列導(dǎo)致活化體從第二融合分子釋放。在一些方法中，靶多肽為細(xì)胞受體，并且結(jié)合配偶體為受體的配體。在這些方法的一些中，細(xì)胞受體為細(xì)胞表面受體，并且第二跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)閜dger的跨膜結(jié)構(gòu)域。這些方法中的一些涉及g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)。這些方法中的一些具體涉及tpor或glp1r。

本發(fā)明的一些方法采用為蛋白酶的酶。在這些方法的一些中，底物序列包含蛋白酶的切割位點(diǎn)。在這些方法的一些中，采用的蛋白酶為tev蛋白酶。在這些方法的一些中，采用的底物序列包含enlyfqs(seqidno:4)(tev1)、enfyfqs(seqidno:5)(tev2)、enlyyqs(seqidno:6)(tev3)、或enlffqs(seqidno:7)(tev4)。本發(fā)明的一些方法采用為hek293或hek293t細(xì)胞的宿主細(xì)胞。在一些方法中，宿主細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第一融合分子。在這些方法的一些中，第二融合分子經(jīng)由慢病毒載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)。

在本發(fā)明的一些方法中，采用的候選結(jié)合配偶體為肽或抗體。在一些方法中，候選結(jié)合配偶體經(jīng)由接頭序列連接至第二跨膜結(jié)構(gòu)域。在這些方法的一些中，接頭序列可包含ggggs(seqidno:l)的3、5、6、8、10或更多個串聯(lián)重復(fù)序列。

在本發(fā)明的一些方法中，活化體為轉(zhuǎn)錄因子，并且人工信號通路是在由轉(zhuǎn)錄因子識別的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的控制下的報告基因的表達(dá)。在這些方法的一些中，報告基因經(jīng)由慢病毒載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。在一些方法中，報告基因在表達(dá)融合分子之前導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。在一些方法中，轉(zhuǎn)錄因子為gla4-v16，并且轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包含gal4uas和腺病毒晚期啟動子。在一些方法中，采用的報告基因?yàn)闊晒馑孛竘uc2p基因或tdtomato報告基因。

本發(fā)明的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)的進(jìn)一步理解可參考說明書和權(quán)利要求的剩余部分來實(shí)現(xiàn)。

附圖說明

圖1.用于監(jiān)控受體-配體相互作用的基于鄰近度的方法的示意圖。(a)膜蛋白質(zhì)偶聯(lián)到特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使得一旦膜蛋白質(zhì)被可溶性或膜系激動劑刺激就激活報告基因的表達(dá)。(b)基于鄰近度的選擇系統(tǒng)由兩個膜系蛋白質(zhì)組成。第一個為在其細(xì)胞內(nèi)側(cè)上偶聯(lián)到蛋白酶tev的大膜系潛在配體庫。第二，膜系受體蛋白質(zhì)具有tev切割位點(diǎn)和附著于其細(xì)胞內(nèi)側(cè)的人工轉(zhuǎn)錄因子。共定位的受體蛋白質(zhì)和配體的相互作用近似于tev和tev識別位點(diǎn)，這極大地有利于轉(zhuǎn)錄因子的催化釋放。釋放的轉(zhuǎn)錄因子引入細(xì)胞核并且激活報告基因的表達(dá)。

圖2.血小板生成素受體(tpor)激活的基于鄰近度的鑒定。建立了包含在uas和tpor-tev切割位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄因子的控制下的熒光素酶報告基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。細(xì)胞由編碼血小板生成素(tpo)的慢病毒或tpor結(jié)合抗體3d9或14f12轉(zhuǎn)導(dǎo)。編碼包括3、5、6、8或10個拷貝的(ggggs)(seqidno:l)的不同接頭或人igglfc的基因置于配體和pdgfr跨膜結(jié)構(gòu)域之間。感染后2天測量熒光素酶活性。將包含glp1r-tev切割位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞系用作陰性細(xì)胞對照。通過測量攜帶具有相同接頭類型和長度的不相關(guān)抗體的對照慢病毒的發(fā)光信號來控制反應(yīng)。

圖3a.胰高血糖素樣肽1受體(glp1r)的基于鄰近度的反應(yīng)。將全長glp1r(1-463)和截短的glp1r(1-426)在c端處偶聯(lián)到tev切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子。構(gòu)建了包含在uas和不同glp1r構(gòu)建體的控制下的熒光素酶報告基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。細(xì)胞由編碼glp1r自然配體的慢病毒、毒蜥外泌肽-4作為陽性對照或者不相關(guān)抗體作為陰性對照來轉(zhuǎn)導(dǎo)。感染后1-3天測量熒光素酶活性。感染細(xì)胞的發(fā)光信號除以相應(yīng)未感染細(xì)胞的信號以獲得信噪比(s/n)。

圖3b.通過改變tev切割位點(diǎn)來增強(qiáng)信噪比。將以不同效率切割的四個tev切割位點(diǎn)用于glp1r(1-426)構(gòu)造。包含含有不同tev底物序列的glp1r構(gòu)造的穩(wěn)定細(xì)胞系利用編碼glp1r天然配體的慢病毒、毒蜥外泌肽-4作為潛在陽性構(gòu)建體，或者vcl.l或不相關(guān)抗體作為陰性對照來轉(zhuǎn)導(dǎo)。在感染后1-3天測量熒光素酶活性。感染細(xì)胞的發(fā)光信號除以相應(yīng)未感染細(xì)胞的信號。

圖4.熒光蛋白作為報告基因用于基于鄰近度的方法。研究包含在具有不同tev切割位點(diǎn)的uas和glp1r構(gòu)造的控制下的tdtomato報告基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。細(xì)胞利用包含毒蜥外泌肽-4的慢病毒作為陽性構(gòu)建體或者不相關(guān)抗體作為陰性對照來轉(zhuǎn)導(dǎo)。在感染后2天觀察熒光蛋白質(zhì)的選擇性表達(dá)。

具體實(shí)施方案

i.概述

本發(fā)明提供用于鑒定靶蛋白或多肽的結(jié)合配偶體的方法。靶蛋白可以為可結(jié)合到另一種多肽或肽分子，例如細(xì)胞表面受體、核受體和其它配體結(jié)合蛋白質(zhì)的任何蛋白質(zhì)或多肽。所述方法依賴于靶蛋白(例如，細(xì)胞受體)和候選結(jié)合配偶體(例如，候選多肽配體)的共定位表達(dá)和基于鄰近度的選擇方式。本發(fā)明部分地基于由本發(fā)明人生成用于鑒定細(xì)胞受體的配體的通用系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用由鄰近效應(yīng)引起的化學(xué)速率加速、配體及其受體在空間上的近似性。所述系統(tǒng)使用人工信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且因此無需知曉受體-配體體系的確切化學(xué)性質(zhì)或其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。該方法允許從在其處于其自然環(huán)境中時與受體相互作用的大庫中自分泌選擇分子。如本文所詳述的，本發(fā)明提供了新的和通用的方法以檢測配體-受體結(jié)合活性。這在其中下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制未知的情況下是尤其重要的。

鄰近效應(yīng)表現(xiàn)為有效的摩爾數(shù)(molarities)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的大部分生物學(xué)。此類鄰近效應(yīng)可以通過區(qū)室化、對支架分子的粘附、或酶活性位點(diǎn)的螯合來實(shí)現(xiàn)。有效摩爾數(shù)可大致幾百或10¹⁰摩爾。通過選擇適當(dāng)?shù)拿?底物體系、最佳反應(yīng)難度、和優(yōu)化的接頭長度，本發(fā)明允許形成穩(wěn)健且通用的系統(tǒng)，其可用于構(gòu)建大多數(shù)膜受體和其它結(jié)合蛋白質(zhì)的報告系統(tǒng)。不同于目前本領(lǐng)域中已知的選擇方法，本發(fā)明的基于鄰近度的報告系統(tǒng)僅依賴于兩個分子是否相互作用并且可不依賴于自然通路的特定下游要求。相反，系統(tǒng)連接到通用報告系統(tǒng)，所述報告系統(tǒng)的化學(xué)性因?yàn)猷徑?yīng)而相對于競爭性反應(yīng)是有利的。因此，在復(fù)雜系統(tǒng)諸如細(xì)胞的情況下，引入的有效摩爾數(shù)變成有利于給定的相互作用的特異性參數(shù)。

如本文所詳述的，本發(fā)明的方法采用候選結(jié)合配偶體的細(xì)胞內(nèi)組合庫和其中候選結(jié)合配偶體和感興趣的蛋白質(zhì)(例如，靶受體)共定位于細(xì)胞區(qū)室(例如，質(zhì)膜)中的表達(dá)系統(tǒng)。細(xì)胞內(nèi)組合庫可在細(xì)胞中表達(dá)多達(dá)1.0x10⁸的不同抗體或肽，該細(xì)胞還表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。表達(dá)系統(tǒng)使得相互作用的分子螯合并達(dá)到比當(dāng)其在本體溶液中相互作用可實(shí)現(xiàn)的更高的有效摩爾數(shù)。此外，利用酶-底物報告系統(tǒng)，其可利用質(zhì)膜中的該分子相互作用并報告其發(fā)生。以對細(xì)胞區(qū)室中的任何分子相互作用普遍適用的方式構(gòu)建酶-底物系統(tǒng)。

本發(fā)明的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)的進(jìn)一步理解可通過參考說明書和權(quán)利要求的剩余部分來實(shí)現(xiàn)。

ii.定義

除非另有限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。以下參考文獻(xiàn)向技術(shù)人員提供本發(fā)明所用的許多術(shù)語的一般定義：academicpressdictionaryofscienceandtechnology，morris(編輯)，academicpress(第一版，1992)；oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology，smith等人(編輯)，oxforduniversitypress(修訂版，2000)；encyclopaedicdictionaryofchemistry，kumar(編輯)，anmolpublicationspvt.ltd.(2002)；dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology，singleton等人(編輯)，johnwiley&sons(第三版，2002)；dictionaryofchemistry，hunt(編輯)，routledge(第一版，1999)；dictionaryofpharmaceuticalmedicine，nahler(編輯)，springer-verlagtelos(1994)；dictionaryoforganicchemistry，kumar和anandand(編輯)，anmolpublicationspvt.ltd.(2002)；以及adictionaryofbiology(oxford平裝參考書)，martin和hine(編輯)，oxforduniversitypress(第4版，2000)。此外，提供以下定義以幫助讀者實(shí)施本發(fā)明。

除非另有限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。以下參考文獻(xiàn)向技術(shù)人員提供本發(fā)明所用的許多術(shù)語的一般定義：oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology，smith等人(編輯)，oxforduniversitypress(修訂版，2000)；dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology，singleton等人(編輯)，johnwiley&sons(3prdp編輯，2002)；以及adictionaryofbiology(oxford平裝參考書)，martin和hine(編輯)，oxforduniversitypress(4pthp編輯，2000)。此外，提供以下定義以幫助讀者實(shí)施本發(fā)明。

除非上下文另外清楚地指示，單數(shù)術(shù)語“一”、“一個”和“所述”包括復(fù)數(shù)指示物。類似地，除非上下文另外清楚地指示，單詞“或”旨在包括“和”。

如本文所用，術(shù)語肽的“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸為由遺傳密碼編碼的那些，以及稍后改性的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，碳與氫、羰基基團(tuán)、氨基基團(tuán)和r基團(tuán)結(jié)合，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。此類類似物具有改性的r基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或改性的肽主鏈，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。

如本文所用，術(shù)語“包括”或“包含”在提及本發(fā)明所必要的組合物、方法、和相應(yīng)組分時使用，但開放以納入未指定的元件，無論其是否必要。

如本文所用，使用“基本上由……組成”是指給定實(shí)施方案中所需的那些元件。術(shù)語允許存在不實(shí)質(zhì)上影響本發(fā)明的該實(shí)施方案的基本的和新型的或功能性特征的元件。

術(shù)語“由……組成”是指如本文所述的組合物、方法及其相應(yīng)組分，其不包括在實(shí)施方案的所述描述中未列出的任何元件。

術(shù)語“接觸”是指其正常含義并且是指將兩種或更多種試劑(例如，多肽或小有機(jī)分子)組合、將試劑和細(xì)胞組合、或?qū)煞N不同細(xì)胞群組合。接觸可在體外進(jìn)行，例如在測試試管或生長培養(yǎng)基中將兩種多肽混合或?qū)⒖贵w群與細(xì)胞群混合。接觸還可在細(xì)胞中或原位進(jìn)行，例如，通過在將編碼兩種多肽的重組多核苷酸的細(xì)胞中，或在細(xì)胞裂解物中共表達(dá)使兩種多肽在細(xì)胞中接觸。

就多肽序列而言，“保守修飾變體”是指具有保守氨基酸取代的變體，氨基酸殘基被具有帶相同電荷的側(cè)鏈的其它氨基酸殘基替代。具有帶相同電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。

術(shù)語“工程化細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”(或簡稱“宿主細(xì)胞”)是指其中已經(jīng)引入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，這些術(shù)語不僅旨在指特定的受試細(xì)胞，而且指此類細(xì)胞的后代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境影響，后代中可發(fā)生特定修飾，所以此類后代實(shí)際上可不與親本細(xì)胞相同，但仍包括在如本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。

毒蜥外泌肽-4是胰高血糖素樣肽1(glp-1)受體的39個氨基酸激動劑。毒蜥外泌肽-4存在于吉拉毒蜥，鈍尾毒蜥(helodermasuspectum)的唾液中。毒蜥外泌肽-4具有比glp-1顯著更長的半衰期。

“融合”蛋白質(zhì)或多肽是指由至少兩種多肽和用于將兩種多肽可操作地連接成一個連續(xù)多肽的連接序列或連接組成的多肽。連接在融合多肽中的兩種多肽通常來源于兩個獨(dú)立的源，因此融合多肽包括在自然界中通常不連接地存在的兩個連接的多肽。

當(dāng)關(guān)于兩種多肽使用時，“異源”是指兩者不存在于自然界中的相同細(xì)胞或微生物中。等位變異或天然存在的突變事件不產(chǎn)生如本文所定義的異源生物分子或序列。載體構(gòu)建體的“異源”區(qū)域是在較大的多核苷酸分子內(nèi)的多核苷酸的可鑒定區(qū)段，發(fā)現(xiàn)其在自然界中與較大分子不相關(guān)。因此，當(dāng)異源區(qū)域編碼哺乳動物基因時，所述基因的兩側(cè)通常是多核苷酸，所述多核苷酸不側(cè)接源生物體的基因組中的哺乳動物基因組多核苷酸。

術(shù)語“分離”是指將多肽或蛋白質(zhì)從其天然環(huán)境中移除。然而，與其一起發(fā)現(xiàn)的一些組分可繼續(xù)具有“分離的”蛋白質(zhì)。因此，“分離的多肽”不如其在自然界中所呈現(xiàn)那樣，而是可顯著小于100％純蛋白。

在兩種或更多種核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語“相同的”或百分比“同一性”是指相同的兩種或更多種序列或子序列。當(dāng)如使用以下序列比較算法中的一個或通過手動比對和目視檢測所測量的，在比較窗或指定區(qū)域范圍內(nèi)比較和比對最大對應(yīng)性時，如果兩種序列具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，在指定區(qū)域內(nèi)，或者，當(dāng)未指定時，在整個序列內(nèi)的60％同一性，另選地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，則兩個序列是“基本上相同的”。任選地，同一性存在于至少約50個核苷酸(或10個氨基酸)長度的區(qū)域內(nèi)，或更優(yōu)選地存在于100至500個或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個氨基酸)長度的區(qū)域內(nèi)。

對比序列用于比較的方法是本領(lǐng)域中為人們所熟知的。用于比較的最佳序列比對可以例如通過如下方法進(jìn)行：局部同源算法(smith和waterman，adv.appl.math.2:482c，1970)；同源比對算法(needleman和wunsch，j.mol.biol.48:443，1970)；搜索相似性法(pearson和lipman，proc.nat'l.acad.sci.usa85:2444，1988)；這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(wisconsin遺傳軟件包(geneticscomputergroup，madison，wi)中的gap、bestfit、fasta和tfasta)；手動比對和視覺檢測(參見，例如，brent等人，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons,inc.(ringbou編輯，2003))。適用于測定百分比序列同一性和序列相似性的算法的兩個示例為blast和blast2.0算法，其分別描述于altschul等人，nuc.acidsres.25:3389-3402，1977；和altschul等人，j.mol.biol.215:403-410，1990中。

除了上述序列同一性的百分比之外，兩個核酸序列或多肽基本上相同的另一個指示是由第一核酸編碼的多肽與抵抗由第二核酸編碼的多肽的抗體具有免疫交叉反應(yīng)性，如下所述的。因此，多肽通常與第二多肽基本上相同，例如，其中兩種肽僅在保守取代上不同。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示是兩個分子或其互補(bǔ)物在嚴(yán)格條件下彼此雜交，如下所述。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示是相同的引物可用于擴(kuò)增序列。

“配體”是由特定抗原、受體或靶分子識別的分子。可用于本發(fā)明實(shí)踐中的配體的示例可包括但不限于細(xì)胞膜受體的激動劑和拮抗劑、毒素和毒液、病毒表位、激素、激素受體、多肽、肽、酶、酶底物、輔因子、藥物(例如阿片劑、類固醇等)、凝集素、糖、多核苷酸、核酸、寡糖、蛋白質(zhì)和單克隆抗體。

“連接”是指可操作地或功能性連接兩個生物分子(例如，多肽或編碼兩個多肽的多核苷酸)的方式，其包括但不限于重組融合、共價鍵、二硫鍵、離子鍵、氫鍵和靜電鍵?！叭酆稀笔侵竿ㄟ^共價鍵連接?！敖宇^”或“間隔段”是指連接兩個生物分子并且用于將兩個分子置于具有最小空間位阻的優(yōu)選構(gòu)型中的分子或分子組。

當(dāng)涉及核酸時，術(shù)語“可操作地連接”是指多核苷酸元件以功能關(guān)系連接。當(dāng)核酸放置成與其它核酸序列成功能關(guān)系時，核酸“可操作地連接”。例如，如果啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其可操作地連接至編碼序列?？刹僮鞯剡B接是指被連接的dna序列通常是連續(xù)的，并且在必須接合兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的情況下是連續(xù)的并且在閱讀框中。

除非另外指明，術(shù)語“多肽”和“肽”在本文中可互換使用以指氨基酸殘基的聚合物。其包括短的寡肽(例如，具有小于約25個殘基的肽)和較長的多肽分子(例如，多于約25或30個氨基酸殘基的聚合物)。通常，本發(fā)明中使用的候選肽或多肽配體可包含約4個氨基酸殘基至約350個或更多的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，肽或多肽包含長度為約6個氨基酸殘基至約60個氨基酸殘基。在一些其它實(shí)施方案中，其可包含長度為約8個氨基酸殘基至約40個氨基酸殘基。肽或多肽可以包括天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物。除非另有說明，特定的多肽序列也隱含地包括其保守修飾的變體。

如本文所用，術(shù)語“肽模擬物”或“擬肽”是指生物學(xué)上模擬肽功能的參考肽的衍生化合物。通常，擬肽衍生物具有參考多肽的生物學(xué)功能的至少50％、至少75％或至少90％。

術(shù)語“可操作地連接”是指兩個或多個多核苷酸(例如dna)片段之間的功能關(guān)系。通常，其是指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與轉(zhuǎn)錄序列的功能關(guān)系。例如，如果啟動子或增強(qiáng)子序列刺激或調(diào)節(jié)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞或其它表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子或增強(qiáng)子序列可操作地連接到編碼序列。通常，可操作地連接到轉(zhuǎn)錄序列的啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列在生理上與轉(zhuǎn)錄序列相鄰，即它們是順式作用的。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，例如增強(qiáng)子，不需要在生理上鄰近或位于編碼序列的轉(zhuǎn)錄被其增強(qiáng)的所述編碼序列附近。

除非另有說明，術(shù)語“受體”廣義地是指對給定配體具有親和力的分子。受體可以是天然存在的分子或人造分子。另外，它們可以其未改變狀態(tài)使用或者作為與其它物種的聚集體使用。受體可以直接或經(jīng)由特異性結(jié)合物質(zhì)共價或非共價地附接至結(jié)合成員?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的受體的典型示例是細(xì)胞表面信號受體。

短語“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”或“信號傳導(dǎo)活動”(例如，glp-1r介導(dǎo)的信號傳導(dǎo))是指至少一種生物化學(xué)反應(yīng)，但更常見的是一系列生物化學(xué)反應(yīng)，其由細(xì)胞與刺激性化合物或試劑相互作用產(chǎn)生。因此，刺激性化合物與細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳送的“信號”，最終導(dǎo)致細(xì)胞響應(yīng)。

如本文所用，術(shù)語“變體”是指包含與參考分子的序列基本上相同的序列的分子(例如，肽或多肽)。例如，參考分子可以是本文所公開的酶多肽或其融合物。參考分子也可以是編碼多肽的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，變體可以與參考分子共享至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的序列同一性。在一些其它實(shí)施方案中，該變體與參考分子的不同之處在于具有一個或多個保守氨基酸取代。在一些其它實(shí)施方案中，參考分子的變體是保守修飾的變體，例如具有改變的氨基酸序列(例如，具有一個或多個保守氨基酸取代)，但基本上保留參考分子的生物學(xué)活性的變體。保守的氨基酸取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

術(shù)語“載體”旨在表示能夠輸送其已經(jīng)連接的另一多肽的多核苷酸分子。載體的一種類型是“質(zhì)?！?，其是指其中可以連接附加的dna區(qū)段的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。載體的另一種類型是病毒載體，其中附加的dna區(qū)段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離基因哺乳動物載體)。其它載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細(xì)胞中時整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而連同宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)可與其操作地連接的基因的表達(dá)。此類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱為“表達(dá)載體”)。

iii.基于鄰近度選擇的表達(dá)系統(tǒng)

本發(fā)明的方法利用表達(dá)系統(tǒng)，所述表達(dá)系統(tǒng)允許經(jīng)表達(dá)靶蛋白(例如，細(xì)胞受體)和候選結(jié)合配偶體(例如，候選多肽配體)的庫錨定并共定位于細(xì)胞區(qū)室，例如質(zhì)膜中。候選結(jié)合配偶體經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)組合庫進(jìn)行表達(dá)。靶蛋白和結(jié)合配偶體的相互作用將激活報告細(xì)胞區(qū)室(例如質(zhì)膜)中分子相互作用發(fā)生的酶-底物系統(tǒng)。靶蛋白和結(jié)合配偶體以如下方式表達(dá)，使得其各自融合或僅攜帶酶-底物報告系統(tǒng)的一個組分。使用細(xì)胞表面受體和肽配體作為示例，該系統(tǒng)僅在配體和受體相互作用以使反應(yīng)物接近時起作用。當(dāng)受體及其配體之間的相互作用導(dǎo)致它們接近時，蛋白水解反應(yīng)釋放可在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生可檢測響應(yīng)的活化體或效應(yīng)分子。例如，活化體可以是進(jìn)入核并與細(xì)胞核中的啟動子結(jié)合以激活報告基因的肽或多肽轉(zhuǎn)錄因子。許多優(yōu)點(diǎn)源自該表達(dá)系統(tǒng)和產(chǎn)生的選擇格式。例如，該系統(tǒng)允許在完整活細(xì)胞的生理相關(guān)環(huán)境中確定大量潛在激動劑的分子相互作用。此外，該系統(tǒng)能夠搜索受體的配體，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制未知或配體本身未知。

為了將候選結(jié)合配偶體(例如，多肽配體)和靶蛋白(例如，細(xì)胞受體)共定位表達(dá)到質(zhì)膜，結(jié)合配偶體可以融合到跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域并由第一表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)。靶蛋白表達(dá)為來自第二表達(dá)構(gòu)建體的融合體。在一些實(shí)施方案中，靶蛋白是細(xì)胞表面受體，所述細(xì)胞表面受體包含一種或多種天然跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)，例如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域連同細(xì)胞表面受體的天然tm。在其中靶蛋白缺乏天然tm(例如，核受體或其它配體結(jié)合蛋白)的一些其它實(shí)施方案中，其可以表達(dá)為具有異源跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域的融合體。在一些實(shí)施方案中，接頭序列用于連接融合多肽的組分的表達(dá)構(gòu)建體中，例如將候選配體(例如，抗體或肽)連接到跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，迄今為止產(chǎn)生的大多數(shù)膜系毒素包含一系列20個交替的甘氨酸和天冬酰胺殘基。該接頭序列可用于本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體。膜系鏈之前的此類接頭可向肽毒素提供結(jié)合其同源離子通道所必需的旋轉(zhuǎn)靈活性和距離。在各種實(shí)施方案中，可以使用和優(yōu)化各種長度的接頭以表達(dá)融合構(gòu)建體。

為例舉利用受體和肽配體的選擇方案，候選配體和受體以如下方式表達(dá)，使得各自融合到或僅攜帶酶-底物報告系統(tǒng)的一個組分。因此，如本文所例示的，配體-tm融合構(gòu)建體可另外表達(dá)酶(或其底物)，并且受體構(gòu)建體可另外表達(dá)底物序列(或酶)。在各種實(shí)施方案中，底物肽序列還連接至效應(yīng)物或活化體序列(例如轉(zhuǎn)錄因子)。當(dāng)配體與受體結(jié)合時，底物序列的酶切割將導(dǎo)致效應(yīng)分子的釋放。釋放的效應(yīng)分子然后可激活細(xì)胞中可檢測的信號通路，從而提供發(fā)生配體-受體結(jié)合事件的指示。

適用于本發(fā)明的酶-底物報告體不限于任何特定的酶-底物系統(tǒng)；多個人們所熟知的酶和多肽底物對中的任一種可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。如本文所例示的，酶-底物系統(tǒng)的一個示例是tev蛋白酶和酶的特異性肽切割位點(diǎn)。tev蛋白酶是為人們所熟知的并且是來自煙草蝕刻病毒(tev)的高序列特異性半胱氨酸蛋白酶。其是pa類糜蛋白酶樣蛋白酶的成員。由于其高序列特異性，其經(jīng)常用于體外和體內(nèi)融合蛋白質(zhì)的受控切割。在本發(fā)明的實(shí)踐中，可使用野生型tev蛋白酶、野生型酶的任何變體(例如保守修飾的變體)或酶片段。表達(dá)tev蛋白酶和變體的序列和載體通常用于本領(lǐng)域中，并且易于在文獻(xiàn)或商業(yè)供應(yīng)商中獲得，例如，kapust等人，prot.expr.purif，19：312-8，2000；kapust等人，prot.eng.，14：993-1000，2001；chen等人，prot.sci.19：2379-88，2010；以及addgene(cambridge,ma)。tev蛋白酶的相應(yīng)切割位點(diǎn)序列也已被很好地表征并用于本領(lǐng)域中。適用于tev蛋白酶的底物序列的示例包括，例如enlyfqs(seqidno：4)(tev1)、enfyfqs(seqidno：5)(tev2)、enlyyqs(seqidno：6)(tev3)和enlffqs(seqidno：7)。在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明構(gòu)建體的tev蛋白酶底物序列是enfyfqs(seqidno：5)(tev2)。

類似地，本領(lǐng)域熟知的任何報告基因均可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。其可以是編碼蛋白質(zhì)的任何基因或多核苷酸，其由細(xì)胞的表達(dá)可以檢測和/或定量。因此，報告物的表達(dá)水平的測量是指導(dǎo)報告基因表達(dá)的啟動子元件的活化水平的指示?？捎米鲌蟾婊虻幕虻氖纠ɡ缇幋a代謝酶、抗生素抗性因子、發(fā)光蛋白或熒光蛋白的基因。此類報告基因是本領(lǐng)域所熟知的并且具體示例描述于wood(1995)curr.opin.biotechnol.6(1)：50-58中。在本發(fā)明的一些構(gòu)建體中，報告基因編碼熒光素酶。在一些其它實(shí)施方案中，報告基因編碼代謝酶如β-半乳糖苷酶。在一些實(shí)施方案中，報告基因可以是補(bǔ)充宿主細(xì)胞中營養(yǎng)缺陷突變的基因，并允許在選擇性培養(yǎng)基上表達(dá)該基因的細(xì)胞生長。

用于實(shí)施本發(fā)明方法的表達(dá)載體和報告細(xì)胞的構(gòu)建可根據(jù)分子生物學(xué)的常規(guī)實(shí)踐方法進(jìn)行。用于執(zhí)行本發(fā)明所需步驟的一些具體方案也在本文中例示。例如，如本文所詳述的，編碼配體-tm-酶融合體的表達(dá)載體可通過將候選配體融合到pdgfr跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸514-561)的n端，同時將酶(例如tev蛋白酶)與跨膜結(jié)構(gòu)域的c端融合形成。為了獲得旋轉(zhuǎn)靈活性，可在配體序列和跨膜結(jié)構(gòu)域之間插入接頭序列。如本文所例示的，一個接頭序列包含ggggs(seqidno：1)的一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多個)串聯(lián)重復(fù)序列。在一些實(shí)施方案中，接頭包含ggggs(seqidno：1)的8、10或更多個串聯(lián)重復(fù)序列?？梢詫⑴潴w-tm-酶融合體克隆入慢病毒載體(例如，本文所例示的plv2載體)中，以產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的病毒顆粒。就受體-底物-效應(yīng)分子融合而言，示例性效應(yīng)分子可以是gal4dna-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與單純皰疹病毒vp16c端激活結(jié)構(gòu)域的融合體。這導(dǎo)致與所有哺乳動物細(xì)胞正交的人工轉(zhuǎn)錄因子(gal4-vp16)。靶受體(例如，tpor或glpir)的編碼區(qū)在其c端處融合到酶的底物序列或切割位點(diǎn)(例如，tev蛋白酶切割位點(diǎn))和gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子。然后可將該融合序列克隆到合適的表達(dá)載體(例如，pcdna5載體)中。

本發(fā)明中可以使用各種表達(dá)載體。例如，慢病毒載體適用于在宿主細(xì)胞中引入和表達(dá)候選結(jié)合配偶體的組合庫。慢病毒載體是能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞兩者并且通常產(chǎn)生高病毒滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。適用于本發(fā)明的基于慢病毒載體的示例包括例如本文所例示的plv2慢病毒載體?？刹捎貌⑿揎椧杂糜趯?shí)施本發(fā)明的其它慢病毒載體包括例如plvx-puro、plvx-ires-neo、plvx-ires-hyg和plvx-ires-puro。具有克隆的候選配體序列的各種慢病毒載體可被引入合適的宿主細(xì)胞中以表達(dá)候選配體庫。例如，hek293細(xì)胞系、hek293t細(xì)胞系和tf-1細(xì)胞系全部均適用于本發(fā)明。本領(lǐng)域所熟知的許多其它包裝細(xì)胞系(例如，lenti-x293t細(xì)胞系)也可用于表達(dá)本發(fā)明中的組合庫。除了基于慢病毒的載體和宿主細(xì)胞外，其它逆轉(zhuǎn)錄型病毒載體和表達(dá)系統(tǒng)也可以用于本發(fā)明方法的實(shí)踐中。這些包括基于mmlv的載體pqcxin、pqcxiq和pqcxih，以及相容的生產(chǎn)細(xì)胞系，諸如基于hek293的包裝細(xì)胞系gp2-293、ecopack2-293和amphopack293以及基于nih/3t3的包裝細(xì)胞系retropackpt67。

為了鑒定可以與受體結(jié)合的候選配體，宿主細(xì)胞還可包含可被效應(yīng)分子激活以允許檢測結(jié)合事件的發(fā)生的可檢測的報告基因。例如，當(dāng)選擇的效應(yīng)分子是gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子時，可以將uas-報告基因載體引入宿主細(xì)胞中。如本文所例示的，報告基因載體包含由gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子識別并激活可操作連接的序列的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列(例如，gal4uas和腺病毒晚期啟動子的多個重復(fù)序列)?？刹僮鞯剡B接的序列通常編碼易于檢測的信號。例如，報告基因載體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可響應(yīng)于gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而驅(qū)動熒光素酶luc2p或tdtomato報告基因的轉(zhuǎn)錄。如本文所例示的，通過利用報告基因構(gòu)建體(例如，uas-報告基因載體)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(例如，hek293細(xì)胞)，可以容易地產(chǎn)生包含報告基因的穩(wěn)定的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系。

本發(fā)明示例了配體與tpor和glp-1受體的共定位表達(dá)和結(jié)合的檢測。本文所述的通用選擇方案可廣泛地施用于鑒定任何細(xì)胞受體的配體。這些包括通常包含其自身跨膜結(jié)構(gòu)域(例如gpcr或酶連接的受體)的任何細(xì)胞表面受體，例如gpcr和酶連接受體。除了具有跨膜結(jié)構(gòu)域的表面受體之外，還可以在本發(fā)明的選擇系統(tǒng)中檢查其它細(xì)胞受體或配體-結(jié)合蛋白質(zhì)，以鑒定其配體或結(jié)合配偶體，包括例如細(xì)胞質(zhì)受體或核受體。就缺乏天然跨膜結(jié)構(gòu)域的受體或配體-結(jié)合蛋白質(zhì)而言，可在用于本發(fā)明的選擇方法之前將它們重組融合到異源跨膜結(jié)構(gòu)域(例如pdgfrtm)。在各種實(shí)施方案中，選擇系統(tǒng)可用于鑒定其中配體尚未被鑒定的受體(孤兒受體)的新配體或調(diào)節(jié)劑(激動劑或拮抗劑)。就具有已知配體的受體而言，可以尋求新型激動劑或拮抗劑的鑒定，以專門用于模擬、增強(qiáng)或抑制配體的作用。

本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)。gpcr構(gòu)成最大的細(xì)胞表面受體蛋白家族。存在gpcr的三個主要家族，gs-、gi-和gq-偶聯(lián)受體。在激活時，不同的gpcr刺激多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。例如，gs偶聯(lián)受體增加，然而gi偶聯(lián)受體減少camp產(chǎn)生。因此，這兩種不同的gpcr可以激活或抑制camp反應(yīng)元件。另一方面，gq偶聯(lián)受體增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度并激活多響應(yīng)元件?；谛蛄型葱院凸δ芟嗨菩裕琯pcr可以分成a類(視紫紅質(zhì)樣受體)、b類(分泌素受體家族)、c類(代謝型谷氨酸/信息素)、d類(真菌交配信息素受體)、e類(環(huán)狀amp受體)和f類(卷曲/平滑受體)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及酶聯(lián)受體。酶聯(lián)受體包括受體酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相關(guān)受體、受體樣酪氨酸磷酸酶、受體絲氨酸/蘇氨酸激酶、受體鳥苷酸環(huán)化酶和組氨酸激酶相關(guān)受體。其中，受體酪氨酸激酶代表最大的酶聯(lián)受體群。這些分子中的大多數(shù)是生長因子和激素，如表皮生長因子(egf)、血小板衍生生長因子(pdgf)、成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)、肝細(xì)胞生長因子(hgf)、胰島素、神經(jīng)生長因子(ngf)等等的受體。

除了共定位到質(zhì)膜之外，本發(fā)明的方法還可用于選擇與受體共定位到其它細(xì)胞區(qū)室的配體。選擇性近似的兩種蛋白質(zhì)的任何情況均將增加其相互作用的有效摩爾數(shù)。因此，例如，本發(fā)明的方法也可用于監(jiān)測細(xì)胞器-細(xì)胞器相互作用或通常通過重新指導(dǎo)報告系統(tǒng)來追蹤蛋白質(zhì)運(yùn)輸。

iv.位于配體庫中的質(zhì)膜

本發(fā)明提供了在細(xì)胞中表達(dá)時可定位于質(zhì)膜的多肽或抗體(例如，單鏈抗體)的組合庫。所述庫可各自包含至少1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰或更多不同的多肽或抗體序列。通常，庫的每個成員包含可操作連接至跨膜結(jié)構(gòu)域的特異性或隨機(jī)多肽或抗體序列?？缒そY(jié)構(gòu)域，例如如本文所例示的pdgfr跨膜區(qū)域，使得經(jīng)表達(dá)的肽連接至細(xì)胞膜。除了pdgfr之外，本領(lǐng)域所熟知的許多其它跨膜結(jié)構(gòu)域以及這些已知的跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域的變體(例如，保守修飾的變體)也可用于構(gòu)建本發(fā)明的配體庫。參見例如，remm等人，genomeres.10：1679-1689，2000；和hubert等人，celladh.migr.4：313-324，2010。

在一些實(shí)施方案中，候選配體是多肽或肽序列的組合庫。任何多肽或肽(例如，隨機(jī)肽)可用于構(gòu)建本發(fā)明的組合庫。它們可以包含長度為至少4、5、6、7、8、10、15、20、25、50、100、200、300或更多個的氨基酸殘基。常規(guī)的遺傳工程技術(shù)通常用于表達(dá)多肽庫。為了產(chǎn)生本發(fā)明的重組多肽或肽庫，將編碼該肽的多核苷酸插入合適的表達(dá)系統(tǒng)中。融合肽的表達(dá)可使用本領(lǐng)域已知的許多類型的合適的表達(dá)載體，包括例如包含細(xì)菌、病毒、酵母、真菌、昆蟲或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的載體。如本文所例示的，用于產(chǎn)生本發(fā)明的肽或多肽庫的優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是基于慢病毒的。獲得和使用此類表達(dá)載體的方法是為人們所熟知的。就在用于產(chǎn)生和表達(dá)本發(fā)明的組合庫的這種和其它分子生物學(xué)技術(shù)中的指導(dǎo)而言，參見例如，sambrook等人，molecularcloning，alaboratorymanual，當(dāng)前版本，coldspringharborlaboratory，newyork；miller等人，geneticengineering8:277-298(plenumpress，當(dāng)前版本)，wu等人，methodsingenebiotechnology(crcpress，newyork，n.y.，當(dāng)前版本)，recombinantgeneexpressionprotocols，inmethodsinmolecularbiology，第62卷(tuan等人，humanapress，totowa，n.j.，當(dāng)前版本)，以及本文所引用的參考文獻(xiàn)。在示例性實(shí)施方案中，可將多核苷酸置于表達(dá)載體中的合適啟動子的控制下，例如，如本文所例示的慢病毒載體中的ef1啟動子。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所用的配體的組合庫是抗體庫。任何抗體序列可用于構(gòu)建本發(fā)明的組合肽庫。在一些實(shí)施方案中，通常使用單鏈抗體庫。單鏈抗體庫可包含單獨(dú)的重鏈或輕鏈抗體或其可變結(jié)構(gòu)域。然而，更通常地，單鏈抗體庫的成員由被單個連續(xù)蛋白質(zhì)內(nèi)的肽間隔段分離的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的融合體形成。參見例如ladner等人，wo88/06630；mccafferty等人，wo92/01047?？贵w庫的多樣性可由從天然來源諸如免疫或未免疫b細(xì)胞的非克隆群體獲得的抗體編碼序列產(chǎn)生。另選地，或者另外，可通過本領(lǐng)域熟知的人工誘變引入多樣性。在一些實(shí)施方案中，抗體庫表達(dá)單鏈可變區(qū)片段(scfv)。本領(lǐng)域中描述了適用于本發(fā)明的特定scfv庫，例如gao等人，proc.natl.acad.sci.99:12612-6，2012。此類抗體庫可用本領(lǐng)域所熟知的各種載體產(chǎn)生和表達(dá)。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的抗體庫通過基于慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體構(gòu)建。用于在真核宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的此類抗體庫的構(gòu)建可根據(jù)本文所例示的技術(shù)和本領(lǐng)域所熟知的其它方法進(jìn)行。

本領(lǐng)域所熟知的許多技術(shù)可以容易地用于增加候選配體庫的成員的多樣性。這些方法包括例如組合鏈改組、抗體序列的人源化、突變的引入、親和力成熟、使用突變體宿主細(xì)胞等。這些方法全部均可在本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷下在本文所述方法的實(shí)踐中使用。參見，例如，aujame等人，hum.antibod.8:155-168，1997；barbas等人，proc.natl.acad.sci.usa88:7978-82，1991；barbas等人，proc.natl.acad.sci.usa91:3809-13，1994；boder等人，proc.natl.acad.sci.usa97:10701-10705，2000；crameri等人，nat.med.2:100-102，1996；fisch等人，proc.natl.acad.sci.usa93:7761-7766，1996；glaser等人，j.immunol.149:3903-3913，1992；eving等人，immunotechnology，2:127-143，1996；kanppik等人，j.mol.biol.，296:57-86，2000；low等人，j.mol.biol.260:359-368，1996；riechmann和winter，proc.natl.acad.sci.usa，97:10068-10073，2000；以及yang等人，j.mol.biol.254:392-403，1995。

在一些實(shí)施方案中，候選配體庫包含源自單個候選多肽或起始框架多肽(例如，細(xì)胞受體的已知多肽配體)的變體或突變體。例如，編碼候選多肽的多核苷酸分子可在一個或多個選擇的密碼子處改變。改變被定義為編碼候選多肽的基因中的一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，其導(dǎo)致多肽的氨基酸序列的改變。優(yōu)選地，改變將是通過在分子的一個或多個區(qū)域中利用任何其它氨基酸取代至少一個氨基酸。改變可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生。這些方法包括但不限于寡核苷酸介導(dǎo)的誘變(例如，zoller等人，methodsenzymol.154:329-50，1987)、盒式誘變(例如，well等人，gene34:315，1985)、易錯pcr(參見，例如，saiki等人，proc.natl.acad.sci.usa.86:6230-4，1989；以及keohavong和thilly，proc.natl.acad.sci.usa，86:9253-7，1989)，以及dna改組(stemmer，nature370:389-91，1994；以及stemmer，proc.natl.acad.sci.91:10747-51，1994)。

在一些實(shí)施方案中，候選配體可以進(jìn)一步與融合配偶體(例如另一種肽或其它部分)共軛，所述融合配偶體可用于改善純化、增強(qiáng)肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)、幫助檢測、穩(wěn)定肽等。本發(fā)明的候選肽配體的合適的融合配偶體的示例包括聚乙二醇、聚乙二醇化(pegylation)、或其它化學(xué)物質(zhì)。在許多合適的肽或多肽融合配偶體中的是例如β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標(biāo)簽等。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的候選肽或多肽可具有可檢測的標(biāo)記。

在一些實(shí)施方案中，候選配體可包含二十個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物，例如4-羥基脯氨酸、5-羥賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸或羧基谷氨酸，并且可包括不由多肽鍵連接的氨基酸。類似地，它們也可以是環(huán)狀多肽和其它構(gòu)象約束結(jié)構(gòu)。用于修飾多肽以產(chǎn)生類似物和衍生物的方法是本領(lǐng)域所熟知的，例如，roberts和vellaccio，thepeptides:analysis,synthesis,biology，gross和meinhofer編輯，第5卷，第341頁，academicpress,inc.，newyork，n.y.(1983)；以及burger的medicinalchemistryanddrugdiscovery，manfrede.wolff編輯，ch.1，第619-620頁，johnwiley&sonsinc.，newyork，n.y.(1995)。

v.經(jīng)由基于鄰近度的測定法選擇配體

本發(fā)明提供用于從可表達(dá)并定位于宿主細(xì)胞群的質(zhì)膜的候選配體的大細(xì)胞內(nèi)組合庫中鑒定靶分子(例如靶受體)的一種或多種配體的方法。在這些方法中，來自庫和靶分子(例如表面受體)的不同候選配體共定位于宿主細(xì)胞的質(zhì)膜。靶分子(例如受體)和候選配體各自與酶和酶的同源肽底物或識別序列中的一個組分融合。當(dāng)共定位的配體與相鄰的靶分子(例如受體)結(jié)合時，由于酶促反應(yīng)釋放與底物序列融合的效應(yīng)細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)錄因子)。然后，在激活人工細(xì)胞反應(yīng)或信號傳導(dǎo)通路(例如熒光反應(yīng)、發(fā)光反應(yīng)或其它信號)時，效應(yīng)分子可導(dǎo)致可檢測的響應(yīng)。

用于本發(fā)明實(shí)施方法的宿主細(xì)胞可以為任何熟知的適于攜帶和表達(dá)本文所述的靶分子、候選配體和報告構(gòu)建體的真核細(xì)胞或細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，哺乳動物宿主細(xì)胞用于表達(dá)用于基于鄰近度的配體選擇的融合分子。例如，它們可以為攜帶外源表達(dá)載體的雜交瘤細(xì)胞系或哺乳動物細(xì)胞系(例如，hek293細(xì)胞)，如下文所例示的。這些包括任何正常的人類或異常永生動物或人類細(xì)胞。除了本文所示例的細(xì)胞系之外，本領(lǐng)域還已知能夠表達(dá)本發(fā)明的靶分子和候選配體構(gòu)建體的多個其它合適的宿主細(xì)胞系。這些包括例如cho細(xì)胞系、各種cos細(xì)胞系、hela細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的b細(xì)胞和其它雜交瘤細(xì)胞系。使用哺乳動物組織細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)多肽通常論述于，例如，winnacker，fromgenestoclones，vchpublishers，n.y.，n.y.，1987中。哺乳動物宿主細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)調(diào)控序列，諸如復(fù)制的起源、啟動子和增強(qiáng)子、以及必需的加工信息位點(diǎn)，諸如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。這些表達(dá)載體通常包含源自哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可以是組成型的、細(xì)胞類型特異的、階段特異性的、和/或可調(diào)節(jié)的或可調(diào)控的?？捎玫膯幼影ǖ幌抻诒疚乃纠膃f1a和人ubc啟動子、金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導(dǎo)型mmtv啟動子、sv40啟動子、mrppoliii啟動子、組成型mpsv啟動子、四環(huán)素誘導(dǎo)型cmv啟動子(諸如人即刻早期cmv啟動子)、組成型cmv啟動子、和本領(lǐng)域已知的啟動子-增強(qiáng)子組合。

用于監(jiān)測結(jié)合活性的候選配體構(gòu)建體和靶分子(例如，受體)構(gòu)建體的表達(dá)可用分子生物學(xué)的常規(guī)操作技術(shù)和本文所示例的方法進(jìn)行。從候選配體庫選擇靶受體的配體也可利用本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序或本文所述的具體實(shí)施來進(jìn)行。不考慮所用的配體，可首先將編碼多肽或抗體配體的組合庫的表達(dá)載體庫(例如，慢病毒載體)引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(例如，hek293)中以提供編碼配體的病毒的庫。在將病毒連同表達(dá)特異性膜結(jié)合靶分子(受體諸如tpor或glp-1r)的病毒一起共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，配體融合體的庫將被表達(dá)并與受體共定位到膜中。在一些實(shí)施方案中時，可首先將靶分子表達(dá)載體和報告基因構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞中。然后可將配體表達(dá)庫引入穩(wěn)定表達(dá)靶分子(例如，表面受體)的宿主細(xì)胞中。

取決于該方法中所用的特異性效應(yīng)分子和報告基因，各種基于鄰近度的反應(yīng)測定法可用于檢測配體與靶分子的結(jié)合。使用gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子和gal4uas轉(zhuǎn)錄響應(yīng)元件作為示例，攜帶uas報告基因和靶受體-切割位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄因子融合體兩者的宿主細(xì)胞可首先被攜帶候選配體-tm-tev蛋白酶融合體的庫的慢病毒來感染。然后在測量報告基因活性之前培養(yǎng)細(xì)胞。

本發(fā)明可采用用于檢測和定量報告基因表達(dá)的各種方法，所述方法通?；跍y量由報告基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。各種適當(dāng)?shù)目蓹z測標(biāo)記物是本領(lǐng)域已知的，包括能夠產(chǎn)生可檢測信號的熒光、放射性、酶或其它配體，諸如抗生物素蛋白/生物素。在一些實(shí)施方案中，可使用熒光標(biāo)記或酶標(biāo)簽，諸如脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶，而不是放射性或其它在環(huán)境上不可取的試劑。在酶標(biāo)簽的情況下，比色指示劑底物是已知的，所述比色指示劑底物可用于提供人眼可見或采用分光光度計(jì)的方式。如本文所例示的，報告基因可以是其表達(dá)可通過螢光素酶測定法容易檢測到的熒光素酶基因，或者其表達(dá)可通過熒光顯微鏡觀察到的tdtomato基因。適用于本發(fā)明的報告基因的其它示例包括β-內(nèi)酰胺酶、以及編碼gfp的基因或其它熒光蛋白，其可通過熒光顯微鏡觀察或使用熒光激活細(xì)胞分選進(jìn)行檢測。

當(dāng)報告基因編碼酶時，可使用代謝以產(chǎn)生可測量產(chǎn)物的酶的底物。例如，通過該酶切割以產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物的β-半乳糖苷酶底物x-gal經(jīng)常用于測定β-半乳糖苷酶報告基因表達(dá)(millerj.編輯，(1992)ashortcourseinbacterialgenetics:alaboratorymanualandhandbookforescherichiacoliandrelatedbacteria，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，newyork)。另選地，β-半乳糖苷酶底物鄰硝基丙基-b-d-吡喃半乳糖苷(onpg)由β-半乳糖苷酶代謝產(chǎn)生具有黃色的化合物。酶的數(shù)量通過分光光度法或用elisa讀數(shù)器測量著色化合物的光密度來測定。在420nm下讀取吸光度(millerj.h.編輯(1972)experimentsinmoleculargenetics，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，newyork)。其它常用的報告基因?yàn)榭股乜剐砸蜃勇让顾匾阴＾D(zhuǎn)移酶(cat)、螢火蟲螢光素酶基因(如下文實(shí)施例中所示)、和水母綠色熒光蛋白(valdivia和falkow(197)trendsmicrobiol.5(9):360-363；naylor(1999)biochem.pharmacol.58(5)-49-757；himes和shannon(2000)methodsmol.biol.130:165-174)。此外，基于其檢測和定量的能力，還可將各種另選的蛋白質(zhì)用作報告基因。用于測量此類基因的表達(dá)水平的測定已被充分開發(fā)并且通常由普通技術(shù)人員實(shí)施(rosenthal(1987)methodsenzymology152:704-720；davey等人(1995)methodsmol.biol.49:143-148；和bronstein等人(1994)anal.biochem.219(2):169-181)。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例以進(jìn)一步例示本發(fā)明，但不限制其范圍。本發(fā)明的其它變型將對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的并被所附權(quán)利要求包括。

實(shí)施例1.材料和方法

細(xì)胞系。hek293(atcc登記號crl-1573)或者h(yuǎn)ek293t(atcc登記號crl-3216)細(xì)胞保持在包含10(體積/體積)％fbs、青霉素和鏈霉素的dmem中，并且使用lipofectamine2000(lifetechnologies)轉(zhuǎn)染。哺乳動物細(xì)胞抗生素遺傳霉素和潮霉素來自invivogen。熒光素酶測定試劑獲自promega(el500)。

質(zhì)粒構(gòu)建。慢病毒載體編碼配體-tm-tev蛋白酶。配體融合到pdgfr跨膜結(jié)構(gòu)域的n端(氨基酸514-561)，然而tev蛋白酶融合到跨膜結(jié)構(gòu)域的c端。在配體和跨膜結(jié)構(gòu)域之間加入不同數(shù)量的ggggs(seqidno:1)接頭序列。在ubc(泛素c)啟動子的控制下，將配體-跨膜-tev引入慢病毒載體中。

受體-tev切割位點(diǎn)-gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子載體。將gal4dna-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到單純皰疹病毒vp16c端活化結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生與哺乳動物細(xì)胞正交的人工轉(zhuǎn)錄因子。tpor或glp1r的編碼區(qū)域之后是tev蛋白酶切割位點(diǎn)和gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子并且克隆到pcdna5中，其表達(dá)處于cmv啟動子的控制下。該載體具有慶大霉素選擇盒，用于產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。

上游活化體序列報告基因載體(uas)。uas-報告基因載體包含gal4uas的9個重復(fù)序列和腺病毒晚期啟動子。該序列響應(yīng)于gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而驅(qū)動熒光素酶luc2p或tdtomato報告基因的轉(zhuǎn)錄。載體具有潮霉素選擇盒，用于產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。

產(chǎn)生穩(wěn)定的報告基因細(xì)胞系。使用lipofectamine通過首先利用uas-報告基因載體轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。在200ug/ml潮霉素中選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。兩周之后，收集所選擇的細(xì)胞，并用特異性受體-tev切割位點(diǎn)-gal4-vp16轉(zhuǎn)錄因子載體轉(zhuǎn)染。在800ug/ml慶大霉素和10ug/ml潮霉素中選擇細(xì)胞并持續(xù)兩周。

慢病毒包裝。通過以1:1:1的比例利用pcmvd8.9和pvsvg病毒包裝載體共轉(zhuǎn)染慢病毒載體在hek293t細(xì)胞中產(chǎn)生病毒。在轉(zhuǎn)染后48小時收集包含病毒的上清液，并通過0.22um膜過濾單元(millipore)過濾。使用lenti-xp24elisa(clontech)測定慢病毒制劑的滴度。

基于鄰近度的反應(yīng)測定。將攜帶uas報告基因和受體-切割位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定細(xì)胞系以每孔20000個細(xì)胞接種在96孔板中。細(xì)胞用攜帶配體-mt-tev蛋白酶的慢病毒以等于1的moi感染。細(xì)胞培養(yǎng)24-72小時，然后測量報告基因活性。熒光素酶活性通過使用熒光素酶測定系統(tǒng)(promega)測定，同時tdtomato的表達(dá)通過熒光顯微鏡觀察。

實(shí)施例2.系統(tǒng)構(gòu)建

構(gòu)建酶-底物系統(tǒng)，其中蛋白水解反應(yīng)是低效的，使得在基礎(chǔ)濃度下，其僅緩慢進(jìn)行。使用tev蛋白酶和高特異性切割位點(diǎn)。蛋白酶附著到配體構(gòu)建體的pdgfr跨膜(tm)結(jié)構(gòu)域的c端(圖1)。切割位點(diǎn)位于受體的細(xì)胞質(zhì)部分和人工肽轉(zhuǎn)錄因子之間。切割之后，釋放轉(zhuǎn)錄因子并激活報告基因的表達(dá)(圖1)。重要的是，因?yàn)闈撛诘呐潴w及其受體兩者均錨定在質(zhì)膜中，所以它們之間的任何相互作用均可導(dǎo)致其所附著的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)物的接近，并有利于信號的產(chǎn)生。

在該系統(tǒng)中，有效摩爾數(shù)參數(shù)在兩種水平上操作。首先，因?yàn)榉磻?yīng)物被限制并且共定位在質(zhì)膜中，所以存在有利于相互作用的強(qiáng)力的隔離效應(yīng)。其次，當(dāng)這些隔離的分子相互作用時，其將酶和底物組分聚集在一起，從而極大增加了系統(tǒng)的信號組分的有效摩爾數(shù)。重要的是需要注意，該系統(tǒng)僅需要膜中的分子相互作用，并且在很大程度上獨(dú)立于任何專門的效應(yīng)，諸如由相互作用導(dǎo)致的構(gòu)象變化。

實(shí)施例3.概念驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該方法，研究了單通道和多通道膜蛋白兩者。就單通道受體而言，研究了天然血小板生成素(tpo)配體以及先前由血小板生成素受體(tpor)產(chǎn)生的scfv抗體(zhang等人，chemistry&biology20：734-741，2013)。就多通道膜受體而言，研究了由glp-1gpcr受體來識別肽。

激素tpo或tpor結(jié)合抗體，3d9或14f12，通過被融合到pdgfr跨膜結(jié)構(gòu)域的n端而在細(xì)胞表面上顯示。類似構(gòu)建的無關(guān)抗體用作陰性對照。膜系3d9-scfv蛋白可激活tporsie-bla報告細(xì)胞系，因此被用作陽性對照。相對于無關(guān)的抗體對照，在質(zhì)膜處顯示的抗體或真實(shí)的tpo增加了轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的信號(圖2)。還進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)以控制肽或抗體與系統(tǒng)的受體組分的非特異性相互作用。為此，研究了攜帶glp1r-轉(zhuǎn)錄因子融合體和無關(guān)活化體的細(xì)胞系，諸如僅在表達(dá)tpor的細(xì)胞中有活性的tpo激活抗體或tpo。結(jié)果示出抗體或tpo的顯示不增加攜帶錯誤受體的細(xì)胞中的信號。還測試了配體和tm結(jié)構(gòu)域之間的接頭長度對基于鄰近度的反應(yīng)的影響。血小板生成素具有332a，并且scfv具有約250aa。通過ggggs(seqidno:1)的3至9個串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)合到質(zhì)膜的tpo產(chǎn)生相似的信號，然而在scfv的情況下，較長的距離導(dǎo)致較高的活性(圖2)。因此，較長的柔性接頭可具有更通用的實(shí)用性。

接著研究了該方法是否可以用于多通道膜蛋白。在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)膜系毒蜥外泌肽-4可激活胰高血糖素樣肽-1受體(glp1r)。因此，使用glp-1r和毒蜥外泌肽-4作為本研究的受體配體對。glp1r屬于七個跨膜g蛋白偶聯(lián)受體的β1家族。結(jié)合肽配體的b類受體的結(jié)合模型設(shè)想了兩步機(jī)制，其中肽配體的c端部分最初與受體的n端胞外域相互作用。在第二步中，配體的n端與跨膜螺旋體和受體的連接環(huán)相互作用，這導(dǎo)致激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

將全長glp1r融合到轉(zhuǎn)錄因子。將膜系毒蜥外泌肽-4在其c端細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域處與tev蛋白酶融合。共表達(dá)受體和毒蜥外泌肽-4的相互作用導(dǎo)致從第1天開始明顯增加的信號活性，這持續(xù)到感染后第3天(圖3a)。還測試了轉(zhuǎn)錄因子所附接的glp1r的c端尾部的長度是否對信噪比(sn)具有影響。全長受體具有59aa細(xì)胞內(nèi)尾部。先前研究展示，c-端可被截短至c端leu422殘基，但不影響glp-1效力或受體的表達(dá)。截短的受體的細(xì)胞內(nèi)尾部具有22個氨基酸。將glp1r的氨基酸1-4226與附著于截短受體的可釋放轉(zhuǎn)錄因子融合。具有較短受體細(xì)胞內(nèi)尾部的構(gòu)造產(chǎn)生較高的s/n比。作為進(jìn)一步的對照，研究了相似長度的非特異性肽配體。作為nachr(煙堿乙酰膽堿受體)/gaba(代謝型gaba受體)的阻斷劑的非特異性肽，諸如vc1.1導(dǎo)致甚至更低的s/n(圖3b)。最后，當(dāng)無關(guān)g蛋白偶聯(lián)受體，cxcr4代替glp1r時，沒有觀察到響應(yīng)(圖3b)。

實(shí)施例4.不同tev切割位點(diǎn)的影響

為了在保持信號強(qiáng)度的同時降低噪聲，測試可以不同效率由tev切割的四種tev底物序列。tev蛋白酶識別通式為exxyxqg(seqidno:2)或exxyxqs(seqidno:3)的線性表位，其中q和g或q和s之間發(fā)生切割。最有效的底物是enlyfqs(seqidno:4)(tevl)，這在上述所有實(shí)驗(yàn)中使用。

假設(shè)低效切割的底物序列可在保持信號的強(qiáng)度的同時產(chǎn)生更少的噪聲。系統(tǒng)性研究展示，許多不同的氨基酸可以不同的切割效率(kcat/km)容納于不同位置中。比較了四個不同序列enlyfqs(seqidno:4)(tevl)、enfyfqs(seqidno:5)(tev2)、enlyyqs(seqidno:6)(tev3)和enlffqs(seqidno:7)(tev4)的s/n比。其相應(yīng)的kcat/km為4.51±0.65、0.024±0.001、0.056±0.005、0.35±0.041mm^-1.s^-1。

監(jiān)測了使用這些序列對基于鄰近度的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的反應(yīng)動力學(xué)的影響。相對較差的tev2底物即使在感染后3天也產(chǎn)生最高的s/n比，然而較好的tev1和tev4底物從第2天開始產(chǎn)生非常高的噪音水平(圖3b)。因此，tev2是目前用于控制鄰近度增強(qiáng)反應(yīng)的最佳切割位點(diǎn)

實(shí)施例5.熒光蛋白可用作報告基因

就通常用于選擇功能性抗體或肽的基于鄰近度的反應(yīng)而言，當(dāng)與選擇方法如熒光激活細(xì)胞分選結(jié)合時，報告基因如gfp或β-內(nèi)酰胺酶可能是理想的。此外，熒光蛋白可用于活細(xì)胞中的動態(tài)細(xì)胞測定，使得能夠評估單個樣品中隨時間推移的信號活性。如圖4所示，將tdtomato用作報告基因，并在顯微鏡下觀察其表達(dá)。與使用熒光素酶報告基因的結(jié)果一致，膜系毒蜥外泌肽-4誘導(dǎo)高百分比的細(xì)胞表達(dá)tdtomato，然而無關(guān)蛋白質(zhì)(抗體)不能產(chǎn)生明顯量的熒光。值得注意的是，弱化的tev2和tev3切割位點(diǎn)表現(xiàn)出低得多的背景。

雖然出于清楚理解的目的，已經(jīng)通過例示和實(shí)施例的方式對前述發(fā)明進(jìn)行了一些詳細(xì)的描述，但是根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是可對其進(jìn)行某些改變和修改，但在不脫離所附權(quán)利要求的精神或范圍。

本說明書中引用的所有出版物、數(shù)據(jù)庫、基因庫序列、專利和專利申請以引用方式并入本文，如同每個被具體地并單獨(dú)地指示為通過引用并入一樣。