專利名稱：免疫測(cè)定試劑、生物傳感器和檢測(cè)分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及免疫測(cè)定試劑、生物傳感器、和測(cè)定(assay)分析物的方法，其可使用魚精蛋白以高度靈敏的方式測(cè)定樣品中存在的分析物。
背景技術(shù)：
生物化學(xué)結(jié)合測(cè)定廣泛用于確定生物樣品中包含的分析物的存在和濃度。這樣的測(cè)定基于結(jié)合配偶體(binding partners)的原理。所關(guān)心的分析物與分析物結(jié)合劑(例如對(duì)所述分析物的抗體或?qū)λ龇治鑫锏氖荏w)結(jié)合，且所述分析物和所述分析物結(jié)合劑因此稱作“結(jié)合配偶體”。當(dāng)所述結(jié)合配偶體之一結(jié)合至固相時(shí)，所述測(cè)定稱作“非均相測(cè)定”。這樣的非均相測(cè)定包括例如夾層法、間接法和競(jìng)爭(zhēng)法，所有術(shù)語(yǔ)都是本領(lǐng)域容易理解的。測(cè)定的靈敏度典型地是指當(dāng)與在缺乏分析物的情況下得到的信號(hào)讀取相比時(shí)在通過(guò)測(cè)定產(chǎn)生的信號(hào)中產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化的分析物的最小質(zhì)量。增加的靈敏度是期望的，因?yàn)槠淙菰S檢測(cè)更小量的分析物以及分析物的總體更高精度的測(cè)量。非特異性結(jié)合是指在具有固相的非均相測(cè)定體系中結(jié)合配偶體的非特異性相互作用。非特異性結(jié)合經(jīng)常降低非均相測(cè)定的靈敏度，且因此期望減少這樣的非特異性結(jié)合。仍需要容許以高度靈敏的方式檢測(cè)分析物的免疫測(cè)定試劑、生物傳感器和測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本文中所公開的提供用于分析物的高度靈敏的檢測(cè)的免疫測(cè)定試劑，其中所述免疫測(cè)定試劑包括(a)包括所述分析物和纖維蛋白原(血纖蛋白原，fibrinogen)的樣品、及
(b)魚精蛋白。所公開的還提供生物傳感器，其包括:(a)基底，對(duì)分析物特異性的捕獲抗體固定至所述基底；(b)免疫測(cè)定試劑，其包括⑴包括所述分析物和纖維蛋白原的樣品、及( )魚精蛋白；和(C)對(duì)所述分析物特異性的檢測(cè)抗體。所公開的進(jìn)一步提供測(cè)定分析物的高度靈敏的方法，包括:制備包括(i)包括所述分析物和纖維蛋白原的樣品、及(ii)魚精蛋白的免疫測(cè)定試劑；向所述免疫測(cè)定試劑添加檢測(cè)抗體以提供檢測(cè)抗體-分析物復(fù)合物(complex);將所述檢測(cè)抗體-分析物復(fù)合物與固定在基底上的捕獲抗體接觸以提供檢測(cè)抗體-分析物-捕獲抗體復(fù)合物；和檢測(cè)所述分析物。所公開的進(jìn)一步提供用于檢測(cè)分析物的方法，包括:制備包括(i)包括所述分析物和纖維蛋白原的樣品、 及(ii)魚精蛋白的免疫測(cè)定試劑；將所述免疫測(cè)定試劑與固定在基底上的捕獲抗體接觸以提供捕獲抗體-分析物復(fù)合物；將所述捕獲抗體-分析物復(fù)合物與檢測(cè)抗體接觸以提供捕獲抗體-分析物-檢測(cè)抗體復(fù)合物；和檢測(cè)所述分析物。


以下參照附圖進(jìn)一步詳細(xì)地描述示例性實(shí)施方式。可理解，為了清楚可已放大所述附圖的各方面:圖1是金染色(gold staining)測(cè)定的示意圖；和圖2是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的示意圖。
具體實(shí)施例方式本文提供的是包括(a)包括所關(guān)心的分析物和纖維蛋白原的樣品、及(b)魚精蛋白的免疫測(cè)定試劑、以及使用所述試劑檢測(cè)分析物的方法。不希望受任何特定理論或作用機(jī)理束縛，據(jù)信在樣品例如血液樣品中纖維蛋白原的存在降低基于結(jié)合配偶體的分析物檢測(cè)方法的靈敏度和/或特異性(specificity)。進(jìn)一步據(jù)信對(duì)于這樣的測(cè)定的非特異性結(jié)合、或其它干擾模式可通過(guò)如下減少:在檢測(cè)前將所述樣品與魚精蛋白組合以提供免疫測(cè)定試劑。更具體地，據(jù)信改善的性能是由于魚精蛋白與所述樣品中存在的纖維蛋白原的靜電相互作用，由此顯著改善所述分析物的測(cè)定的靈敏度和再現(xiàn)性。根據(jù)所公開的一個(gè)方面，所述分析物為肌鈣蛋白I，且所公開的提供測(cè)定肌鈣蛋白I的高度靈敏的方法。在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“肌鈣蛋白I(Tnl)”是指與肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C 一起通常存在于肌肉組織中的蛋白質(zhì)。肌鈣蛋白I調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的鈣依賴性相互作用。肌鈣蛋白I的的三種同種型已被鑒別:慢縮(Slow-twitch)骨骼肌亞型肌鈣蛋白1、快縮(fast-twitch)骨骼肌亞型 肌鈣蛋白I和心肌肌鈣蛋白I。當(dāng)與其它肌鈣蛋白比較時(shí)，心肌肌鈣蛋白I在N-末端具有31個(gè)額外的氨基酸殘基且為心肌中存在的唯一肌鈣蛋白亞型。臨床研究已證明，心肌肌鈣蛋白I (cTnl)是在急性心肌梗塞(AMI)后4_6小時(shí)在血流中可檢測(cè)的且之后保持升高數(shù)天(參見Mair等，Clin.Chem., 41 (9):1266-1272(1995);和 Larue 等，Clin.Chem.，39 (6):972_979 (1993))。因此，cTnl 升高覆蓋肌酸激酶-MB (CK-MB)和乳酸脫氫酶兩者的診斷窗口(diagnostic window)(參見Bodor,J.Clin.1mmunoassay, 17(1):40-44 (1994))。進(jìn)一步的研究已表明，cTnl 具有比 CK-MB 高的對(duì)心肌損傷的臨床特異性(參見Adams等,Circulation, 88 (I): 101-106 (1993);和Apple等，Clin.Chim.Acta237:59-66 (1995))。由于其心臟特異性和靈敏度，cTnl已用作在診斷具有不穩(wěn)定心絞痛和非-ST段抬高急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的病人中的可靠標(biāo)志(marker)。具有ACS的病人的先前臨床研究已顯示，cTnl值的較小增加提供關(guān)于死亡的短期和長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)后(prognostic)信息(參見 Lindahl 等，J.Am.Coll.Cardiol., 38: 1497-1498, (2001) ；Venge 等，Am.J.Cardiol.,89: 1035-1041(2002) ；Galvani 等，Circulation,95 =2053-2059(1997)；Antman 等，1^^叫.]\]\^(1.,335:1342-1349(1996) ；0ttani 等，Am.Heart J., 40:917-927(2000);和 Heidenreich 等，J.Am.Coll.Cardiol.,38:478-485 (2001)) 最終，預(yù)后評(píng)估在鑒別最可能受益于特定治療干預(yù)的病人中可為有用的。
但是，樣品中包含的一些因素例如蛋白質(zhì)、葡萄糖和離子可在TnI的免疫測(cè)定期間阻礙抗原-抗體結(jié)合。特別地，纖維蛋白原(其為以約1.5-4.0g/L的量存在于人血漿中的蛋白質(zhì))大大地阻礙抗原-抗體反應(yīng)，特別是Tn1-抗體反應(yīng)。因此，所公開的提供通過(guò)經(jīng)由將樣品與魚精蛋白組合來(lái)除去樣品中包含的纖維蛋白原而減少非特異性結(jié)合、且由此改善使用所述樣品的TnI測(cè)定的靈敏度和再現(xiàn)性的方法。根據(jù)示例性實(shí)施方式，所公開的提供用于TnI的高度靈敏測(cè)定的免疫測(cè)定試劑。所述免疫測(cè)定試劑包括(a)包含TnI和纖維蛋白原的樣品、及(b)魚精蛋白。如所提及的，據(jù)信由于魚精蛋白和樣品中存在的纖維蛋白原的靜電相互作用而產(chǎn)生魚精蛋白-纖維蛋白原復(fù)合物。因此，免疫測(cè)定中的纖維蛋白原和魚精蛋白可全部或部分地作為復(fù)合物存在于所述免疫測(cè)定試劑中。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“樣品”是指寬范圍的生物學(xué)物質(zhì)以及由所述生物學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)或提取的組合物。包含分析物的樣品可為任何合適的樣品，包括但不限于血液樣品如血清樣品或血漿樣品。血漿是其中懸浮血細(xì)胞的血液的液體組分。例如，血漿可包含水，血漿蛋白質(zhì)，月旨質(zhì)，糖類，無(wú)機(jī)鹽，和非蛋白質(zhì)的氮化合物如尿素、氨基酸和尿酸。血漿可通過(guò)任何合適的方式(例如使用離心)與血液樣品中的其它組分(例如血細(xì)胞)分離。血漿樣品從包含抗凝血?jiǎng)┤绺嗡剽c、檸檬酸鈉、氟化鈉和草酸鉀或乙二胺四乙酸(EDTA)鉀的血液管(采血管，blood tube)得到。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，使用血衆(zhòng)樣品。 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“分析物”是指待測(cè)量的物質(zhì)或化學(xué)成分。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，分析物為肌鈣蛋白如肌鈣蛋白I。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，分析物為心肌肌鈣蛋白1。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“纖維蛋白原”是指存在于脊椎動(dòng)物血漿和淋巴中且在血液凝固中起關(guān)鍵作用的因子。纖維蛋白原為具有約340，000道爾頓(340KDa)分子量的糖蛋白。在血漿中，纖維蛋白原典型地具有約1.5-4.0g/L的濃度。纖維蛋白原為包含經(jīng)由二硫鍵彼此連接的兩組三個(gè)不同鏈(α (Α)、β (V)、Y)的六聚物。這三個(gè)鏈的N-末端部分包含參與鏈的交聯(lián)的半胱氨酸。C-末端部分包含約225個(gè)氨基酸殘基的域(domain)，其可用作分子識(shí)別單元。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“魚精蛋白”是指具有多個(gè)正離子的蛋白質(zhì)，其具有+20的平均電荷量且由式I表示:式I
權(quán)利要求
1.關(guān)于分析物的高度靈敏的檢測(cè)的免疫測(cè)定試劑，包括(a)包含所述分析物和纖維蛋白原的樣品、及(b)魚精蛋白，其中所述纖維蛋白原和魚精蛋白可為魚精蛋白-纖維蛋白原復(fù)合物的部分。
2.權(quán)利要求1的試劑，其中所述分析物為肌鈣蛋白I。
3.權(quán)利要求1的試劑,其中所述樣品為血漿。
4.權(quán)利要求1的試劑，其中以約2納克/毫升-約4毫克/毫升的量包含所述魚精蛋白。
5.物傳感器，包括: (a)基底，對(duì)分析物特異性的捕獲抗體固定至所述基底； (b)根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫測(cè)定試劑；和 (C)與固定至所述基底的所述捕獲抗體相同的檢測(cè)抗體。
6.權(quán)利要求5的生物傳感器，其為基于質(zhì)量的傳感器、光學(xué)傳感器、電傳感器或磁傳感器。
7.權(quán)利要求5的生物傳感器，其中所述基底為選自硅晶片、玻璃基底、石英基底、金屬基底、和塑料基底的至少一種。
8.測(cè)分析物的高度靈敏的方法，包括: 制備根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫測(cè)定試劑； 向所述免疫測(cè)定試劑添加檢測(cè)抗體以產(chǎn)生檢測(cè)抗體-分析物復(fù)合物； 將所述檢測(cè)抗體-分析物復(fù)合物與捕獲抗體結(jié)合，由此產(chǎn)生檢測(cè)抗體-分析物-捕獲抗體復(fù)合物；和 檢測(cè)所述分析物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中檢測(cè)所述分析物包括使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、電-化學(xué)發(fā)光測(cè)定(ECL)、放射免疫測(cè)定(RIA)、固相RIA(SPRIA)、免疫印跡、免疫沉淀、免疫組織化學(xué)染色、或熒光激活細(xì)胞分類(FACS)。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述捕獲抗體或檢測(cè)抗體用螢光素酶、螢光素、馬來(lái)酸脫氫酶、脲酶、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、雜環(huán)氧化酶、乳過(guò)氧化物酶或微過(guò)氧化物酶標(biāo)記。
11.權(quán)利要求8的方法，其中使用包括魚精蛋白的免疫測(cè)定試劑的測(cè)定的靈敏度比沒有魚精蛋白的相同測(cè)定的大。
12.權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括將對(duì)所述分析物特異性的捕獲抗體固定至基底。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述捕獲抗體和所述檢測(cè)抗體相同。
14.權(quán)利要求8的方法，其中制備免疫測(cè)定試劑包括將包括分析物和纖維蛋白原的樣品與魚精蛋白組合以形成魚精蛋白-纖維蛋白原復(fù)合物。
15.權(quán)利要求8的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在將所述免疫測(cè)定試劑與檢測(cè)抗體接觸之前，從所述免疫測(cè)定試劑除去所述魚精蛋白-纖維蛋白原復(fù)合物。
16.測(cè)分析物的高度靈敏的方法，包括: 制備根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫測(cè)定試劑； 將所述免疫測(cè)定試劑與捕獲抗體接觸以形成捕獲抗體-分析物復(fù)合物； 將所述捕獲抗體-分析物復(fù)合物與檢測(cè)抗體接觸以形成捕獲抗體-分析物-檢測(cè)抗體復(fù)合物；和 檢測(cè)所述分析物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中檢測(cè)所述分析物包括使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、電-化學(xué)發(fā)光測(cè)定(ECL)、放射免疫測(cè)定(RIA)、固相RIA (SPRIA)、免疫印跡、免疫沉淀、免疫組織化學(xué)染色、或熒光激活細(xì)胞分類(FACS)。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述捕獲抗體或檢測(cè)抗體用螢光素酶、螢光素、馬來(lái)酸脫氫酶、脲酶、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶(AP)、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、雜環(huán)氧化酶、乳過(guò)氧化物酶或微過(guò)氧化物酶標(biāo)記。
19.權(quán)利要求16的方法，其中使用包括魚精蛋白的免疫測(cè)定試劑的測(cè)定的靈敏度比沒有魚精蛋白的相同測(cè)定的大。
20.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括將對(duì)所述分析物特異性的捕獲抗體固定至基底。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述捕獲抗體和所述檢測(cè)抗體相同。
22.權(quán)利要求16的方法，其中制備免疫測(cè)定試劑包括將包括分析物和纖維蛋白原的樣品與魚精蛋白組合以形成魚精蛋白-纖維蛋白原復(fù)合物。
23.權(quán)利要求16的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在將所述免疫測(cè)定試劑與捕獲抗體接觸之前，從所述免疫測(cè)定試 劑除去所述魚精蛋白-纖維蛋白原復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明提供使用魚精蛋白測(cè)定在樣品中存在的分析物的高度靈敏的方法、以及免疫測(cè)定試劑和生物傳感器，其通過(guò)魚精蛋白與樣品中存在的纖維蛋白原的靜電相互作用而減少非特異性結(jié)合。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103091496SQ20121027800
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者李埈炯, 李守*, 崔倫碩, 樸珍映, 徐慧凈, 李貞男, 韓京燕 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社