專利名稱：一種表面修飾C8烷基鏈的Fe₃O₄磁性材料及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于無機材料和分析技術(shù)領域，具體涉及一種表面修飾C8垸基鏈的Fe304磁性 材料及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
眾所周知，蛋白質(zhì)組成具有多樣性和可變性，即在同一物種的不同細胞中或同一細胞 在不同時期，其蛋白質(zhì)組成都是在不斷變化的，造成蛋白質(zhì)組成異常復雜。同時由于蛋白 質(zhì)存在翻譯后修飾，所以一個mRNA往往對應多個蛋白質(zhì)，也就是說，蛋白質(zhì)的數(shù)量遠遠 多于基因的數(shù)量，蛋白質(zhì)在大小、相對豐度、酸堿度和疏水性方面差異很大，僅在相對豐 度上，高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)相差六個數(shù)量級甚至更高；而且，由于蛋白質(zhì)無法像 DNA—樣被"擴增"，這些都造成許多含量低的蛋白質(zhì)在大規(guī)模的檢測中很難被檢測到。低 豐度蛋白的分析與鑒定是蛋白質(zhì)組學研究的重點和難點內(nèi)容之一。在生物體中承擔重要生 命活動的蛋白往往都是低豐度蛋白，然而其極低的含量給后續(xù)的分析和檢測帶來困難，限 制了人們對它們的研究和認識。因此要從分子水平上，深入研究生命過程的規(guī)律，探索生 命現(xiàn)象的奧秘，必須對一些具有重要生理功能的低豐度蛋白質(zhì)進行分析監(jiān)測，這對目前的 分析技術(shù)和手段不能不說是一個嚴峻的挑戰(zhàn)。
低豐度蛋白的有效濃縮是實現(xiàn)其準確分析和鑒定的重要條件之一。實際上在蛋白質(zhì)組 學研究過程中許多方面都涉及到樣品的有效富集，以膠內(nèi)酶解樣品的分析為例酶解肽段 提取液的體積太大，在質(zhì)譜分析前必須濃縮。目前最常用的樣品濃縮方法有溶劑蒸發(fā)法和 色譜濃縮法。溶劑蒸發(fā)法費時費力，在干燥過程中容器表面的吸附會造成大量的肽段損失， 同時無機鹽等雜質(zhì)也會被濃縮，影響質(zhì)譜鑒定的靈敏度。色譜濃縮法是利用樣品與吸附劑 之間的色譜相互作用對樣品進行濃縮，吸附劑一般是采用烷基鏈修飾的硅膠。該方法能實 現(xiàn)在對樣品進行有效濃縮的同時，去除樣品中的鹽分和其他雜質(zhì)。尤其是在液相色譜與質(zhì) 譜聯(lián)用時，為了防止樣品中的鹽分等雜質(zhì)進入質(zhì)譜影響信號檢測，都是采用了在分離柱前 連接一根短小的反相預柱，以實現(xiàn)對樣品濃縮和除鹽的效果。被人們廣泛采用的進行樣品 除鹽濃縮的商品化產(chǎn)品Zip-tip和Zip-plate，也都是基于色譜濃縮法的原理。分別是在槍頭管 尖或是九十六孔板孔的底部填充少許反相填料，操作相對繁瑣；且由于填料很少，因此能 富集濃縮的樣品量很有限。近年來，納米材料以其發(fā)展快速和應用潛力而被越來越多地應 用于在蛋白質(zhì)組學分析中。楊艽原教授小組等成功地將沸石納米粒子應用于痕量肽段的富
集，但是該方法需要高速離心分離樣品和沸石混合物，操作相對繁瑣。因此發(fā)展一種簡單 便捷而又有效的分離富集蛋白和肽段的方法成為蛋白質(zhì)組學研究的一個重要方面。
磁性聚合物微球以其易于表面修飾、溶液分散性好以及靈敏的磁場感應性為其應用于 蛋白質(zhì)組學分析中痕量肽段的分離富集方面提供了可能。本研究合成了四氧化三鐵磁性聚 合物微球，進而合成了新型的表面修飾C8烷基鏈的磁性聚合物材料。利用該磁性聚合物 材料作為吸附劑，進行痕量多肽的分離富集以及MALDI-TOF/MS直接分析并初步應用于 實際血樣中多肽的富集。從而簡化了低濃度多肽的分析測定程序，解決了痕量樣品的分析 困難；也為磁性聚合物微球的應用開辟了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、效率高、效果好，能對多肽進行富集的表面修 飾烷基鏈的Fe304氨基磁性微球及其制備方法和應用。
本發(fā)明提供的表面修飾烷基鏈的Fe304磁性材料，是先采用水熱法合成以氨基修飾的 四氧化三鐵磁性納米材料，然后與二甲基辛基硅烷反應對其表面進行化學修飾，生成表面 修飾C8烷基鏈的磁性微球，其結(jié)構(gòu)如下式所示
11 NH -Si /
即通過對磁球表面氨基的類似硅烷化反應連接C8烷基鏈。 上述表面修飾C8烷基鏈的磁性納米粒子的制備方法如下
(1) 用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵的超順磁性納米粒子采用3.0克
FeCl3.6H20為原料，以80-90mL乙二醇為分散體系，添加6-12克無水乙酸鈉，10-20克1，6-己二胺，反應溫度為195-200°C，反應時間為4-6小時，生成表面帶有氨基的磁性納米粒子， 其粒徑是20—100nm;
(2) 首先，將由步驟(1)合成的Fe304氨基磁性微球，反復用去離子水洗滌，以除去 水溶性雜質(zhì)，然后將產(chǎn)物以45-5(TC烘干得到黑色粉末。其次，對Fe304氨基磁性微球進行 表面修飾，取千燥的Fe304氨基磁性微球10mg，分散在l-2mL的無水吡啶中，再加入0.1-0.2g 二甲基辛基硅烷，室溫機械攪拌12-24 h后，用乙醇和水反復洗滌，所得產(chǎn)物分散在lmL 去離子水中，備用。
本發(fā)明合成的表面修飾C8垸基鏈的磁性微球，合成方法簡單有效并具有很好的磁場
感應性，可直接放入含多肽的樣品中，無需特殊處理，肽段結(jié)合到磁性納米材料后，無需 離心分離，采用簡單磁場作用即可實現(xiàn)肽段的富集。
本發(fā)明提供的表面修飾C8烷基鏈的磁性微球為生物體中低豐度蛋白、肽段的富集提 供了新的方法，并擴展了磁性納米材料的實際應用，在生物分析研究等領域有良好的實用 價值和應用前景。


圖1為表面修飾C8基團的磁性納米粒子的合成方法。
圖2為水熱法合成的表面修飾氨基的Fe304磁性納米粒子的透射電鏡圖(a)和掃描電鏡 圖(b)。它具有很好的均一性和分散性。
圖3為氨基磁性鈉米粒子(a)與用C8修飾的氨基磁性鈉米粒子(b)紅外圖對比， 圖中所標峰(2900cm-1)的強度變化表示納米粒子表面碳鏈的增加，可見，經(jīng)過表面修飾 后我們成功制備了表面修飾C8烷基鏈的磁性鈉米粒子。
具體實施例方式
實施例是對本發(fā)明所提供的超順磁性的表面修飾C8烷基鏈的磁性納米材料進行低豐 度肽段的分離富集分析過程的進一步說明。 實施例1表面修飾C8烷基鏈的磁性硅球材料的合成
表面修飾C8烷基鏈的磁性硅球材料的合成共分為三步。
首先，用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵的超順磁性納米粒子；采用3.0克 FeCl3'6H20為原料，以90mL乙二醇為分散體系，添加6-12克無水乙酸鈉，10-20克1,6-己二胺，反應溫度為198X:，反應時間為6小時，生成表面帶有氨基的磁性納米粒子,其粒 徑是20—100 ran;
其次，將合成Fe304氨基磁性微球反復用去離子水洗滌，以除去水溶性雜質(zhì)，最后將 產(chǎn)物以5(TC烘干得到黑色粉末。再對Fe304氨基磁性微球進行表面修飾，取干燥的Fe304 氨基磁性微球10mg，分散在lmL的無水吡啶中，再加入0.1g二甲基辛基硅垸，室溫機械 攪拌12-24h后，用乙醇和水反復洗滌，所得產(chǎn)物分散在lraL去離子水中備用。 實施例2表面修飾C8垸基鏈的磁性納米粒子用于肽段富集
(1)蛋白溶液酶解
取1.0mg蛋白樣品，包括牛血清白蛋白(BSA)、細胞色素C (Cytochrome C)、馬心 肌蛋白(Myoglobin)、牛卩-酪蛋白(卩-casein)分別溶于1.0mL水中，加熱變性后，往溶液 中加入碳酸氫銨溶液調(diào)節(jié)體系PH約為8，以l:50(酶和蛋白之間的質(zhì)量比)加入25嗎胰 蛋白酶。在37°C的溫度下，酶解12小時后終止酶解，酶解液置于-80° C冰箱冷凍待
(2)肽段的分離富集
將20 pL濃度為2 mg mL—1的磁性材料分散液分別加入到1 mL濃度為5 fmol ^L—1標 準肽段或是標準蛋白的胰蛋白酶酶解肽段混合物中，37°C，振蕩90min。在外加磁場作用 下去除上清后，用純水反復清洗三次；然后分散在5pLCHCA (5mg/mL;溶于50% (v/v) 乙腈和0.1% (v/v) TFA中)將1 )iL含有被富集肽段的分散液點到靶板上，待干后進行 MALDI-TOFMS分析。
(3)鹽溶液中肽段的富集
將20 pL濃度為10 mg mL—1的磁性材料分散液分別加入到1 mL濃度為5 fmol (iL—1 Myoglobin蛋白的胰蛋白酶酶解肽段混合物中，37°C，振蕩60 min。在外加磁場作用下去 除上清后，用20pL純水清洗2次；然后分散在5 CHCA (5mg/mL;溶于50% (v/v)乙 腈和0.1% (v/v) TFA中)將1 含有被富集肽段的分散液點到靶板上，待干后進行 MALDI-TOFMS分析。 (4) MALDI-TOF-MS的檢測
取luL富集有肽段的磁性微球分散液點于MALDI靶板上，然后再點上0.5 CHCA。待靶板上的點樣液干燥、結(jié)晶后，將靶板放進質(zhì)譜儀，進行MALDI-TOF質(zhì)譜測 定。MALDI-TOFMS質(zhì)譜實驗在4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems)上完成； 激光器為Nd-YAG激光，波長355 nm，激光脈沖頻率200 Hz;加速電壓20 kV，正離子 模式，反射式TOF條件下檢測。
實施例3表面修飾C8烷基鏈的納米磁性材料用于人血清中肽段的富集
取10 成人血清，加入20 iaLPBS緩沖溶液稀釋后，再加入20|aL濃度為10 mg/mL 的表面修飾C8烷基鏈的磁性材料；用移液槍吹打5次，30s后，磁分離去除上清。將富 集了肽段的材料用PH為7.0的PBS緩沖溶液清洗2次，上清去除；清洗過的材料用5pL CHCA (5mg/mL;溶于50% (v/v)乙腈和0.1% (v/v) TFA中)分散；將1 pL含有被富集肽 段的分散液點到靶板上，干后再點0.5pLCHCA。待干后進行MALDI-TOF MS分析。
權(quán)利要求
1、一種表面修飾C8烷基鏈的Fe3O4磁性微球，其特征在于是先采用水熱法合成氨基修飾的四氧化三鐵磁性納米材料，然后與二甲基辛基硅烷反應對其表面進行化學修飾，生成表面修飾C8烷基鏈的磁性微球，其結(jié)構(gòu)如下式所示id="icf0001" file="S2007100477010C00011.gif" wi="58" he="28" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>
2、 一種如權(quán)利要求1所述的表面修飾C8烷基鏈的磁性微球的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1) 用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵的超順磁性納米粒子釆用3.0克FeCly6H20為原料，以80-90mL乙二醇為分散體系，添加6-12克無水乙酸鈉，10-20克1,6-己二胺，反應溫度為195-200°C，反應時間為4-6小時，生成表面帶有氨基的磁性納米粒子, 其粒徑是20—100 nm;(2) 首先，將由步驟(1)合成的Fe304磁性微球反復用去離子水洗滌，以除去水溶性 雜質(zhì)，然后將產(chǎn)物以45-50'C烘干得到黑色粉末；其次，對Fe304磁性微球進行表面修飾， 取干燥的Fe304氨基磁性微球10mg，分散在l-2mL的無水吡啶中，再加入0.1-0.2g 二甲基 辛基硅烷，室溫機械攪拌12-24 h后，用乙醇和水反復洗滌，所得產(chǎn)物分散在lmL去離子 水中，備用。
3、 一種權(quán)利要求1所述的表面修飾C8烷基鏈的磁性微球在生物體中富集低豐底蛋白 和肽段中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于無機材料和分析技術(shù)領域，具體涉及一種表面修飾C8烷基鏈的Fe₃O₄磁性微球及其制備方法和應用。該磁性納米材料是先合成表面富含氨基的四氧化三鐵的磁性納米材料，采用C1-C8對其進行表面化學修飾而獲得。該固定C1-C8烷基鏈的磁性納米粒子作為微吸附劑，比表面積大，可對生物體中具有的肽段進行富集，方法簡單有效。該材料在蛋白組學等領域有良好的應用前景。
文檔編號C01G49/08GK101172666SQ20071004770
公開日2008年5月7日 申請日期2007年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日
發(fā)明者寧 姚, 張祥民, 鄧春暉, 陳和美 申請人:復旦大學