一種文庫對文庫的酵母雙雜交規(guī)?；Y選互作蛋白質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種文庫對文庫的酵母雙雜交規(guī)?；Y選互作蛋白質(zhì)的方法，以基因組規(guī)模的cDNA作為Bait篩選同樣是基因組規(guī)模的cDNA?Library。在本技術(shù)實施過程中采取對cDNA文庫進(jìn)行均一化處理的方法來降低高豐富度互作蛋白對低豐富度互作蛋白的掩蓋作用，提高了篩選的效率；利用酵母URA3基因的特性自動的去除baitc?DNA中具有自激活作用的序列。本發(fā)明建立了一種可行性高，成本低廉，實驗條件要求低，工作量較小的利用文庫對文庫的酵母雙雜交技術(shù)大規(guī)模篩選互作蛋白質(zhì)的方法，并成功的應(yīng)用于了病原物-寄主植物互作蛋白質(zhì)的篩選。
【專利說明】一種文庫對文庫的酵母雙雜交規(guī)?；Y選互作蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種文庫對文庫的酵母雙雜交規(guī)?；Y選互作蛋白質(zhì)的方法。該方法不同于以往的高通量篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的酵母雙雜交方法，本發(fā)明采用文庫對文庫的篩選方法，在克服前者的缺點的基礎(chǔ)上能夠方便簡捷的用于分子生物學(xué)相關(guān)的領(lǐng)域內(nèi)不同物種和不同物種間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者，其功能的發(fā)揮不是孤立的，是在縱橫交錯的網(wǎng)絡(luò)中通過與其它分子相互作用完成的。而蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的互作就是其中一種重要的形式。目前蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的主要策略有兩種:一種是以蛋白質(zhì)復(fù)合體為出發(fā)點，即大規(guī)模的質(zhì)譜分析。另一種是通過酵母雙雜交系統(tǒng)，后者是目前基因組范圍內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建研究方面應(yīng)用較為廣泛的策略。
[0003]酵母雙雜交技術(shù)是由Fields S.等人于1989年首次建立。該技術(shù)的基本原理是基于對真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子(如GAL4、GCN4)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。轉(zhuǎn)錄因子通常包含兩個模塊式結(jié)構(gòu)域:一個是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, BD),負(fù)責(zé)結(jié)合于DNA序列的特定位點(上游激活序列，up stream activating sequence, UAS)上；一個是激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)協(xié)助RNA聚合酶激活其下游基因的轉(zhuǎn)錄，只有兩者空間上接近共同作用時才能激活報告基因。利用此特性，分別使BD和AD與“誘餌”蛋白(X)和“獵物”蛋白(Y)形成融合蛋白，如 果兩種蛋白X和Y可以發(fā)生相互作用，就能使BD和AD空間上相互接近從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。
[0004]目前，不同的大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)已應(yīng)用于了從病毒到人類等多種生物的蛋白質(zhì)相互作用研究，但從大規(guī)模酵母雙雜交篩選方式來看，卻可以歸納為以下兩種主要的方式:
[0005](I)文庫篩選法:一般用相對較少的已知或未知誘餌去篩選相對較大獵物庫，也可以在誘餌篩選出陽性獵物后，再以獵物為誘餌篩庫，如此循環(huán)，最后構(gòu)建成一個互作的網(wǎng)絡(luò)。誘餌可以一個或數(shù)個至數(shù)千個，可以是0RF、全長cDNA或它們的片段(含結(jié)構(gòu)域)，但一次雜交只能使用一個誘餌篩選，數(shù)千個誘餌必須重復(fù)數(shù)千次雜交；獵物庫一般很大，可以是眾多ORF集合成的庫，也可以是全長cDNA庫或cDNA片段庫。文庫篩選法優(yōu)點是可以得到相互作用的結(jié)構(gòu)域信息和降低假陰性率。
[0006](2)陣列篩選法:所有含不同AD-Y的菌株單個(一對一陣列法)或混合成集合(高通量陣列法)與排成陣列所有含不同BD-X的菌株一一對應(yīng)篩選。采用一對一陣列法的好處是陽性克隆可從陣列位置推出序列信息而不需測序，可以自動化；高通量陣列法雖然需測序鑒定陽性克隆，但是相對于一對一陣列法具有通量性高的優(yōu)點。
[0007]雖然運用以上兩種大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)獲得了部分模式生物如T7噬菌體、幽門螺旋桿菌、酵母、秀麗隱桿線蟲、果蠅、擬南芥的全部或部分的蛋白質(zhì)互作圖譜，但是這兩種方法有一個共同的缺點，那就是工作量大，成本高，實驗硬件條件要求高。比如2011年來自北卡羅來納大學(xué)的Jeffery L.Dangl教授領(lǐng)導(dǎo)由20多個國立和國際實驗室組成的“擬南芥蛋白互作組圖譜聯(lián)盟”歷時4年耗資800萬美元首次獲得模式植物擬南芥的部分蛋白相互作用圖譜。該實驗中研究人員分析獲得了擬南芥上萬個開放閱讀框(ORF)，然后利用一對一陣列篩選的方法對這些ORF進(jìn)行檢測，結(jié)果在40萬次蛋白分析實驗中，共發(fā)現(xiàn)了 6250個蛋白互作樣本，其中有2774種蛋白參與，但是這些蛋白互作樣本在擬南芥完整蛋白作用譜中僅占大約2%，這主要是因為由于分析的上萬個開放閱讀框(ORF)僅覆蓋擬南芥完整蛋白的三分之一。
[0008]綜上所述，現(xiàn)有的高通量的酵母雙雜交技術(shù)并不適合于一般的實驗室進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的篩選，因此亟需探索一種操作簡捷、工作量小、成本較低、硬件條件要求較低的新的高通量的酵母雙雜交方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供了一種文庫對文庫的酵母雙雜交規(guī)模化篩選互作蛋白質(zhì)的方法，該方法成本較為低廉、對實驗條件要求較低，是一種適合規(guī)?；鞍踪|(zhì)相互作用發(fā)掘的方法。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0010](I)均一化(特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因其拷貝數(shù)和表達(dá)量是不一樣的，經(jīng)過均一化這一步驟的處理使所有表達(dá)基因的含量大致相等)“誘餌” CDNA文庫和“獵物” CDNA文庫的構(gòu)建:提取實驗對象組織總RNA，純化獲得mRAA，分別以GBK-SMART III和GBK-⑶S III(“誘餌”cDNA第一鏈)，SMART III和CDS III (“獵物”cDNA第一鏈)為引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，對生成的第一鏈cDNA再分別以BD 5’PCR primer和BD 3’PC R primer (“誘餌”cDNA文庫)，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer (“獵物” cDNA文庫)為引物通過LD-PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增獲得未均一化的雙鏈cDNA文庫，然后按照DSN法(雙鏈特異性核酸酶Duplex-specificnuclease)對上述兩個cDNA文庫進(jìn)行均一化處理并以BD 5’PCR primer和BD 3’PCRprimer, AD 5’ PCR primer和AD 3’ PCR primer對相應(yīng)的文庫進(jìn)行擴(kuò)增，獲得足夠量的均一化的“誘餌” cDNA文庫和“獵物” cDNA文庫。
[0011](2)大規(guī)模轉(zhuǎn)化“誘餌”cDNA文庫、“獵物”cDNA文庫:將上述構(gòu)建好的“誘餌”cDNA文庫按照 Clontech 公司 Yeastmaker?Yeast Transformation System 2 試劑盒操作說明與線性化的質(zhì)粒PGBKT7共轉(zhuǎn)化酵母菌株MaV203，“獵物”cDNA文庫與線性化的質(zhì)粒pGADT7共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，獲得轉(zhuǎn)化入酵母菌株中的“誘餌” cDNA文庫和“獵物” cDNA文庫。
[0012](3)含有cDNA文庫的酵母菌株的收集及“誘餌”cDNA文庫中自激活序列的去除:將構(gòu)建有“獵物” cDNA文庫的Y187菌株涂布SD/-Leu酵母平板培養(yǎng)基，將構(gòu)建有“誘餌” cDNA文庫的酵母MaV203涂布含0.2 % 5-F0A的SD/_Trp酵母平板培養(yǎng)基，30°C放置3~5天，沖洗收集生長的克隆，即獲得構(gòu)建進(jìn)酵母菌株Y187中的“獵物” cDNA文庫和去除自激活序列的酵母菌株MaV203中的“誘餌” cDNA文庫。
[0013](4)構(gòu)建以酵母菌株Y2HGold為載體的“誘餌”cDNA文庫:將上述去除自激活序列的“誘傅” cDNA 文庫離心收集,Clontech 公司 Easy yeast plasmid Isolation kit 提取質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒利用Yeastma ker?Yeast Transformation System 2試劑盒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold。[0014](5)大規(guī)模酵母雙雜交篩選互作蛋白質(zhì):上述構(gòu)建好的Y2HGold菌株中的“誘餌” cDNA文庫和Y187菌株中的“獵物” cDNA文庫混合雜交，通過兩重選擇培養(yǎng)基的篩選獲得報告基因被激活表達(dá)的陽性克隆，對互作雙方的插入片段進(jìn)行測序及分析。
[0015]所述步驟(1)中構(gòu)建“誘餌” cDNA文庫和“獵物” cDNA文庫分別使用了兩對引物，其中 GBK-SMART III和 GBK-CDS III用于“誘餌” cDNA 文庫的第一鏈合成，BD 5’ PCR primer和BD 3’PCR primer用于雙鏈的合成；SMART III和CDS III用于“獵物”cDNA第一鏈的合成，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer用于雙鏈的合成。具體序列如下:GBK_SMART 1115’-CTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCrGrGrG-3’ GBK-CDS II1:5’-CGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCC-d (T) 3(IVN_3，SMART II1: 5 ’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCrGrGrG-3，CDS II1:5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)S0VN-3J BD 5’ PCR primer:5’ -GAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGC-3’ BD 3’ PCR primer:5’ -GGGTTATGCTAGTTATGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGA-3’AD 5’PCR primer:5 ’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’ AD3’ PCR primer:5’ -GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’
[0016]SMART III和 CDS IILAD 5，PCR primer 和 AD 3，PCR primer 序列來源于 Clontech公司試劑盒，GBK-SMART III和 GBK-CDS III，BD 5，PCR primer 和 BD 3，PCR primer 則是本發(fā)明的創(chuàng)新，GBK-SMART III由42個堿基組成，前39個堿基與質(zhì)粒pGBKT7(購買自Clontech公司)同源，最后的三個rG (非脫氧核苷酸G)是基于RNase H_反轉(zhuǎn)錄酶完成mRNA反轉(zhuǎn)錄后在第一鏈cDNA的3’末端繼續(xù)延長三個C堿基的特性，在引物GBK-SMART III 3’端末端設(shè)計添加的，這三個rG與cDNA第一鏈3’末端延長的三個C堿基互補(bǔ)，使RNase H ~反轉(zhuǎn)錄酶在合成中自動進(jìn)行模板轉(zhuǎn)換，并將與PGBKT7同源的重組序列固定在cDNA的3’末端；GBK-⑶S III由56個堿基組成，在3’端帶有30個(d) T，尾端設(shè)計了 VN序列，以提高啟動引導(dǎo)的特異性，并在其5’端設(shè)計了與pGBKT7同源的重組序列，這樣就在cDNA第一鏈的兩端引入了質(zhì)粒PGBKT7同源的重組序列，然后再根據(jù)GBK-SMART III，GBK-CDS III的序列分別設(shè)計引物 BD 5，PCR primer 和 BD 3，PCR primer。
[0017]所述步驟(2)中酵母菌株MaV203的表型如下
[0018]
【權(quán)利要求】
1.一種文庫對文庫酵母雙雜交規(guī)?；Y選互作蛋白質(zhì)的方法，步驟如下: (1)均一化誘餌CDNA文庫和獵物cDNA文庫的構(gòu)建:提取目標(biāo)生物組織總RNA，純化獲得mRNA，分別以 GBK-SMART III和 GBK-CDS III, SMART III和 CDS III為引物進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)，對生成的第一鏈cDNA再分別以BD 5’ PCR primer和BD 3’ PCR primer,AD 5’PCR primer和AD 3’ PCR primer為引物通過LD-PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增獲得未均一化的雙鏈cDNA文庫，然后按照DSN法對上述兩個cDNA文庫進(jìn)行均一化處理并以BD 5’ PCR primer和BD 3’ PCRprimer, AD 5’ PCR primer和AD 3’ PCR primer對相應(yīng)的文庫進(jìn)行擴(kuò)增，獲得足夠量的均一化的誘餌cDNA文庫和獵物cDNA文庫； 所述引物如下:

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種文庫對文庫酵母雙雜交規(guī)?；Y選互作蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述步驟(1)中構(gòu)建均一化誘餌cDNA文庫和獵物cDNA文庫的目標(biāo)生物組織或細(xì)胞既可以來源于同一種生物又可來源于具有互作關(guān)系的不同生物。
【文檔編號】C40B20/00GK103774241SQ201210395295
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月18日
【發(fā)明者】史軍偉, 張婷婷, 董五輩 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)