專利名稱:表面固定金屬離子的氨基磁性納米粒子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬無機(jī)材料合成及生化分析技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種具有超順磁性的表面固定 金屬離子的氨基磁性納米粒子及其制備方法。
背景技術(shù):
蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價(jià)修飾方式之一。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生命周期 中,大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾 乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮及腫 瘤發(fā)生等過程在內(nèi)的所有生命活動(dòng)。對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析與鑒定 中一個(gè)非常重要的內(nèi)容,確定蛋白質(zhì)的磷酸化修飾位點(diǎn)并總結(jié)其相關(guān)的序列特點(diǎn)有助于進(jìn) 一步地了解參與磷酸化的底物及其酶的功能關(guān)系,從而更深入理解磷酸化修飾在生命過程 中的作用。因此發(fā)展磷酸化蛋白的研究方法對(duì)于認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過程具有重要的意義。規(guī)模 化的識(shí)別和鑒定生物體內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)及其變化,在技術(shù)方法上還存在很大問題, 其中磷酸化修飾蛋白質(zhì)的識(shí)別與檢測(cè)是影響磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。近年 來,基于基質(zhì)輔助激光解析的飛行時(shí)間質(zhì)譜成為磷酸化蛋白結(jié)構(gòu)解析的強(qiáng)大輔助工具。由 于在實(shí)際生物樣本中蛋白質(zhì)磷酸化的化學(xué)計(jì)量值較低,且在質(zhì)譜分析中,由于磷酸肽本身 所具的負(fù)電性又使其在質(zhì)譜分析時(shí)信號(hào)受抑制,磷酸化肽段離子化效率低,因此其信號(hào)往 往被非磷酸化肽段所抑制,這對(duì)磷酸化肽段的鑒定提出了挑戰(zhàn)。在質(zhì)譜分析前對(duì)磷酸蛋白 /肽進(jìn)行選擇性分離或富集為磷酸化蛋白的結(jié)構(gòu)解析提供了有效的解決方法。固定金屬離 子螯合色譜(MAC)是該方面目前研究的熱點(diǎn)。固相金屬離子親和色譜最初用于磷蛋白的 親和純化,磷酸基團(tuán)與固相化的金屬離子有高親和力,可被選擇性地吸附在上面,通過固 定在多孔樹脂上的金屬離子和磷酸化肽段或蛋白的磷酸根離子之間的靜電相互作用實(shí)現(xiàn) 選擇性分離富集。
磁性聚合物納米粒子以其本身特有的物理、化學(xué)性質(zhì)以及在細(xì)胞分離、磁輔助給藥和 酶固定等眾多領(lǐng)域中的潛在應(yīng)用前景而得到了廣泛的關(guān)注。磁性聚合物納米粒子融合了磁 性材料的磁響應(yīng)特性和微球聚合物材料的高分散性等優(yōu)點(diǎn),使得其對(duì)痕量肽段的富集成為 可能。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、效率高、效果好,能對(duì)痕量磷酸化肽段進(jìn)行高
選擇性富集及直接進(jìn)行質(zhì)譜分析的表面固定有金屬離子的氨基磁性納米粒子及其制備方 法和應(yīng)用。
本發(fā)明提供的表面固定有金屬離子的氨基磁性納米粒子,是先采用水熱法合成氨基四 氧化三鐵磁性納米材料,然后與己二酰氯反應(yīng),繼而再與亞氨基二乙酸反應(yīng)對(duì)其表面進(jìn)行 化學(xué)修飾,生成表面帶有羧基的磁性納米材料,進(jìn)而固定金屬離子而獲得。其結(jié)構(gòu)如下式 所示-
<formula>formula see original document page 5</formula>式中,1表示氨基四氧化三鐵磁性納米粒子;M表示表面固定的金屬離子;
金屬離子M可以是Fe3+、 Al3+、 Ga3+、 In3+、 Ce3+、 Zr4+、 N產(chǎn)或C等。用于磷酸化
肽段富集的磁球外部固定的金屬離子可以是F^+、 Al3+、 Ga3+、 In3+、 C^+或Zr"等。 上述表面固定有金屬離子的氨基磁性納米粒子的制備方法如下
(1) 用水熱法合成表面帶有氨基的超順磁性納米粒子采用1.0—5.0克FeCl3'6H20 為原料,以20 — 80mL乙二醇為分散體系,添加2-6克無水乙酸鈉,反應(yīng)溫度為190_210 °C,反應(yīng)時(shí)間為6—18小時(shí),生成表面帶有氨基的磁性納米粒子,其粒徑是30 — 100nm;
(2) 在磁性納米粒子表面進(jìn)行化學(xué)修飾固定金屬離子將0.2 — 0.6g氨基四氧化三鐵 磁性納米材料分散于40—80mL無水甲苯和5—20mL吡啶的混合液中,超聲分散;然后 往密閉體系中注入5—20mL己二酰氯,反應(yīng)3 — 6h。在外加磁場(chǎng)作用下,收集產(chǎn)物,并 用無水甲苯清洗。將最終材料分散于30—60mL無水甲苯中;然后往該混合液中加入5 — 20mLIDA,反應(yīng)3 — 6h。最終產(chǎn)物經(jīng)磁分離收集,用無水甲苯清洗。將得到的產(chǎn)物分散 在10-30mL,濃度為0.1-0.3 M的FeCl3溶液中,振蕩分散2-4h;然后用去離子水反復(fù)清 洗材料。
本發(fā)明中,水熱法合成粒子和進(jìn)行化學(xué)修飾后表面羧基化的氨基磁性納米粒子皆具有
很好的超順磁性,其飽和磁化強(qiáng)度分別為40—70emu/g和30—60emu/g。
本發(fā)明合成的具有超順磁性表面固定有金屬離子的氨基磁性納米粒子可直接放入含 有磷酸化肽的復(fù)雜肽段混合物中,進(jìn)行痕量磷酸化肽選擇性富集,無需特殊處理;富集好 后,采用簡(jiǎn)單磁場(chǎng)對(duì)磷酸化肽和其他樣品的進(jìn)行分離,無需離心,所以可以克服傳統(tǒng)離心 造成的非磷酸化肽的共離心沉淀問題;富集后樣品無需洗脫,克服了樣品洗脫過程造成的
樣品損失問題,并且該材料不存在傳統(tǒng)材料的"孔洞效應(yīng)",可直接用于基質(zhì)輔助激光解 析離子化質(zhì)譜分析,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)的鑒定,方法簡(jiǎn)單實(shí)用有效。
本發(fā)明中,上述富集體系的pH值為1-6,樣品濃度為2X10- — 2X10—9 M,超順磁性 微球量是50-1000嗎/1 mL樣品,富集時(shí)間在30秒一90分鐘,富集溫度在20-45°C ,本發(fā) 明可用任何一種合成的表面固定不同金屬離子的磁性納米粒子,其溶液分散性非常好,體 系均勻穩(wěn)定,有利于溶液中的磷酸化肽在材料上的富集。
本發(fā)明的表面固定有金屬離子的氨基磁性納米粒子的合成方法簡(jiǎn)單有效并具有很好 的磁場(chǎng)感應(yīng)性;可對(duì)磷酸化肽進(jìn)行有效選擇性富集;富集過程無需離心分離,采用磁場(chǎng)作 用就可實(shí)現(xiàn)材料和樣品的分離;與基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜有很好的相容性,被固定 金屬離子磁性納米粒子吸附后的樣品無需樣品洗脫步驟可直接進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電 離-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析,避免了洗脫過程造成的樣品損失;方法簡(jiǎn)單有效。本發(fā)明可對(duì)低至 2 fmol/^L級(jí)的復(fù)雜肽段混合物中的磷酸化肽實(shí)現(xiàn)高選擇性富集,富集效率提高一個(gè)數(shù)量級(jí) 以上;釆用富集到的磷酸化肽樣品可進(jìn)而實(shí)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)的鑒定。該材料的合成及應(yīng)用為 磷酸化肽段的富集提供了新的方法,并擴(kuò)展了磁性納米材料的實(shí)際應(yīng)用,在蛋白質(zhì)組學(xué)翻 譯后修飾研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
圖1為水熱法合成的氨基磁性納米粒子的透射電鏡圖(a)和掃描電鏡圖(b)。 圖2為表面羧基化磁性納米粒子材料水熱法合成的透射電鏡圖(a)和掃描電鏡圖(b)。 由圖1和2可見氨基磁性納米粒子和表面羧基化磁性納米粒子皆具有很好的均一性 和分散性。
圖3氨基磁性納米粒子和表面羧基化磁性納米粒子的磁滯回線圖??梢娀瘜W(xué)修飾前后 磁性納米粒子都具有很好的超順磁性。
圖4為氨基磁性納米材料(a)和表面羧基化磁性納米粒子(b)的傅立葉變換紅外譜 圖。將兩者的紅外圖譜比較可見,經(jīng)過表面修飾后我們成功制備了表面羧基化的磁性納米 粒子。
圖5為表面固定有金屬離子的氨基磁性納米粒子的合成路線圖。
圖6為50嗎表面固定F^+離子的氨基磁性納米粒子富集2Xl(r8 MP-casein的胰蛋 白酶酶解混合肽段的前后的MALDI-TOF MS譜圖(a和b)。比較a和b圖可見磷酸化肽 富集效率均超過一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。
圖7為50嗎表面固定F^+離子的氨基磁性納米粒子富集2xl(^M casein蛋白的胰蛋 白酶酶解混合肽段前后的MALDI-TOF MS譜圖(a和b)。比較a和b圖,可見肽段混合 物中的磷酸化肽得到了選擇性富集。
具體實(shí)施例方式
通過實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明所提供的超順磁性的表面固定F^+離子的氨基磁性納米粒子材 料進(jìn)行樣品富集和基質(zhì)輔助激光解吸離子化/質(zhì)譜直接分析過程的進(jìn)一步說明。 實(shí)施例1表面固定金屬離子的氨基磁性納米粒子的合成
氨基四氧化三鐵表面固定金屬離子的磁性微球材料的合成共分為三步。 首先,采用水熱法合成氨基四氧化三鐵磁性納米材料1.0gFeCl—H20溶于30mL乙 二醇中,磁力攪拌0.5 h得到黃色透明溶液。然后加入4.0 g無水NaAc,磁力攪拌0.5 h 后,加入3.6 g 1,6-己二胺,再磁力攪拌0.5h后,得到褐黃色透明溶液。將所得溶液轉(zhuǎn)入 200 mL的Teflon-lined不銹鋼反應(yīng)釜中。放于烘箱,200 °C,放置12小時(shí)。50°(]真空干
其次,在氨基磁性納米粒子表面進(jìn)行化學(xué)修飾在雙頸圓底燒瓶中將0.3 g氨基四氧
化三鐵磁性納米材料分散于60 mL無水甲苯和10 mL吡啶的混合液中超聲分散;然后往 該密閉體系中注入10mL己二酰氯,反應(yīng)4h。磁場(chǎng)分離收集產(chǎn)物。然后,將最終材料分 散于40mL無水甲苯中;然后往該混合液中加入10mLIDA,反應(yīng)4h。磁分離收集產(chǎn)物, 真空干燥備用。
最后,將金屬離子固定在氨基四氧化三鐵磁性納米材料表面將上述得到的產(chǎn)物分散 在20mL濃度為0.2M的氯化鐵(FeCl3)水溶液中,分散液振蕩2 h。 60'C真空干燥過夜
備用o
實(shí)施例2肽段混合物中磷酸化肽的選擇性富集和質(zhì)譜測(cè)定
取200pL濃度為2X10-SM酪蛋白的胰蛋白酶酶解的肽段混合物,加入5 濃度為 10mgml/1的表面固定F^+的氨基四氧化三鐵磁性納米材料分散,用乙酸調(diào)節(jié)體系pH值 為2; 37。C下分別孵育15 min。在磁場(chǎng)作用下,去除上清溶液;采用pH值為2的50%ACN 溶液清洗材料(用乙酸調(diào)節(jié)),去除上清。在沉淀中加入10pL的50% (體積比)的乙腈 水溶液,振蕩使之懸浮。懸浮液0.5pL與等體積30 mg mU1 2,5-DHB (50%乙腈水溶液,v/v) and 1% (v/v) H3P04水溶液,1:1 (v/v)混合點(diǎn)至MALDI耙板上,在MALDI-TOF/TOF (4700
Proteomics Analyzer, Applied Biosystems);激光器為Nd-YAG激光,波長(zhǎng)355nm, 激光脈 沖頻率200Hz;加速電壓20KV;正離子模式,反射式TOF檢測(cè)。由圖6a和6b所示,磷 酸化肽段得到了有效選擇性富集。 實(shí)施例3
調(diào)整采用的混合肽段樣品是200 濃度為2xl(T7 M的Casein蛋白的胰蛋白酶酶解的 肽段混合物,其他條件同實(shí)施例l,進(jìn)行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7a和 7b所示。復(fù)雜肽段混合物中的磷酸化肽段得到了選擇性富集。 實(shí)施例4一5
調(diào)整0 -酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物的濃度為2X 1(T7M和2X 10—9M,其他條件 同實(shí)施例2,重復(fù)上述選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。 實(shí)施例6—8
調(diào)整吸附時(shí)間為30秒,15分鐘,60分鐘,其他條件同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇性富集濃 縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表面固定F^+的氨基四氧化三鐵磁性納米材料在30秒的時(shí)間 時(shí)就能實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽段的有效富集。 實(shí)施例9_10
調(diào)整吸附溫度為20, 45度,其他條件同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。 實(shí)施例11一12
調(diào)整吸附體系pH值為4, 6,其他條件同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。 實(shí)施例13—17
調(diào)整采用的材料表面固定的金屬離子分別是Al3+、 Ga3+、 In3+、 Ce3+、 Zr4+,其他條件 同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。 實(shí)施例4-17所得結(jié)果與實(shí)施例2相似。
權(quán)利要求
1、一種表面固定金屬離子的氨基磁性納米粒子,其特征在于是先采用水熱法合成氨基四氧化三鐵磁性納米材料,然后與己二酰氯反應(yīng),繼而再與亞氨基二乙酸反應(yīng)對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)修飾,生成表面帶有羧基的磁性納米材料,進(jìn)而固定金屬離子而獲得,其結(jié)構(gòu)如下式所示式中,1表示氨基四氧化三鐵磁性納米粒子;M表示表面固定的金屬離子;這里金屬離子M為Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、Ce3+或Zr4+。
2、 一種如權(quán)利要求1所述的表面固定金屬離子的氨基磁性納米粒子的制備方法,其特征在于具體步驟如下(1)用水熱法合成表面帶有氨基的超順磁性納米粒子采用1.0—5.0克FeCl3'6H20 為原料,以20—80mL乙二醇為分散體系,添加2-6克無水乙酸鈉,反應(yīng)溫度為190—210 'C,反應(yīng)時(shí)間為6—18小時(shí),生成表面帶有氨基的四氧化三鐵磁性納米粒子,其粒徑是30(2)在磁性納米粒子表面進(jìn)行化學(xué)修飾固定金屬離子將0.2—0.6g氨基四氧化三鐵 磁性納米材料分散于40—80mL無水甲苯和5—20mL吡啶的混合液中超聲分散;然后往 該密閉體系中注入5—20mL己二酰氯,反應(yīng)3—6h;在外加磁場(chǎng)作用下,收集產(chǎn)物,并 用無水甲苯清洗;將最終材料分散于30—60mL無水甲苯中;然后往該混合液中加入5 — 20mLIDA,反應(yīng)3—6h;最終產(chǎn)物經(jīng)磁分離收集,用無水甲苯清洗。
3、如權(quán)利要求1所述的表面固定金屬離子的氨基磁性納米粒子作為微吸附劑的應(yīng)用, 其特征在于直接將所述磁性納米粒子加入含有磷化肽的復(fù)合肽段混合物中,進(jìn)行痕量磷酸一畫nm; 化肽選擇性富集,富集后采用磁場(chǎng)對(duì)磁酸化肽和其他樣品進(jìn)行分離;富集體系pH值為1 —6,樣品濃度為2X10—7 —2X10力M,富集時(shí)間為30秒—90分鐘;富集溫度為20—45°C , 超順磁性納米粒子量是50-1000 ^g/ m L樣品。
全文摘要
本發(fā)明屬于無機(jī)材料和生化分析技術(shù)領(lǐng)域,具體為一種表面固定金屬離子的氨基磁性納米粒子及其制備方法和應(yīng)用。該磁性納米粒子是先合成表面帶有氨基的磁性納米材料,然后采用己二酰氯繼而采用亞氨基二乙酸對(duì)其進(jìn)行表面化學(xué)修飾,進(jìn)而固定金屬子而獲得。該固定金屬離子的磁性納米粒子作為微吸附劑,比表面積大,可進(jìn)行復(fù)雜肽段混合物中痕量磷酸化肽段的選擇性富集,方法簡(jiǎn)單有效。本發(fā)明可對(duì)低至2fmol/μL級(jí)的復(fù)雜肽段混合物中的磷酸化肽實(shí)現(xiàn)高選擇性富集,富集效率可提高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。該材料在蛋白質(zhì)組學(xué)翻譯后修飾研究等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)B22F1/02GK101104526SQ200710041500
公開日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2007年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日
發(fā)明者寧 姚, 張祥民, 徐秀青, 鄧春暉 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)