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改良的內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ及使用方法

文檔序號:1704903閱讀:353來源:國知局

專利名稱::改良的內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
:在此描述了源自里氏木霉(Trichodermareesei)的改良內(nèi)切葡聚糖酶II(EGII),包括所述EGII的組合物以及使用所述組合物處理紡織品的方法。在此提供了新型酶制劑,其包括在工業(yè)應(yīng)用上表現(xiàn)極為優(yōu)異的展現(xiàn)內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶,該應(yīng)用例如衣物洗滌組合物、新造紡織品的生物拋光、對纖維織物或衣服提供磨損的外表,以及紙漿處理。此外,本發(fā)明涉及編碼此酶的DNA構(gòu)建體,提供編碼此酶的基因的方法,生產(chǎn)該酶的方法、含該酶的酶制劑,以及這些酶在許多工業(yè)應(yīng)用中的用途。因此,本申請也提供了用纖維素酶處理含棉織物及不含棉纖維素織物的改進方法以及由這些方法生產(chǎn)的織物。特別地,本發(fā)明的改進方法涉及將含棉織物與不含棉織物與水性溶液接觸,該水性溶液含有包括改良的EGII纖維素酶的纖維素酶組合物。
背景技術(shù)
:纖維素酶或纖維素的酶是參與纖維素水解的酶。天然纖維素水解中,已知涉及三種主要的纖維素酶類型,即纖維二糖水解酶(l,4-p-D-葡聚糖纖維二糖水解酶,EC3.2.1.91)、內(nèi)切-卩-l,4-葡聚糖酶(內(nèi)切-l,4-p-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(glucanohydrolase),EC3.2丄4)和卩-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。纖維素酶由包括真菌、放線菌(actinomycetes)、粘細(xì)菌(myxobacteria)和真細(xì)菌的多種微生物合成,但也由植物合成。尤其是已經(jīng)鑒定了多種物種的內(nèi)切葡聚糖酶。纖維素酶的極重要工業(yè)應(yīng)用是用于纖維素紡織品或織物的處理,例如作為洗滌劑組合物或織物軟化劑組合物的成分,用于新織物的生物拋光(衣服磨光),和用于獲得含纖維素織物(尤其是牛仔布)的"石洗"外表,并且已經(jīng)提出了用于此種處理的若干方法。本發(fā)明的一個目的在于提供在酸或中性條件下具有大量的纖維素活性以及在紙漿加工、紡織品處理、衣物洗滌工藝以及動物飼料中具有改進的性能的新型酶制劑;優(yōu)選新型纖維素酶,更優(yōu)選表現(xiàn)良好的內(nèi)切葡聚糖酶,預(yù)期它們可通過重組技術(shù)生產(chǎn)。大多數(shù)新造的棉織物和棉混物(cottonblendfabrics)具有相當(dāng)僵硬的手感除非用磨光組分處理它們。此外,織物表面由于從單個棉纖維突出的小細(xì)毛纖維而并非總是平滑的。另外,相對短的穿著期后,絨毛的聚集出現(xiàn)在表面(表面起毛)在該表面上產(chǎn)生"起球,,的外觀,造成該織物具有不具吸引力的、磨損的外表。聚酯織物中,這一現(xiàn)象實際是"起球"并且提供了類似的不具吸引力的織物外觀。術(shù)語"起球"也將在本申請用于纖維素織物。因此,纖維素酶在紡織品處理中的有用特征在于它們通過使得用過的織物色彩更加鮮明而修復(fù)這些織物的能力。例如,重復(fù)洗滌含棉織物導(dǎo)致該織物淺灰色的色光,而這被認(rèn)為是由于破裂的和混亂的纖絲,有時稱作"起球",由機械作用所造成。這一淺灰色的色光尤其在彩色織物上是顯而易見的。結(jié)果是,纖維素酶去除纖維的混亂頂層并且提高織物整體外觀的能力是有價值的??椢锉砻娴睦w維素酶處理提高了對于手感以及外觀而言的織物質(zhì)量而沒有損失織物吸濕度。最重要的作用是較少的細(xì)毛和起球,增加的光彩/光澤,提高的織物手感,增加的持久柔軟性和提高的吸水力。這些作用被稱作生物拋光作用。盡管本領(lǐng)域的知識涉及許多纖維素酶組合物,但是一直需要具有不同的特征鐠的、可作為洗滌劑組合物的組分用于諸如處理紡織品,用于紙漿和紙的處理,以及用于生物量轉(zhuǎn)化中的新型纖維素酶。在此描述的纖維素酶組合物提供了改進的性能特征,尤其是在紡織品加工中。發(fā)明概述出人意料地,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了用具有主要由改良的EGII組分組成的木霉纖維素酶組合物處理纖維素產(chǎn)品相比于富含內(nèi)纖維素酶的組合物提供了更優(yōu)異的性能。相對于目前用于在制造期間處理棉織物的標(biāo)準(zhǔn)商品化纖維素酶,通過使用在此所述的特定酶組合物,起球的去除更有效,磨損提高并且酶處理期間的織物破壞量降低。因而本發(fā)明組成了使用特定纖維素酶組合物處理棉織物的方法。一個實施方式中,纖維素酶組合物主要由改良的EGII組分組成。一方面,該酶組合物包括至少80%改良的EGII組分。第二方面,該酶組合物包括至少90%的改良的EGII組分。第三方面,該酶組合物包括至少95%改良的EGII組分。又一方面,該酶組合物包括至少97%改良的EGII組分。另一實施方式中,改良的EGII組分是基本上純的。一個實施方式中,將該改良的EGII組分配制為纖維素酶組合物。一方面,該改良的EGII組分是處理組合物的一部分。第二方面,該改良的EGII組分是洗滌劑組合物的一部分。一個實施方式中,提供了使用特定的纖維素酶組合物處理纖維織物的方法。該方法包括下述步驟(a)將所述含纖維素織物與包括有效量的纖維素酶的處理組合物接觸;和(b)在對于處理所述織物有效的條件下溫育6與所述纖維素酶接觸的所述含纖維素織物。一方面,該纖維素酶包括改良的EGH組分。另一實施方式中,提供了編碼圖1提供的氨基,列的分離的DNA。一方面,該DNA具有SEQIDNO:2提供的序列。一個實施方式中,本發(fā)明包括具有編碼改良EG2的序列(與egl2基因編碼序列互補的序列)的分離的多核苷酸,和/或包括該多核苷酸的組合物。該多核苷酸可為mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA或其反義類似物。另一實施方式中,egl2多核苷酸可包括在中度至高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO:2呈現(xiàn)的核酸序列的互補序列雜交的分離的核酸分子,其中該核酸分子編碼展現(xiàn)內(nèi)切葡聚糖酶活性的改良EG2多肽。另一實施方式中,該多核苷酸與SEQIDNO:2呈現(xiàn)的序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或更高序列同一性并且編碼改良的EG2蛋白。一個具體實施方式中,該多核苷酸包括與SEQIDNO:2基本上相同的序列。本發(fā)明也考慮該多核苷酸的片段,優(yōu)選長度至少約15-30個核苷酸。第二方面,改良的EG2多肽或蛋白質(zhì)包括與SEQIDNO:l呈現(xiàn)的序列具有至少80%、85%、卯%、95%、98%或更多序列同一性的序列。第三方面,本發(fā)明涉及包括該核普酸序列的核酸構(gòu)建體,該核苷酸序列編碼本發(fā)明的多肽,其有效地連接到指導(dǎo)該多肽在適當(dāng)宿主中生產(chǎn)的一種或多種控制序列。第四方面,本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組表達栽體。本發(fā)明還提供含有編碼改良EG2或其片段或剪接變體的核酸序列的重組表達載體,該核^列有效連接到對于該蛋白質(zhì)在經(jīng)選擇的宿主中表達有效的調(diào)控元件。一個相關(guān)的方面,本發(fā)明包括含有該載體的宿主細(xì)胞。第五方面,本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過重組技術(shù)來產(chǎn)生改良EG2的方法,該方法包括在對于促進該蛋白質(zhì)表達有效的條件下培養(yǎng)包括編碼改良EG2的核酸序列的重組原核或真核宿主細(xì)胞,并且隨后從該宿主細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基回收該蛋白。第六方面,本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法,該方法包括(a)培養(yǎng)能夠生產(chǎn)該多肽的微生物;和(b)回收該多肽。在此還提供了用于檢測egl2核酸的分析方法并且改良的EG2蛋白也成為了本發(fā)明的部分。本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將從下面詳細(xì)的描述中變得顯而易見。然而應(yīng)理解,在指出本發(fā)明優(yōu)選實施方式的詳細(xì)說明和具體實施例僅僅以說明的方式給出,因為通過這一詳細(xì)的說明,在本發(fā)明范圍和精神內(nèi)的多種改變和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。附圖簡要說明圖1說明在此所述的改良的EGII的氨基酸序列(SEQIDNO:l)。圖2說明編碼圖1所示氨基酸序列的核苷酸序列。圖3是公開的EG2(Gene(1988)63(1):11-22)(標(biāo)記的Eg2-1988')與在此所述(標(biāo)記的,mEG2')的氨基酸序列的比對。圖4和5是用于表達改良的EGII的EGIIpTrex3質(zhì)粒的示意圖。圖6是源自里氏木霉EG2菌抹A和B(描述于實施例1和2)的濃縮的上清液的SDS-PAGE。圖7是酶處理后,表l提供的對于抗起球的表面纖維定量的結(jié)果的圖示。圖8是示出酶處理對于抗起球的結(jié)果的照片。圖9是表2提供的織物磨損結(jié)果的圖示。詳細(xì)說明現(xiàn)在將使用下面的定義和實例僅以參考的方式詳細(xì)描述本發(fā)明。在此所指的所有專利和出版物(包括該專利和出版物中公開的所有序列)明確地引入本文作為參考。除非在此另有定義,否則在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)8明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。Singleton等人,DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY5第二版,JohnWileyandSons,NewYork(1994),以及Hale&Marham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,N.Y.(1991)向技術(shù)人員提供了本發(fā)明使用的許多術(shù)語的一般性字典。盡管與在此描述的那些類似或等效的任何方法和材料可以用于實踐或檢驗本發(fā)明,但描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)值。除非另有指明,核酸以5,到3,的方向從左至右書寫;氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左至右書寫。對于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語,專業(yè)人員尤其針對于Sambrook等人,1989和AusubelFM等人,1993。應(yīng)理解本發(fā)明并不限于所述的具體方法、原理和試劑,因為它們可變化。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)值。除非另有指明,核酸以5,到3,的方向從左至右書寫;氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左至右書寫。在此提供的標(biāo)題不限制本發(fā)明實施方式的各個方面,其可以參考作為整體的說明書。因此,緊接下面定義的術(shù)語將基于整個說明書作更全面地定義。定義"含棉織物"指由純棉或棉混紡物制成的縫制或未縫制的織物,包括棉織織物、棉針織物、棉牛仔布、棉紗等。當(dāng)使用棉混紡物時,織物中的棉量應(yīng)至少約為按棉重量計40%;優(yōu)選按棉重量計大于約60%;最優(yōu)選按棉重量計大于約75。/。。當(dāng)用作混紡物時,織物中使用的伴侶材料可以包括一種或多種非棉纖維,該非棉纖維包括合成纖維如聚酰胺纖維(例如,尼龍6和尼龍66)、丙烯酸纖維(例如聚丙烯腈纖維)和聚酯纖維(例如聚對苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯醇纖維(例如Vinylon)、聚氯乙烯纖維、聚偏l,l-二氯乙烯纖維、聚氨基曱酸酯纖維、聚脲纖維和芳族聚酰胺纖維。"含纖維素織物"指任何含棉或不含棉的纖維素織物或者含棉或不含棉纖維素混紡物,包括天然纖維素制品和人工纖維素制品(例如黃麻纖維、亞麻、苧麻、粘膠絲、TENCELtm)。含人造纖維素織物標(biāo)題下包括本領(lǐng)域公知的再生織物,例如粘膠絲。其它含人造纖維素織物包括化學(xué)改良的纖維素纖維(例如由乙酸酯衍生的纖維素)和溶劑紡絲纖維素纖維(例如萊奧塞爾纖維(lyocell))。當(dāng)然,含纖維素織物定義中包括任何由此種材料制成的衣服和紗。類似地,"含纖維素織物"包括由此種材料制成的紡織品纖維。"處理組合物"指包括可在制造期間用于處理含纖維素織物的改良EGII纖維素組分的組合物。該處理包括但不限于石洗;抗起球;含纖維素術(shù)。此外,本發(fā)明上下文中的處理考慮從纖維素織物或纖維除去"死棉,,(即明顯比成熟棉更加無定形的未成熟棉)。已知死棉造成不均勻染色。此外,"處理組合物"指包括可用于洗涂污染的制造的含纖維素織物的改良EGII纖維素酶組分的組合物。例如,改良的EGII纖維素酶可用于洗滌劑組合物來洗滌衣物。根據(jù)本發(fā)明有用的洗滌劑組合物包括特殊制劑例如預(yù)洗、預(yù)浸和家用復(fù)色組合物。處理組合物可為需要稀釋的濃縮物的形式,或者為稀釋溶液的形式或者為可以直接應(yīng)用于含纖維素織物的形式。申請人目前相信不管用于制造期間的石洗組合物還是用于污染的制造的含纖維素酶織物的衣物洗滌,纖維素酶對含纖維素織物的作用模式都沒有顯著不同。因此,在摻入纖維素酶的洗滌劑和制造工藝中獲得了由某些纖維素酶或纖維素酶混合物賦予的改進特性,如磨損、染料再沉積、強度損失和改進的觸感。當(dāng)然,用于纖維素酶的多種紡織品應(yīng)用(例如石洗或衣物洗滌或預(yù)浸)的特定組合物的配方可由于各組合物所針對的不同應(yīng)用而不同,如在此所指出。然而,通過加入纖維素酶組合物所實現(xiàn)的改進通常將在每種不同紡織品應(yīng)用中是一致的。"石洗組合物"指用于石洗含纖維素織物的制劑。相比于旨在清潔污染的衣服的洗滌組合物,石洗組合物用來在呈現(xiàn)給消費者出售前(即制造工藝期間)改良含纖維素織物。"石洗"指在攪拌和噴流(cascading)條件下用纖維素酶溶液對有色的含纖維素織物的處理,即在轉(zhuǎn)鼓式洗衣機中,其賦予牛仔布"石洗的"外觀。賦予牛仔布石洗外觀的方法描述于美國專利號4,832,864,其在此通過整體引用作為參考。總體上,石洗技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于染色的牛仔布。"洗滌劑組合物"指旨在用于清洗污染的含纖維素織物的洗滌介質(zhì)中的混合物。本發(fā)明上下文中,該組合物除了纖維素酶和表面活性劑以外可包括許多添加劑,包括但不限于其它水解酶、助洗劑、漂白劑、上藍劑和焚光染料、抗結(jié)塊劑、掩蔽劑、纖維素酶活化劑、抗氧化劑,并且可包括增溶劑。與石洗組合物相比,該組合物通常用于清潔污染的衣服并且并不在制造工藝期間使用。"再沉積纖維素酶"指在使用纖維素酶溶液進行含纖維素織物的酶促石洗或其它處理(尤其是牛仔布)中,導(dǎo)致染料再沉積到基質(zhì)上的纖維素酶。這一作用通常被稱作回染(backstain)。該織物回染由于代替了想要的在白底上的藍色,而導(dǎo)致不完全的石洗,該再沉積導(dǎo)致在藍色底上的藍色。"表面活性試劑或表面活性劑"指公知其在洗滌劑組合物中的應(yīng)用的陰離子、非離子和兩性表面活性劑。"洗滌介質(zhì)"指通過向水中加入需要量的洗滌劑組合物而制備的水性洗滌溶液。洗滌介質(zhì)通常含有清潔有效量的洗滌劑。如在此所定義的術(shù)語"EGII"指通常源自木霉的EGII,或者體現(xiàn)那些源自木霉的EGII的鑒定特性的內(nèi)切葡聚糖酶型組分。應(yīng)指出以前一些作者用命名法"EGIII"來指EGII,但目前命名法使用術(shù)語EGII。參見例如Stalbrand等人,APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,vol.61,p.1090-1097(1995))中的討論。任何情況下,在此定義的EGII蛋白基本上與EGIII蛋白在其分子量、pI和最適pH上不同。術(shù)語"EGII纖維素酶"指源自木霉的特征為最適pH約4.0至6.0、等電點(pi)約5.5以及分子量約48K道爾頓的內(nèi)切葡聚糖酶組分。優(yōu)選地,EGII纖維素酶源自里氏木霉或源自綠色木霉(Trichodermaviride)。在此使用的術(shù)語"改良EGII"指圖1示出的氨基*列。在此的術(shù)語"%同源性"與在此的術(shù)語"%同一性"互換使用并且指當(dāng)使用序列比對程序比對時,編碼改良EGII的核酸序列或改良的EGII氨基酸序列之間的核酸或氨基酸序列同一性的水平。例如,如在此所使用,80%同源性指由限定的算法確定的相同事物為80%序列同一性,并且因此給定序列的同源物在一段長度的給定序列上具有大于80%序列同一性。如在此所述,示例性的序列同一性水平包括但不限于與給定序列(例如改良的eglII的編碼序列)有80、85、卯、95、98%或更多序列同一性??梢杂糜诖_定兩序列間同一性的示例性計算機程序包括但不限于BLAST程序組,例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN,公眾可從因特網(wǎng)在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST獲得。也參見Altschul等人,19卯和Altschul等人,1997。當(dāng)評價給定核酸序列相對于GenBankDNA序列和其他^>共數(shù)據(jù)庫的核酸序列時,通常使用BLASTN程序進行序列檢索。BLASTX程序優(yōu)選用于針對GenBank蛋白序列或其他公共數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列來檢索所有讀碼框已經(jīng)被翻譯了的核酸序列。BLASTN和BLASTX都使用空位罰分11.0以及延伸空位罰分1.0的默i^參數(shù),并利用BLOSUM-62矩陣來運行(參見例如Altschul等人,1997)。為了確定兩條或更多條序列間的"%同一性",4吏用諸如MacVector版本6.5的CLUSTAL-W程序,以包括空位罰分10.0以及延伸空位罰分0.1的默認(rèn)參數(shù),以及BLOSUM30相似性矩陣來運行,進行被選擇序列的優(yōu)選的比對。"組分纖維素酶"是一種組分,其基本上不含給定微生物生產(chǎn)的纖維素酶體系中通常發(fā)生的其它纖維素酶組分。該單組分可為重組組分,即由編碼單組分的DNA序列克隆并且隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達所產(chǎn)生,參見例如美國專利5,654,193。組分纖維素酶的其它實例包括但不限于JP-07203960-A和WO92/06209/>開的那些。宿主優(yōu)選異源宿主,但是某些條件下宿主也可為同源宿主。如在此所使用的術(shù)語"純化的"也指除去在表達該改良EGII的細(xì)胞中存在的其他組分、尤其是其它蛋白質(zhì)和最特別是其他酶。該改良的EGII可為"基本上純的"(即不含來自產(chǎn)生它的生物的其它組分),也就是說,例如重組生產(chǎn)改良EGII的宿主生物。優(yōu)選的實施方式中,改良的EGII為至少75%(w/w)純的,優(yōu)選至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%純的。另一優(yōu)選實施方式中,改良的EGII是100。/。純的。短語"抗起球處理"指在制造工藝或隨后的洗滌中進行的處理。每種情形下,通過向含有織物、水、緩沖劑、纖維素酶和任選地洗滌劑或表面活性劑的水平或垂直轉(zhuǎn)鼓噴射式染色機、洗衣機或其他設(shè)備中加入棉產(chǎn)品,同時向該織物提供攪拌和剪切來進行處理。通常在處理后用水漂洗以從織物除去余下的化學(xué)品和殘渣(包括松散的細(xì)纖維)。處理后,從該機器移出該織物并干燥。在此使用的術(shù)語"多肽,,指由通過肽鍵連接的氨基酸殘基的單鏈組成的化合物。在此使用的術(shù)語"蛋白質(zhì)"與術(shù)語"多肽"可互換使用。術(shù)語"核酸分子,,包括RNA、DNA和cDNA分子。應(yīng)理解,作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果,可產(chǎn)生編碼給定蛋白質(zhì),例如改良的EG2(或任何其它蛋白質(zhì))的眾多核苷酸序列。本發(fā)明設(shè)想編碼改良的EG2的每種可能的變體核苷酸序列,考慮到遺傳密碼簡并性,其全部是可能的。"異源"核酸構(gòu)建體或序列具有一部分序列,其并非表達它的細(xì)胞天然的。對于控制序列,異源指本質(zhì)上指這樣的控制序列(如啟動子或增強子),其天然調(diào)控的基因與其目前正調(diào)控表達的基因不同。通常,異源核,列不是該細(xì)胞內(nèi)源的或者不是它們存在的基因組的一部分,并且通過感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、顯孩"主射、電穿孔等^L加入到該細(xì)胞中。"異源"核酸構(gòu)建體可含有與在天然細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列組合相同或者不同的控制序列/DNA編碼序列組合。如在此所使用,術(shù)語"載體"指設(shè)計用來在不同宿主細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體。"表達載體"指具有在外源細(xì)胞中整合并表達異源DNA片段的能力的載體。許多原核細(xì)胞和真核細(xì)胞表達載體是可商購的。對于合適的表達載體的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。因此,"表達盒"或"表達栽體"是重組或者合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體,其具有一系列允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特定核酸元件。重組表達盒可以整合到質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。通常,表達載體的重組表達盒部分除了其它序列,包括待轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動子。如在此所使用,術(shù)語"質(zhì)粒,,指用作克隆載體的環(huán)狀雙鏈DNA構(gòu)建體,并且其在許多細(xì)菌和一些真核生物中形成染色體外自主復(fù)制遺傳元件。如在此所使用,術(shù)語"編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列,,指核苷酸序列,其能夠在細(xì)胞中表達并且該選擇標(biāo)記的表達賦予含有所表達基因的細(xì)胞在相應(yīng)的選擇試劑存在下,或在相應(yīng)的選擇生長條件下生長的能力。如在此所使用,術(shù)語"啟動子"指起指導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄作用的核酸序列。啟動子通常將適于要表達靶基因的宿主細(xì)胞。啟動子和其他轉(zhuǎn)錄以及翻譯調(diào)控核酸序列(也稱作"控制序列")一起對于表達給定基因是必需的??傮w上,轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列包括但不限于啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強子或激活序列。當(dāng)將核酸置于與另一核酸序列的功能性關(guān)系時,核酸是"有效連接的"。例如,編碼分泌性前導(dǎo)序列的DNA與多肽的DNA有效連接,如果該多肽的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白的話;啟動子或增強子與編碼序列有效連接,如果其影響該序列的轉(zhuǎn)錄的話;或者核糖體結(jié)合位點與編碼序列有效連接,如果其被定位以促進翻譯的話。通常,"有效連接"指被連接的DNA序列是連續(xù)的,并且在分泌前導(dǎo)序列的情形下,是連續(xù)的且在讀碼框內(nèi)。然而,增強子不必須是連續(xù)的。通過在方便的限制酶位點的連接完成連接。如果該位點不存在,則根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭、接頭或PCR引物。如在此所使用,術(shù)語"基因,,指參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA區(qū)段,其可包括或可不包括在編碼區(qū)前或后的區(qū)域,例如5,非翻譯(5'UTR)或"前導(dǎo)序列"和3'UTR或"拖尾"序列,以及各個編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。通常,編碼如在此所述的新型蛋白質(zhì)或其類似物或同源物的核酸分子將在中度至高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與在此提供的該蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸序列雜交。然而,一些情形下,使用具有基本上不同的密碼子用法的新型編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列,而由該新型編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)具有與天然蛋白質(zhì)相同或基本上相同的氨基酸序列。例如,可根據(jù)特定密碼子被宿主細(xì)胞所利用的頻率來改變編碼序列以促進該新型蛋白質(zhì)在特定原核或真核細(xì)胞表達體系中的更快表達。例如,Te'o等人,F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters190:13-19,(2000)描述了在絲狀真菌中表達的基因的優(yōu)化。如果兩條序列在中度至高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件下相互特異性地雜交,那么認(rèn)為一條核酸序列對于參照核酸序列是"可選擇性雜交的"。雜交條件是根據(jù)核酸結(jié)合復(fù)合體或探針的解鏈溫度(Tm)。例如,"最大嚴(yán)謹(jǐn)性"通常發(fā)生在約Tm-5。C(比探針的Tm低5。C);"高度嚴(yán)謹(jǐn)性,,為低于Tm約5-10°;"中度嚴(yán)謹(jǐn)性"為低于探針的Tm約10-20°;而"低嚴(yán)謹(jǐn)性,,為低于Tm約20-25°。在功能上,可使用最大嚴(yán)謹(jǐn)性條件來鑒定與雜交探針具有嚴(yán)格同一性或接近嚴(yán)格同一性的序列;而高度嚴(yán)謹(jǐn)性條件用于鑒定與探針具有約80%或更高序列同一性的序列。中度和高度嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件是本領(lǐng)域公知的(參見例如,Sambrook等人,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第二版),ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.,1989,Chapters9和11,以及A訓(xùn)belFM等人,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.,1993,其在此通過引用作為參考)。高度嚴(yán)謹(jǐn)性條件的實例包括在約42°C于50%甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt's溶液、0,5%SDS和100jig/ml變性載體DNA中雜交,隨后于室溫在2XSSC和0.5%SDS中洗滌兩次并在42。C于0.1XSSC和0.5%SDS中再洗涂兩次。如在此所使用,"重組的"包括已經(jīng)通過引入異源核酸序列而被改變的細(xì)月包或載體,或者源自經(jīng)如此改變過的細(xì)^<的細(xì)月包。因此,例如,重組細(xì)胞表達在細(xì)胞的天然(非重組)形式中并未發(fā)現(xiàn)相同形式的基因或者作為有意人類干涉的結(jié)果而表達本來異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。如在此所使用,術(shù)語"轉(zhuǎn)化的"、"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)基因的"對于細(xì)胞指細(xì)胞具有整合到其基因組的非天然(異源)核酸序列或者作為在多代都保持的附加型質(zhì)粒。如在此所使用,術(shù)語"表達"指這樣的過程,即根據(jù)基因的核酸序列通過該過程生產(chǎn)多肽。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。在將核酸序列插入到細(xì)胞的上下文中的術(shù)語"導(dǎo)入的"指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo),,并且包括核酸序列在真核生物或原核生物細(xì)胞中的整合,核酸序列在那里可整合到細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA),轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子,或瞬時表達(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。術(shù)語"信號序列"指蛋白質(zhì)N末端部分促進該蛋白質(zhì)的成熟形式在細(xì)胞外分泌的氨基酸序列。細(xì)胞外蛋白質(zhì)的成熟形式?jīng)]有信號序列,該信號序列在分泌過程中被切掉。術(shù)語"宿主細(xì)胞"指含有載體且支持表達構(gòu)建體復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯(表達)的載體。用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是原核生物細(xì)胞,例如大腸桿菌,或真核生物細(xì)胞例如酵母、植物、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細(xì)胞。通常,宿主細(xì)胞是絲狀真菌。術(shù)語"絲狀真菌"指本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何以及所有絲狀真菌。優(yōu)選的真菌選自曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬、鐮孢屬(Fusarium)、金小孢子屬(Chrysosporium)、青霉屬(Penicillium)、腐質(zhì)霉(Humicola)、脈孢霉(Neurospora)或它們的替代的有性形式例如棵孢殼屬(Emericella)、肉座菌屬(Hypocrea)。如在此所使用,術(shù)語"純化"通常指將含有核酸或蛋白質(zhì)的細(xì)胞進行生化純化和/或柱層析。在此使用的術(shù)語"分離的"或"純化的"指從核酸或蛋白質(zhì)天然結(jié)合的至少一種組分取出的核酸或蛋白質(zhì)。本上下文中,術(shù)語"基本上純的多肽"指這樣的多肽制劑,其含有按重量計至多10%的與其天然結(jié)合的其他多肽物質(zhì)(優(yōu)選其它多肽物質(zhì)的更低百分?jǐn)?shù),例如按重量計至多8%、按重量計至多6%、按重量計至多5%、按重量計至多4%、按重量計至多3%、按重量計至多2%、按重量計至多1%和按重量計至多1/2%)。因此,優(yōu)選該基本上純的多肽是至少92%純的,即該多肽組成^^要該制劑中存在的總多肽物質(zhì)重量計至少92%,且優(yōu)選更高百分?jǐn)?shù)例如至少94%純的、至少95%純的、至少96%純的、至少96%純的、至少97%純的、至少98%純的、至少99%、和至少99.5%純的。在此公開的多肽優(yōu)選基本上純的形式。特別是,優(yōu)選在此公開的多肽是"實質(zhì)上純的形式",即該多肽制劑是基本不含與其天然結(jié)合的其它多肽物質(zhì)。這可以通過例如借助公知的重組方法制備多肽而實現(xiàn)。在此,術(shù)語"基本上純的多肽"與術(shù)語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。如在此所使用,術(shù)語"活性的"和"生物活性的,,指與特定蛋白質(zhì)相關(guān)的生物活性,例如與蛋白酶相關(guān)的酶促活性。給定蛋白質(zhì)的生物活性指通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員歸結(jié)于該蛋白質(zhì)的任何生物活性。如在此所使用,術(shù)語"富含的"指發(fā)現(xiàn)該新型蛋白質(zhì)的濃度相比于該新型蛋白質(zhì)在野生型或天然發(fā)生的真菌纖維素酶組合物中的濃度更大。宿主生物和培養(yǎng)條件本發(fā)明設(shè)想使用細(xì)胞來表達改良的EGII,無需特定的表達方法。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。諸如溫度、pH等的培養(yǎng)條件是在轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染前用于親本宿主細(xì)胞的那些培養(yǎng)條件并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。一種方法中,用表達載體轉(zhuǎn)染絲狀真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞,該表達載體具有與編碼改良EGII的DNA區(qū)段有效連接的、在宿主細(xì)胞系中發(fā)揮作用的啟動子或者生活活性啟動子片段或者一種或多種(例如一系列)增強子,以在該細(xì)胞系中表達改良的EGII。(i)絲狀真菌本發(fā)明提供絲狀真菌,其包括已經(jīng)被以有效導(dǎo)致相比于相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化親代真菌具有增強的改良EGII產(chǎn)生或表達的方式而改變、選擇和培養(yǎng)的細(xì)胞??杀惶幚砗?或改變用于增強的改良EGI1表達的親代絲狀真菌物種的實例包括但不限于木霉屬,例如里氏木霉、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、綠色木霉(Trichodermaviride)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、青霉菌、腐質(zhì)霉包括孤獨腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、曲霉菌(Aspergillussp.)、金小抱子(Chrysosporiumsp.)、鐮孢、肉座菌和棵包殼菌。在通常用于培養(yǎng)親代真菌系的條件下培養(yǎng)改良的EGII表達細(xì)胞。通常,在含有生理鹽和營養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞,例如描述于Pourquie,J.等人,BiochemistryandGeneticsofCelluloseDegradation,eds.Aubert,J.P.等人,AcademicPress,pp.7186,1988和llmen,M.等人,Appl.Environ.Microbiol.63:12981306,1997。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的,例如在28。C于搖床或發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)物直到達到想要的改良EGII表達水平。可在科學(xué)文獻和/或從真菌的來源例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC;前往萬維網(wǎng)atcc.org)找到給定絲狀真菌的優(yōu)選培養(yǎng)條件。確立了真菌生長后,將細(xì)胞暴露于有效造成或允許改良EGII過表達的條件。在改良的EGII編碼序列在誘導(dǎo)型啟動子控制下的情形下,在有效誘導(dǎo)高水平改良的EGII表達的濃度下,將諸如糖、金屬鹽或抗生素的誘導(dǎo)劑加入培養(yǎng)基中。(ii)酵母本發(fā)明還設(shè)想使用酵母作為宿主細(xì)胞用于改良的EGII生產(chǎn)。已經(jīng)在釀酒酵母(S.cerevisiae)的多種菌林中表達了編碼水解酶的若干其它基因。這些包括編碼兩種內(nèi)切葡聚糖酶(Penttila等人,1987)、兩種纖維二糖水解酶(Penttila等人,1988)和一種來自里氏木霉的P-葡糖苷酶(Cummings和Fowler,1996)、來自Aureobasidliumpullulans的木聚糖酶((Li和Ljungdahl,1996)、來自小麥的a-淀粉酶(Rothstein等人,1987)等的序列。此外,在釀酒酵母的實驗室菌抹中成功表達了編碼溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)內(nèi)切-卩-l,4-葡聚糖酶(END1)、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysospori腿)纖維二糖水解酶(CBH1)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)纖維糊精酶(CEL1)和Endomycesfibrilizer纖維二糖酶(BgH)的纖維素酶基因表達盒(VanRensburg等人,1998)。核酸構(gòu)建體/表達載體可將編碼改良EGII的多核苷酸片段("編碼改良的EGII的核酸序列)整合到異源核酸構(gòu)建體或載體中,其能夠被導(dǎo)入到絲狀真菌或酵母細(xì)胞并在其中復(fù)制。在此公開的載體和方法適合用于表達改良的EGII的宿主細(xì)胞??墒褂萌魏屋d體只要其可在被引入到的細(xì)胞中復(fù)制和存活。大量適合的栽體和啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且是可商購的??寺『捅磉_載體還描述于Sambrook等人1989、AusubelFM等人,1989以及Strathern等人,1981,其全部在此明確地通過引用作為參考。用于真菌的適合的表達載體描述于vandenHondel,C.A.M.J.J.等人,(1991)In:Bennett,J.W.和Lasure,L.L.(編)MoreGeneManipulationsinFungi.AcademicPress,pp.396428。適合的DNA序列可通過多種方法插入質(zhì)粒或載體(在此統(tǒng)稱"栽體")中。通常,通過標(biāo)準(zhǔn)方法將DNA序列插入適合的限制性內(nèi)切酶位點。i^為該方法和相關(guān)的亞克隆方法在本領(lǐng)域4支術(shù)人員知識的范圍內(nèi)??赏ㄟ^將包括改良EGII編碼序列的異源核酸構(gòu)建體導(dǎo)入經(jīng)選擇的絲狀真菌菌林的細(xì)胞中來產(chǎn)生包括改良EGII編碼序列的重組絲狀真菌。一旦獲得期望形式的改良egl2核酸序列、其同源物、變體或片段,可以以多種形式#>飾它。當(dāng)該序列包括非編碼側(cè)翼區(qū)域時,可對側(cè)翼區(qū)域進行切除、誘變等。因此,可在天然發(fā)生的序列上進行轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入??筛鶕?jù)公知的重組技術(shù)將改良的egi2編碼序列插入適合的載體并用于轉(zhuǎn)化能夠表達改良EGII的絲狀真菌。由于遺傳密碼子的固有簡并性,可將編碼基本上相同或功能上等同的氨基酸序列的其他核酸序列用于克隆和表達改良的EGII。因此,應(yīng)理解編碼區(qū)的此種替代落入由本發(fā)明覆蓋的序列變體內(nèi)??梢砸耘c在此所述用于親代改良EGII編碼核酸序列相同的方式利用任何以及所有這些序列變體。本發(fā)明還包括重組核酸構(gòu)建體,其包括一種或多種如在此所述的編碼改良EGII的核酸序列。該構(gòu)建體包括以正向或反向插入本發(fā)明序列的載體,例如質(zhì)?;虿《据d體。異源核酸構(gòu)建體可包括用于改良的egl2、或其變體、片段或剪接變體的編碼序列它們是(i)孤立的;(ii)與其他編碼序列組合;例如融合蛋白或信號肽編碼序列,其中egl2編碼序列是顯性編碼序列;(iii)與在適合宿主中對于表達編碼序列有效的非編碼序列組合,例如內(nèi)含子和控制元件,例如啟動子和終止子元件或5,和/或3,非翻譯區(qū);和/或(iv)在編碼改良的egl2序列為異源基因的載體或宿主環(huán)境中。本發(fā)明一方面,使用異源核酸構(gòu)建體在體外將編碼改良的EGII核酸序列體外轉(zhuǎn)移到細(xì)胞,優(yōu)選用已建立的絲狀真菌和酵母菌林系。對于長期、高產(chǎn)率生產(chǎn)的改良EGII,優(yōu)選穩(wěn)定的表達。任何對于產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體有效的方法可用于實踐本發(fā)明。適合的載體通常裝有編碼選擇標(biāo)記的核酸序列、插入位點和適當(dāng)?shù)目刂圃鐔幼雍徒K止序列。載體可包括有效連接到編碼序列、對于在宿主細(xì)胞(和/或在并未正常表達改良的可溶蛋白抗原編碼序列的載體或宿主細(xì)胞環(huán)境下)中表達編碼序列有效的調(diào)控序列,包括例如非編碼序列,例如內(nèi)含子和控制元件,如啟動子和終止元件或5,和/或3'非翻譯區(qū)。大量適合的載體和啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,其中許多是市售可得和/或描述于Sambrook等人(上文)。示例性啟動子包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子,其實例包括CMV啟動子、SV40早期啟動子、RSV啟動子、EF-la啟動子、如(ClonTech和20BASF)所述在tet-on或tet-off體系中含有tet應(yīng)答元件(TRE)的啟動子、P-肌動蛋白啟動子和能夠通過加入某些金屬鹽而上調(diào)的金屬硫蛋白啟動子。啟動子序列是由特定絲狀真菌出于表達目的識別的DNA序列。其有效連接到編碼改良EGII多肽的DNA序列。該連接包括關(guān)于編碼改良EGII多肽的DNA序列的起始密碼將啟動子定位到所述表達栽體中。啟動子序列含有介導(dǎo)改良的EGII多肽表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。實例包括來自黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aawamori)或米曲霉(A.oryzae)葡糖淀粉酶,a-淀粉酶或a-葡糖苷酶編碼基因;構(gòu)巢曲霉gpdA或trpC基因;粗糙脈孢菌cbhl或trpl基因;黑曲霉或米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶編碼基因;里氏木霉cbhl、cbh2、egll、egl2或其他纖維素酶編碼基因的啟動子。適合的選擇標(biāo)記的選擇將取決于宿主細(xì)胞,而用于不同宿主的適合的標(biāo)記是本領(lǐng)域公知的。典型的選擇標(biāo)記基因包括來自構(gòu)巢曲霉或里氏木霉的argB、來自構(gòu)巢曲霉的amdS、來自粗糙脈孢菌或里氏木霉的pyr4;來自黑曲霉或構(gòu)巢曲霉的pyrG。其它示例性選擇標(biāo)記包括但不限于trpc、trpl、oliC31、niaD或leu2,其包括在用于轉(zhuǎn)化諸如trp-、pyr-、leu-等的突變體林系的異源核酸構(gòu)建體中。此種選擇標(biāo)記賦予轉(zhuǎn)化體利用通常不被絲狀真菌所代謝的代謝物的能力。例如來自里氏木霉的編碼乙酰胺酶的amdS基因,其允許轉(zhuǎn)化體細(xì)胞在作為氮源的乙酰胺上生長。選擇標(biāo)記(例如pyrG)可恢復(fù)營養(yǎng)缺陷型突變體菌林在選擇性基本培養(yǎng)基上生長的能力或者選擇標(biāo)記(例如0lic31)可賦予轉(zhuǎn)化體在抑制性藥物或抗生素存在下生長的能力。使用本領(lǐng)域通常使用的方法將選擇標(biāo)記編碼基因克隆到任何適合的質(zhì)粒。示例性質(zhì)粒包括pUC18、pBR322和pUClOO。除非另有說明,本發(fā)明的實踐將使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù),這在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。此種技術(shù)在文獻中進行了全面解釋。參見例如Sambrook等人,1989;Freshney,1987;Ausubel等人,1993;和Coligan等人,1991。在此提及的所有專利、專利申請、文章和出版物在此明確并入本文作為參考。宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化本發(fā)明還提供經(jīng)遺傳修飾以包括外源提供的改良EGII編碼核酸序列的細(xì)胞和細(xì)胞組合物??捎每寺≥d體或表達載體來遺傳修飾(例如轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)親代細(xì)胞或細(xì)胞系。如上面進一步所述,載體可為例如質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。多種方法可用于將表達載體體外傳遞到細(xì)胞。構(gòu)建適合的載體后,將其用于轉(zhuǎn)化真菌或酵母菌菌林。將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中以表達異源核酸序列的通常方法是普通技術(shù)人員已知的。此類方法包括但不限于電穿孔;核顯微注射或直接微注射到單細(xì)胞;與完整細(xì)胞的細(xì)菌原生質(zhì)體融合;使用聚陽離子,例如1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞曱基聚甲溴化物或polyomithine;與脂質(zhì)體、lipofectamine的膜融合或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染;DNA包被微粒的高速轟擊;磷酸鉤-DNA沉淀溫育;DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染;修飾的病毒核酸的感染;等。將異源核酸構(gòu)建體(表達載體)導(dǎo)入絲狀真菌(例如里氏木霉)的方法包括但不限于使用顆?;蚧驑?、在轉(zhuǎn)化過程前絲狀真菌細(xì)胞壁的透化作用(例如使用高濃度堿,例如0.05M至0.4MCaCh或醋酸鋰),原生質(zhì)體融合或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。通過用聚乙二醇和CaCh處理原生質(zhì)體或原生質(zhì)球來轉(zhuǎn)化絲狀真菌的示例性方法描述于Campbell,E.I.等人,Curr.Genet.16:5356,1989和Penttila,M.等人,Gene,63:1122,1988。此外,可以體外轉(zhuǎn)錄包括改良的EGII編碼核酸序列的異源核酸構(gòu)建體并且通過7>知方法(例如通過注射)將得到的RNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。導(dǎo)入包含改良egl2的編碼序列的異源核酸構(gòu)建體后,可以在按照適于活化啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或EGII編碼核酸序列擴增表達改良后的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因修飾的細(xì)胞。諸如溫度、pH等的培養(yǎng)條件是之前用于選擇的宿主細(xì)胞進行表達的那些,且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。通常認(rèn)為導(dǎo)入了該異源核酸構(gòu)建體的細(xì)胞的后代包含在異源核酸構(gòu)建體中發(fā)現(xiàn)的改良的EGII編碼核酸序列。設(shè)想新型且有用的絲狀真菌轉(zhuǎn)化體,例如里氏木霉用于生產(chǎn)纖維素酶組合物。本發(fā)明包括絲狀真菌,尤其是包括改良的egl2編碼序列或包括改良的egl2編碼序列的改良形式的真菌。通常可以通過絲狀真菌的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體在固體培養(yǎng)基上更快的生長率以及平滑而非粗糙輪廓的圓形菌落的形成而將其與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體區(qū)分開。此外,一些情形下,可以通過在固體非選擇培養(yǎng)基上生長轉(zhuǎn)化體,從該培養(yǎng)基收集孢子并且確定這些將隨后萌發(fā)并在選擇培養(yǎng)基上生長的孢子的百分?jǐn)?shù)來進行穩(wěn)定性的進一步檢測。改良的EGII核酸編碼序列和/或蛋白質(zhì)表達的分析為了評估由轉(zhuǎn)化有改良的EGII編碼核酸構(gòu)建體的細(xì)胞系表達的改良EGII,可以在蛋白質(zhì)水平、RNA水平或使用尤其用于內(nèi)切葡聚糖酶活性和/或產(chǎn)生的功能性生物檢測法來進行檢測。在此描述的改良egl2核酸和蛋白序列的一個示例性應(yīng)用中,改造絲狀真菌(例如里氏木霉)的基因修飾的菌株以產(chǎn)生增加量的改良的EGII。該基因修飾的絲狀真菌對于產(chǎn)生具有更多增加的水解纖維素能力的纖維素酶產(chǎn)物是有用的。一個方法中,這通過將改良的egl2編碼序列導(dǎo)入適合的宿主(例如絲狀真菌如里氏木霉)而實現(xiàn)。因此,本發(fā)明包括在絲狀真菌或其他適合的宿主中表達改良的EGII的方法,其通過將含有編碼改良的EGII的DNA序列的表達載體導(dǎo)入該絲狀真菌細(xì)胞或其他適合的宿主來實現(xiàn)。另一方面,本發(fā)明包括改變改良的EGII在絲狀真菌或其他適合的宿主中的表達的方法。該改變包括表達的減少或消除,或者改變形式的改良EGII的表達。改變形式的改良EGII可具有改變的氨基酸序列或改變的核醋列。通常,用來分析改良EGII表達的測定法包括使用適合的標(biāo)記探針(基于核酸編碼序列)的RNA印跡、點印跡(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或原位雜交,以及常規(guī)RNA印跡和放射自顯影。此外,可例如通過內(nèi)切葡聚糖酶活性、表達和/或產(chǎn)生的測定法直接測量樣品中改良EGII的產(chǎn)生和/或表達。此類測定法描述于例如S.P.和Brown,R.DJr.(Biochim.Biophys.Acta,1978,523:133146;Schuldn(1988)和美國專利號5,246,853和5,475,101,其每個在此都明確并入本文作為參考。可以使用Suurnakki等人,(2000)和Ortega等人,(2001)所述的方法來測量改良的EGII水解分離的可溶和不溶底物的能力。用于測定纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶或p-葡糖苷酶活性的底物包括結(jié)晶纖維素、濾紙、磷酸膨化纖維素、羥乙基纖維素、羧曱基纖維素、纖維寡糖、曱基傘形糖基乳糖苷、甲基傘形糖基纖維二糖苷、鄰-硝基苯基乳糖苷、對-硝基苯基乳糖苷、鄰-硝基苯基纖維二糖苷、對-硝基苯基纖維二糖苷、鄰-硝基苯基葡糖苷、對-硝基苯基葡糖苷、曱基傘形糖基葡糖苷??墒褂敏燃谆w維素(CMC)水解根據(jù)Ghose,1987,PureandAppl.Chem.59:257-268或Wood,T.M.,和K.M.Bhat,1988,Methodsformeasuringcellulaseactivities.MethodsEnzymol,160:87-112的方法來觀,J定內(nèi)切葡聚糖酶活性。簡言之,可使用CMC作為底物體外來測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。可在50°C,于含有低粘度CMC(每升10g)的50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中檢測無細(xì)胞培養(yǎng)液(細(xì)胞外活性)或由超聲破壞的含細(xì)胞培養(yǎng)液(總活性)的適合稀釋液。通過在沸水浴中加熱5-10分鐘終止反應(yīng)。使用3,5-二硝基水楊酸試劑以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)測量還原糖。酶活性(CMCase)表示為每分鐘釋放的還原糖的微摩爾數(shù)(國際單位)。此外,可通過免疫方法,例如細(xì)胞的免疫組化染色、組織切片或組織培養(yǎng)基的免疫測定(例如通過Western印跡或ELISA)來評估蛋白質(zhì)表達。該免疫測定法可以用于定性及定量評估改良EGII的表達。該方法的細(xì)節(jié)純化形式的改良EGII可用于生產(chǎn)對于表達的蛋白質(zhì)特異的單克隆或多克隆抗體用于多種免疫測定法(參見例如Hu等人,1991)。示例性的測定法包括ELISA、竟?fàn)幟庖邷y定法、放射免疫測定法、Western印跡、24間接免疫熒光測定法等。通常,可商購的抗體和/或試劑盒可用于內(nèi)切葡聚糖酶蛋白質(zhì)的表達水平的定量免疫測定。純化改良的EGII的方法通常,在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的改良的EGII纖維素酶分泌到培養(yǎng)基中并且可通過例如從細(xì)胞培養(yǎng)基中除去不想要的組分而純化或分離。然而,一些情形下,可以以細(xì)胞形式生產(chǎn)改良的EGII纖維素酶,需要從細(xì)胞裂解物中回收。此種情形下,使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的技術(shù)從生產(chǎn)該EGII纖維素酶的細(xì)胞純化它。實例包括但不限于親和層析(Tilbeurgh等人,1984)、離子交換層析法(Goyal等人,1991;Fliess等人,1983;Bhikhabhai等人,1984;Ellouz等人,1987),包括使用高分辨力材料的離子交換(Medve等人,1998)、疏水相互作用層析(Tomaz和Queiroz,1999),以及兩相分配(Brumbauer等人,1999)。通常,分級分離改良的EGII纖維素酶以分離具有被選擇特性的蛋白質(zhì),例如與特定結(jié)合劑(例如抗體和受體)的結(jié)合親和性;或具有所選擇的分子量范圍,或等電點范圍。一旦實現(xiàn)改良EGII纖維素酶的表達,從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物純化因而產(chǎn)生的改良EGII纖維素酶。適于此種純化的示例性方法包括下述抗體親和柱層析,離子交換層析;乙醇沉淀;反向HPLC;二氧化硅或陽離子交換樹脂(如DEAE)上的層析;層析聚焦;SDS-PAGE;硫酸銨沉淀;和使用諸如SephadexG-75的凝膠過濾??墒褂枚喾N蛋白質(zhì)純化的方法并且此類方法是本領(lǐng)域已知的且描述于例如Deutscher,1990;Scopes,1982。根據(jù)例如所用純化方法的性質(zhì)和所產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)來選擇純化步驟。實用性相信用于下面實施例中的抗起球處理條件與通常用于抗起球的那些一致。當(dāng)在典型的制造工藝中進行抗起球時,抗起球處理時間約15至約120分鐘;抗起球處理溫度約35。C至約60°C,液體與織物的比例按重量計約2.5:1到約10:1之間,以及pH約4.0至約6.0。當(dāng)在典型衣物洗滌中進行抗起球時,處理時間約10至60分鐘;溫度約20°C至約70。C,液體與織物的比例在按重量計約2.5:1和約10:1之間,以及pH約7.0至約9.5。用于抗起球的處理組合物的量取決于纖維素酶組合物中的活性蛋白質(zhì)的濃度、被處理的棉產(chǎn)品的量、以及期望的抗起球作用量、處理時間和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的參數(shù)。當(dāng)在典型制造工藝中用于抗起球時,處理組合物的優(yōu)選量通常在每kg織物約2,000和約100,000CMC單位酶之間,并且更優(yōu)選每kg織物約10,000和約40,000CMC單位酶之間。當(dāng)在典型的衣物洗滌中用于抗起球時,處理組合物的優(yōu)選量通常在每kg織物約200和約40,000CMC單位酶之間,并且更優(yōu)選每kg織物約1,000和約10,000CMC單位酶之間??刂泼缸饔玫囊环N選擇(推薦但并不需要)是在將溶液加熱至7(TC處理10分鐘后通過加入破壞酶活性的化學(xué)品,或通過立即干燥織物來破壞酶。使用改良的EGII纖維素酶處理含纖維素織物的方法本發(fā)明的一方面是用于處理包括本發(fā)明的改良EGII的紡織品的組合物。另一實施方式中,本發(fā)明涉及本發(fā)明的改良EGII在生物拋光工藝中的應(yīng)用。生物拋光是紗表面的特定處理,其提高織物在手感和外觀方面的質(zhì)量。生物拋光的最重要作用可以表征為較少的細(xì)毛和起球、增加的光彩/光澤、提高的織物手感、增加的持久柔軟性和改變的吸水性。通常在針織和梭織織物制造的濕處理中進行生物拋光。濕處理包括步驟如退漿、煮練、漂白、洗滌、干燥/印刷和織物整理。這些步驟的每步期間,織物或多或少經(jīng)歷機械作用。通常,在針織或梭織紡織品后,織物轉(zhuǎn)到退漿階段,隨后是煮練階段等。退漿是從紡織品除漿的行為。在紡織機上梭織之前,通常用淀粉或淀粉衍生物漿包覆經(jīng)紗以便增加它們的拉伸強度。梭織后,必須在進一步加工織物之前除去漿涂層以保證均勻以及防洗結(jié)果。已知為了實現(xiàn)生物拋光的效果,需要纖維素作用和機械作用的組合。也知道當(dāng)用與使用軟化劑的常規(guī)處理組合的纖維素酶處理時可實現(xiàn)"超柔軟"。設(shè)想使用本發(fā)明的改良的EGII用于纖維素織物的生物拋光是有益的,例如可以實現(xiàn)更加徹底的拋光??赏ㄟ^利用如WO93/20278所述的方法獲得生物拋光。如上所指出,本發(fā)明涉及用改良的EGII纖維素酶處理含纖維素的織物的方法。本發(fā)明的改良EGII纖維素酶組合物的使用提供新的以及出人意料的結(jié)果,其相對于現(xiàn)有技術(shù)的纖維素酶處理而言引起相對高的磨損水平同時保持相當(dāng)水平的回染。由于磨損水平起到特定纖維素酶處理技術(shù)(例如石洗或衣物洗滌)的質(zhì)量以及效力指標(biāo)的作用,本發(fā)明的使用提供了令人驚奇的高質(zhì)量的紡織品處理組合物。在衣物洗滌的上下文中,磨損有時被稱作顏色凈化、脫細(xì)毛或生物拋光。本發(fā)明具體設(shè)想改良的EGII纖維素酶單獨或與其它纖維素酶組分組合使用以實現(xiàn)優(yōu)異的磨損(相比于富含的EGII纖維素酶)。此外,設(shè)想缺少結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然發(fā)生的纖維素酶在本發(fā)明范圍內(nèi)。也考慮本發(fā)明的方法將對于被處理的含纖維素織物提供其它增強,包括織物觸感和/或外觀的改進。A.用改良的EGII纖維素酶組合物進行紡織品處理的方法根據(jù)本發(fā)明,上面所述的改良EGII纖維素酶組合物可用于紡織品的制造,例如抗起球、石洗等。優(yōu)選地,本發(fā)明的處理組合物包括含有有效量的改良EGII纖維素酶以及其他可選成分(包括例如緩沖劑、表面活性劑和煮練劑)的水溶液。衣服制造期間的典型抗起球處理步驟中,將織物或衣服、水、緩沖劑、洗滌劑和酶加入到水平或垂直轉(zhuǎn)鼓噴射式染色機、洗滌機或其他對織物提供攪拌和剪切的設(shè)備。處理通常使用下面范圍的條件pH3.5-6.0(液比1:2-1:100溫度30-70。C酶劑量50,000-500,000CMCU時間10-60分鐘織物速度10-200m/分鐘備選條件包括于pH4至6.5下,在35°C至60°C下15至120分鐘。液體與織物比通常在按重量計2.5:1和20:1之間。處理條件的優(yōu)化在技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。根據(jù)Ghose(1987)的纖維素酶測定法,加入的纖維素酶的量通常相當(dāng)于每千克織物約l,OOO至200,000CMC單位的纖維素酶活性。處理后,通常通過將溶液加熱至70。C持續(xù)IO分鐘而破壞該酶。從機器中取出織物、干燥、并制成巻,有時在另外的染色之后制成巻。進一步的概述見于美國專利號5,232,851,第一欄。特別設(shè)想的制劑可包括范圍在0.03-0.20%的proxel(1,2-苯并異噻唑啉)作為防腐劑或氧化劑。特別設(shè)想的制劑可包括范圍在10-35%的丙三醇。對于衣物洗滌步驟期間的抗起球處理,洗滌劑混合物中包括纖維素酶和許多其它成分。其它成分可包括其他酶,例如蛋白酶、脂肪酶和其它纖維素酶,以及表面活性劑、緩沖劑、助洗劑、漂白劑、防再沉積劑、焚光增白劑、抗氧化劑(例如proxel)和增溶劑。本領(lǐng)域已知通過在浮石存在下洗滌由該織物制成的牛仔布或牛仔褲以提供該織物顏色的期望的局部發(fā)亮或通過酶促(尤其是用纖維素酶)處理織物,染色了的織物(尤其是牛仔布織物或牛仔褲)中的"石洗"外表是可能的。用本發(fā)明的改良EGII處理可單獨進行(如美國專利號4,832,864所公開)、與比常規(guī)方法所需量更少的浮石一起,或者與珍珠巖一起(例如WO95/09225所公開)進行。有效量的改良EGII纖維素酶組合物是足夠用于其想要的目的的改良EGII纖維素酶的濃度。因此,根據(jù)本發(fā)明處理組合物中改良EGII纖維素酶的"有效量,,是將提供期望的處理(例如石洗、抗起球、軟化等)的量。所用的改良EGII纖維素酶的量也依賴于所用儀器、所用工藝參數(shù)(改良的EGII纖維素酶溶液的溫度、在纖維素酶溶液中的暴露時間等)以及纖維素酶活性(例如相比于較低活性的纖維素酶組合物,使用更有活性的纖維素酶組合物的特定溶液將需要較低濃度的纖維素酶)。熟練技術(shù)人員根據(jù)上面的因素以及期望的結(jié)果可以容易地確定改良EGII纖維素酶的準(zhǔn)確濃度。優(yōu)選地,改良EGII纖維素酶組合物以1-1000ppm,更優(yōu)選10-400ppm以及最優(yōu)選20-100ppm總蛋白質(zhì)的濃度存在。任選地,處理組合物中使用緩沖劑以便緩沖劑的濃度為足以維持溶液pH為所用改良EGII纖維素酶展示活性的范圍內(nèi),而這反過來取決于所用改良EGII纖維素酶的性質(zhì)。所用緩沖劑的準(zhǔn)確濃度將取決于若干因素,它們是熟練技術(shù)人員可以容易地考慮的。例如,優(yōu)選實施方式中,選擇緩沖劑以及緩沖劑濃度以便保持最終的改良EGII纖維素酶溶液的pH在最佳纖維素酶活性所需的pH范圍內(nèi)。優(yōu)選地,石洗組合物中的緩沖劑濃度為約0.001N或更大。適合的緩沖劑包括例如檸檬酸鹽和乙酸鹽。除了改良的EGII纖維素酶和緩沖劑,處理組合物可任選地含有表面活性劑。優(yōu)選地,表面活性劑以在稀釋的洗滌介質(zhì)中大于100ppm的濃度存在,優(yōu)選約200-15,000ppm。適合的表面活性劑包括任何與纖維素酶和織物相容的表面活性劑,包括例如陰離子型、非離子型和兩性表面活性劑。適合用在此的陰離子表面活性劑包括線性或分支的烷基苯磺酸鹽;具有線性或分支的烷基或烯基的烷基或烯基醚硫酸鹽;烷基或烯基硫酸鹽;鏈烯磺酸鹽;烷基磺酸鹽等。對于陰離子表面活性劑適合的相反離子包括堿金屬離子例如鈉和鉀;堿土金屬離子例如鉤和鎂;銨離子以及具有碳數(shù)為2或3的1-3個烷醇基團的烷醇胺。兩性表面活性劑包括季銨磺酸鹽,以及甜菜堿型兩性表面活性劑。此類兩性表面活性劑在同一分子中具有正和負(fù)電荷基團。非離子表面活性劑通常包括聚氧化烯醚,以及高級脂肪酸烷醇酰胺或其烯化氧加合物,以及脂肪酸甘油單酯。也可以以本領(lǐng)域已知的方式使用表面活性劑的混合物。優(yōu)選實施方式中,可以制備濃縮的處理組合物用于在此所述方法。該濃縮物將含有濃縮量的上面所述的改良EGII纖維素酶組合物、緩沖劑和表面活性劑,優(yōu)選在水溶液中。當(dāng)如此配制時,可以用水容易地稀釋該處理濃縮物以迅速且準(zhǔn)確地制備根據(jù)本發(fā)明并具有這些添加劑必需濃度的處理組合物。優(yōu)選地,該濃縮物將包括約0.1至約50重量百分?jǐn)?shù)的上述真菌纖維素酶組合物(蛋白質(zhì));約0.1至約80重量百分?jǐn)?shù)緩沖劑;約0至約50重量百分?jǐn)?shù)表面活性劑;余量為水。當(dāng)配制水性濃縮物時,可以稀釋這些濃縮物以達到上面指出的改良EGII纖維素酶溶液中必需的組分濃度。容易顯見的是,該處理濃縮物將允許溫和配制改良EGII纖維素酶溶液以及允許該濃縮物向?qū)⒁褂盟奈恢玫撵`活運輸。處理濃縮物可以是任何本領(lǐng)域公知的形式,例如液體劑、乳劑、凝膠劑或糊劑。此類形式是技術(shù)人員z^知的。當(dāng)使用固體處理濃縮物,纖維素酶組合物可為粒劑、粉劑、團塊或固體盤。當(dāng)使用粒劑時,優(yōu)選配制該粒劑以含有纖維素酶保護劑。參見,例如WO91/17235且標(biāo)題為"GRANULESCONTAININGBOTHANENZYMEANDANENZYMEPROTECTINGAGENTANDDETERGENTCOMPOSITIONSCONTAININGSUCHGRANULES",該申請在此通過整體引用作為參考。同樣,可以配制該粒劑以含有降低粒劑向洗滌介質(zhì)的溶解速率的物質(zhì)。此類物質(zhì)和粒劑公開于美國專利號5,254,283,將其完整并入本文作為參考。需要時,也可以與本發(fā)明的處理組合物一起使用其它物質(zhì)或者將其他物質(zhì)置于該處理組合物中使用,所述物質(zhì)包括石頭、浮石、填料、溶劑、酶活化劑和其他抗再沉積劑。含纖維素的織物與含有效量的改良EGII纖維素酶或衍生物的處理組合物接觸,并因此將該改良的EGII纖維素酶帶至織物附近。例如,如果處理組合物是水性溶液,織物可直接浸入該溶液。類似地,處理組合物是濃縮物時,用含纖維素的織物將該濃縮物稀釋至水浴。處理組合物是固體形式時,例如預(yù)洗凝膠劑或固體棒,可通過直接將該組合物應(yīng)用至該織物或洗滌液而接觸該處理組合物。在對于允許酶促作用以賦予含纖維素織物石洗外觀有效的條件下,用處理溶液溫育含纖維素織物。例如,石洗期間,可調(diào)節(jié)pH、液比、溫度和反應(yīng)時間來優(yōu)化石洗組合物作用的條件。"有效條件,,必然指允許改良EGII纖維素酶與含纖維素織物有效反應(yīng)的pH、液比和溫度。用于改良EGII纖維素的反應(yīng)條件,以及因此對于本發(fā)明處理組合物有效的條件與用于其他類似纖維素酶的公知方法基本上類似。因此,用包括根據(jù)本發(fā)明的改良EGII的處理組合物對于處理含纖維素織物有效的條件與使用野生型纖維素酶組合物的現(xiàn)有技術(shù)的那些條件基本上相似。因此,最大化使用根據(jù)本發(fā)明的處理組合物的條件在本領(lǐng)技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。處理期間在此使用的液比通常為足以在纖維織物中實現(xiàn)期望效果的量并且取決于所用方法。優(yōu)選地,液比為約3:1至約100:1;更優(yōu)選4:1至約50:1,和最優(yōu)選約6:1至約20:1。用本發(fā)明處理組合物處理期間的反應(yīng)溫度由兩種竟?fàn)幰蛩乜刂啤J紫?,較高溫度通常對應(yīng)于增強的反應(yīng)動力學(xué)(即更快反應(yīng)),相比于較低溫度下所需的反應(yīng)時間,較高溫度允許減少的反應(yīng)時間。因此,反應(yīng)溫度通常至少約10°C和更高。其次,纖維素酶是在超過給定反應(yīng)溫度時喪失活性的蛋白質(zhì),該溫度取決于所用纖維素酶的性質(zhì)。因此,如果允許反應(yīng)溫度太高,那么纖維素活性作為纖維素酶的變性結(jié)果而喪失。結(jié)果是,在此所用的最大反應(yīng)溫度通常為約65。C。鑒于上述,反應(yīng)溫度通常為約30。C至約65。C;優(yōu)選約35°C至約60°C;和更優(yōu)選約35°C至約55°C。反應(yīng)時間取決于發(fā)生處理時的特定條件。例如pH、溫度以及改良EGII纖維素酶的濃度都將影響最佳反應(yīng)時間。通常反應(yīng)時間為約5分鐘至約5小時,且優(yōu)選約10分鐘至約3小時,及更優(yōu)選約20分鐘至約1小時。使用根據(jù)本發(fā)明的改良EGII纖維素酶組合物(即處理組合物)在上述方法中處理的含纖維素織物相比于用富含內(nèi)切EGII纖維素酶組合物以相同方式處理的相同含纖維素織物而言,顯示出降低的染料再沉積、增強的抗起球和增強的磨損。B.用包含改良EGII纖維素酶的洗滌劑組合物處理含纖維素織物的方法根據(jù)本發(fā)明,上述改良的EGII纖維素酶組合物可用作洗滌劑組合物。根據(jù)本發(fā)明的洗滌劑組合物作為預(yù)洗組合物、預(yù)浸組合物或在常規(guī)洗滌循環(huán)中用于洗滌劑清潔是有用的。優(yōu)選地,本發(fā)明的洗滌劑組合物包括有效量的改良EGH纖維素酶,以及表面活性劑,并且任選地包括下述其他成分。本發(fā)明洗滌劑組合物中使用的改良EGII纖維素酶的有效量是足以賦予含纖維素酶織物提高的磨損的量。優(yōu)選地,所用改良EGII纖維素酶是以按洗滌劑重量百分?jǐn)?shù)計約0.001%至約25%的濃度,更優(yōu)選約0.02%至約10%。優(yōu)選地選擇洗滌劑組合物中所用的改良EGII纖維素酶的具體濃度以便在稀釋到洗滌介質(zhì)時,改良的EGII纖維素酶的濃度在約0.1至約1000ppm,優(yōu)選約0.2ppm至約500ppm,和最優(yōu)選約0.5ppm至約250ppm總蛋白質(zhì)的范圍。因此,洗滌劑組合物中所用的改良EGII纖維素酶的具體量將取決于將該洗滌劑加入水中以便形成洗滌溶液時該洗滌劑被稀釋的程度。在該改良EGII纖維素酶較低濃度下(即改良EGII酶濃度低于20ppm),相比于現(xiàn)有技術(shù)組合物,在反復(fù)洗滌后,降低的回染或再沉積且具有等同表面纖維磨損將變得顯而易見。較高濃度下(即改良EGII纖維素酶濃度大于40ppm),在單次洗滌后,降低的回染且具有等同表面纖維去除將變得顯而易見。本發(fā)明洗滌劑組合物可為任何本領(lǐng)域已知的形式,例如作為液體稀釋劑、粒劑、乳劑、凝膠劑或糊劑。此類形式是熟練技術(shù)人員公知的。當(dāng)使用固態(tài)洗滌劑組合物時,優(yōu)選將改良的EGII纖維素酶配制為粒劑。優(yōu)選地,可以配制粒劑以額外含有纖維素酶保護劑。參見例如,WO91/17235,標(biāo)題為"GRANULESCONTAININGBOTHANENZYMEANDANENZYMEPROTECTINGAGENTANDDETERGENTCOMPOSITIONSCONTAININGSUCHGRANULES"。類似地,可以配制粒劑以含有降低該粒劑溶解到洗滌介質(zhì)中的速率的物質(zhì)。此類物質(zhì)和粒劑公開于美國專利號5,254,283,將其完整并入本文作為參考。本發(fā)明改良EGII可用于配制多種洗滌劑組合物。許多已知的化合物適合用于包含本發(fā)明改良EGII的組合物。這些包括非離子、陰離子、陽離子或兩性離子洗滌劑,如BarryJ.Anderson的美國專利號4,404,128和JiriFlora等人的美國專利號4,261,868所/>開。適合的洗滌劑制劑7>開于美國專利號5,204,015的實施例7中。本領(lǐng)域熟知可以用作洗劑組合物的不同制劑。除了典型洗滌劑組合物,容易理解本發(fā)明的改良EGII可用于天然或野生型纖維素酶所用的任何目的。本發(fā)明的變體可在洗滌劑組合物中包括提高的性能(相比于野生型)。如在此所使用,洗滌劑中增強的性能定義為增加某些g感染色劑的清潔,如在標(biāo)準(zhǔn)洗滌循環(huán)后常規(guī)評估所確定??梢詫⒈景l(fā)明改良的EGII配制成具有pH在6.5和12.0之間,在按重量計約0.01%至約5%(優(yōu)選0.1%至0.5%)水平的已知的粉末和液體洗滌劑。這些洗滌劑組合物也可以包括其他酶,例如已知的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶或內(nèi)切糖苷酶,以及助洗劑和穩(wěn)定劑。本發(fā)明改良EGII向常規(guī)洗滌劑組合物的添加沒有產(chǎn)生任何特殊的使用限制。換言之,任何適于洗滌劑的溫度和pH也適于本發(fā)明的組合物,只要pH在上述范圍內(nèi),以及溫度低于所述改良EGII的變性溫度。此夕卜,本發(fā)明的改良EGII可以用于洗滌劑組合物而不用洗滌劑,再次單獨使用或者與助洗劑和穩(wěn)定劑組合使用。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明改良EGII的洗滌劑組合物。洗滌劑組合物可另外含有洗滌劑組合物中通常使用的添加劑。這些可以選自但不限于漂白劑、表面活性劑、助洗劑、酶和漂白催化劑。參見例如,美國專利6268169。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于顯而易見的是哪種添加劑適于包括在該組合物中。在此提供的列表不意味著窮舉并且僅僅應(yīng)被當(dāng)作適當(dāng)添加劑的實例。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也易于顯而易見的是只使用與該組合物中的酶和其他組分相容的那些添加劑,例如表面活性劑。當(dāng)存在時,洗滌劑組合物中存在的添加劑的量為約0.01%至約99.9%,優(yōu)選約1%至約95%,更優(yōu)選約1%至約80%。動物飼料動物伺料中可以包括本發(fā)明的改良EGII,例如動物飼料添加劑的一部分,如美國專利號5,612,055;5,314,692;和5,147,642所述。紙漿和紙應(yīng)用造紙工業(yè)中,本發(fā)明的改良EGII可有益地應(yīng)用于,例如,如下對于剝皮用改良EGII預(yù)處理可在機械鼓中剝皮前降解形成層,導(dǎo)致有益的節(jié)能。對于纖維分離由于纖維素酶在纖維間表面的水解效應(yīng),在精煉或錘打之前,用改良EGII處理含纖維素纖維物質(zhì)可導(dǎo)致減少的能量消耗。改良EGII的使用相比于使用已知酶可導(dǎo)致提高的節(jié)能,因為相信本發(fā)明酶組合物可具有較高的滲透纖維壁的能力。對于纖維改良,即纖維特性改進,其中需要穿過纖維壁的部分水解(需要較深滲透酶(例如,以便使粗纖維更柔軟))。纖維的深處理目前對于高產(chǎn)率紙漿(例如機械紙漿或再生紙漿的混合物)是不可能的。這歸因于纖維壁結(jié)構(gòu)的性質(zhì),該結(jié)構(gòu)由于纖維壁的孔基質(zhì)的物理限制而阻止酶分子通過。設(shè)想本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶能夠滲透入纖維壁。對于排水改進可通過用水解酶(例如纖維素酶)處理紙漿來提高造紙紙漿的排水能力。本發(fā)明改良EGII的使用可更有效,例如導(dǎo)致在細(xì)級分中強烈水合的微纖絲(由纖維殘渣組成)的更高程度的松散維管束,這通過阻斷纖維間的以及造紙機的金屬絲網(wǎng)中的中空空間而限制排水速率。當(dāng)對紙漿進行纖維素酶處理時加拿大標(biāo)準(zhǔn)游離度(CSF)增加而Sch叩per-Riegler排水指數(shù)降低,參見例如美國專利號4,923,565和4,613,406。對于纖維間結(jié)合。紙漿生產(chǎn)中應(yīng)用水解酶以提高纖維間結(jié)合。該酶漂洗纖維表面雜質(zhì),例如纖維素碎屑,從而提高附著纖維壁的暴露纖維素的面積,因而提高纖維-纖維氫鍵能力。這一工藝也稱作dehornification。用含纖維素的酶制劑生產(chǎn)的紙和板可具有提高的強度和降低的克重,更平滑的表面以及提高的適印性。對于酶促脫墨。已知在使用水解酶(例如纖維素酶)制漿期間再生紙的部分水解促進墨顆粒的除去以及聚集。本發(fā)明改良EGII的使用由于酶分子向纖維壁的纖絲基質(zhì)更好的滲透因而軟化該表面,借此油墨顆粒有效地釋放而給予油墨從表面結(jié)構(gòu)更加有效的釋放。釋放的油墨顆粒的聚集也提高,這是由于發(fā)現(xiàn)附著源自纖維的油墨顆粒的纖維素片段被更有效水解。例如,可才安照WO91/14819、WO91/14822、WO92/17573和WO92/18688所述進行木質(zhì)纖維素紙漿的處理。植物材料的降解另一實施方式中,本發(fā)明涉及才艮據(jù)本發(fā)明的改良EGII和/或酶組合物降解植物材料,例如細(xì)胞壁的用途。設(shè)想本發(fā)明的改良EGII和/或酶組合物可用于制備酒、果汁或蔬菜汁以增加產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明的改良EGII也可用于多種植物細(xì)胞壁衍生材料或廢料,例如農(nóng)業(yè)殘留物如麥秸、玉米棒、全玉米植物、堅果殼、草、蔬菜殼、豆莢、廢谷物、甜菜漿等。可降解植物材料以便改進不同種類的工藝、促進其他組分的純化或提取如從谷物純化p-葡聚糖或p-葡聚糖寡聚物、提高飼料價值、減少水結(jié)合能力、提高廢水工廠的降解力、提高諸如草和玉米向青貯祠料的轉(zhuǎn)變,等。下面的實驗公開內(nèi)容中,使用下面的縮寫叫(當(dāng)量);M(摩爾濃度);HM(微摩爾濃度);N(正常);mol(摩爾);mmol(毫摩);nmol(微摩);nmol(納摩);g(克);mg(毫克);kg(千克);ng(微克);L(升);ml(毫升);pl(微升);cm(厘米);mm(毫米);nm(微米);nm(納米);。C.(攝氏度);h(小時);min(分鐘);sec(秒);msec(毫秒);Ci(居里);mCi(毫居里);pCi(微居里);TLC(薄層層析);Ts(曱苯磺?;?;Bn(苯甲基);Ph(苯基);Ms(曱磺?;?;Et(乙基),Me(甲基)。實施例在下面實施例中進一步詳細(xì)描述本發(fā)明,這些實施例不以任何方式旨在限制本發(fā)明所主張的范圍。附圖意在理解為說明書和本發(fā)明說明的整體的部分。在此引用的所有參考文獻通過具體引用作為參考以如全部在此所述。提供下面的實施例以說明但不限于所要求保護的發(fā)明。實施例1EGII表達這一實施例闡述宿主細(xì)胞的構(gòu)建以及改良EGII纖維酶的表達生物整理和牛仔布洗滌應(yīng)用需要低水解纖維素活性的菌林。構(gòu)建缺失了主要纖維素酶中一些或全部的新菌林。關(guān)于缺失期望纖維素酶(例如CBHI、CBHII、EGI、和EGII)的技術(shù)參見美國專利5,472,864以及WO92/17574。所用宿主菌林為里氏木霉菌林RL-P37。該菌林的來源和特性早先已經(jīng)/^開(Sheir-Neiss和Montenecourt,1984)。作為來自野生型菌林(QM6a)的若干突變步驟的結(jié)果,獲得了過量生產(chǎn)纖維素酶的菌林。對于里氏木霉Eg2A,通過使用分子遺傳學(xué)技術(shù)缺失或破壞使編碼CBHIl、CBHII的序列失活。對于里氏木霉Eg2B,通過使用分子遺傳學(xué)技術(shù)缺失或破壞使編碼CBHIl、CBHII、EGI和EGII的序列失活。用已經(jīng)置于獲自CBHI編碼基因的高效啟動子控制下的、圖2示出的單拷貝的核苷酸序列轉(zhuǎn)化里氏木霉EG2A和B。EGII表達盒的構(gòu)建使用PCR以根據(jù)Saloheimo,M.等人,1988年公開的eglII核苷紗列(含有egll基因特異序列)設(shè)計引物來分離eglII基因。將限制性位點加入eglII以允許插入到栽體pTrex3(參見美國專利6426410)。使用正向引物,加入SacII位點。也加入CBH1啟動子的最后IO個核苷酸(緊鄰在CBH1信號序列前),因為這可以增加表達。使用反向引物,加入AscI位點。正向引物和反向引物的序列示于下面36egH/ptrex3F:5丄ccgcgg乂^ctgcgcatc^i^tgaacaagtccgtggctccat乂3'(38.匿)~^~^^-^---_-^SacIICBH1啟動子eg/IIeglI/ptrex3R:5^'ggc、,cgcc^^:actttcttgcgagacacgagctga^y3'(35-mer)AsciPCR混合物含有下面組分正向引物(IOjiM)1nL;反向引物(IO^M)1pi;DNA(500ng/pL)1dNTPs(lOmM)110XHerculase緩沖液;5nLHerculaseDNA聚合酶;0.5pL(Stratagene目錄#60026)以及去離子水至總體積50pL。PCR方案如下在94。C初始變性60sec,分別在94°C30sec;50。C30see;72°C卯sec變性、退火和延伸23個循環(huán),和在72°C5分鐘的最終延伸步驟。通過1%瓊脂糖中電泳分析PCR片段。使用Gel-ExtractionPurificationKit(Qiagene目錄No.28706)分離期望大小的片段。將PCR片段克隆到pTrex3,形成pEG2/pTrex3(參見圖5和6),并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5aMaxEfficiency細(xì)胞(Invitrogen目錄號18258012)。測定了插入的DNA的核苷酸序列(參見圖2)。pEG2/pTrex3具有下面的序列,其中大寫字母表示pTrex3質(zhì)粒核苷酸,小寫字母表示EG2核苷酸AAGCTTACTAGTACTTCTCGAGCTCTGTACCGTATCGATGGCGCCAGCTGCAGGCGGCCGCGTGGAATTCTCACGGTGAATGTAGGCCTTCTCAAGCACCCCCAACCTCCATTACGCCTCGTGAGTCATGGCACTGTTCTCAAATAGATTCCAGAGCTGAAGGTCGCACAACCGCATGATAAAGCACGTGGCTCACCGAAAAGCAAGATGAACCTGGATACATCCATCATCACGCACGACCTCGTATTCGCCCTAAACCGAAGTGCGTGGTTTCGGTATACTGCGTGTGTCTTCTCTAGGCTAGTGTTGAATTGTTTGTGTTGGAGTCCGCTCTGGAGAATGGTGGACTAACGACTACCGAATAGTGATCCTGAGAAGGGGGGTTTGGAGCATCAAACAAAGAACGAAGACGCCTCTTTTCGGTGAAGAACTGGATACTTGTTGTGTCTTAAGAGGCCAGAGACAATCTATTCAAACACCCAAGAACCTGTGGGGTATATATCTAGAGTTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATCATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCATCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTAGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAACCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTTACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATATAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTTCAACCGCGGACTGCGCATCatgaacaagtgcagcgtccatactatatggcggcgccgctccagtgtggaggtattggttggagcggacccagcttgttcgaccctcaatccttattatgactactatcaccacttcgacccggccaccacagggctacctcaacaagctcatcaactccgatttgccggcgttaacatcgcgggttttgtgagtacccttgtttcctggtgttgctggcATGTCCGGTCGCGACGTACG50CCTGCAGCCACTTGCAGTCC100TTGTAGGGTAGGAATTGTCA150CCCCATAGAGTTCCCAATCA200GGGGAGAAGTTGACTTCCGC250ATAGGGTCGGCAACGGCAAA300TTTGCGATCTAACATCCAGG350CACTTTGATCTGCTGGTAAA400TAAATCTACACGTGGGCCCC450TGCCATTCTTTTCCCTTCCT500AGCTGTAACTACCTCTGAAT550TGCACCTGCATCATGTATAT600CAATGTGGGACTTTGATGGT650GCAAAGTTTTGTTTCGGCTA700CTGTGTATTTTTGTGGCAAC750AAGCTTGCTCTTTTGAGCTA800GTGAAGTCGGTAATCCCGCT850CCGAAGCTGCTGCGAACCCG900CGAGCGGCTAAATTAGCATG950GTTGAATCATGGCGTTCCAT1000AGCAGGCACTCATTCCCGAA1050ACCGGAATAATATAATAGGC1100GCAGGGGTACTGAGCTTGGA1150ACCTTTGGCGTTTCCCTGAT1200TTAACCCAGACTGACCGGAC1250TCATTGCGATGTGTAATTTG1300CCGAATGTAGGATTGTTATC1350TCTGTGTCGGGCAGGACACG1400GATAGCAGTGTCTAGTAGCA1450AAAATACAAACCAATGGCTA1500ATATACCAGCGGCTAATAAT1550TTTGCCAACGGCTTGTGGGG1600CCACGTTTGTTTCTTCACTC1650GGGTCGCTTGTTTGTTCCGG1700CTGACTCGGAGCGTTTTGCA1750AAATGTTGACATTCAAGGAG1800GTAAGGAGGTTTGTCTGCCG1850TGAAGTGGTCCATATTGAAA1900TGAGTTGAAACTGCCTAAGA1950TGTACATGTTTGTGCTCCGG2000ACTGCTGCCTTTACCAAGCA2050GGGCCACTGCATGGTTTCGA2100GCCGATAAAGATAGCCTCAT2150CGAATGTGTATATATAAAGG2200CCATCTACTCATCAACTCAG2250GAGGCACAGAAACCCAATAG2300ccgtggctccattgctgctt2350gcscsgcsgsctgtctgggg2400tacgaattgtgctcctggct2450cgcaatgtattccgggagcc2500tccggtccaaCC3CC3CC3C2550acccacgagctctggggtcc2600actttggctgtsccacagag2650tgaaaagttgggcgggtata2700cagcgatgcggeictgcaagaacaccgccggggtggtaagcggcggtgttttgtacaactactgagaattaatggaagtcttgttacagtggtttatcctccgttgaagaacttcaccggccatcggccagatgcagcacttcgtcaacgagcttacctgtcggatggcagtacctcgtcacttgattccacgagcatttccaagtatgatgtctctgggcgcatactgcatcgtcgacatacggtgggatcattggtcagggcggccctactttggtcgcagttggcatcaaagtacgcacggcatcatgaatgagccccacgacgtgaacggtccaagaggttgtaaccgcaatccgcattcatctctttgcctggaaatgattggcaacgatggcagtgcagccgccctgtctcaagtcaacgaatctgatttttgacgtgcacaaatggtactcacgccgaatgtactacaaataacgcttgccacttggctccgacagaacaatcgccggtggtggcaacgttcagtcctgcataccaatatctcaaccagaactcagatgtctattgccggatcatjttgatagcacgtatgtcctgtggtaactcatggacggacacatccttggaagtagGGCGCGCCGCGCGCCAGCTCCGTGAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAACAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCATAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAACGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTAGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACACATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCtccgccaccatcaagatgtg2750cctgacagctcactcaggaa2800gcacttgcgttacctcgaag2850tcaaacaactaccccgatgg2900cgacgggatgactattttcc2950gggcggcaat3000cagcttgttcaggggtgcct3050ccacaattatgctcgatgga3100ctaatgctcaattcacgagc3150tctcagtcgagggtgtggtt3200C3tC33C3CCtgggctgcca3250acgctggtgctacgtcgcaa3300tctgctggggctttcatatc3350cacgaacccggatgggtcaa3400acttggactcagacaactcc3450attgacggcgccttttctcc3500ccaggctatcctgscagsaa3550aagacatgtgccagcaaatc3600cttggctatgttggttgggg3650ccgactggca3700tcagctcgtgtctcgcaaga3750CGAAAGCCTGACGCACCGGT3800GGCGGGAGCTACATGGCCCC3850GACCCTTTTCAAATATACGG3900GCTTGGTATTGCGATGTTGT3950CAAAACGATTCCTTAGTAGC4000AGAGGAAATTAAAAAAAAAA4050GAATCGCCGCTCTTCGTGTA4100CCCGCTGGAGAGCATCCTGA4150GCAGGTGTTGCTAGGGAGCG4200GTTGATATATATGTATGTTT4250GTTCGCCCTCGCTGCTTGTG4300ACTCCCATCTTTCAGTAAAG4350ATTTAAACTCGTTAGCATGG4400CCATGGTTCTGCAGCTTTCC4450ATCACCAGCTAGGCACCAGC4500CATCCGCTCCCCCGGGATCA4550AGAAGCCTACATAACCCTCA4600AACATCCTGACTATAAGCTA4650GGCCGCTGATAAGCGCGCCC4700AAGTCCAGACGCTGCCTGCG4750TCGGGGATCCTTTCAGAGGC4800AGATCTTGTGTCCAAGCTGG4850CGCTAGCATTCTGTAAACGG4900CCTCTACCTCTCAGGGAGAT4950CTGACGCTGGCTTCTGTGCA5000CGCCGCTCTCGCGCAGGCAA5050AGAGACCCGTTGGTCCACTC5100CTTCGAGTCAAGGTACACCG5150GTCAGCTAACATATGCCACC5200CATGGCTAAACAAGTACGAC5250CGCAAAGCCGGTGCCGTCTT5300GATGGTCTGCGAGACAGTCA5350GCAACAAGAACTGGTCGTGC5400GTTGGGATTCGTGGTGGCGT545039CATCGGTGTAGGAACGGATATCAACTTCCTGTACGGTCTAAAGATGGCGAACAGCATGGAGCCGATTACGCACTCTGTTGCCTGCTCTATACCAGGCCTCTATACGAGACCGGCAGTCACACCAAATCCGTCCTCGGTCACCCCATGCCCTGGCGCCAGTAGAACGGCGGGCTCAATATCCCACACCCTCCTATCCTGCGCAAAGCCGGTCACACCGTGAGCCACGATCTCATCTCCCATATGCGCGATATCAGTGCATCCCTACTGAACCCGAACATCACGCATCTCCAGAAGTGGAATGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGTACGCCTACCGCTGCGGTACCCTCTGTGATCAACCTGCTGTTTGCGGATAAGAACATCGATGAGCTTGATGCCCTCGTGCGGGCACCGGTTGCAGTGCAGACGTTGGCGATTGCAGAGGATCCATAGCTAATAAGTGTCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAAAAAACCTGCCGTAGAACAAGGAAGAATCCCTTCAGGGCACAAGTGTCTCTCACCAAAGGAAAGCCCAGAATATCGATTATAATTACCTCAGGTCGACGTCATAGCTGTTTCCTGTGTACATACGAGCCGGAAGCATAAGCTAACTCACATTAATTGCAAACCTGTCGTGCCAGCTGCGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGAATACGGTTATCCACAGAATCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCTTTTTCCATAGGCTCCGCCCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGGGATACCTGTCCGCCTTTCTCTCACGCTGTAGGTATCTCAGCTGTGTGCACGAACCCCCCAACTATCGTCTTGAGTCCAAAGCAGCCACTGGTAACAGGACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGTTTGGTATCTGCGCTCTGCTTAGCTCTTGATCCGGCAAACTTTGCAAGCAGCAGATTACGTTGATCTTTTCTACGGGGTCAGGGATTTTGGTCATGAGATTAAATTAAAAATGAAGTTTTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTGTCTATTTCGTTCATCCACTACGATACGGGAGGGCTTATCGGTGGCTCGATTCGAGTGAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGGGTCAGGAGACGGTGCACAAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTGATGAAGTATGTTAGACCTGGAGCCATGGAAATACGACTCCGAGTCGGACATTATTGCCGGCTACTACAACTTCGACGGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCCCGTGGACGCCATACAAGATCTACGCGGCTGACGGCAGCGGCGAGCCGGCGATTCCAAAAGCTGTTAACATGAACGAGTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAGGAACTGGACGCCATCAGGCATGACCAGTTCCGGTACGATTTCACGAGCGTGGTTGTTAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGAAGAGTATGATCCGGAGGTTATCGGACGGAGACTCAGAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAGATAGCAATTTGCACAAGAAAAGTGACCATGCCATGCTACCGAAGAGATATGACACGCTTTTGCGTTTCCAGTCTAGACATGGGTTATATCTCAAATGTGCGCGCGCAGATCCATATATAGTCCCATGGCCATTCGAATTGAAATTGTTATCCGCTCACAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTATTAATGAATCGGCCAACGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAGGGGATAACGCAGGAAAGAGGAACCGTAAAAAGGCCGCCCCTGACGAGCATCACAAAACGACAGGACTATAAAGATACCGCTCTCCTGTTCCGACCCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCCCGGTAAGACACGACTTATTTAGCAGAGCGAGGTATGTACCTAACTACGGCTACACTAGGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAACCACCGCTGGTAGCGGTCGCAGAAAAAAAGGATCTCATGACGCTCAGTGGAACGAAATATCAAAAAGGATCTTCACCAAATCAA丁CTAAAGTATATACTTAATCAGTGAGGCACCTATAGTTGCCTGACTCCCCGTCCCATCTGGCCCCAGTGCTGCCCGGCCGCGT5500GCCGTATGCA5550GCGTTGTCGG5600TCCTTCTTTT5650TTTTATACTA5700CCGCCTCTTC5750CCAAGGTCAT5800TCCAAGATCA5850CAATGTCCTT5900CCGCACTCGC5950CACGATTTCG6000CGCCGACGTA6050ATATCAAAGA6100CTCTGGGACA6150GAAATGGCGG6200TCGCGCCGAT6250TATGGGTATG6300TCCGGTTACC6350AGGCGGTTAG6400GCGTACCATG6450TGAAGAGAGG6500ATGTGGTGAC6550ATCAATACCA6600GAAAGAGCAG6650CCATCTCTCA6700CGTATAACGG6750ATCTAAGGAT6800GGGCCCGGGT6850CGTAATCATG6900ATTCCACACA6950CTAATGAGTG7000TCCAGTCGGG7050GCGGGGAGAG7100TGACTCGCTG7150CAAAGGCGGT7200AACATGTGAG7250GTTGCTGGCG7300ATCGACGCTC7350CAGGCGTTTC7400GCCGCTTACC7450TTTCTCATAG7500TCCAAGCTGG7550CTTATCCGGT7600CGCCACTGGC7650GGCGGTGCTA7700AAGAACAGTA7750AAAGAGTTGG7800GGTTTTTTTG7850AGAAGATCCT7900ACTCACGTTA7950TAGATCCTTT8000TGAGTAAACT8050TCTCAGCGAT8100GTGTAGATAA8150AATGATACCG8200CGAGACCCACCGGAAGGGCCAGTCTATTAAAGTTTGCGCAGTCGTTTGGTTTACATGATCCCGATCGTTGGGCAGCACTGCTGTGACTGGCGACCGAGTTTAGCAGAACTAACTCTCAAGCGTGCACCCAGTGAGCAAAACACGGAAATGATTTATCAGGGAAAAATAAACTGACGTCTACGTATCACGACCTCTGACACATGCCGGGAGTGTCGGGGCTGCACCATAAATTTGTTAAATCCTTATAAATTTGGAACAAGGAAAAACCGTTCAAGTTTTTAGGGAGCCCCGAAAGGAAGGGTAGCGGTCAGCTACAGGGCGCACAGATGCGGCTGCGCAACGCCAGCTGGGCCAGGGTTTGCTCACCGGCGAGCGCAGAATTGTTGCCGGACGTTGTTGCATGGCTTCATCCCCATGTTGTCAGAAGTAACATAATTCTCTGAGTACTCAGCTCTTGCCCTTAAAAGTGCGATCTTACCGACTGATCTTCACAGGAAGGCTTGAATACTCGTTATTGTCTCAAATAGGGGAGAAACCATTGGCCCTTTCGATGCAGCTCCCAGACAAGCCGGCTTAACTAATTGTAAACGCAGCTCATTTCAAAAGAATAAGTCCACTATCTATCAGGGCTGGGGTCGAGCGATTTAGAGGAAGAAAGCGCGCTGCGCGTGCGTACTATGGTAAGGAGAACTGTTGGGAACGAAAGGGGGTCCCAGTCACTCCAGATTTAGTGGTCCTGCGAAGCTAGAGCATTGCTACATCAGCTCCGGTGCAAAAAAGGTTGGCCGCATTACTGTCATACCAAGTCATGGCGTCAATATCATCATTGGCTGTTGAGATAGCATCTTTTAAAATGCCGCATACTCTTCCCATGAGCGGATTCCGCGCACATTATCATGATCTCGCGCGTCGGAGACGGTCGTCAGGGCGTGCGGCATCATTAATATTTTTTTAACCAATGCCCGAGATATAAAGAACGTGATGGCCCACGTGCCGTAAACTTGACGGGGAAAGGAGCGGAACCACCACAGTTGCTTTGAAATACCGCATGGGCGATCGGATGTGCTGCAGACGTTGTAATCAGCAATAAAACTTTATCCTAAGTAGTTCGGCATCGTGGTTCCCAACGACGGTTAGCTCGTGTTATCACGCCATCCGTATCTGAGAATACGGGATAATAAAAACGTTCTCCAGTTCGATACTTTCACCAAAAAAAGGGATTTTTCAATATACATATTTGATTTCCCCGACATTAACCTATTCGGTGATGCACAGCTTGTCGTCAGCGGGGAGCAGATTGGTTAAAATTCAGGCCGAAATGGGTTGAGTGGGACTCCAACTACGTGAACCGCACTAAATCAAAGCCGGCGGCGCTAGGGCCCCGCCGCGCCGTATGCGGTCAGGCGCCATTGCGGGCCTCAGGCGATTAAAACGACGGCCACCAGCCAGC8250GCCTCCATCC8300GCCAGTTAAT8350TGTCACGCTC8400TCAAGGCGAG8450CTTCGGTCCT8500TCATGGTTAT8550AGATGCTTTT8600GTGTATGCGG8650CCGCGCCACA8700TCGGGGCGAA8750GTAACCCACT8800GCGTTTCTGG8850ATAAGGGCGA8900TTATTGAAGC8950AATGTATTTA9000AAAGTGCCAC9050TAAAAATAGG9100ACGGTGAAAA9150CTGTAAGCGG9200TGTTGGCGGG9250TACTGAGAGT9300GCGTTAAATT9350CGGCAAAATC9400TTGTTCCAGT9450GTCAAAGGGC9500ATCACCCAAA9550GGAACCCTAA9600AACGTGGCGA9650GCTGGCAAGT9700TTAATGCGCC9750GTGAAATACC9800TCGCCATTCA9850TTCGCTATTA9900GTTGGGTAAC3950AGTGCCC9997消化含有里氏木霉eglII基因的表達載體pEGII/ptrex3(參見圖5和6)以確認(rèn)正確的插入片段大小。用Xbal消化來自一個正確克隆的質(zhì)粒DNA以釋方文包括cbhl啟動子-eglII-cbhl終止子-amdS的表達盒。通過瓊脂糖提取純化這一6.0kb表達盒并將其轉(zhuǎn)化到里氏木霉以產(chǎn)生稱作Eg2B的菌林。已經(jīng)公開了用外源添加的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化里氏木霉的方法(Penttila等人,1986;Gruber等人,1990;Smith等人,1991)。通過將質(zhì)粒DNA整合到宿主染色體中產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。整合可以在與質(zhì)粒DNA區(qū)域同源的基因組位點或者可以在非同源位點。41實施例2富含EG2的里氏木霉產(chǎn)物的生化表征下面實施例詳述了如何回收并表征EGII。使用本領(lǐng)域已知的方法,在發(fā)酵罐中生長產(chǎn)生改良EG2的里氏木霉菌株EG2B,使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法回收并濃縮上清液。濃縮上清液產(chǎn)物(改良的EG2(EG2B),和IndiAgeMaxL(EG2A)以便它們具有相同量的EG2蛋白。用13%山梨醇、1.35%苯甲酸鈉,或者13%甘油、1.35%苯甲酸鈉配制IndiAgeMaxL和改良的EG2。將IndiAgeMaxL配制成124g/L蛋白質(zhì)(散射校正的A280nm)。由SDS-PAGE凝膠得到的光密度分析法(AmershamBiosciences)表明這一上清液的主要組分是約35%EG1和50%EG2蛋白。將改良的EG2配制成78g/L蛋白(散射校正的A280nm)。光密度分析法(AmershamBiosciences)結(jié)果顯示這一產(chǎn)物含有96%EG2蛋白。當(dāng)濃縮以含有相同量的EG2蛋白時,根據(jù)CMC/DNS檢測發(fā)現(xiàn)IndiAgeMaxL和改良EG2具有類似的內(nèi)切葡聚糖酶活性。在生物整理和牛仔布洗滌應(yīng)用測試中,對于CMC活性,給予IndiAgeMaxL和改良EG2劑量(于下面描述)。蛋白質(zhì)測定-散射校正的A280nm是基于蛋白質(zhì)的固有吸收,由于在它們的組成中存在芳香氨基酸(主要是酪氨酸和色氨酸)。由于樣品中可能存在干擾物質(zhì),如果對該吸收值校正散射,那么將得到更準(zhǔn)確的測定。4吏用干凈的3ml石英杯,加入3mL的MilliQ水。AutozeroaUVA/is分光光度計(PerkinElmerLambda35或Cary3),數(shù)據(jù)間隔lnm,掃描速度120nm/min,以及縫隙0.5nm)。向3mL7JC中加入諸如lOOpL稀釋樣品將給出落入0.04和0,2吸收值單位之間的A280。加入100pL稀釋樣品并混合。從650至250波長掃描。通過對觀察到的吸收值的log對于波長的log之間的線性關(guān)系外推進行散射校正。通過考慮.94AUM"cm"的摩爾吸收值來計算濃度(根據(jù)EG2序列由VectorNTI軟件計算)。通過在不同稀釋度下一式三份進行光語測量。使用ImageScanner儀器(AmershamBiosciences)完成光密度分析法分析并JU吏用ImageQuantTLv2005(AmershamBiosciences)軟件完成1DGel分析。實施例3生物拋光性能這一實施例描述了當(dāng)具有不同組成的纖維素酶產(chǎn)物在含有纖維素纖維的整理織物中使用時發(fā)現(xiàn)的表面纖維去除和抗起球中的差別。具體地,這一實施例描述了改良EGII內(nèi)切葡聚糖酶相比于富含內(nèi)切EGII的纖維素酶而言具有提高的表面纖維去除(IndiAge⑧MAXL,可獲自Genencor,PaloAlto,California)。球的能力。具體地,4姿下面條件,在Thiesmini-soft(3kg)噴射式染色機(Thies,CoesfeldGermany;網(wǎng)址thiestextilmaschinen.de)上處理織物樣品(Brushed棉針織;IntertexLLC(GardenGrove,CA)制造的用反應(yīng)性寶藍染色且織物一側(cè)拉過絨的100%棉毛布)緩沖液pH5:二7K合檸檬酸鈉(1g/1)和一水合檸檬酸(0.8g/1)液體301水織物3kg士0.1kg液比1:10(10升水中l(wèi)kg織物)穩(wěn)定60°C酶劑量113,176或213,579或318,830CMC單位*時間30分鐘織物速度100m/分鐘酶處理后,通過加入lg碳酸鈉/1,于60。C升高pH至值大于9,持續(xù)5分鐘使酶失活。用301水漂洗織物兩次并在家用干燥機中干燥。使用兩種方法中至少其一(通常是兩者都用)來定量經(jīng)處理后的織物上存在的起球和織物表面纖維的量。第一種方法使用Videometer,VideometerLab2Image分才斤葉義系統(tǒng)(Videometer,HorsholmDenmark;網(wǎng)址videometer.com)。圖像分析儀配有定量織物上的表面纖維和起球量的軟件?;蛘呖梢酝ㄟ^視覺定量織物表面細(xì)毛的量(例如ASTM檢測方法D3512-02)。下面表l顯示了來自Videometer的結(jié)果。也參見圖7。圖8是已經(jīng)用與視覺評估所用的相同活性的纖維素酶處理的織物圖片。表l織物表面纖維定量<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表中的數(shù)值表示織物表面纖維量。數(shù)字越大,織物表面纖維和起球的量越小。這些結(jié)果表明當(dāng)在上述生物整理工藝中給予相同劑量的活性單位時,改良的EGII組分纖維素酶對于除去起球和織物表面纖維(細(xì)毛)比IndiAgeMAX纖維素酶更有效。實施例4牛仔布磨損性能這一實施例闡述了改良EGII紡織品處理組合物的提高的牛仔布整理特性。相比于IndiAgeMaxL,當(dāng)用具有改良的EGII紡織品處理組合物在下面的條件下處理牛仔布時,獲得了磨損水平的提高。在高剪切洗衣才幾中比較IndiAgeMaxL和改良的Eg2的牛仔布生物石洗。以2,500、5,000、10,000、和20,000CMCU/L的劑量,按下面的條件,用IndiAgeMaxL和改良的EG2處理牛仔褲腿設(shè)備Unimac(501b實驗室規(guī)模前方裝載洗衣機)牛仔布基質(zhì)來自ConeMill的12退漿的(6-硫底部/艇青染色的牛仔褲腿+6-100%靛青染色的牛仔褲腿作為壓載物)酶分別含有10138CMCU/g和11674CMCU/g的改良EG2和IndiAgeMaxL。都用13%山梨醇和1.35%苯曱酸鹽配制。液比10至1(30L緩沖液中3kg牛仔布)pH:5.0+0.1(用磷酸氫二鈉(DSP)/檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié))溫度55。C處理時間60分鐘酶處理后用水漂洗兩次。纖維素酶處理后,為了定量回染和磨損水平,使用Minolta的ChromaMeterCR-200對每條牛仔褲腿取8個反射計讀數(shù)。使用CIELAB(-b"坐標(biāo)表示磨損和回染性能的定量。使用CIELMi定量磨損,并使用絕對CIEM定量回染(CIEL*:LMi越高,磨損越高;CIElb*l:絕對值1)*越高,回染越高)。表2.A和B對于牛仔布的磨損和回染的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>這些結(jié)果表明相比于富含內(nèi)切EGII的紡織品處理組合物而言,改良的EGII紡織品處理組合物具有增強的磨損性能。應(yīng)理解,在此描述的實施例和實施方式只用于說明的目的并且對其的許多修飾或改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以提出的且包括在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在此引用的所有出版物、專利和專利申請出于所有目的完整并入本文作為參考。權(quán)利要求1、可得自或來自木霉屬物種的纖維素酶,其包含根據(jù)SEQIDNO1的氨基酸序列。2、組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求1的纖維素酶或其具有大于95%序列同一性的衍生物。3、根據(jù)權(quán)利要求2的組合物,其中所述纖維素酶具有至少97%的序列相似性。4、編碼權(quán)利要求1的纖維素酶的分離的DNA。5、包含SEQIDNO:2的分離的DNA。6、包含權(quán)利要求4的DNA的表達載體。7、包含權(quán)利要求5的DNA的表達載體。8、用權(quán)利要求4的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。9、用^又利要求5的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。10、一種表達纖維素酶的方法,包括(a)用編碼根據(jù)權(quán)利要求6或7的氨基酸序列的DNA轉(zhuǎn)化適合的微生物;(b)在適于所述DNA表達的條件下,制備含有所述適合的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)液;(c)在允許期望量的所述纖維素酶表達的條件下,維持所述發(fā)酵培養(yǎng)液一段時間;和(d)收集含有所述纖維素酶的所述發(fā)酵培養(yǎng)液。11、包含權(quán)利要求l、2或3的纖維素酶的洗滌劑組合物。12、一種處理紡織品的方法,包括將所述紡織品與權(quán)利要求l、2或3的纖維素酶接觸。13、一種處理基于纖維素的紙漿的方法,包括將所述基于纖維素的紙漿與權(quán)利要求l、2或3的纖維素酶接觸。14、一種用纖維素酶處理含纖維素的織物的方法,包括步驟(a)將所述含纖維素的織物與包舍有效量的改良EGII纖維素酶的處理組合物接觸;和(b)在對處理所述織物有效的條件下,溫育與所述EGII纖維素酶接觸的所述含纖維素織物。15、根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述含纖維素的織物包括含棉織物。16、根據(jù)權(quán)利要求15的方法,其中所述含棉織物包括染色的牛仔布。17、根椐權(quán)利要求14的方法,其中所述處理組合物包含濃度為約0.1至約1,000ppm總蛋白質(zhì)的改良的EGII纖維素酶或改良的EGII纖維素酶4汙生物。18、根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述處理組合物包含濃度為約0.2至約500ppm的改良的EGII纖維素酶或改良的EGII纖維素酶衍生物。19、根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述改良的EGII纖維素酶源自真菌或細(xì)菌微生物。20、根據(jù)權(quán)利要求19的方法,其中所述真菌是木霉屬物種。21、根據(jù)權(quán)利要求20的方法,其中所述木霉屬物種是長枝木霉。22、根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述處理方法包括石洗含纖維素的織物并且所述處理組合物包括石洗組合物。23、根據(jù)權(quán)利要求22的方法,其中所述含纖維素的織物是有色的。24、根據(jù)權(quán)利要求23的方法,其中所述有色的織物是染色的牛仔布。25、根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述處理方法包括洗滌含纖維素的織物并且所述處理組合物是包含表面活性劑的洗滌劑組合物。26、根據(jù)權(quán)利要求25的方法,其中所述表面活性劑包括非離子乙氧基化烷基酚或非離子乙氧基化醇。全文摘要本文描述了具有SEQIDNO1所示氨基酸序列的改良EGII纖維素酶,包含改良EGII的組合物和使用方法。文檔編號D06M16/00GK101583712SQ200880002410公開日2009年11月18日申請日期2008年1月11日優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日發(fā)明者A·克勞爾,E·A·博迪申請人:丹尼斯科美國公司
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