專利名稱：一種耐熱β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(SyXyn11)基因的異源表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于細菌的耐熱￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(SyXynll)基因的異源表達、活性測定及分析和酶學性質(zhì)分析方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
P-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-P-1,4-xylanase, EC 3. 2.1. 8),能從木聚糖主鏈的內(nèi)部隨機切割木糖苷鍵，將其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖。根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域氨基酸的同源性和疏水簇分析法可將木聚糖酶劃分為糖苷水解酶10家族和11家族。木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織等工業(yè)領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用價值，但由于紙漿漂白、飼料制粒等 工藝均需要較高溫度，因此耐熱木聚糖酶的研究和開發(fā)得到了很多研究者的青睞。目前已發(fā)現(xiàn)了許多能產(chǎn)11家族耐熱木聚糖酶的微生物，其中許多耐熱木聚糖酶基因已被克隆并表達在合適的宿主中。畢赤酵母表達系統(tǒng)由于能高效分泌外源蛋白到胞外，并能進行高密度發(fā)酵，因而在木聚糖酶研究中備受關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于細菌的耐熱￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(SyXynll)基因的異源表達、活性測定及分析和酶學性質(zhì)分析方法，為該基因的異源高效表達和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。EvXynlIts是一種來源于細菌的極端耐熱木聚糖酶突變體(GenBank登錄號EU591743)，它的熱穩(wěn)定性非常好，具有適合于工業(yè)應(yīng)用的理想特性。為實現(xiàn)EvXynllTS在工業(yè)上的應(yīng)用，擬將該耐熱基因在畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的進行分泌表達，但是由于它來源于細菌，其密碼子偏好性與畢赤酵母有較大差異，于是對此耐熱基因中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并命名為SyxynlI。本發(fā)明的技術(shù)方案一種源自細菌的耐熱￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(SyXynll)，其基因(Syxynll)完整的mRNA核苷酸序列為SEQ IDNO 10所述的由完整mRNA推導的SyXynll氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的Syxynll完整的異源表達、活性測定及分析和酶學性質(zhì)分析方法(I)重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxynll的構(gòu)建根據(jù)密碼子的偏愛性，宿主細胞能夠以不同的速度合成蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)的基因中有些密碼子對應(yīng)的tRNA含量少(即屬于稀有密碼子)，所以合成量較少，宿主以此來控制蛋白質(zhì)的合成速度。因此按照密碼子的偏好性，對外源蛋白編碼基因進行密碼子優(yōu)化可以有效提高外源蛋白的表達量。為實現(xiàn)來源于細菌的耐熱木聚糖酶基因Evxynllis在P. pastoris中的高表達,對Evxynllis成熟肽基因序列(585bp)進行分析，發(fā)現(xiàn)其密碼子的偏好性與畢赤酵母有很大差異。遂對照畢赤酵母密碼子偏好性表對EvxynlIts中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并在基因兩端分別加入EcoR1、Not I位點，該基因命名為Syxynl I，人工合成后克隆至pUCm_T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxynll。
(2)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxynll進行EcoR I和Not I雙酶切，割膠回收產(chǎn)物與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒PPIC9K連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR篩選鑒定后，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-Syxynllo(3) Syxynll 在 P. pastoris 中的表達pPIC9K_Syxynll 經(jīng) Sal I 線性化后，用電穿孔法將其導入P. pastoris GSl 15中，涂布于MD平板上進行初步篩選，最終在YPD平板上篩選出抗高濃度G418的重組畢赤酵母，命名為GS115/Syxynll ;同時電轉(zhuǎn)pPIC9K至P. pastoris GS115做對照，并命名為GS115/9K。提取重組子的基因組DNA，以此為模板，進行PCR驗證。(4)木聚糖酶的活性測定及分析木聚糖酶酶活測定采用改良的DNS試劑法。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)，并采用SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行分析及表觀分子量的測定。(5)重組木聚糖酶酶學性質(zhì)分析酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性取適當稀釋酶 液于55 95°C水浴條件下進行酶解反應(yīng)，每隔5°C，分別測定酶活，以酶活力最高者為100%，作溫度-相對酶活性曲線；將酶液于不同溫度下保溫不同時間后，按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以O(shè)min時取出的酶液的酶活性為100%，作溫度-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。酶的最適pH及pH穩(wěn)定性65°C下,分別測定木聚糖酶在不同pH值下的酶活性。以酶活力最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線；將酶在不同的pH值條件下于40°C保溫lh，再分別測定殘留酶活性，以酶活力最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。金屬離子對酶活性的影響將不同金屬離子溶液與酶液混合，至終濃度為2mmol/L，40°C保溫lh，然后按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為100%，殘余酶活與其的比值為相對酶活。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種來源于細菌的耐熱@-1，4_內(nèi)切木聚糖酶(SyXynll)基因的異源表達、活性測定及分析和酶學性質(zhì)分析方法，為該基因的異源高效表達和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。EvXynllTS是一種來源于細菌的極端耐熱木聚糖酶突變體(GenBank登錄號EU591743)，它的熱穩(wěn)定性非常好，在90°C下處理60min酶活不下降，具有適合于工業(yè)應(yīng)用的理想特性。為實現(xiàn)EvXynllTS在工業(yè)上的應(yīng)用，擬將該耐熱基因在畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115中的進行分泌表達,但是由于它來源于細菌,其密碼子偏好性與畢赤酵母有較大差異，于是對此耐熱基因中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并命名為Syxynl I。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxynll的構(gòu)建為實現(xiàn)來源于細菌的耐熱木聚糖酶基因Evxynllis在P. pastoris中的高表達,對EvxynlIts成熟肽基因序列(585bp)進行分析，發(fā)現(xiàn)其密碼子的偏好性與畢赤酵母有很大差異。遂對照畢赤酵母密碼子偏好性表對Evxynl Its中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并在基因兩端分別加入EcoR1、Not I位點，該基因命名為SyxynlI，人工合成后克隆至pUCm-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。實施例2重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxynll進行EcoR I和Not I雙酶切，割膠回收約600bp的目的基因Syxynll，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a感受態(tài)細胞，經(jīng)通用引物(5' -AOX和3' _A0X)PCR篩選鑒定后，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。實施例3Syxynll在P. pastoris中的表達pPIC9K-Syxynll經(jīng)Sal I線性化后,用電穿 孔法將其導入P. pastoris GS115中，涂布于MD平板上篩選重組畢赤酵母；在MD平板上將生長良好的菌落用牙簽點種至含不同濃度G418的YPD平板上篩選抗高濃度G418(2. Omg/mL)的重組畢赤酵母，命名為GS115/Syxynll ;同時電轉(zhuǎn)pPIC9K至P. pastoris GS115做對照，并命名為GS115/9K。參照《分子克隆實驗指南》中的方法提取重組子的基因組DNA。以此為模板，利用通用引物5' -AOX和3' -AOX進行PCR驗證。耐熱木聚糖酶基因Syxynll的常規(guī)誘導表達參見Mult1-CopyPichia Expression Kit (Invitrogen 公司)操作手冊。實施例4木聚糖酶的活性測定及分析木聚糖酶酶活測定采用改良的DNS試劑法，用櫸木木聚糖作為底物，其中酶反應(yīng)溫度設(shè)定為65°C，以在測定的條件下，每分鐘釋放I y mol還原糖所需的酶量定義為I個酶活單位(U)。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)，以牛血清白蛋白為標準。并采用SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行分析及表觀分子量的測定。實施例5重組木聚糖酶酶學性質(zhì)分析酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性取適當稀釋酶液于55 95°C水浴條件下進行酶解反應(yīng)，每隔5°C，分別測定酶活，以酶活力最高者為100%，作溫度-相對酶活性曲線；將酶液于不同溫度下保溫不同時間后，按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以O(shè)min時取出的酶液的酶活性為100%，作溫度-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。酶的最適pH及pH穩(wěn)定性65°C下,分別測定木聚糖酶在不同pH值下的酶活性。以酶活力最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線；將酶在不同的pH值條件下于40°C保溫lh，再分別測定殘留酶活性，以酶活力最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。反應(yīng)所用的緩沖液為0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH3. 5 8. 0)和0. 05mol/L甘氨酸-氫氧化納緩沖液(pH 8. 5 9. 5)。金屬離子對酶活性的影響將不同金屬離子溶液與酶液混合，至終濃度為2mmol/L，40°C保溫lh，然后按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為100%，殘余酶活與其的比值為相對酶活。
權(quán)利要求
1.一種源自細菌的耐熱β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(SyXynll)的優(yōu)化基因，其完整mRNA的核苷酸序列對應(yīng)于序列表中的SEQ ID N0:1。
2.這種源自細菌的耐熱β_1，4-內(nèi)切木聚糖酶(SyXynll)，基因優(yōu)化后其氨基酸序列對應(yīng)于序列表中的SEQ ID Ν0:2。
3.所述的Syxynll完整的異源表達、活性測定及分析和酶學性質(zhì)分析方法(1)重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxynll的構(gòu)建根據(jù)密碼子的偏愛性,宿主細胞能夠以不同的速度合成蛋白質(zhì)；編碼蛋白質(zhì)的基因中有些密碼子對應(yīng)的tRNA含量少(即屬于稀有密碼子)，所以合成量較少，宿主以此來控制蛋白質(zhì)的合成速度；因此按照密碼子的偏好性，對外源蛋白編碼基因進行密碼子優(yōu)化可以有效提高外源蛋白的表達量；為實現(xiàn)來源于細菌的耐熱木聚糖酶基因EvxynllTS在P. pastoris中的高表達,對EvxynllTS成熟肽基因序列 (585bp)進行分析，發(fā)現(xiàn)其密碼子的偏好性與畢赤酵母有很大差異；遂對照畢赤酵母密碼子偏好性表對EvxynlIts中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并在基因兩端分別加入EcoR1、Not I 位點，該基因命名為Syxynl I，人工合成后克隆至pUCm_T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化JMl09，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxynll ；(2)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxynll進行EcoRI和 NotI雙酶切，割膠回收約600bp的目的基因Syxynll，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K連接， 轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)通用引物(5' -AOX和3' -Α0Χ)PCR篩選鑒定后，轉(zhuǎn)化 JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-Syxynll ；(3)Syxynll在P. pastoris中的表達pPIC9K_Syxynll經(jīng)Sal I線性化后，用電穿孔法將其導入P. pastoris GSl 15中，涂布于MD平板上篩選重組畢赤酵母；在MD平板上將生長良好的菌落用牙簽點種至含不同濃度G418的YPD平板上篩選抗高濃度G418 (2. Omg/mL)的重組畢赤酵母，命名為GS115/Syxyn 11 ;同時電轉(zhuǎn)pP IC9K至P. pas tor i s GS115做對照，并命名為GS115/9K ;參照《分子克隆實驗指南》中的方法提取重組子的基因組DNA ;以此為模板，利用通用引物5' -AOX和3' -AOX進行PCR驗證；耐熱木聚糖酶基因Syxynll的常規(guī)誘導表達參見 Mult1-Copy Pichia Expression Kit (Invitrogen 公司)操作手冊；(4)木聚糖酶的活性測定及分析木聚糖酶酶活測定采用改良的DNS試劑法，用櫸木木聚糖作為底物，其中酶反應(yīng)溫度設(shè)定為65°C，以在測定的條件下，每分鐘釋放Iymol還原糖所需的酶量定義為I個酶活單位(U);蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍染色法(Bradford 法)，以牛血清白蛋白為標準；并采用SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行分析及表觀分子量的測(5)重組木聚糖酶酶學性質(zhì)分析酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性取適當稀釋酶液于55 95°C水浴條件下進行酶解反應(yīng)，每隔5°C，分別測定酶活，以酶活力最高者為100%，作溫度-相對酶活性曲線；將酶液于不同溫度下保溫不同時間后，按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以O(shè)min時取出的酶液的酶活性為100%，作溫度-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到 85%以上，即定義為穩(wěn)定；酶的最適pH及pH穩(wěn)定性65°C下，分別測定木聚糖酶在不同pH值下的酶活性；以酶活力最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線；將酶在不同的pH值條件下于40°C保溫lh， 再分別測定殘留酶活性，以酶活力最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線；當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定；反應(yīng)所用的緩沖液為0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(ρΗ3· 5 8. O)和O. 05mol/L甘氨酸-氫氧化納緩沖液(pH 8. 5 9. 5)；金屬離子對酶活性的影響將不同金屬離子溶液與酶液混合，至終濃度為2mmol/L， 40°C保溫lh，然后按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為100%，殘余酶 活與其的比值為相對酶活。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來源于細菌的耐熱β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(SyXyn11)基因的異源表達、活性測定及分析和酶學性質(zhì)分析方法。EvXyn11TS是一種來源于細菌的極端耐熱木聚糖酶突變體(GenBank登錄號EU591743)，它的熱穩(wěn)定性非常好，具有適合于工業(yè)應(yīng)用的理想特性。為實現(xiàn)EvXyn11TS在工業(yè)上的應(yīng)用，將該耐熱基因中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并命名為Syxyn11，其核苷酸序列為SEQ ID NO1，其氨基酸序列為SEQ ID NO2。這為該基因的異源表達和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟價值，也為其它β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/34GK103014040SQ20121056251
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者鄔敏辰, 陸源, 張慧敏, 李劍芳 申請人:江南大學