專利名稱：洗滌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及洗滌劑組合物，更具體地說，涉及具有優(yōu)異的對泥污的凈化力的洗滌劑組合物。
粘在衣服上的泥土通常被分為有機(jī)土和無機(jī)土。多泥的土是一種典型的無機(jī)土。多泥的土例如極常見地粘附到短襪上，并且已知它是最難于除去的泥土。表面活性劑和助洗劑(它們是洗衣用洗滌劑的活性組分)具有較弱的對無機(jī)土的效果。因此，開發(fā)了各種技術(shù)以增強對無機(jī)土的洗脫效果。但是，其中的大多數(shù)運用了應(yīng)用常規(guī)洗滌劑基料的技術(shù)并且具有各自的缺點。例如，基于羧酸的聚合物(如羧甲基纖維素或聚丙烯酸鹽，具有使其中的泥垢分散的效果)，由于成本和生物降解性而難于以足量摻和。還提出了還原劑的應(yīng)用；但在摻和時它仍有問題，因為還原劑有時會引起染色的衣服脫色。
除了前述常規(guī)物質(zhì)的應(yīng)用外，人們還試圖應(yīng)用酶來增強對無機(jī)土的洗滌效果。由于酶僅僅作用于特異性底物，所以它在少量摻和下就產(chǎn)生效果。因此，酶是優(yōu)異的洗滌劑基料并且有望在洗滌劑組合物中起更重要的作用。日本專利申請公開(kokai)No.59-49279公開了在洗滌劑中摻和纖維素酶可增大對泥污的洗滌能力。還有，PCT Kohyo公開No.3-504080公開了一些纖維素酶，它們可降低含棉織物的粗糙度并具有除去泥污的效果。此外，WO 95/25790和日本專利公開(kokoku)No.6-39596公開了含果膠酶的洗滌劑。具體地說，日本專利公開(kokoku)No.6-39596公開了果膠酶在抗泥污方面是有效的。但是，這些專利公開中所公開的果膠酶甚至在40℃下預(yù)浸泡一小時后進(jìn)行的洗滌中也表現(xiàn)不充分的洗滌效果。
鑒于上述情況，本發(fā)明的一個目的是提供具有優(yōu)異的對泥污的凈化力的洗滌劑組合物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，與常規(guī)洗滌劑的情況相比，通過摻和在堿性區(qū)具有反應(yīng)的最佳pH的原果膠酶可獲得特別優(yōu)異的對泥污的凈化力，于是導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
因此，本發(fā)明提供了一種包括原果膠酶的洗滌劑組合物，該原果膠酶在原果膠或聚半乳糖醛酸被用作底物時具有7.0或更高的反應(yīng)最佳pH。


圖1示出用于克隆果膠酸裂合酶的基因的引物1和引物2的DNA序列。
圖2示出引物1和引物2之間的DNA序列和推測的氨基酸序列，以及引物3和引物4的位置。
圖3示出用于擴(kuò)增本發(fā)明的果膠酸裂合酶整個區(qū)的引物5和引物6。這些是實施例5中描述的PCR擴(kuò)增用的引物，形成的擴(kuò)增片段(約lkbp)被Sal I消化隨后被連接到用Sal I和Sma I消化的pHSP64上。
圖4示出果膠酸裂合酶插入到載體(pHSP64)中，以及產(chǎn)生的表達(dá)果膠酸裂合酶pHSP-A156的載體。
Amp氨芐西林抗性標(biāo)記基因Tet四環(huán)素抗性標(biāo)記基因在本發(fā)明中，術(shù)語“原果膠酶”總體上表示作用于原果膠(不溶性天然果膠)的酶，原果膠是一種通過果膠分子借助于Ca2+，Mg2+的相互連接，或分子間鍵合；連接到纖維素分子上等而變成不溶的果膠質(zhì)。
根據(jù)“l(fā)wanami Seibutsugaku Jiten”(第3版，Iwanami Shoten，1983年3月10日出版)和“Oyou Kosogaku(應(yīng)用酶學(xué))”(由YoshioTsujisaka編輯，p.50，Kodansha Co.，Ltd.，1979年6月1日出版)，雖然預(yù)見了原果膠酶的存在，但直到最近才將它作為樣品提取出來。實際上，對真實的原果膠酶酶樣品的報導(dǎo)相當(dāng)有限(T.Sakai和M.Okushima，農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.)，42，2427，(1978)；T.Sakai和M.Okushima，農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)，46，667，(1982)；T.Sakai和T.Sakamoto，農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)，54，879，(1990)；等)。
至于原果膠酶的應(yīng)用，只有日本專利申請公開(kokai)No.6-220772和“Sensyoku Kogyo(染料工業(yè))”(vol.43，No.4，p.162～173(1995))描述了它在纖維的洗滌中的應(yīng)用。迄今沒有公開在洗滌劑組合物中摻和原果膠酶的公開報導(dǎo)。
已知原果膠酶被分成兩類A型和B型(Sakai，Sakamoto，“Sen-i Kogaku(纖維工程)，”45，301(1992))。A型原果膠酶分解原果膠中的聚半乳糖醛酸部分而起增溶溶解作用，B型原果膠酶則作用于殘余部分(例如，果膠質(zhì)與纖維素分子之間的連接部位)。兩類原果膠酶(即A型和B型)都可用于本發(fā)明中。
用于本發(fā)明的原果膠酶在原果膠或聚半乳糖醛酸被用作底物的反應(yīng)體系中具有7.0或更高的反應(yīng)最佳pH。從凈化力的角度來看，所述反應(yīng)的最佳pH優(yōu)選是7.5或更高，更優(yōu)選是8.0或更高。反應(yīng)的最佳pH可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種緩沖系統(tǒng)中測定，并且所述反應(yīng)的最佳pH在至少一種這類緩沖系統(tǒng)中必須是7.0或更高。當(dāng)原果膠是底物時，應(yīng)用含果膠質(zhì)的棉纖維，并且為了測量目的，具有高果膠質(zhì)含量的那些是優(yōu)選的。當(dāng)原果膠酶是A型并且具有果膠酶活性時，則反應(yīng)的最佳pH可通過例如應(yīng)用果膠酸作底物而獲得。如將在下文的實施例部分中描述的那樣，測定反應(yīng)最佳pH的體系可包括Britton-Robinson廣域緩沖劑(磷酸/乙酸/硼酸/氫氧化鈉)(“Shin Jikkenkagaku-koza 20，”生物化學(xué)(Biochemistry)[II]，由日本化學(xué)學(xué)會編輯，p.1229，Maruzen K.K.，1978年10月20日出版)或甘氨酸-NaOH緩沖劑，以及作為底物的棉織物或聚半乳糖醛酸。
用于本發(fā)明的原果膠酶在pH8.0時優(yōu)選具有高的釋放來自棉的果膠的能力。考慮到洗滌效果，以0.2mg/g棉的量釋放來自棉的果膠的能力是更優(yōu)選的。本文應(yīng)用的“釋放來自棉的果膠的能力”定義為讓酶(0.4mg/ml)與棉紗(20mg/ml)在30℃下反應(yīng)一小時后從棉紗(1g)釋放的果膠的量，是通過詳細(xì)示于下述實施例中的方法測定的。
對本發(fā)明的原果膠酶來源沒有特別的限制，可應(yīng)用見于寬范圍的植物、細(xì)菌和真菌中的酶。實例包括細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬(Bacillus)；酵母，例如毛孢子菌屬(Tricosporon)、內(nèi)孢霉屬(Endomyces)、擬內(nèi)孢霉(Endomycopsis)、酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、畢赤氏酵母(Pichia)、漢森酵母(Hansenula)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、有孢漢森酵母屬(Hanseniaspora)、球擬酵母屬(Torulopsis)、假絲酵母屬(Candida)或克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)；以及霉菌，例如鐮刀霉菌屬(Fusarium)、Galactomyces、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)或栓菌屬(Trametes)。這些酶中，得自芽孢桿菌屬的原果膠酶是特別優(yōu)選的。
應(yīng)用于本發(fā)明中的原果膠酶還可表現(xiàn)另一種酶活性，只要它表現(xiàn)上述原果膠酶活性即可。例如，可應(yīng)用表現(xiàn)原果膠酶活性的果膠酸裂合酶。
表現(xiàn)原果膠酶活性的酶的實例包括由芽孢桿菌KSM-P15或芽孢桿菌KSM-366生產(chǎn)的果膠酸裂合酶；得自枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)IFO12113的B型原果膠酶；具有缺失、替換或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列的酶；以及對這些酶的抗體有免疫反應(yīng)性的酶。
得自菌株KSM-P15的酶在本發(fā)明中是特別優(yōu)選的。由菌株KSM-P15產(chǎn)生的、表現(xiàn)原果膠酶活性的果膠酸裂合酶的氨基酸序列示于序列1中。在本發(fā)明中，可應(yīng)用具有序列1的氨基酸序列的酶或者具有序列1的氨基酸序列但其中缺失、替換或添加了一個或多個氨基酸的酶。對所述缺失、替換或添加(下文將稱為“突變”)沒有特別的限制，只要該原果膠酶和果膠酸裂合酶未被滅活即可，并且所述突變優(yōu)選保留了序列1中第107號位的賴氨酸、第129號位的賴氨酸和第132號位的精氨酸。而且，對突變程度沒有特別的限制，只要保留了上述第107號位、第129號位和第132號位即可。優(yōu)選地，在序列1的氨基酸Nos.36和132之間存在55.7％或更高的同源性。更優(yōu)選地，該同源性是70％或更高，特別優(yōu)選地為80％或更高。
下面是關(guān)于由芽孢桿菌KSM-366菌株生產(chǎn)的、表現(xiàn)原果膠酶活性的果膠酸裂合酶的酶學(xué)特性更為詳細(xì)的描述。它的測定將在下文(見實施例III-1-B)描述。
(1)作用經(jīng)過以內(nèi)向方式β消除來分裂果膠酸(聚半乳糖醛酸)的α-1，4-鍵并且在非還原端的C4～C5位置上提供一個雙鍵從而形成不飽和的二半乳糖醛酸酐(digalacturonide)或不飽和的低聚半乳糖醛酸酐(oligo-galacturonide)。
(2)底物特異性作用于原果膠、果膠酸(聚半乳糖醛酸)、酸溶性的果膠酸和果膠。
(3)最佳pHpH8.0～9.0(Britton-Robinson廣域緩沖劑)(4)最佳溫度大約60℃(pH8，Tris-HCl緩沖劑)(5)分子量大約43kDa(通過SDS-PAGE測定的)(6)等電點大約pH10.3(等電聚焦PAGE)下面是關(guān)于由芽孢桿菌KSM-P15菌株生產(chǎn)的、表現(xiàn)原果膠酶活性的果膠酸裂合酶的酶學(xué)特性更為詳細(xì)的描述。它的測定將在下文(見實施例III-2-B)描述。
(1)作用經(jīng)過以內(nèi)向方式β消除來分裂果膠酸(聚半乳糖醛酸)的α-1，4-鍵并且在非還原端的C4～C5位置上提供一個雙鍵從而形成不飽和的二半乳糖醛酸酐或不飽和的低聚半乳糖醛酸酐。
(2)底物特異性作用于原果膠、果膠酸(聚半乳糖醛酸)、酸溶性的果膠酸和果膠。
(3)最佳pHpH10.3～10.7(甘氨酸-NaOH緩沖劑)(4)最佳溫度50～55℃(pH10.5，甘氨酸-NaOH緩沖劑)(5)分子量大約20～21kDa(通過沉降平衡測定的；大約26kDa，通過SDS-PAGE測定的)(6)等電點大約pH10.3
(等電聚焦PAGE)(7)氨基酸末端序列包括APTVVHETIRVPAGQTFDGK上述酶值的每一種都含變種菌株的值。就KSM-P15菌株來說，最佳溫度是50～55℃，分子量約為20～21kDa，等電點約為pH10.3。
生產(chǎn)上述表現(xiàn)原果膠酶活性的酶的微生物實例包括前述微生物；它們的變種；以及由重組DNA(它具有編碼這些酶的DNA序列)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及其突變體。
為了產(chǎn)生重組載體，將基因插入適合在感興趣的宿主中表達(dá)該基因的任意載體。該載體的實例包括pBR322、pUC18和pUC19(當(dāng)大腸埃希氏菌(Escherichia coli)被用作宿主時)，以及pUB110(當(dāng)枯草芽孢桿菌被用作宿主時)。
為了通過應(yīng)用前述生產(chǎn)表現(xiàn)原果膠酶活性的酶的微生物、它們的變種或者由重組DNA(它具有編碼這些酶的DNA序列)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及其突變體來生產(chǎn)表現(xiàn)原果膠酶活性的酶，可將所述微生物菌株接種入含有同化的碳源、氮源和其它必需營養(yǎng)物的培養(yǎng)基，然后通過一般方法培養(yǎng)。
靶物質(zhì)(即表現(xiàn)原果膠酶活性的酶)可通過收集和純化酶的一般方法從這樣獲得的培養(yǎng)液收集和純化。這樣獲得的酶溶液可以不經(jīng)任何進(jìn)一步的處理而應(yīng)用或者可通過已知方法純化、結(jié)晶或?；．?dāng)該酶溶液被用于洗滌劑組合物時，可通過已知方法將培養(yǎng)液濃縮、透析、然后噴霧干燥而得粒子。
對摻入本發(fā)明洗滌劑組合物中的原果膠酶的量沒有特別限制，只要酶活性被成功地表達(dá)即可，并且前述關(guān)于棉果膠的釋放能力可作為優(yōu)選的摻和量的指標(biāo)。例如，原果膠酶以0.001～500mg/L的量、更優(yōu)選以0.05～50mg/L的量被摻入洗滌液，隨著酶樣品的量而減少，所以前述關(guān)于棉果膠的釋放能力可以是0.2mg/g棉或更多。當(dāng)本發(fā)明的原果膠酶屬于A型并且表現(xiàn)果膠酶活性時，該酶可被以1～10,000U/L、更優(yōu)選以5～5,000U/L、特別優(yōu)選以10～2,000U/L的量摻和，洗滌時的濃度是通過下述測定原果膠酶活性的方法測定的。
為了獲得高的抗泥污的洗滌效果，重要的是應(yīng)用在進(jìn)行實際洗滌的堿性范圍內(nèi)表現(xiàn)原果膠酶活性的酶。具體地說，優(yōu)選摻和具有7.0或更高的最佳反應(yīng)pH的原果膠酶或者在pH為8.0時具有0.2mg/g棉或更大的棉果膠釋放能力的原果膠酶。換言之，對本發(fā)明的實施方案來說，重要的是原果膠酶在含洗滌劑的堿性溶液中起作用而引起棉果膠的釋放。
并且，本發(fā)明的洗滌劑組合物可包含已知的洗滌劑組分，它的實例包括如下。
(1)表面活性劑表面活性劑的實例包括陰離子型表面活性劑，例如具有一個C10～C18(平均)烷基的線型烷基苯磺酸鹽，具有一個C10～C20(平均)線型或含支鏈的烷基、其上添加了環(huán)氧乙烷(平均0.5～8mol/分子)的烷基醚磺酸鹽，具有一個C10～C20(平均)烷基的烷基硫酸鹽，分子中具有10～20個(平均)碳原子的烯屬磺酸鹽，分子中具有10～20個(平均)碳原子的烷基磺酸鹽，分子中具有10-20個(平均)碳原子的α-磺基脂肪酸甲酯或乙酯，C8～C20(平均)高級脂肪酸鹽，具有一個C10～C20(平均)線型或含支鏈的烷基、其上添加了環(huán)氧乙烷(平均0.5～8mol/分子)的烷基醚羧酸；非離子型表面活性劑，例如具有一個C10～C20(平均)烷基和一條環(huán)氧乙烷單元(平均1～20mol)的鏈的脂肪醇乙氧基化物，脂肪酸鏈烷醇酰胺或它們的烯化氧加合物，或者氧化丙烯-丙二醇縮合物(商品名為“Pluronic”)的環(huán)氧乙烷加合物；甜菜堿型兩性表面活性劑；磺酸酯型兩性表面活性劑；磷酸酯型表面活性劑；氨基酸型表面活性劑；以及陽離子型表面活性劑。
這些表面活性劑中，從增強凈化力考慮，陰離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑優(yōu)選被用作活性表面活性劑。特別優(yōu)選的陰離子型表面活性劑實例包括具有一個C10～C18(平均)烷基的線型烷基苯磺酸鹽、烷基磺酸酯、聚氧化烯烷基醚硫酸鹽和α-磺基脂肪酸甲酯?？缮倭康靥砑觿游镏突蜃貦坝椭舅猁}。優(yōu)選的非離子型表面活性劑實例包括聚氧化烯(優(yōu)選是氧化乙烯和/或氧化丙烯)烷基醚。
這些表面活性劑可被摻入所述洗滌劑組合物的量為0.5～60wt.％(下文簡單地以“％”表示)、對粉狀洗滌劑組合物來說尤其是10～45％，對液體洗滌劑組合物來說是20～50％。當(dāng)洗滌劑組合物含有40％(被還原時有效氧含量為10％)或更多漂白劑時，則所述表面活性劑優(yōu)選以1～10％的量、更優(yōu)選以1～5％的量被摻和。
(2)其它的酶組分所述洗滌劑組合物可進(jìn)一步包含除原果膠酶以外的酶。該酶的實例包括水解酶、氧化還原酶、裂合酶、轉(zhuǎn)移酶和異構(gòu)酶(按反應(yīng)性分類)。這些酶中，纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、酯酶、半纖維素酶、過氧化物酶、酚氧化物酶和果膠酶(不同于原果膠酶)是特別優(yōu)選的。商品酶可按已知的量摻和。優(yōu)選的酶的實例包括蛋白酶，例如在日本專利申請公開(kokai)No.5-25492中描述的蛋白酶，Alkalase、Esperase、Sayinase、Durazym(Novo Nordisk A/S)，Prafect、Maxapem或Properase(Genencor Int.Inc.)；纖維素酶，例如在日本專利公開(kokoku)No.4-43119中描述的纖維素酶或Celluzyme(NovoNordisk A/S)；脂肪酶，例如Lipolase(Nova Nordisk A/S)或Lipomax(Genencor Int.Inc.)；以及淀粉酶，例如描述于WO94/26881中的液化α-淀粉酶，描述于日本專利公開(kokoku)Nos.7-8993和7-49594中的支鏈淀粉酶，描述于日本專利申請公開(kokai)No.6-264094中的、具有α-淀粉酶活性的堿性支鏈淀粉酶，Termamyl、Duramyl(NovaNordisk A/S)，Maxamyl、Prafect或OXAm(Genencor Int.Inc.)。
這些酶中，與前述原果膠酶一起應(yīng)用的纖維素酶或蛋白酶增強了對泥污的凈化力。此外，纖維素酶和蛋白酶與前述原果膠酶一起應(yīng)用進(jìn)一步增強了該凈化力。
(3)漂白劑在本發(fā)明的洗滌劑組合物中添加漂白劑導(dǎo)致對泥污凈化力的進(jìn)一步增強。漂白劑的實例包括過碳酸鈉和過硼酸鈉。
(4)金屬離子螯合劑螯合劑的實例包括縮聚磷酸鹽(例如三聚磷酸鹽)、焦磷酸鹽或正磷酸鹽；硅鋁酸鹽(例如沸石)；合成的層狀結(jié)晶硅酸鹽；次氮基三乙酸酯；乙二胺四乙酸鹽；檸檬酸鹽；異檸檬酸鹽；和聚縮醛羧化物。
這些螯合劑中，結(jié)晶硅鋁酸鹽(合成沸石)是特別優(yōu)選的。在A型、X型和P型沸石中，A型是優(yōu)選的。優(yōu)選應(yīng)用的合成沸石的初級平均粒徑為0.1～10μm，尤其是0.1～5μm。
所述金屬離子螯合劑可被添加的量為0～50％，優(yōu)選為5～40％，并且優(yōu)選應(yīng)用無磷的金屬離子螯合劑。
同樣優(yōu)選的是具有高金屬離子螯合能力的結(jié)晶硅酸鹽，例如下列文獻(xiàn)中描述的那些日本專利申請公開(kokai)Nos.7-89712和60-227895；玻璃物理與化學(xué)(Phys.Chem.Glasses)，7，p127～p138(1966)；Z.Kristallogr.，129，p396～p404(1969)等。它們的實例包括“Na-SKS-6”(δ-Na2Si2O5)(可從Clariant Japan Co.商購)。
(5)抗再沉積劑抗再沉積劑的實例包括聚乙二醇、羧酸聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。這些物質(zhì)中，羧酸聚合物具有金屬離子螯合能力和將固體粒狀污垢從衣服分散到洗滌液中的能力以及抗再沉積作用。所述羧酸聚合物包括丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸等的均聚物或共聚物，馬來酸和上述單體的共聚物是優(yōu)選的。該共聚物的分子量優(yōu)選是數(shù)千到100,000。同樣優(yōu)選的是聚合物例如聚縮水甘油酸鹽，纖維素衍生物例如羧甲基纖維素，或者氨基羧酸聚合物例如聚天冬氨酸鹽，因為這些物質(zhì)還具有螯合金屬離子、分散和防再弄臟的能力。
所述抗再沉積劑被摻和的量為0～20％，優(yōu)選0～10％，更優(yōu)選1～5％。
(6)堿性劑常規(guī)堿性劑優(yōu)選被摻入該洗滌劑組合物。被用于粉狀洗滌劑中的堿性劑實例包括堿金屬碳酸鹽，例如通常稱為重蘇打或輕蘇打的碳酸鈉，以及JIS No.1、2或3的無定形堿金屬硅酸鹽。這些無機(jī)堿性劑在干燥洗滌劑時能有效地形成粒子芯于是可提供具有優(yōu)異流動性的較硬的洗滌劑。代替這些堿性劑，可應(yīng)用碳酸氫三鈉和碳酸氫鈉，并且磷酸鹽例如三聚磷酸鹽也可起堿性劑作用。可被用于液體洗滌劑中并且起表面活性劑的反離子作用的堿性劑實例包括氫氧化鈉和單乙醇胺、二乙醇胺與三乙醇胺，以及前述堿性劑。所述堿性劑被摻入本發(fā)明的組合物中的量優(yōu)選為0.01～60％，更優(yōu)選為1～50％，特別優(yōu)選為1～20％。
(7)至于其它組分，可摻和通常已知的組分；即增充劑，例如硫酸鈉；描述于日本專利申請公開(kokai)No.6-316700中的漂白活化劑或四乙酰乙二胺(TAED)；酶穩(wěn)定劑，例如硼化合物或亞硫酸鈉；吸油基質(zhì)，例如無定形硅鋁酸鹽；消泡劑，例如聚硅氧烷/二氧化硅體系；抗氧化劑；熒光染料；上藍(lán)劑；以及已知量的香料。尤其，描述于日本專利申請公開(kokai)No.8-218093(p.4，1.18和p.7，1.17)中的組分可用作上述組分。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可通過一般方法并組合應(yīng)用前述原果膠酶和已知組分來制備。根據(jù)用途，洗滌劑的形態(tài)可選自液體、粉末或粒子。而且，本發(fā)明的洗滌劑組合物可被用作衣服的洗滌劑和漂白洗滌劑，優(yōu)選作為衣服的洗滌劑。在制備衣服的粒狀洗滌劑時，優(yōu)選將單獨制備的洗滌劑基料和單獨制備的酶粒子干混于是得到所述洗滌劑。當(dāng)然，原果膠酶不能被滅活。
實施例下面將通過實施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但不能認(rèn)為實施例限制本發(fā)明。
I.各種測定方法I-1.反應(yīng)最佳pH的測定1)以原果膠作底物將具有適當(dāng)濃度的酶溶液(0.1ml)添加到含有Britton-Robinson廣域緩沖劑(pH3～12)和棉纖維(2.2％(w/v))的底物溶液(1.9ml)中。將該混合物在30℃下保溫1小時，然后進(jìn)行離心(3000rpm，5分鐘，4℃)。往形成的上清液(0.25ml)中添加冷卻了的濃硫酸(96％，3ml)并混合。還添加咔唑溶液(0.25ml；0.2咔唑/100％乙醇)并混合。讓形成的混合物在80℃水浴中顯色20分鐘然后用水冷卻20分鐘。接著，在525nm處測定吸光度?；谕瑫r配制的D-半乳糖醛酸的校準(zhǔn)曲線計算釋放的果膠的量。由于棉果膠是一種原果膠，所以釋放并溶解棉果膠的酶是原果膠酶。釋放最大量的棉果膠時的pH被定義為反應(yīng)的最佳pH。各種棉織物和棉紗都可用作起該測定中底物作用的棉纖維，但含有更大量果膠質(zhì)的那些優(yōu)選被用于該測定，并且每克棉含有至少5mg果膠質(zhì)(由草酸銨提取法測定的，該方法將在后面描述)的那些是特別優(yōu)選的。除Britton-Robinson廣域緩沖劑之外的緩沖劑可被用于該測定中。因為有些緩沖劑可能會影響某些酶的酶活性，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的緩沖劑可按用途和情形任意選擇。
2)以聚半乳糖醛酸作底物將具有適當(dāng)濃度的酶溶液(0.1ml)添加到含有Britton-Robinson廣域緩沖劑(pH3～12)，聚半乳糖醛酸(PG；ICN Biomedicals，Ohio；0.56％)和氯化鈣(0.56mM)的底物溶液(0.9ml)中。將該混合物在30℃下保溫20分鐘。往形成的混合物中添加1ml DNS溶液(0.5％3，5-二硝基水楊酸；1.6％氫氧化鈉；30％酒石酸鈉鉀)。將該混合物煮沸5分鐘以便使還原糖顯色。恰在顯色后，用冰冷卻該混合物約15分鐘，與4ml離子交換水混合，然后進(jìn)行離心(3,000rpm，10分鐘)。在535nm處測定形成的上清液的吸光度?；谕瑫r配制的D-半乳糖醛酸的校準(zhǔn)曲線計算產(chǎn)生的還原糖的量。將活性最高時的pH定義為反應(yīng)的最佳pH。除Britton-Robinson廣域緩沖劑之外的緩沖劑可被用于該測定中。因為有些緩沖劑可能會影響某些酶的酶活性，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的緩沖劑可按用途和情形任意選擇。
I-2棉果膠釋放能力的測定(pH8.0)將酶溶液(0.1ml)添加到含有Tris-HCl緩沖劑(pH8.0，55.6mM)和棉纖維(2.2％(w/v))的底物溶液(1.9ml)中。該反應(yīng)混合物中的最終酶濃度是0.4mg/ml。使該混合物在30℃下反應(yīng)1小時接著進(jìn)行離心(3,000rpm，5分鐘，4℃)。往形成的上清液(0.25ml)中添加冷卻了的濃硫酸(3ml，96％)并混合。還添加咔唑溶液(0.25ml；0.2％咔唑/100％乙醇)并混合。讓形成的混合物在80℃水浴中顯色20分鐘再用水冷卻20分鐘。接著，在525nm處測定吸光度?；谕瑫r配制的D-半乳糖醛酸的校準(zhǔn)曲線計算釋放的果膠的量。從該結(jié)果計算從1g棉釋放的果膠的量并定義為pH8.0時的棉果膠釋放能力。由于棉果膠是原果膠，所以具有棉果膠釋放能力的酶在堿性范圍內(nèi)具有原果膠酶活性。在該測定中起底物作用的棉紗是每克棉中含有1.5～2.5mg果膠質(zhì)(由草酸銨提取法測定的，該方法將在后面描述)的那些。用于本發(fā)明中的棉紗包括紗線支數(shù)為30～40支的縫紉用棉，是由Kanebo Co.生產(chǎn)的。
I-3應(yīng)用草酸銨提取棉果膠以及棉果膠的定量測定通過草酸銨提取法提取并定量測定了果膠質(zhì)。提取操作是這樣進(jìn)行的將剪得很細(xì)的棉加到0.5％的草酸銨溶液中而得1％(w/v)的棉濃度。通過硫酸咔唑法測定提取的果膠質(zhì)的量。該提取和定量分析的方法是按描述于“The Research Reports by Hamamatsu Technology Center，Shizuoka”(No.4，p.17～22，1994)中的方法進(jìn)行的。
I-4酶粉末中果膠酶活性的測定將具有適當(dāng)濃度的酶溶液(0.1ml)添加到含有緩沖劑、聚半乳糖醛酸(PG；ICN Biomedicals，Ohio；0.56％)和氯化鈣(0.56mM)的底物溶液(0.9ml)中。將該混合物在30℃下保溫20分鐘。作為底物溶液的緩沖劑，將甘氨酸-NaOH緩沖劑(pH10.0，最終濃度50mM)用于測定堿性酶，而將檸檬酸緩沖劑(pH5.0；最終濃度10mM)用于測定酸性酶。往形成的混合物中添加1ml DNS溶液(0.5％3，5-二硝基水楊酸；1.6％氫氧化鈉；30％酒石酸鈉鉀)。將該混合物煮沸5分鐘以便使還原糖顯色。恰在顯色后，用冰冷卻該混合物約15分鐘，與4ml離子交換水混合，然后進(jìn)行離心(3,000rpm，10分鐘)。在535nm處測定形成的上清液的吸光度?；谕瑫r配制的D-半乳糖醛酸的校準(zhǔn)曲線計算產(chǎn)生的還原糖的量，于是獲得酶活性。就酶活性來說，將在一分鐘內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol半乳糖醛酸的還原糖的酶量定義為1U。
I-5纖維素酶活性的測定將具有適當(dāng)濃度的酶溶液(0.1ml)添加到含有羧甲基纖維素(CMCSunrose AO1MC，DS＝0.65～0.75，DP＝250，Nihon Seishi Co.；1.1％)和甘氨酸-NaOH緩沖劑(pH10.0，111mM)的底物溶液(0.9ml)中。將該混合物在40℃下保溫20分鐘。往形成的混合物中添加1ml的DNS溶液(0.5％3，5-二硝基水楊酸；1.6％氫氧化鈉；30％酒石酸鈉鉀)。將該混合物煮沸5分鐘以便使還原糖顯色。恰在顯色后，用冰冷卻該混合物約15分鐘，然后與4ml離子交換水混合。在535nm處測定形成的上清液的吸光度?；谕瑫r配制的D-葡萄糖的校準(zhǔn)曲線計算產(chǎn)生的還原糖的量，于是獲得酶活性。就酶活性來說，將在一分鐘內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol葡萄糖的還原糖的酶量定義為1U。
I-6蛋白酶活性的測定通過如下修改的Anson-Hemoglobin法(M.L.Anson，普通生理學(xué)雜志(J.Gen.Physiol.)，22，79，1938)測定了對脲變性的血紅蛋白的降解活性。將具有適當(dāng)濃度的酶溶液(0.1ml)添加到反應(yīng)混合物中含脲變性的血紅蛋白(1.70％)和氯化鈣(0.46mM)的底物溶液(0.65ml)中。將該混合物在pH10.5和25℃下保溫20分鐘。往形成的混合物中添加1ml三氯乙酸(TCA5％ w/v溶液)從而停止反應(yīng)。將該混合物進(jìn)行離心(3000rpm，10分鐘)。用酚試劑使存在于形成的上清液中的蛋白質(zhì)顯色。基于同時配制的酪氨酸的校準(zhǔn)曲線計算TCA可溶性蛋白質(zhì)的量，于是獲得酶活性。就酶活性來說，將在一分鐘內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)于1mmol酪氨酸的TCA可溶性蛋白質(zhì)的酶量定義為1U。
II.產(chǎn)生堿性原果膠酶的微生物的分離II-1.芽孢桿菌KSM-366菌株的分離將得自日本各地并且懸浮于已滅菌的水中的土壤或者在KaoCorporation的微生物保藏中心貯存的菌株涂在含有聚半乳糖醛酸的瓊脂平板培養(yǎng)基上，然后在30℃下培養(yǎng)3～5天。當(dāng)生長了細(xì)菌后，將1％(w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)溶液傾入培養(yǎng)基中，然后將形成的培養(yǎng)基放置10分鐘。選擇由于聚半乳糖醛酸的分解而在菌落周圍形成清亮區(qū)的細(xì)菌并作為產(chǎn)生果膠酸裂合酶的細(xì)菌保藏，于是用于制備經(jīng)歷各種試驗的粗酶。按這種方式，選擇芽孢桿菌KSM-366菌株作為生產(chǎn)具有堿性原果膠酶活性的酶的細(xì)菌。
菌株KSM-366的真菌學(xué)特征如下A形態(tài)特征(a)細(xì)胞的形狀和大小桿狀(0.6～0.8)×(3～5)μm(b)多形性 無(c)活動性 有(有緣毛的鞭毛)(d)孢子(大小、形狀、位置、 (0.6～1.0)×(1.0～5)μm，膨脹) 從中央到亞端的，不膨脹(e)革蘭氏染色 陽性
(f)耐酸性陰性(g)在肉湯瓊脂平板上的生長形成乳白色、平滑或葉形菌落(h)石蕊牛奶 堿化，液化B生理學(xué)特征(a)硝酸鹽的還原 陽性(b)反硝化作用陰性(c)MR檢驗陰性(pH5.8)(d)VP檢驗陽性(e)吲哚形成 陰性(f)硫化氫形成陰性(g)淀粉水解 陽性(h)檸檬酸的利用 陽性(Christensen，Simmons培養(yǎng)基)(i)無機(jī)氮的利用 利用了硝酸鹽和銨鹽(j)色素形成 無(k)脲酶 陰性(l)氧化酶陽性(m)過氧化氫酶陽性(n)生長溫度范圍 10℃～45℃(最佳溫度30℃～40℃)(o)生長pH范圍pH5～11(最佳生長pHpH6～9)(p)氧對生長的影響在厭氧條件下生長(q)OF檢驗-(無顏色變化的生長)(r)氯化鈉耐性在含10％氯化鈉的培養(yǎng)基上生長(s)從糖形成酸從下列物質(zhì)生成了酸半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘露糖、
肌醇、山梨糖醇、海藻糖、甘油、麥芽糖、果糖、蜜三糖、蜜二糖和可溶性淀粉；從乳糖未形成酸(t)從葡萄糖形成氣體 無基于“伯捷氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊”(“Berger’s Manual of SystematicBacteriology”)(Williams & Wilkins Co.，1984)中的描述，上述真菌學(xué)特征的研究合理地啟示了該菌株屬于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。然而，該菌株在高于45℃的溫度下不能存活，但在11的最大pH下能存活。由于已知的地衣芽孢桿菌菌株不具有這些性能，所以該菌株是一種新微生物。因此，我們將該菌株(一種新微生物)作為芽孢桿菌KSM-366(FERM BP-6262)保藏在工業(yè)科學(xué)和技術(shù)局的國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所。
II-2芽孢桿菌KSM-P15菌株的分離按II-1中描述的相同方法，將芽孢桿菌KSM-P15菌株作為生產(chǎn)表現(xiàn)堿性原果膠酶活性的酶的細(xì)菌進(jìn)行了分離。
菌株KSM-P15的真菌學(xué)特征如下A形態(tài)特征(a)細(xì)胞的形狀和大小桿狀(0.3～0.5)×(1.6～2.1)μm(b)多形性 無(c)活動性 有(d)孢子(大小、形狀、位置、 (0.6～0.7)×(1.2～膨脹) 1.4)μm，從中央到亞端，膨脹(e)革蘭氏染色 陽性(f)耐酸性 陰性(g)在肉湯瓊脂平板上的生長 形成淡黃白色、點狀、隆起的整個菌落(h)石蕊牛奶淡紅色，未凝固B生理學(xué)特征(a)硝酸鹽的還原 陽性(b)反硝化作用 陰性(c)MR檢驗 陽性(pH5.5)(d)VP檢驗 陽性(e)吲哚形成 陰性(f)硫化氫形成 陰性(g)淀粉水解 陽性(h)檸檬酸的利用 陽性(i)無機(jī)氮的利用 未利用硝酸鹽或銨鹽(j)色素形成 無(k)脲酶 陰性(l)氧化酶 陽性(m)生長溫度范圍 20℃～45℃(n)生長pH范圍 pH7～10(o)氧對生長的影響 在厭氧條件下生長(p)OF檢驗 生長，無顏色變化(q)從葡萄糖形成氣體 無(r)氯化鈉耐性 在含3％氯化鈉的培養(yǎng)基上未生長(s)從糖形成酸 從下列物質(zhì)生成了酸半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘露糖、海藻糖、乳糖、甘油、麥芽糖、果糖、蜜三糖、蜜二糖和可溶性淀粉；從肌醇或山梨糖醇未形成酸基于“伯捷氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊”(Williams & Wilkins Co.，1984)中的描述，上述真菌學(xué)特征合理地啟示了該菌株屬于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)，這是一個具有很多變種的菌株。然而，該菌株具有不完全與環(huán)狀芽孢桿菌的已知菌株相符的性能，所以該菌株是一種新微生物。因此，該菌株(一種新微生物)作為芽孢桿菌KSM-P15(FERMBP-6241)被保藏在工業(yè)科學(xué)和技術(shù)局的國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所。
III.具有堿性原果膠酶活性的果膠酸裂合酶的制備及其酶學(xué)性能III-1通過芽孢桿菌KSM-366菌株生產(chǎn)的果膠酸裂合酶A.酶的制備將芽孢桿菌KSM-366菌株在含果膠質(zhì)(0.5％)和碳酸鈉(0.5％)的營養(yǎng)肉湯(0.8％)中培養(yǎng)總計72小時。接著，離心該培養(yǎng)液以便除去細(xì)胞。通過超濾(6,000-Mr截止)濃縮這樣獲得的上清液。將形成的濃縮液凍干，于是獲得酶粉末。這樣獲得的酶粉末表現(xiàn)原果膠酶活性并且將在下文被稱為原果膠酶A。
接著，將原果膠酶A溶于25mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.5)，加到用相同的緩沖劑平衡的Super Q Toyopearl 650C(Toso Co.的產(chǎn)品)的柱(5×20cm)上。收集用平衡緩沖劑洗脫的蛋白質(zhì)(未被柱吸附的蛋白質(zhì))，然后裝到用20mM磷酸緩沖劑(pH6.0)平衡的、SP Toyopearl 550C(TosoCo.的產(chǎn)品)的柱(2.5×20cm)上。用平衡緩沖劑洗滌該柱，并用0～0.3M氯化鈉于平衡緩沖劑中的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)，從而收集表現(xiàn)果膠酶活性的蛋白質(zhì)。通過超濾(PM10 Diaflo膜，Amicon的產(chǎn)品；10,000-Mr截止)濃縮這樣獲得的級分，接著加到用含有100mM氯化鈉和1mM氯化鈣的50mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.5)平衡的、Sephacryl S-200(Pharmacia的產(chǎn)品)的柱(2.6×60cm)上，再用該緩沖劑洗脫。收集包括幾乎單一蛋白質(zhì)的果膠酶活性級分，透析，然后凍干，于是獲得純化過的酶粉末。這樣獲得的酶表現(xiàn)原果膠酶活性并且將被稱為原果膠酶PA。
B酶學(xué)性能(a)標(biāo)準(zhǔn)酶活性將包含0.1M Tris-HCl緩沖劑(pH8)、0.5mM氯化鈣和0.2％聚半乳糖醛酸(由Sigma生產(chǎn))的底物溶液(3ml)在30℃下保溫5分鐘。添加適當(dāng)稀釋了的酶溶液
而引發(fā)反應(yīng)。將該混合物在30℃下保溫20分鐘，然后將它在沸水中放置5分鐘而終止該酶反應(yīng)。通過測量235nm處的吸光度并且應(yīng)用不飽和二半乳糖醛酸酐的摩爾消光系數(shù)(4600M-1cm-1，Hasegawa & Nagel，食品科學(xué)雜志(J.Food Sci.)，31，838～845，1966)進(jìn)行計算來測定反應(yīng)中形成的不飽和低聚半乳糖醛酸的量。應(yīng)用了試驗空白，即在添加了所述酶溶液后立即將該試驗空白在沸水中放置5分鐘。一個酶單位(1U)被定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol不飽和二半乳糖醛酸酐的不飽和低聚半乳糖醛酸的酶量。在測定反應(yīng)的最佳pH的實驗中，將時間掃描方法用來直接測定235nm處的吸光度增加。
(b)最佳pH應(yīng)用0.2M Britton-Robinson廣域緩沖劑(pH6.5～12.0)通過標(biāo)準(zhǔn)酶活性測定方法研究了反應(yīng)的最佳pH。結(jié)果表明，該反應(yīng)的最佳pH是8.0～9.0。
(c)最佳溫度在5℃～70℃之間(包括端點)的溫度下通過應(yīng)用0.1M Tris-HCl緩沖劑(pH8.0)研究了反應(yīng)的最佳溫度。結(jié)果表明，所述酶在10℃～70℃的寬溫度范圍內(nèi)起作用，以約60℃為最佳溫度。
(d)分子量通過SDS-PAGE(12.5％凝膠)估測該酶的分子量約為43kDa。
(e)等電點應(yīng)用含有pH8～10.5或pH3～10的兩性電解質(zhì)的5％聚丙烯酰胺凝膠(Pharmalyte，Pharmacia的產(chǎn)品)通過等電聚焦PAGE測得所述酶的等電點約為pH10.3。
III-2.由芽孢桿菌KSM-P15菌株生產(chǎn)的果膠酸裂合酶A.酶的制備按III-1A中描述的相同方法培養(yǎng)了芽孢桿菌KSM-P15菌株，并制備了該酶粉末。獲得的酶粉末表現(xiàn)原果膠酶活性并且將在下文被稱為原果膠酶B。
接著，將原果膠酶B溶于50mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.5)，加到用相同的緩沖劑平衡的Super Q Toyopearl 650C(Toso Co.的產(chǎn)品)的柱(5×20cm)上。收集用平衡緩沖劑洗脫的蛋白質(zhì)(未被柱吸附的蛋白質(zhì))，然后注入Bio Cad60 HPLC系統(tǒng)(Nibon Perceptive Co.的產(chǎn)品)中，該系統(tǒng)裝有一個用含0.2mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.0)平衡的HS柱(磺丙基；1×10cm)。用0～0.2M氯化鈉于平衡緩沖劑中的線性梯度洗脫吸附在該柱上的蛋白質(zhì)，從而收集表現(xiàn)果膠酶活性并包括幾乎單一蛋白質(zhì)的級分。將這樣獲得的級分透析并凍干，于是得到純化過的酶粉末。所述生成的酶表現(xiàn)原果膠酶活性并且將被稱為原果膠酶PB。
B酶學(xué)性能(a)標(biāo)準(zhǔn)酶活性將0.5M甘氨酸-NaOH緩沖劑(pH10.5)(0.3ml)、6mM氯化鈣(0.3ml)和離子交換水(1.7ml)置于試管中，然后將該試管在30℃下保溫5分鐘。將適當(dāng)?shù)叵♂屃说拿溉芤?br> 添加到該試管中，將該試管在恒溫下進(jìn)一步保溫5分鐘。將聚半乳糖醛酸的水溶液(0.6ml，1％(w/v)，ICNBiochemicals Co.的產(chǎn)品)添加到所述酶溶液中而引發(fā)反應(yīng)，并將該混合物在30℃下保溫10分鐘。通過添加3ml的50mM HCl終止該反應(yīng)。通過測量235nm處的吸光度并且應(yīng)用不飽和二半乳糖醛酸酐的摩爾消光系數(shù)(4,600M-1cm-1，S.Hasegawa和C.W.Nagel，食品科學(xué)雜志，31，838～845，1966)進(jìn)行計算來測定該反應(yīng)中形成的不飽和低聚半乳糖醛酸的量。按如下方法制備了試驗空白將50mM鹽酸(3ml)添加到用未摻和所述酶的溶液處理過的反應(yīng)混合物中，接著將酶溶液(0.1ml)加到其中。一個酶單位(1U)被定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol不飽和二半乳糖醛酸酐的不飽和低聚半乳糖醛酸酐的酶量。
(b)最佳pH應(yīng)用50mM Tris-HCl緩沖劑(pH7～9)或50mM甘氨酸-NaOH緩沖劑(pH8.5～11.0)通過標(biāo)準(zhǔn)酶活性測定方法研究了反應(yīng)的最佳pH。所述酶在甘氨酸-NaOH緩沖劑(pH10.5)中表現(xiàn)最高反應(yīng)速度。在pH10.3～10.7時，該活性是最大活性的90％或更多，并且在pH10～11之間，該活性是最大活性的70％或更多。
(c)最佳溫度在10℃～70℃之間(包括端點)的溫度下通過應(yīng)用50mM甘氨酸-NaOH緩沖劑(pH10.5)研究了反應(yīng)的最佳溫度。結(jié)果表明，所述酶在10℃～65℃的寬溫度范圍內(nèi)起作用，以50～55℃為最佳溫度。
(d)分子量(d-1)通過沉降平衡實驗獲得的酶分子量是20.3±1.0kDa。
(d-2)通過SDS-PAGE(15％凝膠)估測該酶的分子量約為26kDa。將分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(SDS-PAGE分子量標(biāo)準(zhǔn)，低范圍，Bio-Rad的產(chǎn)品)用作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
(e)等電點應(yīng)用含有pH8～10.5的兩性電解質(zhì)的5％聚丙烯酰胺凝膠(Pharmalyte，Pharmacia的產(chǎn)品)通過等電聚焦PAGE測得所述酶的等電點約為pH10.3。
(f)氨基酸末端序列將所述酶在ProSorb濾膜(Perkin-Elmer Co.)上作印跡并且應(yīng)用蛋白質(zhì)測序儀(674型，Applied Biosystem Co.)分析，從而確定直到第20個氨基酸的氨基酸序列；即APTVVHETIRVPAGQTFDGK.
(g)內(nèi)部氨基酸序列將所述酶用賴氨酰內(nèi)肽酶處理。應(yīng)用自動C端片段分級分離器(CTFF-1Shimadzu Co.)從處理過的溶液分級分離內(nèi)部肽。將該樣品在ProSorb濾膜上作印跡并且應(yīng)用蛋白質(zhì)測序儀測定N端氨基酸序列，從而測得序列為VVIGAPAADGVH。
(h)化學(xué)試劑的影響將各種化學(xué)試劑加到50mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.5)中。將酶溶液加入其中。在30℃下將該混合物保溫1小時后，通過標(biāo)準(zhǔn)分析條件測定了殘余活性。結(jié)果表明，所述酶未受表面活性劑(0.01～0.1％)、螯合劑(0.15～0.20％)或其它化合物的抑制。
IV.克隆得自芽孢桿菌KSM-P15菌株的果膠酸裂合酶的基因以及從轉(zhuǎn)化體制備相應(yīng)的酶IV-1.所述基因的克隆A.基因組DNA的制備在振蕩下將芽孢桿菌KSM-P15菌株在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行需氧培養(yǎng)，再將該培養(yǎng)液離心而收集細(xì)胞。按Saito和Miura的方法(生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochim.Biophys.Acta)，72，619～629，1963)從獲得的細(xì)胞制備基因組DNA。
B.引物制備基于(III-2)中實施例B-f和實施例B-g的結(jié)果合成了引物1和引物2(圖1)。
C.克隆通過應(yīng)用引物1和引物2，并且以芽孢桿菌KSM-P15的基因組DNA(0.5μg)為模板進(jìn)行了PCR。用PCR片段純化試劑盒(BoehringerMannheim)純化獲得的擴(kuò)增了的片段，并且通過將該片段引入質(zhì)粒載體pUC19的Sma I位點而進(jìn)行克隆。在數(shù)個獲得的克隆的已測定核苷酸序列中檢測了靶果膠酸裂合酶的部分基因序列，還推斷了氨基酸序列(見圖2)。
接著，進(jìn)行了反向PCR以便擴(kuò)增上述PCR擴(kuò)增片段的上游區(qū)和下游區(qū)。應(yīng)用了圖2中觀察的核苷酸序列、引物3和引物4。用Pst I預(yù)消化了菌株KSM-P15的基因組DNA(1μg)，用苯酚/氯仿提取，再用T4 DNA連接酶處理而形成分子內(nèi)鍵(環(huán)狀DNA鍵)以便提供模板。應(yīng)用LongTemplate System PCR試劑盒(TaKaRa Co.)進(jìn)行了聚合酶鏈反應(yīng)。檢測到約2.0kbp的擴(kuò)增片段并對該DNA片段直接進(jìn)行了測序。因此，果膠酶裂合酶的氨基酸序列和核苷酸序列(序列1)包括從N端氨基酸序列到終止密碼子(TAA)之前的氨基酸的197個氨基酸。從這些序列推斷出由菌株KSM-P15產(chǎn)生的果膠酸裂合酶(分泌型成熟酶)的分子量為20924Da(大約21kDa)。
設(shè)計了引物5(圖3)以便將恰好位于由菌株KSM-P15產(chǎn)生的果膠酸裂合酶的N端氨基酸(Ala)上游的推斷信號肽酶識別序列(Ala-Glu-Ala)與得自應(yīng)用的載體的信號序列連接。設(shè)計了具有26bp的序列的引物6(圖3)，該序列位于果膠酸裂合酶的基因的終止密碼子(TAA)的下游區(qū)(372bp)內(nèi)。
通過應(yīng)用引物5和引物6，并且以菌株KSM-P15的基因組DNA為模板進(jìn)行了聚合酶鏈反應(yīng)，從而將所述DNA片段擴(kuò)增到約1kbp。用Sal I消化了該DNA片段，通過利用連接酶連接到已用Sal I和Sma I切割了的pHSP64上(Sumitomo等，生物科學(xué)、生物技術(shù)與生物化學(xué)(Biosci.Biotech.Biochem.)56，872，1992)(見圖4)。
將形成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌HB101細(xì)胞并使該轉(zhuǎn)化體在瓊脂平板培養(yǎng)基上生長從而在菌落周圍形成清亮區(qū)(見II-1和II-2)。將本發(fā)明所獲得的編碼本發(fā)明的基因的重組質(zhì)粒命名為pHSP-A156。
IV-2.從轉(zhuǎn)化體制備酶將pHSP-A 156引入枯草芽孢桿菌ISW1214細(xì)胞并且將該轉(zhuǎn)化體在30℃下的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天，從而以相當(dāng)大的量由胞外生產(chǎn)果膠酸裂合酶。
按前述操作(III-2-A)純化這樣獲得的粗果膠酸裂合酶溶液。該酶表現(xiàn)原果膠酶活性，于是該酶在下文將被稱為原果膠酶RB。原果膠酶RB的pH對活性的曲線幾乎與原果膠酶PB的完全一致。
V.凈化力試驗V-1.用于凈化力試驗中的酶的制備(a)原果膠酶A按前面III-1-A中描述的方法制備。
(b)原果膠酶PA按前面III-1-A中描述的方法制備。
(c)原果膠酶B按前面III-2-A中描述的方法制備。
(d)原果膠酶PB按前面III-2-A中描述的方法制備。
(e)原果膠酶RB按前面IV-2中描述的方法制備。
(f)原果膠酶C按如下方法制備原果膠酶C將枯草芽孢桿菌IFO 12113按Sakai等描述的方法(農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)，53，1213，(1989))培養(yǎng)。接著，離心該培養(yǎng)液而除去細(xì)胞。通過超濾(6,000-Mr截止)濃縮形成的上清液。將形成的濃縮液凍干從而獲得酶粉末。這樣獲得的酶粉末具有釋放棉果膠的能力，于是，該酶將在下文被稱為原果膠酶C。確定將原果膠酶C歸入B型原果膠酶，因為它不表現(xiàn)果膠酶活性。
(g)果膠酶D按如下方法制備果膠酶D培養(yǎng)芽孢桿菌KSM-S272(國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)局，保藏號為FERM P-16066)，離心該培養(yǎng)液而除去細(xì)胞。通過超濾(6,000-Mr截止)濃縮形成的上清液。將形成的濃縮液凍干從而獲得具有果膠酶活性的酶粉末。該酶在下文將被稱為果膠酶D。果膠酶D表現(xiàn)堿性果膠酸裂合酶活性，但不表現(xiàn)原果膠酶活性。
(h)果膠酶PD接著，將果膠酶D溶于含1mM氯化鈣的50mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.5)。將該溶液加到用相同的緩沖劑平衡的Super Q Toyopearl 650M(Tosoh Co.的產(chǎn)品)的柱(2.5×10cm)上。收集用平衡緩沖劑洗脫的蛋白質(zhì)(未吸附在柱上的蛋白質(zhì))并注入裝有HS柱(磺丙基；1×10cm)的Bio Cad 60 HPLC系統(tǒng)(Nihon Perceptive Co.的產(chǎn)品)，該HS柱用含有0.2mM氯化鈣(pH7.0)的20mM Tris-HCl緩沖劑平衡了。用0～0.2M氯化鈉于平衡緩沖劑中的線性梯度洗脫吸附在柱上的蛋白質(zhì)，從而收集表現(xiàn)果膠酶活性并且包括幾乎單一蛋白質(zhì)的級分。將這樣獲得的級分透析，然后凍干，從而獲得純化了的酶粉末。該酶將被稱為果膠酶PD。與原果膠酶PA和PB相似，果膠酶PD表現(xiàn)堿性果膠酸裂合酶活性，但不表現(xiàn)原果膠酶活性。
(i)可商購的果膠酶應(yīng)用了下列果膠酶。
Sucrase N(Sankyo Co.)果膠酶Tanabe(Tanabe Seiyaku Co.)Pectolyase(Kikkoman Co.)果膠酶SS(Yakult Honsha Co.)果膠酶HL(Yakult Honsha Co.)V-2.應(yīng)用于凈化力試驗中的酶的活性表1
1)應(yīng)用Britton-Robinson廣域緩沖劑進(jìn)行測定。星號指的數(shù)據(jù)是從應(yīng)用甘氨酸-NaOH緩沖劑獲得的，因為用Britton-Robinson廣域緩沖劑不能測定。
2)應(yīng)用Tris-HCl緩沖劑(pH8.0)進(jìn)行測定。
3)對于原果膠酶A、PA、B、PB、RB和果膠酶D來說，活性是應(yīng)用甘氨酸-NaOH緩沖劑(pH10.0)測定的；而對于其它酶來說，是在檸檬酸鹽緩沖劑(pH5.0)中測定的。
4)B型原果膠酶；對聚半乳糖醛酸不表現(xiàn)分解活性。
5)不能測定活性(即無活性)。
V-3.測試凈化力的方法1.洗滌被泥污弄臟的布片的試驗
用Kanuma-Akadama泥土(日本的Kanuma地區(qū)的泥土)弄臟了棉紡織的布片(針織廠)，從而制備人工法用泥弄臟的布片。
將下文描述的洗滌劑組合物中的每種溶于4°DH硬水(71.2mg；CaCO3/升)以便具有預(yù)定的洗滌劑濃度，從而制備一升洗滌劑溶液。將該洗滌劑溶液轉(zhuǎn)至Terg-O-Tometer不銹燒杯。將五片人工弄污的布加到該洗滌溶液中，在100rpm和30℃下洗滌10分鐘。用流水漂洗該試驗布片，熨平，然后進(jìn)行反射率的測定。
應(yīng)用自動記錄色度計(Shimadzu Co.)測定了被弄污前的原始布料以及洗滌前和洗滌后的布料的反射率。應(yīng)用如下方程計算了凈化力(％)凈化力(％)＝{(洗滌后的反射率)-(洗滌前的反射率)}/{(原始布料的反射率)-(洗滌前的反射率)}×1002.泥襪的洗滌試驗該試驗的參加者穿著運動襪(棉紗和丙烯酸系紗的混紡纖維；由Gunze Co.生產(chǎn)的)。將與用于弄污前述布料的相同種類的泥土等量地涂在右襪和左襪上。用對比洗滌劑組合物洗滌一組十只襪(五只左襪和五只右襪)，用樣品洗滌劑組合物洗滌余下的十只襪(五只右襪和五只左襪)。
洗滌方法如下將每種洗滌劑組合物溶于30升30℃的水(4°DH)以便具有預(yù)定的濃度。將所述襪置于家用雙桶型電動洗衣機(jī)中洗滌10分鐘，用流水漂洗5分鐘，脫水，然后涼干。
至于估價凈化力，將一雙襪進(jìn)行相互比較；其中一只襪是用起對比作用的參比洗滌劑(不含酶的洗滌劑)洗滌的，相對于對比物評價用試驗洗滌劑(含酶的洗滌劑組合物)洗滌的另一只襪。由三名評判人對這十只襪進(jìn)行主觀評價，并將評價分?jǐn)?shù)之和當(dāng)成評價凈化力的等級。評價標(biāo)準(zhǔn)如下+2的確比參比洗滌劑更好+1比參比洗滌劑稍微好些0比得上參比洗滌劑-1比參比洗滌劑稍微差些
-2的確比參比洗滌劑更差V-4凈化力試驗的結(jié)果A.當(dāng)所述酶被摻入衣服用洗滌劑時的效果(a)用于該試驗的洗滌劑的組成
表2
LAS線型烷基(C12～C14)苯磺酸鈉(用于液態(tài)洗滌劑，配制了酸型LAS)。
AS烷基硫酸鹽AE-1聚氧乙烯月桂基醚(添加的E.O.的平均摩爾數(shù)＝4)AF-2聚氧乙烯烷基(C12～C14)醚(添加的E.O.的平均摩爾數(shù)＝6)AEP聚氧乙烯聚氧丙烯月桂基醚(添加的E.O.的平均摩爾數(shù)＝8；添加的P.O.的平均摩爾數(shù)＝3)AES烷基醚硫酸鹽(添加的E.O.的平均摩爾數(shù)＝2.5)脂肪酸得自棕櫚油的脂肪酸鈉沸石4A型沸石，平均粒徑為3μm無定形硅鋁酸鹽見合成實施例1碳酸鈉重蘇打灰無定形硅酸鹽JIS No.2硅酸鈉結(jié)晶硅酸鹽SKS-6(Clariant Japan Co.)，研磨了，平均粒徑15μmAA-MASokalan CP5，丙烯酸-馬來酸共聚物(BASF)PEG聚乙二醇，平均分子量為8,000合成實施例1(制備無定形硅鋁酸鹽的方法)將鋁酸鈉的水溶液(1,010g；Na2O 1.55wt％，Al2O32.30wt％，Na2O/Al2O3＝1.11(摩爾比))加熱到40℃。當(dāng)在1,500rpm下攪拌該溶液時，在20分鐘內(nèi)滴加硅酸鈉水溶液(700g；Na2O 2.75wt％，SiO27.88wt％，SiO2/Na2O＝2.96(摩爾比))和CaCl2·2H2O(1.2g)而引發(fā)反應(yīng)。添加完畢，另外將該混合物加熱15分鐘。接著，通過過濾收集固體物質(zhì)并洗滌。將這樣獲得的濕濾餅在105℃和300乇下干燥10小時。將干濾餅研磨從而獲得細(xì)分散的硅鋁酸鹽粉末，通過X射線檢測證實它是無定形的。
原子吸收分析和等離子體發(fā)射分析表明該這樣獲得的無定形硅鋁酸鹽具有下列組成Al2O321.1wt％，SiO257.2wt％，Na2O 20.8wt％，以及CaO 0.9％(1.65Na2O·0.08CaO·Al2O3·4.75 SiO2)。吸油能力為210ml/100g。
(b)試驗結(jié)果下面的(b-1)～(b-5)中描述了通過應(yīng)用具有表2中所示組成的洗滌劑(a)～(d)進(jìn)行洗滌的試驗結(jié)果，其中的洗滌劑分別添加了各種酶。
從這些結(jié)果可見，本發(fā)明的含原果膠酶的洗滌劑組合物表現(xiàn)的凈化效果明顯高于從含對比性果膠酶的洗滌劑組合物獲得的結(jié)果。此外，當(dāng)摻和了堿性酶(例如原果膠酶A和B)時，可在具有高pH的洗滌劑溶液中產(chǎn)生優(yōu)異的效果。值得注意的是，甚至當(dāng)省去預(yù)浸泡步驟時也可獲得這種優(yōu)異的效果。還應(yīng)注意，在果膠酶(它們在堿性區(qū)內(nèi)具有反應(yīng)的最佳pH)中，能釋放棉果膠的原果膠酶A和B表現(xiàn)優(yōu)異的凈化力，而不能釋放棉果膠的果膠酶D則不表現(xiàn)凈化力。從此可總結(jié)出，堿性原果膠酶作為洗滌劑組分是有效的。
(b-1)得自洗滌劑(a)的洗滌試驗(洗滌液的pH為10.7)的結(jié)果洗滌條件Terg-O-Tometer 100rpm，10分鐘，30℃
表3
從表3可見，本發(fā)明的原果膠酶甚至當(dāng)被摻入重垢型洗滌劑和被用于高pH的洗滌液中時也提供改善的凈化力。反之，含有可商購的果膠酶的對比洗滌劑組合物實際上未表現(xiàn)效果。在對有泥垢的襪的凈化力評價中，本發(fā)明的產(chǎn)品和對比產(chǎn)品之間凈化力的差異更為明顯。此外，應(yīng)注意，雖然確認(rèn)了粗酶制劑的凈化力，但純化過的酶即使只少量地應(yīng)用也提供增強的凈化力。
(b-2)洗滌劑(b)的洗滌試驗(洗滌液的pH為10.6)的結(jié)果洗滌條件Terg-O-Tometer 100rpm，10分鐘，30℃
表4
從表4可見，本發(fā)明的原果膠酶甚至當(dāng)被摻入含非離子型表面活性劑作為主要組分并且具有高的洗滌液pH的重垢型洗滌劑時也提供改善的凈化力。反之，含有可商購的果膠酶的對比洗滌劑組合物實際上未表現(xiàn)效果。應(yīng)注意，雖然確認(rèn)了粗酶制劑的凈化力，但純化過的原果膠酶只少量地應(yīng)用也提供增強的凈化力。
(b-3)洗滌劑(c)的洗滌試驗(洗滌液的pH為9.2)的結(jié)果洗滌條件Terg-O-Tometer 100rpm，10分鐘，30℃
表5
從表5可見，顯然本發(fā)明的原果膠酶甚至被摻入液體洗滌劑組合物中時也提供改善的凈化力。反之，含有可商購的果膠酶的對比洗滌劑組合物實際上未表現(xiàn)效果。此外，應(yīng)注意，雖然確認(rèn)了粗酶制劑的凈化力，但純化過的原果膠酶只少量地應(yīng)用也提供增強的凈化力。
(b-4)洗滌劑(d)的洗滌試驗(洗滌液的pH為8.0)的結(jié)果洗滌條件將待洗滌的物品預(yù)浸泡于具有六倍于實際應(yīng)用的濃度的40℃洗滌劑溶液中。接著，將所述濃度降到實際應(yīng)用的濃度，在100rpm和30℃下的Terg-O-Tometer中洗滌所述物品達(dá)10分鐘。
表6
從表6可見，顯然本發(fā)明的原果膠酶提供改善的凈化力。當(dāng)在具有6倍濃度的40℃洗滌劑溶液中進(jìn)行了預(yù)浸泡時，含有可商購的果膠酶的對比洗滌劑組合物表現(xiàn)了一定的效果。然而，該效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如本發(fā)明的產(chǎn)品所達(dá)到的效果。應(yīng)注意，雖然確認(rèn)了粗酶制劑的凈化力，但純化過的原果膠酶只少量地應(yīng)用也提供增強的凈化力。
(b-5)洗滌劑(d)的洗滌試驗(洗滌液的pH為8.0)的結(jié)果洗滌條件Terg-O-Tometer 100rpm，10分鐘，30℃
表7
從表7可見，顯然，不浸泡時，本發(fā)明的原果膠酶也提供改善的凈化力。反之，含有可商購的果膠酶的對比洗滌劑組合物實際上未表現(xiàn)效果。雖然確認(rèn)了粗酶制劑的凈化力，但純化過的酶只少量地應(yīng)用也提供增強的凈化力。
此外，還通過將0.1重量份的原果膠酶A、B、PA、PB、或RB摻入100重量份示于表8和9中的洗滌劑組合物而制備了本發(fā)明的洗滌劑組合物。當(dāng)形成粒狀洗滌劑組合物時，首先將除所述酶、PC、AC-1和AC-2之外的成分?；苽湎礈靹┗?，接著分別將所述酶、PC、AC-1和AC-2?；⑶遗c所述洗滌劑基料粒子摻和。這樣制備的洗滌劑組合物具有優(yōu)異的凈化力并且適用于洗滌衣服。
表8
表9
LAS-2通過用48％NaOH中和烷基苯磺酸“Alkene L”(烷基鏈的碳原子數(shù)10～14Nisseki Senzai Co.的產(chǎn)品)而獲得的產(chǎn)物。LAS-3通過用50％KOH中和烷基苯磺酸“Alkene L”(烷基鏈的碳原子數(shù)10～14；Nisseki Senzai Co.的產(chǎn)品)而獲得的產(chǎn)物。AS-2Dovanol 25 Sulfate(C12～C15硫酸)的鈉鹽(Mitsubichi Kagaku Co.的產(chǎn)品)。SASHostapur SAS 93，(C13～C18鏈烷磺酸鈉)(Clariant Japan Co.的產(chǎn)品)。AOSα-烯屬磺酸鈉SFE得自棕櫚油。α-磺基脂肪酸甲酯鈉。脂肪酸鹽棕櫚酸鈉AES-2聚氧乙烯烷基(C12～C15)醚硫酸鈉(添加的E.O.的平均摩爾數(shù)＝2)。AE-3Nonidet S-3(通過以平均三摩爾的量將E.O.添加到C12或C13醇而獲得的產(chǎn)物)(由Mistubishi Kagaku Co.生產(chǎn)的)。AE-4Nonidet R-7(通過以平均7.2摩爾的量將E.O.添加到C12～C15醇而獲得的產(chǎn)物)(由Mistubishi Kagaku Co.生產(chǎn)的)。AE-5Softanol 70(通過以平均七摩爾的量將E.O.添加到C12～C15仲醇而獲得的產(chǎn)物)(由Nippon Shokubai Co.生產(chǎn)的)。AG烷基(得自棕櫚油)葡糖苷(平均聚合度為1.5)。吸油載體Tixolex 25(無定形硅鋁酸鈉；由Kofran Chemical生產(chǎn)的；吸油能力235ml/100g)。結(jié)晶硅酸鹽SKS-6；δ-Na2Si2O5；結(jié)晶層狀硅酸鹽；平均粒徑20μm；由Clariant Japan Co.生產(chǎn)的。無定形硅酸鹽JIS No.1硅酸鈉STPP三磷酸鈉NTA次氮基三乙酸鈉PAA聚丙烯酸鈉；平均分子量為12,000。AA-MASokalan CP5；丙烯酸-馬來酸共聚物。CMCSunrose B1B；羧甲基纖維素鈉；由Nibon Seishi Co.生產(chǎn)的)。PEG聚乙二醇；平均分子量為6,000。PVP聚乙烯吡咯烷酮；平均分子量為40,000；K值為26～35。熒光染料Tinopal CBS(由Chiba Geigy生產(chǎn)的)和Whitex SA(由SumitomoChemical Co.生產(chǎn)的)的1∶1摻和物。(注意在液態(tài)洗滌劑的情況下，單獨摻和Tinopal CBS。)香料按日本專利申請公開(kokai)No.8-239700的實施例部分中描述的香料組合物配制的。酶Savinase 12.0 TW(蛋白酶)、Lipolase 100T(脂肪酶)、Termamyl 60T(淀粉酶)(所有這些酶都是由Novo Nordisk A/S生產(chǎn)的)和KAC 500(纖維素酶，由Kao Co.生產(chǎn)的)的2∶1∶1∶1摻和物。(注意在液態(tài)洗滌劑的情況下，單獨摻和Savinase 16.0L(蛋白酶；由Novo Nordisk A/S生產(chǎn)的)。)PC過碳酸鈉；平均粒徑400μm；涂覆了偏硼酸鈉。AC-1TAED，四乙酰乙二胺；由Clariant Co.，Ltd.生產(chǎn)的。AC-2月桂酰氧基苯磺酸鈉B.當(dāng)酶被摻入漂白洗滌劑時的效果制備了具有表11中所示組成的漂白洗滌劑。將人工法用泥弄臟的布片浸泡在每種洗滌劑的0.5％水溶液中(20℃，30分鐘)，接著應(yīng)用Terg-O-Tometer在100rpm和20℃下洗滌10分鐘。結(jié)果示于表10中。
表10
1)線型烷基苯磺酸鈉(碳原子數(shù)為12～14)2)聚氧乙烯烷基醚(烷基的碳原子數(shù)＝12～14；添加的E.O.的平均摩爾數(shù)＝12)3)平均分子量為8,0004)原果膠酶PB，通過日本專利申請公開(kokai)No.62-257990中描述的方法粒化的。50,000U/g粒子(在pH10.0下的果膠酶活性)。5)原果膠酶RB，通過日本專利申請公開(kokai)No.62-257990中描述的方法粒化的。50,000U/g粒子(在pH10.0下的果膠酶活性)。
從表10可知，本發(fā)明的含原果膠酶的漂白洗滌劑組合物表現(xiàn)出驚人的對泥污的凈化力。C.組合應(yīng)用原果膠酶和纖維素酶和/或蛋白酶產(chǎn)生的效果
將表10中所示的各種酶按表11中給出的量摻入前述洗滌劑(a)，再應(yīng)用形成的洗滌劑組合物洗滌人工弄臟的布片(洗滌液的pH10.7；洗滌條件Terg-O-Tometer 100rpm，10分鐘，30℃)。
表11
1)原果膠酶PB，通過日本專利申請公開(kokai)No.62-257990中描述的方法?；摹?0,000U/g粒子(在pH10.0下的果膠酶活性)。2)原果膠酶RB，通過日本專利申請公開(kokai)No.62-257990中描述的方法?；摹?0,000U/g粒子(在pH10.0下的果膠酶活性)。3)KAC-500(纖維素酶；由Kao Corporation生產(chǎn)的)。500U/g粒子。4)蛋白酶K-16，通過日本專利申請公開(kokai)No.62-257990中描述的方法?；摹?U/g粒子。
從如上結(jié)果可知，當(dāng)將本發(fā)明的原果膠酶與纖維素酶或蛋白酶組合應(yīng)用時，可獲得增強的凈化效果。此外，當(dāng)將本發(fā)明的原果膠酶與纖維素酶和蛋白酶組合應(yīng)用從而構(gòu)成三組分體系時，獲得了甚至更為改善的對泥污的凈化效果。
當(dāng)應(yīng)用以下述商品名為可商購的其它纖維素酶或蛋白酶時也可獲得因酶的組合應(yīng)用而達(dá)到的該協(xié)同效果。
纖維素酶Celluzyme(由Novo Nordisk A/S生產(chǎn)的)蛋白酶Alkalase、Esperase、Savinase、Durazym(由Novo NordiskA/S生產(chǎn)的)；Purafect、Maxapem、Properase(由Genencor Int.Inc.生產(chǎn)的)。
如前所述，本發(fā)明的洗滌劑組合物具有很高的對泥污的凈化力，所以特別適用于洗滌衣服。
本申請要求享有基于分別在1997年4月9日和1997年9月8日提交的日本專利申請Nos.9-091142和9-242736的優(yōu)先權(quán)，將它們并入本文作參考。
序列表序列1長度591類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型基因組DNA來源微生物芽孢桿菌菌株KSM-P15序列GCG CCG ACG GTC GTT CAT GAA ACG ATT CGT GTG CCT GCC GGT CAG ACG 48Ala Pro Thr Val Val His Glu Thr Ile Arg Val Pro Ala Gly Gln Thr5 10 15TTT GAC GGA AAA GGG CAG ACC TAT GTG GCT AAT CCG AAT ACA TTG GGG 96Phe Asp Gly Lys Gly Gln Thr Tyr Val Ala Asn Pro Asn Thr Leu Gly20 25 30GAC GGA TCG CAG GCG GAG AAT CAG AAG CCG ATC TTT CGT CTG GAG GCT144Asp Gly Ser Gln Ala Glu Asn Gln Lys Pro Ile Phe Arg Leu Glu Ala35 40 45GGG GCA AGC CTG AAA AAT GTA GTG ATT GGC GCT CCT GCC GCT GAC GGG192Gly Ala Ser Leu Lys Asn Val Val Ile Gly Ala Pro Ala Ala Asp Gly50 55 60GTG CAC TGC TAC GGG GAT TGT ACG ATT ACA AAT GTC ATC TGG GAG GAT 240Val His Cys Tyr Gly Asp Cys Thr Ile Thr Asn Val Ile Trp Glu Asp65 70 75 80GTT GGT GAG GAT GCG CTG ACG CTT AAA TCG TCC GGA ACG GTG AAC ATC 288Val Gly Glu Asp Ala Leu Thr Leu Lys Ser Ser Gly Thr Val Asn Ile85 90 95TCG GGC GGG GCA GCC TAC AAG GCG TAT GAC AAG GTG TTC CAA ATC AAT 336Ser Gly Gly Ala Ala Tyr Lys Ala Tyr Asp Lys Val Phe Gln Ile Asn100 105 110GCA GCG GGG ACG ATC AAC ATT CGT AAC TTC AGG GCC GAT GAC ATC GGG 384Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ile Arg Asn Phe Arg Ala Asp Asp Ile Gly115 120 125AAG CTG GTT CGG CAG AAC GGA GGC ACC ACC TAC AAA GTG GTG ATG AAC 432Lys Leu Val Arg Gln Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Lys Val Val Met Asn130 135 140GTC GAA AAC TGC AAC ATT TCC AGA GTG AAG GAT GCG ATC CTG AGA ACG 480Val Glu Asn Cys Asn Ile Ser Arg Val Lys Asp Ala Ile Leu Arg Thr145 150 155 160GAC AGC AGC ACA AGC ACA GGA CGA ATT GTG AAT ACC CGC TAT TCT AAC 528Asp Ser Ser Thr Ser Thr Gly Arg Ile Val Asn Thr Arg Tyr Ser Asn165 170 175GTG CCA ACA TTG TTC AAA GGC TTT AAA TCA GGC AAT ACC ACC GCA TCC 576Val Pro Thr Leu Phe Lys Gly Phe Lys Ser Gly Asn Thr Thr Ala Ser180 185 190GGA AAT ACG CAG TAT 591Gly Asn Thr Gln Tyr19權(quán)利要求
1.一種包括原果膠酶的洗滌劑組合物，該原果膠酶在原果膠或聚半乳糖醛酸被用作底物時具有7.0或更高的反應(yīng)最佳pH。
2.權(quán)利要求1的洗滌劑組合物，其中所述原果膠酶具有以不小于0.2mg/g棉的量釋放棉果膠的能力。
3.權(quán)利要求1或2的洗滌劑組合物，其中所述原果膠酶得自屬于芽孢桿菌屬的微生物。
4.權(quán)利要求1～3任一項的洗滌劑組合物，其中所述原果膠酶具有果膠酸裂合酶活性。
5.權(quán)利要求1～4任一項的洗滌劑組合物，它進(jìn)一步包括表面活性劑。
6.權(quán)利要求1～5任一項的洗滌劑組合物，它進(jìn)一步包括纖維素酶。
7.權(quán)利要求1～6任一項的洗滌劑組合物，它進(jìn)一步包括蛋白酶。
8.權(quán)利要求1～7任一項的洗滌劑組合物，它進(jìn)一步包括漂白劑。
全文摘要
包含原果膠酶的洗滌劑組合物,該原果膠酶在原果膠或聚半乳糖醛酸被用作底物時的反應(yīng)最佳pH是7.0或更高。該洗滌劑組合物被賦予驚人的對泥污的凈化力。
文檔編號C11D3/386GK1254370SQ98804677
公開日2000年5月24日 申請日期1998年4月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月9日
發(fā)明者和田恭尚, 笠井美由紀(jì), 四方資通, 涼松淳, 小池謙造, 秦田勇二, 小林徹, 伊藤進(jìn), 妻鳥正樹 申請人:花王株式會社