微藻的提取的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包括：(i)用微波輻射處理包含微藻生物質(zhì)的含水混合物，及(ii)從經(jīng)過(guò)處理的微藻生物質(zhì)回收含脂質(zhì)產(chǎn)物。
【專利說(shuō)明】微藻的提取
[0001] 優(yōu)先權(quán)f件
[0002] 本申請(qǐng)要求2011年10月20日提交的題為"微藻的提取（MICR0ALGAL EXTRACTION) "的澳大利亞臨時(shí)專利申請(qǐng)第2011904343號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該案內(nèi)容以全文引用 的方式并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及用于從微藻生物質(zhì)提取材料的方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，化石燃料不能作為一種運(yùn)輸用燃料。這一點(diǎn)結(jié)合化石燃料燃燒的負(fù) 面環(huán)境影響引起了對(duì)于可以提供不可再生化石燃料的替代選擇的可再生能源的研究。生物 燃料是一種此類可再生能源。生物燃料是由可再生有機(jī)來(lái)源或原料制造的燃料。此術(shù)語(yǔ)一 般是指運(yùn)輸用燃料并且包括乙醇和生物柴油。截至目前，用于制造生物柴油的油的主要來(lái) 源是糧食作物。然而，使用糧食作物也會(huì)存在負(fù)面環(huán)境影響，并且其未必能夠供應(yīng)足夠的運(yùn) 輸用燃料。生物質(zhì)，例如草、來(lái)自谷類作物、林業(yè)產(chǎn)品或荒地的殘留物等，可用于制造生物燃 料，但其一般被用于制造生物乙醇。然而，生物乙醇并非燃料來(lái)源的最佳選擇。
[0005] 使用藻類作為再生有機(jī)原料當(dāng)與使用其它可再生有機(jī)來(lái)源相比較時(shí)具有若干益 處，所述有機(jī)原料可用于制造適于生物柴油制造的油。一些藻類產(chǎn)生相當(dāng)大量的油或脂質(zhì)。 舉例來(lái)說(shuō)，一些藻類含有以重量計(jì)高達(dá)80%的油，并且因此，這些藻類可以提供豐富的油來(lái) 源用于制造生物柴油。此外，藻類生長(zhǎng)迅速，并且在一年內(nèi)產(chǎn)生的質(zhì)量可為陸生植物的10 到100倍，并且其將在許多環(huán)境條件中生長(zhǎng)。
[0006] 從藻類提取的油是三酸甘油酯與各種親脂性顏料的混合物。油可以直接地或經(jīng)由 轉(zhuǎn)酯作用轉(zhuǎn)化成生物柴油而間接地用作燃料。
[0007] 不幸的是，已經(jīng)證實(shí)，在工業(yè)規(guī)模上，由藻類制造油是一個(gè)困難和/或昂貴的工 藝。通常，將微藻生物質(zhì)從生長(zhǎng)池、槽或容器中抽吸到離心機(jī)或傾析器中，在其中，將漿料的 體積降低到初始體積的約80%。接著，通常進(jìn)行進(jìn)一步干燥的步驟，隨后是油提取步驟。干 燥步驟需要時(shí)間和大量的能量輸入，并因此增加了所述工藝的總體成本。
[0008] 由藻類制造油需要從生物質(zhì)中提取油，并且優(yōu)選地，從其它有機(jī)污染物中純化出 脂質(zhì)部分。在一些工藝中，使用有機(jī)溶劑，通過(guò)溶劑提取來(lái)提取油。舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)專利第 6, 166, 231號(hào)描述了一種從生物質(zhì)提取油的兩階段溶劑提取。美國(guó)專利第5, 458, 897號(hào)公 開(kāi)了用于從植物材料、動(dòng)物及土壤提取揮發(fā)性油的方法，所述方法是通過(guò)將植物材料、動(dòng)物 及土壤與非水性溶劑混合并將混合物曝露于微波輻射來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0009] 干燥和/或溶劑提取步驟需要時(shí)間并增加了提取工藝的成本。
[0010] 需要用于從藻類提取油和其它產(chǎn)品并且克服了與現(xiàn)有技術(shù)工藝相關(guān)的一個(gè)或多 個(gè)問(wèn)題的方法。
[0011] 本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物都以引用的方式并入本文中。有關(guān)本說(shuō)明書(shū)中所包 括的文獻(xiàn)、操作、材料、裝置、物品等的任何論述僅僅出于提供本發(fā)明的上下文的目的。而不 能視為承認(rèn)這些內(nèi)容中的任一項(xiàng)或全部形成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是與本發(fā)明相關(guān) 的領(lǐng)域中的一般常識(shí)，因?yàn)槠湓谒錾暾?qǐng)的每一權(quán)利要求項(xiàng)的 優(yōu)先權(quán)日:期之前存在于澳大 利亞或者別處中。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)上可行的由微藻制造油的新方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明源自 于有關(guān)從微藻生物質(zhì)提取并分級(jí)分離商業(yè)產(chǎn)品的方法的研究，并且特別是發(fā)現(xiàn)使?jié)裎⒃迳?物質(zhì)曝露于微波輻射引起油產(chǎn)物的釋放，所述油產(chǎn)物可以得到回收，無(wú)需中間干燥步驟。
[0013] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包 括：（i)用微波輻射處理包含微藻生物質(zhì)的含水混合物，及（ii)從經(jīng)過(guò)處理的微藻生物質(zhì) 回收含脂質(zhì)產(chǎn)物。
[0014] 有利的是，所述微藻生物質(zhì)可以是"濕"生物質(zhì)。所述微藻生物質(zhì)可以包含高達(dá) 90%的水。從"濕"生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物意味著無(wú)需從微藻生物質(zhì)去除任何水，并且此舉 使得提取工藝相當(dāng)高效，因?yàn)橥ǔＰ枰膯为?dú)干燥步驟是耗時(shí)并且耗能的。
[0015] 在一些實(shí)施例中，微藻生物質(zhì)包含以重量計(jì)約10%到約90%的水。
[0016] 也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)降低包含微藻生物質(zhì)的含水混合物的pH值，可以從所述生物質(zhì) 中選擇性提取碳水化合物材料。因此，本發(fā)明還提供一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物 和含碳水化合物產(chǎn)物的方法，所述方法包括：（i)提供含有所述微藻生物質(zhì)的含水混合物； (ii)將所述含水混合物的pH值調(diào)到pH〈7 加熱含有所述微藻生物質(zhì)的含水混合物； 及（iv)從所述生物質(zhì)中分離出含脂質(zhì)產(chǎn)物和含碳水化合物產(chǎn)物。
[0017] 此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)增加包含微藻生物質(zhì)的含水混合物的pH值，可以從所述生 物質(zhì)中選擇性提取蛋白質(zhì)材料。因此，本發(fā)明還提供一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物和 含蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包括：（i)提供含有所述微藻生物質(zhì)的含水混合物；（ii)將 所述含水混合物的pH值調(diào)到pH>7 加熱含有所述微藻生物質(zhì)的含水混合物；及（iv) 從所述生物質(zhì)中分離出含脂質(zhì)產(chǎn)物和含蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0018] 本文所描述的方法可以依序進(jìn)行。因此，本發(fā)明提供一種從微藻生物質(zhì)選擇性提 取含脂質(zhì)產(chǎn)物、含碳水化合物產(chǎn)物及含蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法。出于若干原因，這是有益的。首 先，所獲得的含脂質(zhì)產(chǎn)物實(shí)質(zhì)上不含碳水化合物材料和蛋白質(zhì)材料。其次，碳水化合物材料 和蛋白質(zhì)材料是附加值產(chǎn)品，提供了額外的收益流。
[0019] 在一些實(shí)施例中，所述方法包括在pH〈7下進(jìn)行第一次提取，隨后在pH>7下進(jìn)行一 次或多次提取，隨后回收含脂質(zhì)產(chǎn)物。因此，本發(fā)明提供一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn) 物、含碳水化合物產(chǎn)物及含蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包括：
[0020] (i)提供含有所述微藻生物質(zhì)的初始含水混合物；
[0021] (ii)將所述初始含水混合物的pH值調(diào)到pH〈7 ;
[0022] (iii)加熱含有所述微藻生物質(zhì)的所述酸性初始含水混合物以提供第一經(jīng)過(guò)處理 的混合物；
[0023] (iv)從所述第一經(jīng)過(guò)處理的混合物分離固體和液體，以提供第一固體和含碳水化 合物的液體；
[0024] (v)將所述第一固體與含水混合物組合以形成第二含有微藻生物質(zhì)的含水混合 物；
[0025] (vi)將所述第二含水混合物的pH值調(diào)到pH>7 ;
[0026] (vii)加熱含有所述微藻生物質(zhì)的所述堿性第二含水混合物以提供第二經(jīng)過(guò)處理 的混合物；
[0027] (viii)從所述第二經(jīng)過(guò)處理的混合物分離固體和液體，以提供第二固體和含蛋白 質(zhì)的液體；
[0028] (ix)任選地，使用所述第二固體重復(fù)步驟（V)到（viii)，以提供第三固體和另外 的含蛋白質(zhì)的液體；
[0029] (X)將所述第二固體或所述第三固體與含水混合物組合，以形成最終的含水混合 物；
[0030] (xi)用溶劑處理所述最終的含水混合物；
[0031] (xii)從所述最終含水混合物中分離所述溶劑，以提供含有脂質(zhì)產(chǎn)物的溶劑。
[0032] 在一些實(shí)施例中，步驟（ii)中形成的混合物的pH值在約0. 5到約2的范圍內(nèi)。在 一些特定實(shí)施例中，步驟（ii)中形成的混合物的pH值為約1。
[0033] 在一些實(shí)施例中，步驟（vi)中形成的混合物的pH值在約11到約14的范圍內(nèi)。在 一些特定實(shí)施例中，步驟（vi)中形成的混合物的pH值為約13。
[0034] 加熱含有所述微藻生物質(zhì)的酸性或堿性含水混合物的步驟可以使用任何適合的 加熱源進(jìn)行。加熱步驟可以在大氣壓下或在高于大氣壓下進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，加熱含 有所述微藻生物質(zhì)的酸性或堿性含水混合物的步驟是通過(guò)用微波輻射處理所述混合物來(lái) 進(jìn)行的。
[0035] 用溶劑處理所述最終的含水混合物的步驟中使用的溶劑可以是任何非水性溶劑。
[0036] 在另一方面，本發(fā)明提供一種由本文所描述的方法制造的產(chǎn)物。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1是繪示在酸性和堿性條件下通過(guò)不同微波照射時(shí)間得到的碳水化合物提取 產(chǎn)率的比較的圖。
[0038] 圖2是繪示在酸性和堿性條件下通過(guò)不同微波照射時(shí)間得到的蛋白質(zhì)提取產(chǎn)率 的比較的圖。
[0039] 圖3是繪示僅在酸性條件下六次重復(fù)微波提取的碳水化合物提取產(chǎn)率的圖。
[0040] 圖4是繪示僅在酸性條件下六次重復(fù)微波提取的蛋白質(zhì)提取產(chǎn)率的圖。
[0041] 圖5是繪示僅在堿性條件下六次重復(fù)微波提取的碳水化合物提取產(chǎn)率的圖。
[0042] 圖6是繪示僅在堿性條件下六次重復(fù)微波提取的蛋白質(zhì)提取產(chǎn)率的圖。
[0043] 圖7是繪示在堿性到酸性條件下六次重復(fù)微波提取的碳水化合物提取產(chǎn)率的圖。
[0044] 圖8是繪示在堿性到酸性條件下六次重復(fù)微波提取的蛋白質(zhì)提取產(chǎn)率的圖。
[0045] 圖9是繪示在酸性到堿性條件下六次重復(fù)微波提取的碳水化合物提取產(chǎn)率的圖。
[0046] 圖10是繪示在酸性到堿性條件下六次重復(fù)微波提取的蛋白質(zhì)提取產(chǎn)率的圖。
[0047] 圖11是繪示通過(guò)外加葡萄糖進(jìn)行的提取的碳水化合物回收率測(cè)試的圖。
[0048] 圖12是繪示通過(guò)外加 BSA進(jìn)行的提取的碳水化合物回收率測(cè)試的圖。
[0049] 圖13是提取的微藻脂質(zhì)漂浮在提取緩沖液的表面上的照片。
[0050] 圖14是繪示在酸性到堿性條件下從2. 5g生物質(zhì)和25g生物質(zhì)六次重復(fù)微波提取 所提取的碳水化合物產(chǎn)率的比較的圖。
[0051] 圖15是繪示在酸性到堿性條件下從2. 5g生物質(zhì)和25g生物質(zhì)六次重復(fù)微波提取 所提取的碳水化合物產(chǎn)率的比較的圖。
[0052] 圖16是繪示通過(guò)微量勞里法（micro-lowry method)六次重復(fù)微波提取的蛋白質(zhì) 提取效率的圖。
[0053] 圖17是繪示通過(guò)微量勞里法六次重復(fù)微波提取的蛋白質(zhì)提取效率的圖。
[0054] 圖18是繪示以1:10的生物質(zhì)與緩沖液比率和1:5的生物質(zhì)與緩沖液比率進(jìn)行的 提取工藝之間的蛋白質(zhì)提取產(chǎn)率的比較的圖。
[0055] 圖19是繪示使用濕生物質(zhì)進(jìn)行的七次重復(fù)微波提取的蛋白質(zhì)提取效率的圖。
[0056] 圖20是繪示使用濕生物質(zhì)進(jìn)行的七次重復(fù)微波提取的碳水化合物提取效率的 圖。
[0057] 圖21是繪示濕生物質(zhì)、冷凍干燥的生物質(zhì)及烘箱干燥的生物質(zhì)的脂質(zhì)含量分析 的圖。
[0058] 圖22是繪示藻類生物質(zhì)的化學(xué)特征的圖。
[0059] 圖23是繪示用于優(yōu)化濕藻類生物質(zhì)的微波提取條件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的流程圖。
[0060] 圖24是繪示使用濕藻類生物質(zhì)的無(wú)灰分蛋白質(zhì)提取效率的比較的圖。
[0061] 圖25是繪示使用濕藻類生物質(zhì)的無(wú)灰分還原糖提取效率的比較的圖。
[0062] 圖26是繪示使用濕藻類生物質(zhì)的無(wú)灰分碳水化合物提取效率的比較的圖。
[0063] 圖27是繪示利用三次微波提取的無(wú)灰分蛋白質(zhì)提取效率的比較的圖。
[0064] 圖28是繪示利用三次微波提取的無(wú)灰分碳水化合物提取效率的比較的圖。
[0065] 圖29是繪示利用三次微波提取的蛋白質(zhì)和碳水化合物回收率的比較的圖。
[0066] 圖30是繪示微波提取工藝的材料質(zhì)量平衡的圖。
[0067] 圖31是繪示微波提取工藝的脂質(zhì)回收率和損失率的圖。
[0068] 圖32是繪示在不同pH值下利用微波提取的無(wú)灰分碳水化合物提取效率的圖。
[0069] 圖33是繪示在不同pH值下利用微波提取的無(wú)灰分蛋白質(zhì)提取效率的圖。
[0070] 圖34是繪示在不同pH值下利用微波提取的無(wú)灰分還原糖提取效率的圖。
[0071] 圖35是繪示在不同pH值下利用微波提取的總碳水化合物和蛋白質(zhì)回收率的圖。
[0072] 圖36是繪示使用不同加熱方法的無(wú)灰分蛋白質(zhì)提取效率的圖。
[0073] 圖37是繪示使用不同加熱方法的無(wú)灰分碳水化合物提取效率的圖。
[0074] 圖38是繪示總碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及灰分含量的圖。
[0075] 圖39是繪示在不同微波提取溫度和時(shí)間下無(wú)灰分蛋白質(zhì)提取效率的比較的圖。
[0076] 圖40是繪示在不同微波提取溫度和時(shí)間下無(wú)灰分總碳水化合物提取效率的比較 的圖。
[0077] 圖41是繪示在不同提取溫度和時(shí)間下基于微波提取的功率消耗得到的總蛋白質(zhì) 和碳水化合物生產(chǎn)率的比較的圖。
[0078] 圖42是繪示不同提取條件的總功率消耗的比較的圖。
[0079] 圖43是繪示在25mL樣品規(guī)模下基于利用不同提取條件的功率消耗得到的總蛋白 質(zhì)和碳水化合物生產(chǎn)率的比較的圖。
[0080] 圖44是繪示在不同樣品規(guī)模下基于微波提取的功率消耗得到的總蛋白質(zhì)和碳水 化合物生產(chǎn)率的比較的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0081] 在第一方面，本發(fā)明提供一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包 括：（i)用微波輻射處理包含微藻生物質(zhì)的含水混合物，及（ii)從經(jīng)過(guò)處理的微藻生物質(zhì) 回收含脂質(zhì)產(chǎn)物。
[0082] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"微藻"、"微藻的"和相關(guān)術(shù)語(yǔ)意思指任何單細(xì)胞的光合微 生物。微藻又稱為浮游植物、微植物或浮游藻類。典型的微藻包括綠藻（綠藻門）和藍(lán)綠 藻（藍(lán)綠藻門）。
[0083] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"生物質(zhì)"意思指來(lái)自活生物體或目前存活的生物體的生物 材料。
[0084] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"脂質(zhì)"意思指不可溶于水中但可溶于非極性有機(jī)溶劑中并 且有油滑觸感的任何有機(jī)化合物，例如脂肪、油、蠟、固醇或三酸甘油酯。
[0085] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"碳水化合物"意思指用作動(dòng)物飲食中的主要能量來(lái)源的任 何有機(jī)化合物，例如糖、淀粉、纖維素或膠質(zhì)。
[0086] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"意思指含有碳、氫、氧、氮并且通常含有硫，并且由 一條或多條氨基酸鏈構(gòu)成的任何復(fù)雜有機(jī)大分子。
[0087] 用于提取含脂質(zhì)產(chǎn)物以及任選地含碳水化合物產(chǎn)物和/或含蛋白質(zhì)產(chǎn)物的微藻 生物質(zhì)是一種含水懸浮液。含水懸浮液可以通過(guò)使干燥的生物質(zhì)發(fā)生水合作用來(lái)制備。水 合作用可以通過(guò)使干燥的微藻生物質(zhì)與水在足以使生物質(zhì)再水合的溫度下和時(shí)間內(nèi)接觸 來(lái)進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，可以將干燥的生物質(zhì)浸入水中，保持約60分鐘，來(lái)提供微藻生物質(zhì)的含 水懸浮液。
[0088] 或者，微藻生物質(zhì)的含水懸浮液可以是先前未經(jīng)歷干燥步驟的"濕"生物質(zhì)。如先 前所提到的，在從微藻提取脂質(zhì)時(shí)通常使用的干燥步驟是耗時(shí)并且耗能的，并且出于這一 原因，從"濕"生物質(zhì)直接提取含脂質(zhì)產(chǎn)物可能特別有益。
[0089] 或者，微藻生物質(zhì)的含水懸浮液可以是先前經(jīng)歷過(guò)部分干燥步驟的濃縮的藻類糊 漿。
[0090] 微藻生物質(zhì)的含水懸浮液包含以重量計(jì)約10%到約90%的水。
[0091] 微藻生物質(zhì)可以源自于任何適合的微藻種類。特定微藻種類可以基于將源自 于生物質(zhì)的特定產(chǎn)物進(jìn)行選擇。舉例來(lái)說(shuō)，生物燃料可以源自于海洋微藻微擬球藻屬 (Nanochloropsis sp.)。微藻可以使用已知適合于特定種類的條件培養(yǎng)。舉例來(lái)說(shuō)，微擬 球藻屬（一種海洋藻類種類）可以在補(bǔ)充有適合培養(yǎng)基的海水池中培養(yǎng)。微藻還可以在光 生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)，其中包括溫度和光強(qiáng)度在內(nèi)的許多參數(shù)可以在無(wú)菌條件下進(jìn)行控 制。
[0092] 含脂質(zhì)產(chǎn)物一旦從生物質(zhì)釋放，就會(huì)在含水懸浮液的頂部上形成油層。接著，可以 通過(guò)物理方式從含水懸浮液分離這些脂質(zhì)。任選地，可以在微波照射后對(duì)含水懸浮液進(jìn)行 離心，以幫助將懸浮液中的油層與水層和任何固體材料分離。任選地，可以在微波照射后用 溶劑提取含水懸浮液，以從懸浮液中的水層和任何固體材料中提取含脂質(zhì)產(chǎn)物。當(dāng)脂質(zhì)產(chǎn) 物結(jié)合于生物質(zhì)中時(shí)，溶劑提取可以是特別有用的。適合的溶劑包括非水性溶劑。適合的 非水性溶劑包括非極性有機(jī)液體。烴類，例如己烷或石油醚，是適合此目的的非極性有機(jī)液 體。其它適合的溶劑包括酯類、醚類、酮類以及硝化烴和氯化烴。
[0093] 除提取脂質(zhì)外，還可以通過(guò)降低微藻生物質(zhì)的含水懸浮液的pH值，從微藻生物質(zhì) 中選擇性提取碳水化合物材料。因此，本發(fā)明提供一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物和含 碳水化合物產(chǎn)物的方法，所述方法包括：（i)提供微藻生物質(zhì)的含水懸浮液；（ii)將所述含 水懸浮液的pH值調(diào)到pH〈7 加熱微藻生物質(zhì)的含水懸浮液；及（iv)從所述生物質(zhì)中 分離出所述含脂質(zhì)產(chǎn)物和所述含碳水化合物產(chǎn)物。
[0094] 含水懸浮液的pH值可以使用適合的酸來(lái)降低。酸可以是有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸。在一 些實(shí)施例中，酸是無(wú)機(jī)酸。無(wú)機(jī)酸可以選自由硫酸、硝酸、鹽酸及氫氟酸組成的群組。在一 些特定實(shí)施例中，酸是硫酸。
[0095] 含水懸浮液的pH值可以降到低于pH6。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值降到 低于約PH5。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值降到低于約pH4。在一些實(shí)施例中，含水 懸浮液的pH值降到低于約pH3。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值降到低于約pH2。在 一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可以降到介于約0. 5與約3之間。在一些實(shí)施例中，含 水懸浮液的pH值可以降到介于約0. 5與約2之間。
[0096] 加熱微藻生物質(zhì)的含水懸浮液的步驟可以使用任何適合的加熱源進(jìn)行。本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知許多加熱源并且都可以用于此目的。實(shí)例包括熱浴、高壓釜及微波烘箱。加熱 步驟可以在大氣壓下或在高于大氣壓的壓力下進(jìn)行。在后一情形中，可以使用高壓釜。 [0097] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用微波輻射處理微藻生物質(zhì)的含水懸浮液來(lái)進(jìn)行加熱步驟是特別 有益的。使用微波輻射的一個(gè)益處是縮短了此步驟所花費(fèi)的時(shí)間。
[0098] 使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝露于微波輻射的步驟可以包括將含有微藻生物質(zhì) 的含水懸浮液的容器放到微波烘箱中?；蛘?，可以使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液通過(guò)微波烘 箱，所述微波烘箱具有連續(xù)流管定位于其中。微藻生物質(zhì)的含水懸浮液可以曝露于微波輻 射，持續(xù)使得從含水懸浮液中分離出含脂質(zhì)產(chǎn)物的任何時(shí)間段。在一些實(shí)施例中，使微藻生 物質(zhì)曝露于微波輻射一段約1分鐘到約30分鐘的時(shí)間。在一些實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)曝 露于微波輻射一段約10分鐘的時(shí)間。微藻生物質(zhì)曝露于微波輻射的時(shí)間段將至少部分取 決于微波烘箱的輸出功率。
[0099] 在一些實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝露于微波輻射的步驟包括使用第 一微波功率照射所述懸浮液，直到溫度升到介于約80°C與約11(TC之間，接著使用第二微 波功率使所述懸浮液在約80°C和約110°C下保持介于約1分鐘與約30分鐘之間的時(shí)間，所 述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝 露于微波輻射的步驟包括在約1000瓦特（Watt)的微波功率下照射所述懸浮液，直到懸浮 液的溫度升到約100°c，接著使用約200瓦特的微波功率輸入使懸浮液在約100°C下保持約 10分鐘。
[0100] 在如先前所描述進(jìn)行加熱之后，可以在含水懸浮液頂部上的油層中發(fā)現(xiàn)含脂質(zhì)產(chǎn) 物，而可以在水溶液中發(fā)現(xiàn)含碳水化合物產(chǎn)物。若情況就是如此，那么可以通過(guò)離心將油層 和含水液體與固體生物質(zhì)分離。由此提供適合直接或間接用于燃料目的的油以及含碳水化 合物的水溶液。必要時(shí)，可以使用例如溶劑蒸發(fā)、結(jié)晶、色譜法等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從水溶液中回收 碳水化合物?；蛘撸梢栽谒龉に嚨暮罄m(xù)階段（如下文更詳細(xì)地描述）使用溶劑提取從 含水懸浮液中提取含脂質(zhì)產(chǎn)物。
[0101] 通過(guò)增加微藻生物質(zhì)的含水懸浮液的pH值，可以從微藻生物質(zhì)選擇性提取蛋白 質(zhì)材料。因此，在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物和含蛋白質(zhì) 產(chǎn)物的方法，所述方法包括：（i)提供微藻生物質(zhì)的含水懸浮液；（ii)將所述含水懸浮液的 pH值調(diào)到pH>7 加熱微藻生物質(zhì)；及（iv)從所述生物質(zhì)中分離出所述含脂質(zhì)產(chǎn)物和 所述含蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0102] 含水懸浮液的pH值可以使用適合的堿來(lái)增加。堿可以是有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿。在一 些實(shí)施例中，堿是無(wú)機(jī)堿。無(wú)機(jī)堿可以選自由氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化銨組成的群組。 在一些特定實(shí)施例中，堿是氫氧化鈉。
[0103] 含水懸浮液的pH值可以增加到大于pH8。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可 以增加到大于pH9。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可以增加到大于pHIO。在一些實(shí) 施例中，含水懸浮液的pH值可以增加到大于pHl 1。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可 以增加到大于PH12。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可以增加到介于約10與約13. 5 之間。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可以增加到介于約11與約13. 5之間。在一些 實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可以增加到介于約12與約13. 5之間。
[0104] 加熱微藻生物質(zhì)的含水懸浮液的步驟可以使用任何適合的加熱源進(jìn)行。本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知許多加熱源并且都可以用于此目的。實(shí)例包括熱浴、高壓釜及微波烘箱。加熱 步驟可以在大氣壓下或在高于大氣壓的壓力下進(jìn)行。在后一情形中，可以使用高壓釜。
[0105] 使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝露于微波輻射的步驟可以包括將含有微藻生物質(zhì) 的含水懸浮液的容器放到微波烘箱中?；蛘?，可以使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液通過(guò)微波烘 箱，所述微波烘箱具有連續(xù)流管定位于其中。微藻生物質(zhì)的含水懸浮液可以曝露于微波輻 射，持續(xù)使得從含水懸浮液中分離出含脂質(zhì)產(chǎn)物的任何時(shí)間段。在一些實(shí)施例中，使微藻生 物質(zhì)曝露于微波輻射一段約1分鐘到約30分鐘的時(shí)間。在一些實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)曝 露于微波輻射一段約10分鐘的時(shí)間。微藻生物質(zhì)曝露于微波輻射的時(shí)間段將至少部分取 決于微波烘箱的輸出功率。
[0106] 在一些實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝露于微波輻射的步驟包括使用第 一微波功率照射所述懸浮液，直到溫度升到介于約80°c與約11(TC之間，接著使用第二微 波功率將所述懸浮液在約80°C和約110°C下保持介于約1分鐘與約30分鐘之間的時(shí)間，所 述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝 露于微波輻射的步驟包括在約1000瓦特的微波功率下照射所述懸浮液，直到懸浮液的溫 度升到約KKTC，接著使用約200瓦特的微波功率輸入使懸浮液在約10(TC下保持約10分 鐘。
[0107] 在如先前所描述進(jìn)行加熱之后，可以在含水懸浮液頂部上的油層中發(fā)現(xiàn)含脂質(zhì)產(chǎn) 物，而可以在含水液體中發(fā)現(xiàn)含蛋白質(zhì)產(chǎn)物。若情況就是如此，那么可以通過(guò)離心將油層和 含水液體與固體生物質(zhì)分離。由此提供適合直接或間接用于燃料目的的油以及含蛋白質(zhì)的 水溶液。必要時(shí)，可以使用例如溶劑蒸發(fā)、結(jié)晶、色譜法等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從水溶液中回收蛋白質(zhì)。 或者，可以在所述工藝的后續(xù)階段（如下文更詳細(xì)地描述）使用溶劑提取從含水懸浮液中 提取含脂質(zhì)廣物。
[0108] 酸性和堿性提取可以依序進(jìn)行。因此，可以降低含水懸浮液的pH值，加熱懸浮液， 對(duì)混合物離心以提供油層和含碳水化合物的水層以及生物質(zhì)團(tuán)粒。接著，可以使生物質(zhì)團(tuán) 粒懸浮于pH>7的水溶液中，以形成第二含水懸浮液，可以對(duì)所述第二含水懸浮液進(jìn)行加 熱，接著對(duì)混合物離心，以提供含脂質(zhì)層（如果存在的話）、含蛋白質(zhì)的水層及生物質(zhì)團(tuán)粒。 必要時(shí)，可以重復(fù)所述工藝。
[0109] 在一些實(shí)施例中，所述方法包括在pH〈7下進(jìn)行第一次提取，隨后在pH>7下進(jìn)行一 次或多次提取，隨后回收含脂質(zhì)產(chǎn)物。因此，本發(fā)明提供一種從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn) 物、含碳水化合物產(chǎn)物及含蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包括：
[0110] Q)提供含有所述微藻生物質(zhì)的初始含水混合物；
[0111] (ii)將所述初始含水混合物的pH值調(diào)到pH〈7 ;
[0112] (iii)加熱含有所述微藻生物質(zhì)的酸性初始含水混合物以提供第一經(jīng)過(guò)處理的混 合物；
[0113] (iv)從所述第一經(jīng)過(guò)處理的混合物分離固體和液體，以提供第一固體和含碳水化 合物的液體；
[0114] (V)將所述第一固體與含水混合物組合以形成第二含有微藻生物質(zhì)的含水混合 物；
[0115] (vi)將所述第二含水混合物的pH值調(diào)到pH>7 ;
[0116] (vii)加熱含有所述微藻生物質(zhì)的堿性第二含水混合物以提供第二經(jīng)過(guò)處理的混 合物；
[0117] (viii)從所述第二經(jīng)過(guò)處理的混合物分離固體和液體，以提供第二固體和含蛋白 質(zhì)的液體；
[0118] (ix)任選地，使用所述第二固體重復(fù)步驟（V)到（Viii)，以提供第三固體和另外 的含蛋白質(zhì)的液體；
[0119] (X)將所述第二固體或所述第三固體與含水混合物組合，以形成最終的含水混合 物；
[0120] (xi)用溶劑處理所述最終的含水混合物；
[0121] (xii)從所述最終的含水混合物中分離所述溶劑，以提供含有脂質(zhì)產(chǎn)物的溶劑。
[0122] 含水懸浮液的pH值可以降到低于pH6。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值降到 低于約PH5。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值降到低于約pH4。在一些實(shí)施例中，含水 懸浮液的pH值降到低于約pH3。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值降到低于約pH2。在 一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可以降到介于約0. 5與約3之間。在一些實(shí)施例中，含 水懸浮液的pH值可以降到介于約0.5與約2之間。在一些實(shí)施例中，步驟（ii)中形成的 混合物的pH值在約0. 5到約2的范圍內(nèi)。在一些特定實(shí)施例中，步驟（ii)中形成的混合 物的pH值為約1。
[0123] 含水懸浮液的pH值可以增加到大于pH8。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值 增加到大于pH9。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值增加到大于pHIO。在一些實(shí)施例 中，含水懸浮液的pH值增加到大于pHl 1。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值增加到大于 pH12。在一些實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可以增加到介于約10與約13. 5之間。在一些 實(shí)施例中，含水懸浮液的pH值可以增加到介于約11與約13. 5之間。在一些實(shí)施例中，含 水懸浮液的pH值可以增加到介于約12與約13. 5之間。在一些實(shí)施例中，步驟（vi)中形 成的混合物的pH值在約11到約14的范圍內(nèi)。在一些特定實(shí)施例中，步驟（vi)中形成的 混合物的pH值為約13。
[0124] 加熱含有所述微藻生物質(zhì)的酸性或堿性含水混合物的步驟可以使用任何適合的 加熱源進(jìn)行。加熱步驟可以在大氣壓下或在高于大氣壓下進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，加熱含 有所述微藻生物質(zhì)的酸性或堿性含水混合物的步驟是通過(guò)用微波輻射處理所述混合物來(lái) 進(jìn)行的。
[0125] 使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝露于微波輻射的步驟可以包括將含有微藻生物質(zhì) 的含水懸浮液的容器放到微波烘箱中?；蛘?，可以使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液通過(guò)微波烘 箱，所述微波烘箱具有連續(xù)流管定位于其中。微藻生物質(zhì)的含水懸浮液可以曝露于微波輻 射，持續(xù)使得從含水懸浮液中分離出含脂質(zhì)產(chǎn)物的任何時(shí)間段。在一些實(shí)施例中，使微藻生 物質(zhì)曝露于微波輻射一段約1分鐘到約30分鐘的時(shí)間。在一些實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)曝 露于微波輻射一段約10分鐘的時(shí)間。微藻生物質(zhì)曝露于微波輻射的時(shí)間段將至少部分取 決于微波烘箱的輸出功率。
[0126] 在一些實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝露于微波輻射的步驟包括使用第 一微波功率照射所述懸浮液，直到溫度升到介于約80°C與約11(TC之間，接著使用第二微 波功率將所述懸浮液在約80°C和約110°C下保持介于約1分鐘與約30分鐘之間的時(shí)間，所 述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定實(shí)施例中，使微藻生物質(zhì)的含水懸浮液曝 露于微波輻射的步驟包括在約1000瓦特的微波功率下照射所述懸浮液，直到懸浮液的溫 度升到約KKTC，接著使用約200瓦特的微波功率輸入使懸浮液在約10(TC下保持約10分 鐘。
[0127] 用溶劑處理所述最終的含水混合物的步驟中使用的溶劑可以是任何非水性溶劑。
[0128] 源自于微藻生物質(zhì)的含脂質(zhì)產(chǎn)物（油）、碳水化合物及蛋白質(zhì)可以用于許多應(yīng) 用中。微藻油是由具有許多不同功能的不同類型的脂肪酸制成。中性脂質(zhì)三?；视?(triacylglycerol，TAG)可以用于生物柴油；多不飽和脂肪酸（例如-3-脂肪酸DHA和EPA) 可以用作保健食品；膜脂質(zhì)可以用作生物表面活性劑和生物潤(rùn)滑劑。必要時(shí)，可以對(duì)含脂質(zhì) 產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分級(jí)分離和/或純化以提供特定脂質(zhì)用于進(jìn)一步使用。
[0129] 微藻來(lái)源的蛋白質(zhì)可以用作人類和動(dòng)物的食品或飼料蛋白質(zhì)補(bǔ)充。微藻蛋白質(zhì)還 可以是用于生物催化和生物轉(zhuǎn)化的新型酶的極為重要的來(lái)源。此外，這些蛋白質(zhì)水解可以 提供功能性多肽和寡肽，其可以用于食品應(yīng)用、保健食品產(chǎn)品及藥品。
[0130] 微藻來(lái)源的碳水化合物可以用作生物聚合物、粗糖以用于發(fā)酵生產(chǎn)生物化學(xué)品， 例如生物乙醇、乳酸、抗生素。微藻碳水化合物可以被水解以產(chǎn)生功能性多糖或寡糖，其可 以用作人類營(yíng)養(yǎng)和健康產(chǎn)品。
[0131] 下文將借助以下非限制性實(shí)例描述本發(fā)明。
[0132] 實(shí)例
[0133] 微藻生物質(zhì)是從海洋微藻微擬球藻屬獲得。在裝有20ppt海水并補(bǔ)充有F/2培養(yǎng) 基的3000L戶外跑道池中培育微擬球藻屬。pH值一般用1-5% C02控制在7. 9到8. 2。在 戶外條件下，溫度和照明未加控制。
[0134] 微藻還可以在光生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)，其中包括溫度和光強(qiáng)度在內(nèi)的許多參數(shù) 可以在無(wú)菌條件下進(jìn)行控制。
[0135] 實(shí)例1 一在酸性和堿性條件下微波提取干微藻生物質(zhì)
[0136] 材料
[0137] 批號(hào)29的干微藻生物質(zhì)是從南澳大利亞研發(fā)中心（South Australian Research and Development Institute, SARDI)獲得。
[0138] 設(shè)備
[0139] 微波提取是在麥頓（Milestone)的Start Synth微波合成試驗(yàn)站進(jìn)行。
[0140] 程序
[0141] 將干生物質(zhì)（2. 5g)添加到50mL圓形平底燒瓶中。向樣品添加25mL的0. 5M H2S04 溶液或25mL的0. 5M NaOH。接著，在室溫下培育樣品約1小時(shí)，然后在100°C下微波照射2、 5、10或30分鐘。
[0142] 接著以10, 000g將樣品離心10分鐘，并分別收集頂（脂質(zhì)）層和中間（碳水化合 物和蛋白質(zhì)）層。
[0143] 通過(guò)重量分析法來(lái)分析脂質(zhì)提取物，通過(guò)DNS法分析碳水化合物提取物，并通過(guò) BCA法分析蛋白質(zhì)提取物。
[0144] 結(jié)果
[0145] 脂質(zhì)提取
[0146] 在酸性或堿性條件下通過(guò)微波提取所提取的脂質(zhì)的量很難分析。通過(guò)收集2mL頂 層并通過(guò)重量分析法進(jìn)行分析，從2. 5g干生物質(zhì)提取的脂質(zhì)的量低于10mg。然而，通過(guò)大 規(guī)模提取可以解決這一問(wèn)題。
[0147] 優(yōu)化碳水化合物和蛋白質(zhì)提取的微波照射時(shí)間
[0148] 微波照射進(jìn)行2分鐘、5分鐘、10分鐘及30分鐘時(shí)間，以便優(yōu)化提取碳水化合物和 蛋白質(zhì)所需的加工條件。
[0149] 結(jié)果顯示于圖1中。堿性條件不適于碳水化合物提取?；?、5、10及30分鐘提 取所計(jì)算的碳水化合物含量全部低于〇. 2%。另一方面，基于在酸性條件下的2、5、10及30 分鐘提取所計(jì)算的碳水化合物含量為約4%到5%，并且最大值是在30分鐘照射之后獲得， 而最小值是在2分鐘照射之后獲得。在基于5分鐘與10分鐘照射所計(jì)算的碳水化合物含 量之間僅存在較小差異。
[0150] 如圖2中可見(jiàn)，對(duì)于蛋白質(zhì)提取，堿性條件優(yōu)于酸性條件。基于在堿性條件下的2、 5、10及30分鐘提取所計(jì)算的蛋白質(zhì)含量為4%到6%，并且最大值是通過(guò)10分鐘照射獲 得?；谠谒嵝詶l件下的2、5、10及30分鐘提取所計(jì)算的蛋白質(zhì)含量為2%到3%。最大 值是在30分鐘照射之后獲得，并且第二最大值是在10分鐘照射之后獲得。
[0151] 此外，比較在不同照射時(shí)間之后所獲得的碳水化合物和蛋白質(zhì)含量值，差異較小。 然而，為了實(shí)現(xiàn)碳水化合物和蛋白質(zhì)的高提取產(chǎn)率并且節(jié)省能量和時(shí)間，選擇10分鐘提取 進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
[0152] 在酸件備件下重復(fù)微波提取
[0153] 在酸性條件下重復(fù)進(jìn)行微波提取六次，以測(cè)試從干微藻生物質(zhì)提取碳水化合物和 蛋白質(zhì)的效率。
[0154] 如圖3中所示，在六次重復(fù)酸性提取之后，從2. 5g干微藻生物質(zhì)提取的總碳水化 合物為約6. 5%。第一次提取從干微藻生物質(zhì)回收到約4%的碳水化合物，占總提取的碳水 化合物的58. 35%，并且第二次提取回收到總提取的碳水化合物的23. 91%。因此，通過(guò)在 酸性條件下進(jìn)行的第一次和第二次微波提取可以提取到約85%的碳水化合物。
[0155] 然而，在酸性條件下蛋白質(zhì)提取的提取效率不同于碳水化合物提取?；诘谝淮?提取所計(jì)算的干微藻生物質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為約2. 6%，占在6次重復(fù)提取之后所提取的總 蛋白質(zhì)的33. 85%。從第二次到第六次提取獲得的值是類似的。這表明，在酸性條件下進(jìn)行 微波提取的效率可能不足以從干微藻生物質(zhì)提取蛋白質(zhì)。
[0156] 在堿件備件下重復(fù)微波提取
[0157] 在堿性條件下重復(fù)進(jìn)行微波提取六次，以測(cè)試從干微藻生物質(zhì)提取碳水化合物和 蛋白質(zhì)的效率。
[0158] 在堿性條件下進(jìn)行的微波提取不適于從干微藻生物質(zhì)提取碳水化合物。在6次重 復(fù)提取之后，從干微藻生物質(zhì)提取的總碳水化合物以重量計(jì)（g碳水化合物/g干生物質(zhì)） 低于0.2%。然而，如在圖6中所示，在六次連續(xù)堿性提取之后，從2. 5g干微藻生物質(zhì)提取的 總蛋白質(zhì)為約〇. 28g，占干生物質(zhì)的11%。第一次提取回收到總提取蛋白質(zhì)的約52. 72%， 并且第二次提取回收到總提取蛋白質(zhì)的20. 93%。因此，通過(guò)在堿性條件下進(jìn)行的第一次和 第二次微波提取可以提取到約74%的蛋白質(zhì)。
[0159] 在堿件到酸件備件下重復(fù)微波提取
[0160] 在堿性到酸性條件下重復(fù)進(jìn)行微波提取六次，以測(cè)試從干微藻生物質(zhì)提取碳水化 合物和蛋白質(zhì)的效率。第一次提取是在堿性條件下并且第二次和第三次提取變?yōu)樗嵝詶l 件。第四次和第五次提取又是在堿性條件下并且第六次提取變?yōu)樗嵝詶l件。
[0161] 結(jié)果顯示于圖7中。碳水化合物在堿性到酸性重復(fù)提取下的提取結(jié)果不同于僅 在酸性和堿性條件下的提取。在第一次堿性提取之后，從干生物質(zhì)提取的碳水化合物低于 〇. 2%，與從僅堿性提取獲得的結(jié)果相同。然而，在變?yōu)樗嵝詶l件之后，第二次和第三次提取 顯示出低得多的碳水化合物提取效率。在僅酸性條件下，第一次和第二次提取提供約4%和 1. 5%的碳水化合物。在堿性變?yōu)樗嵝蕴崛≈?，第二次和第三次提取都是在酸性條件下， 并且從這兩次提取獲得的碳水化合物含量?jī)H為約1. 5%和1%。此外，在六次重復(fù)酸性提取 之后計(jì)算的總碳水化合物含量為約6. 5%并且在六次重復(fù)堿性到酸性提取之后計(jì)算的總碳 水化合物含量為約3%。
[0162] 蛋白質(zhì)提取結(jié)果顯示于圖8中?；诹沃貜?fù)堿性到酸性提取所計(jì)算的總蛋白質(zhì) 含量為約14%，高于從六次重復(fù)僅堿性提取所獲得的結(jié)果。此外，第一堿性提取占干微藻生 物質(zhì)的約6%并且占所提取的總蛋白質(zhì)的42. 15%。第二次和第三次提取（酸性）總計(jì)占 干微藻生物質(zhì)的約4%并且此類似于第一次和第二次僅酸性提?。▓D4)。與第二次和第三 次提?。ㄋ嵝裕┫啾容^，通過(guò)第四次提?。▔A性）提取到更多蛋白質(zhì)。
[0163] 在酸件到堿件備件下重復(fù)微波提取
[0164] 在酸性到堿性條件下重復(fù)進(jìn)行微波提取六次，以測(cè)試從干微藻生物質(zhì)提取碳水化 合物和蛋白質(zhì)的效率。第一次提取是在酸性條件下，第二次和第三次提取變?yōu)閴A性條件，第 四次和第五次提取又是在酸性條件下，并且第六次提取變?yōu)閴A性條件。
[0165] 結(jié)果顯示于圖9中。通過(guò)在酸性條件下重復(fù)提取從干生物質(zhì)中提取碳水化合物的 性能類似于從僅堿性和酸性條件得到的結(jié)果（圖6)。大部分碳水化合物都是通過(guò)第一次、 第四次及第五次提?。ㄋ嵝裕┧崛?，占通過(guò)六次提取所提取的總碳水化合物的約95%。 然而，即使第二次、第三次及第六次提取（堿性）僅占干生物質(zhì)的約5%，由這三次提取所計(jì) 算的實(shí)際碳水化合物含量也比從僅堿性提取獲得的結(jié)果高得多（圖5)。
[0166] 然而，基于六次重復(fù)酸性到堿性提取所計(jì)算的總蛋白質(zhì)含量為約10%，高于從六 次重復(fù)僅堿性提取所獲得的結(jié)果（圖6)并且類似于由堿性到酸性提取得到的結(jié)果（圖8)。 此外，對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，堿性提取顯示的性能優(yōu)于酸性提取。通過(guò)第二次、第三次及第六次 提?。▔A性）獲得約65%的提取蛋白質(zhì)。
[0167] 通討向干牛物質(zhì)外加 R知量的脂質(zhì)、碳水化合物和蛋白質(zhì)來(lái)測(cè)試脂質(zhì)、碳水化合 物和蛋白質(zhì)的回收率
[0168] 向干微藻生物質(zhì)外加4mg標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)BSA、125mg葡萄糖及0. 260g芥花油。接著 使用"酸性-堿性-堿性-酸性-酸性-堿性"方案進(jìn)行多次提取。同時(shí)進(jìn)行不添加蛋白 質(zhì)、葡萄糖或油的對(duì)照提取。
[0169] 脂質(zhì)回收率仍難以測(cè)量。甚至在外加 0. 26克油情況下，在處理之后所提取的脂質(zhì) 量仍太少而無(wú)法分析。
[0170] 對(duì)于碳水化合物回收率，外加的材料的第一次酸性提取得到213. 64mg葡萄糖當(dāng) 量。這比得到78. 08mg的對(duì)照提取高出135. 56mg (圖11)。這一值與外加葡萄糖125mg相 當(dāng)接近。此結(jié)果證實(shí)，在第一次酸性提取中回收到所有添加的葡萄糖。添加的BSA蛋白質(zhì) 和芥花油可貢獻(xiàn)從外加生物質(zhì)回收的額外的l〇mg葡萄糖當(dāng)量。
[0171] 應(yīng)注意，在標(biāo)準(zhǔn)條件（如關(guān)于對(duì)照物所使用）下提取的總葡萄糖為107. 23mg，低于 先前數(shù)輪（圖9)在相同條件下的平均值131. 05mg。
[0172] 對(duì)于蛋白質(zhì)回收率，外加的材料的第一次酸性提取得到51. 5mg BSA當(dāng)量。這比得 到38. 25mg的對(duì)照提取高出13. 25mg(圖12)。然而，與在提取之間添加的BSA的量4mg相 比較，測(cè)試值高得多。此外，根據(jù)從六次提取回收的總蛋白質(zhì)，外加的樣品顯示23. 5g的BSA 當(dāng)量，高于對(duì)照樣品。這可能是因?yàn)橥饧拥鞍踪|(zhì)的量太少而無(wú)法覆蓋重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間的差異。
[0173] 實(shí)例2-在選定條件下的提取的按比例放大
[0174] 為了在微波提取期間回收大部分的碳水化合物和蛋白質(zhì)，選擇酸性到堿性（酸 性-堿性-堿性-酸性-酸性-堿性）重復(fù)條件。根據(jù)圖9和10,通過(guò)六次提取從干微藻 生物質(zhì)提取的總碳水化合物含量為至多5%，并且通過(guò)六次提取從干微藻生物質(zhì)提取的蛋 白質(zhì)含量為至多10%。此外，根據(jù)圖9,所提取的大多數(shù)碳水化合物能夠通過(guò)第一次酸性提 取來(lái)提取，并且僅極少量的提取的碳水化合物是由第二次和第三次提取提供。對(duì)于蛋白質(zhì)， 第一次酸性提取占總提取蛋白質(zhì)的約25%，并且第二次和第三次提取分別占總提取蛋白質(zhì) 的約30%和20%。因此，酸性到喊性條件不僅使碳水化合物和蛋白質(zhì)提取效率最大化，而 且還實(shí)現(xiàn)了成品產(chǎn)物的分離。在第一次酸性提取之后，移出了大部分的提取的碳水化合物。 因此，來(lái)自第二次和第三次堿性提取的提取物幾乎不含碳水化合物。
[0175] 材料
[0176] 批號(hào)29的干微藻生物質(zhì)是從南澳大利亞研發(fā)中心（SARDI)獲得。
[0177] 設(shè)備
[0178] 微波提取是在麥頓的Start Synth微波合成試驗(yàn)站進(jìn)行。
[0179] 程序
[0180] 將干生物質(zhì)（25g)添加到500mL平底燒瓶中。添加0. 5M H2S04 (250mL)，并且在室 溫下培育樣品約1小時(shí)。接著，在微波烘箱中于100°c下照射樣品10分鐘。
[0181] 接著以10, 000g將混合物離心10分鐘，并分別收集頂（脂質(zhì)）層和中間（碳水化 合物和蛋白質(zhì)）層以提供第一次提取產(chǎn)物。
[0182] 將團(tuán)粒再懸浮于250mL的0. 5M NaOH中并重復(fù)微波照射、離心和產(chǎn)物分離工藝，以 提供第二次提取產(chǎn)物。
[0183] 將團(tuán)粒再次再懸浮于250mL的0. 5M NaOH中并重復(fù)微波照射、離心和產(chǎn)物分離工 藝，以提供第三次提取產(chǎn)物。
[0184] 將團(tuán)粒再次再懸浮于250mL的0. 5M H2S04中并重復(fù)微波照射、離心和產(chǎn)物分離工 藝，以提供第四次提取產(chǎn)物。
[0185] 將團(tuán)粒再次再懸浮于250mL的0. 5M H2S04中并重復(fù)微波照射、離心和產(chǎn)物分離工 藝，以提供第五次提取產(chǎn)物。
[0186] 最后，將團(tuán)粒再次再懸浮于250mL的0. 5M NaOH中并重復(fù)微波照射、離心和產(chǎn)物分 離工藝，以提供第六次提取產(chǎn)物。
[0187] 通過(guò)重量分析法來(lái)分析脂質(zhì)提取物，通過(guò)DNS法分析碳水化合物提取物，并通過(guò) BCA法分析蛋白質(zhì)提取物。
[0188] 結(jié)果
[0189] 脂質(zhì)提取物
[0190] 在每次提取之后未觀察到脂質(zhì)層。因此，收集每次提取的上清液并合并在一起，由 此增加提取物中脂質(zhì)的總量。然而，使樣品在室溫下靜置過(guò)夜之后，未觀察到脂質(zhì)層。相當(dāng) 大量的生物質(zhì)漂浮在樣品中，并且推測(cè)這使得不太可能觀察到所提取的脂質(zhì)。因此，從樣品 的頂層收集100mL樣品，并通過(guò)重量分析法對(duì)此物質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)分析。
[0191] 所提取的脂質(zhì)的不可見(jiàn)性也可能是由容器的形狀所致。在常規(guī)燒杯中，很難在大 量水的頂部上辨識(shí)少量的油。因此，為了在不減少樣品中的水量的情況下濃縮所提取的油， 使用了容量瓶。根據(jù)樣品的體積，將可能含有脂質(zhì)的提取物放入可觀測(cè)的容量瓶中。靜置 過(guò)夜之后，少量的油顯示在瓶壁上（圖13)。
[0192] 碳水化合物和蛋白質(zhì)提取物
[0193] 較大規(guī)模的碳水化合物提取的結(jié)果與小規(guī)模提取相當(dāng)（圖14)。因此，碳水化合物 提取的按比例放大是成功的。然而，如圖15中所示，在較大規(guī)模上蛋白質(zhì)提取的效率類似 于小規(guī)模提取。
[0194] 實(shí)例3-不同批次干微藻生物質(zhì)的提取
[0195] 材料
[0196] 微藻生物質(zhì)是從南澳大利亞研發(fā)中心（SARDI)獲得并且在60到80°C下烘箱干燥。
[0197] 設(shè)備
[0198] 微波提取是在麥頓的Start Synth微波合成試驗(yàn)站進(jìn)行。
[0199] 程序
[0200] 將微藻粉（2. 5g)添加到50mL平底燒瓶中（一式兩份）。添加0· 5M H2S04(25mL) 并混合樣品，接著在室溫下培育約1小時(shí)以使生物質(zhì)再水合。測(cè)量樣品的pH值，接著在微 波烘箱中，在以下條件下加工樣品：
[0201] ?在1000瓦特微波功率下照射每一樣品，直到樣品溫度升到100°C (對(duì)于25mL樣 品體積，此通?；ㄙM(fèi)約30秒）；
[0202] ?在200W微波功率輸入下，使樣品在100°C保持10分鐘。
[0203] 接著，在水浴中冷卻樣品3到5分鐘，之后將其轉(zhuǎn)移到離心管中并以10, 000g離心 10分鐘。
[0204] 接著將上清液轉(zhuǎn)移到25mL量筒中以測(cè)量體積。將lmL上清液轉(zhuǎn)移到1. 5mL離心 管中以進(jìn)行碳水化合物和蛋白質(zhì)分析。
[0205] 將第一次提取之后獲得的團(tuán)粒懸浮于25mL的0. 5M NaOH溶液中并且重復(fù)第一次 提取的工藝進(jìn)行第二次提取。
[0206] 接著，將第二次提取之后獲得的團(tuán)粒懸浮于25mL的0. 5M NaOH溶液中并且重復(fù)第 一次提取的工藝進(jìn)行第三次提取。
[0207] 接著，將第三次提取之后獲得的團(tuán)粒懸浮于25mL的0. 5M H2S04溶液中并且重復(fù)第 一次提取的工藝進(jìn)行第四次提取。
[0208] 將第四次提取之后獲得的團(tuán)粒懸浮于25mL的0. 5M H2S04溶液中并且重復(fù)第一次 提取的工藝進(jìn)行第五次提取。
[0209] 將第五次提取之后獲得的團(tuán)粒懸浮于25mL的0. 5M NaOH溶液中并且重復(fù)第一次 提取的工藝進(jìn)行第六次提取。
[0210] 結(jié)果
[0211] 如表1中所示，pH值隨在不同條件下進(jìn)行的每一次提取而變化。第一次提取的pH 值為1.2。這是因?yàn)樯镔|(zhì)是在強(qiáng)堿性條件下收集，并且所添加的酸部分被堿性生物質(zhì)中 和。在第一次提取之后，通過(guò)添加0.5M NaOH溶液作為第二次和第三次提取緩沖液，pH值 升高到13。第四次和第五次提取是在酸性條件下，并且pH值降到約0. 7,顯著低于第一次 提取的pH值。最后，通過(guò)添加0. 5M NaOH溶液將第六次提取的pH值增加到13. 6。
[0212] 每次提取之后所收集的上清液體積不同。在第一次提取之后，收集到22. 5mL上清 液。這比所添加的用于提取的提取緩沖液的體積少約2. 5mL。由于第一次提取是從干生物 質(zhì)開(kāi)始，故提取緩沖液的一部分將與團(tuán)粒中的生物質(zhì)整合。從第二次到第六次提取，上清液 的體積接近于所添加的體積。
[0213] 表1 一每一提取工藝的上清液的pH值和體積

【權(quán)利要求】
1. 一種用于從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包括：（i)用微波輻射處 理包含微藻生物質(zhì)的含水混合物，及（ii)從所述經(jīng)過(guò)處理的微藻生物質(zhì)回收含脂質(zhì)產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微藻生物質(zhì)是包含高達(dá)90 %的水的濕生物 質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述微藻生物質(zhì)包含以重量計(jì)約10%到約90%的 水。
4. 一種用于從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物和含碳水化合物產(chǎn)物的方法，所述方法 包括：（i)提供含有所述微藻生物質(zhì)的含水混合物；（ii)將所述含水混合物的pH值調(diào)到 pH〈7 加熱含有所述微藻生物質(zhì)的所述含水混合物；及（iv)從所述生物質(zhì)中分離出 所述含脂質(zhì)產(chǎn)物和所述含碳水化合物產(chǎn)物。
5. -種用于從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物和含蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包括： (i)提供含有所述微藻生物質(zhì)的含水混合物；（ii)將所述含水混合物的pH值調(diào)到pH>7 ; (iii)加熱含有所述微藻生物質(zhì)的所述含水混合物；及（iv)從所述生物質(zhì)中分離出所述含 脂質(zhì)產(chǎn)物和所述含蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
6. -種用于從微藻生物質(zhì)提取含脂質(zhì)產(chǎn)物、含碳水化合物產(chǎn)物及含蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方 法，所述方法包括： (i) 提供含有所述微藻生物質(zhì)的初始含水混合物； (ii) 將所述初始含水混合物的pH值調(diào)到pH〈7 ; (iii) 加熱含有所述微藻生物質(zhì)的所述酸性初始含水混合物以提供第一經(jīng)過(guò)處理的混 合物； (iv) 從所述第一經(jīng)過(guò)處理的混合物分離固體和液體，以提供第一固體和含碳水化合物 的液體； (V)將所述第一固體與含水混合物組合以形成第二含有微藻生物質(zhì)的含水混合物； (vi) 將所述第二含水混合物的pH值調(diào)到pH>7 ; (vii) 加熱含有所述微藻生物質(zhì)的所述堿性第二含水混合物以提供第二經(jīng)過(guò)處理的混 合物； (viii) 從所述第二經(jīng)過(guò)處理的混合物分離固體和液體，以提供第二固體和含蛋白質(zhì)的 液體； (ix) 任選地，使用所述第二固體重復(fù)步驟（V)到（viii)，以提供第三固體和另外的含 蛋白質(zhì)的液體； (X)將所述第二固體或所述第三固體與含水混合物組合，以形成最終的含水混合物； (xi) 用溶劑處理所述最終的含水混合物； (xii) 從所述最終含水混合物中分離所述溶劑，以提供含有脂質(zhì)產(chǎn)物的溶劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求6所述的方法，其中在步驟（ii)中形成的所述混合物的 pH值在約0. 5到約2的范圍內(nèi)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中在步驟（ii)中形成的所述混合物的pH值為約1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的方法，其中在步驟（vi)中形成的所述混合物的 pH值在約11到約14的范圍內(nèi)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中在步驟（iv)中形成的所述混合物的pH值為約 13。
11. 根據(jù)權(quán)利要求4到10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中加熱含有所述微藻生物質(zhì) 的酸性或堿性含水混合物的步驟是通過(guò)用微波輻射處理所述混合物來(lái)進(jìn)行。
12. 根據(jù)權(quán)利要求4到11中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述加熱步驟中的任一個(gè) 或多個(gè)是在大氣壓下進(jìn)行的。
13. 根據(jù)權(quán)利要求4到11中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述加熱步驟中的任一個(gè) 或多個(gè)是在高于大氣壓的壓力下進(jìn)行的。
14. 一種由根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一權(quán)利要求所述的方法制造的產(chǎn)物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求4、權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的方法，其實(shí)質(zhì)上如前 文參考實(shí)例所描述。
【文檔編號(hào)】C11B1/10GK104093823SQ201280062416
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月20日
【發(fā)明者】張衛(wèi), 宿鵬 申請(qǐng)人:南澳佛林德斯大學(xué)