七葉內(nèi)酯在制備防治登革熱Ⅱ型病毒感染的藥物中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及七葉內(nèi)酯在制備防治登革熱Ⅱ型病毒感染的藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用中所述的藥物由七葉內(nèi)酯和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，其中七葉內(nèi)酯用在藥物中的質(zhì)量百分含量為10％～60％。本發(fā)明所述的藥物具有抗Ⅱ型登革熱病毒的作用，可用于防治登革熱感染。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
七葉內(nèi)酯在制備防治登革熱Π 型病毒感染的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及含有機(jī)有效成分的醫(yī)藥制品，具體涉及含香豆素類(lèi)化合物的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 登革病毒(dengue virus)在分類(lèi)上屬黃病毒科、黃病毒屬。包括4個(gè)不同血清型， 即Ι、Π 、ΙΠ、?ν型登革病毒。根據(jù)疾病嚴(yán)重程度不同，臨床上可分為登革熱(dengue fever)、 登革出血熱（dengue hemorrhagic fever)和登革休克綜合征（dengue shock syndrome)。 登革熱傳播速度快，發(fā)病率高，登革出血熱和登革休克綜合征病情兇猛，病死率高。隨著全 球經(jīng)濟(jì)一體化程度的加快和氣候的持續(xù)變暖，加上蚊媒擴(kuò)散速度加快、分布范圍變廣，致使 該疾病在世界范圍內(nèi)迅速蔓延。目前，全世界每年約有〇. 5億~1億人感染登革病毒，中國(guó)的 廣東、海南和臺(tái)灣等地都曾有過(guò)登革熱的發(fā)生和大流行。由于感染登革熱的死亡率很高，造 成的危害已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，越來(lái)越引起世界各國(guó)衛(wèi)生部門(mén)的高度重視。因 此，防治登革病毒感染與傳播已成為醫(yī)學(xué)界當(dāng)務(wù)之急。由于登革病毒的致病機(jī)制并未闡明， 尚無(wú)用于人體的疫苗及有效的治療藥物，尋找一種有效治療登革熱的藥物迫在眉睫。
[0003] 七葉內(nèi)酯，又稱秦皮乙素，屬香豆素類(lèi)化合物，屬香豆素類(lèi)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如 下式（I)所示。七葉內(nèi)酯的棱柱狀結(jié)晶、葉狀結(jié)晶真空升華，熔點(diǎn)268~270°C，溶于稀堿顯藍(lán) 色熒光，可溶于熱乙醇及冰醋酸，幾乎不溶于乙醚和水。
[0004]
[0005] 七葉內(nèi)酯來(lái)源于蕓香科植物檸檬的葉，木犀科植物苦楊白蠟樹(shù)的樹(shù)皮及顛茄、曼 陀羅、地黃等植物中，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘等作用。但是，目前文獻(xiàn)報(bào)道 中還沒(méi)有出現(xiàn)七葉內(nèi)酯具有抗登革熱病毒活性的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供七葉內(nèi)酯的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。
[0007] 上述在制藥中的新應(yīng)用為，七葉內(nèi)酯在制備防治登革熱Π 型病毒感染的藥物中的 應(yīng)用。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述的七葉內(nèi)酯可以采用常規(guī)的方法從天然植物提取，也可以由合 成或其他方法制得。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述的藥物由七葉內(nèi)酯和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，其中，七葉內(nèi)酯 在藥物中的質(zhì)量百分含量為10%~60%。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述的藥物可以是臨床上可接受的注射劑、膠囊劑或片劑。
[0011] 本發(fā)明所述的注射劑、膠囊劑和片劑具有抗Π 型登革熱病毒的作用，可用于防治 登革熱感染。
[0012] 本發(fā)明用七葉內(nèi)酯抗登革熱病毒是采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定七葉內(nèi)酯對(duì)登革熱 Π 型病毒的抑制作用，觀察七葉內(nèi)酯對(duì)BHK-21細(xì)胞的毒性作用和對(duì)登革熱Π 型病毒的抑制 作用，利用CCK-8檢測(cè)試劑測(cè)得受試藥物的半數(shù)有毒濃度(CC5Q)為790.5,半數(shù)最大效應(yīng)濃度 (EC 5Q)為2.67，其選擇指數(shù)SI是296.07，為低毒高效。具體實(shí)驗(yàn)方法如下所述。
[0013] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0014] 1.1細(xì)胞株乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)，引自武漢病毒研究所，T11代。本室凍存保種。
[0015] 1.2實(shí)驗(yàn)組及其對(duì)應(yīng)的受試藥物
[0016] 受試樣品：取購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司（LOT:KA0425CA14)七葉內(nèi)酯，加入 含0.5 % DMS0的DMEM培養(yǎng)基解，制得每毫升含七葉內(nèi)酯1.65mg的藥液。
[0017] 1.3病毒株登革二型病毒引自武漢病毒研究所
[0018] 1.3試劑和儀器新生小牛血清及DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司）；DMS0(廣州市康洋化工 有限公司）；胰蛋白酶(美國(guó)DIFC0公司；上海生工生物工程公司代理hOlympus PM-6倒置顯 微鏡（日本OLYMPUS公司）；E-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠）；BP221S電子分析天平 (上海精密儀器表有限公司）。
[0019] 2.方法
[0020] 2.1七葉內(nèi)酯在BHK-21細(xì)胞上毒性濃度的測(cè)定
[0021] 將密度為0.5X105cell/ml BHK-21細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100yL。生 長(zhǎng)24h細(xì)胞成片(80-90%)貼壁后備用。將藥物用細(xì)胞維持培養(yǎng)液(含2%血清)從連續(xù)2倍梯 度稀釋6個(gè)梯度，每孔加入所配制的藥液100yL，設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，每孔加入100yL細(xì)胞維持 培養(yǎng)液。設(shè)溶劑對(duì)照組，于37 °C的5 %⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加藥培養(yǎng)48h后加入含100yL10 % CCK-8試劑的培養(yǎng)基，在37 °C孵育lh。按照下面方法計(jì)算：
[0022]以450nm檢測(cè)吸光度，藥物對(duì)細(xì)胞的毒性以細(xì)胞的活性表示，計(jì)算公式：
[0023] 細(xì)胞活率（％ )=(藥物組-空白對(duì)照)/(細(xì)胞對(duì)照-空白對(duì)照）X 100%。
[0024] 2.2病毒抑制率的測(cè)定
[0025] 選擇生長(zhǎng)旺盛、成層良好細(xì)胞，傾棄生長(zhǎng)液，加入胰酶消化，用生長(zhǎng)液分散使細(xì)胞 懸液濃度為1〇5個(gè)/孔。用移液器將細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔100uL。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)12~18小時(shí)，待細(xì)胞在96孔板中長(zhǎng)成單層后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入100ul的不同 稀釋濃度的藥物和l〇〇uL的100TCID 5Q病毒液，每一藥物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì) 照組、正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，置于培養(yǎng)箱中孵育lh，吸去含藥培養(yǎng)液 和病毒液。在病毒對(duì)照組75 % -100 %病變時(shí)吸去維持液，加入lOOyL 10 % CCK-8，在酶標(biāo)儀 450nm測(cè)定吸光度，計(jì)算藥物的病毒抑制率。
[0026] 病毒抑制率=(試驗(yàn)組平均0D值-病毒對(duì)照組平均0D值)/ (細(xì)胞對(duì)照組平均0D值_ 病毒對(duì)照組平均0D值）X 100%
[0027] 3.結(jié)果
[0028] 3.1藥物毒性結(jié)果見(jiàn)下表1。
[0029]表1
[0030]
[0031] 3.2藥物對(duì)病毒抑制率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表2。
[0032] 表 2
[0033]

【具體實(shí)施方式】
[0034] 例1:(注射劑）
[0035] 取七葉內(nèi)酯lOOOmg，加枸櫞酸lOOOmg，枸櫞酸鈉500mg，氯化鈉1800mg，加1000ml的 注射用水，，攪拌使溶解，除菌濾過(guò)，灌封，經(jīng)100°C 15分鐘流通蒸汽滅菌，制成每支2mg/2ml 的注射液供注射使用。
[0036]例2:(膠囊劑）
[0037] 取七葉內(nèi)酯5000mg與4000mg微晶纖維素、500mg羧甲基淀粉鈉、400mg十二烷基硫 酸鈉等輔料充分混合，采用輥壓法進(jìn)行干法制粒，再與適量硬脂酸鎂混勻，填充入3#空心膠 囊，制成規(guī)格為l〇〇mg/粒的膠囊劑供口服使用。
[0038]例3:(片劑）
[0039] 取七葉內(nèi)酯5000mg與4000mg淀粉、200mg交聯(lián)PVP、300mg羧甲基淀粉鈉混合均勻， 用5 %PVP的75 %乙醇溶液作為粘合劑，制軟材，以18目篩制粒，60 °C干燥后lh，20目整粒后 加入適量滑石粉，混勻，壓片，制成規(guī)格為l〇〇mg/片的片劑供口服使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 七葉內(nèi)酯在制備防治登革熱π型病毒感染的藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物由七葉內(nèi)酯和醫(yī)學(xué)上可接受的 輔料組成，其中七葉內(nèi)酯用在藥物中的質(zhì)量百分含量為10 %~60 %。3. 根據(jù)權(quán)利2所述的應(yīng)用，其特征是，所述的藥物是注射劑、膠囊劑或片劑。
【文檔編號(hào)】A61K31/366GK106038535SQ201610508435
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月29日
【發(fā)明人】李耿, 賴小平, 吳建國(guó)
【申請(qǐng)人】廣州中醫(yī)藥大學(xué)