一種豬圓環(huán)病毒ii型病毒樣顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的病毒樣顆粒疫苗包括可溶性蛋白，該可溶性蛋白為大腸桿菌表達(dá)豬圓環(huán)病毒II型完整衣殼蛋白基因得到的蛋白。其中該衣殼蛋白基因是篩選自目前國(guó)內(nèi)豬圓環(huán)病毒II型流行毒株的衣殼蛋白基因，并且經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化，不僅能在大腸桿菌中大量表達(dá)，而且表達(dá)的可溶性蛋白還能形成病毒樣顆粒。應(yīng)用本發(fā)明的方法制備的豬圓環(huán)病毒II型亞單位疫苗具有抗原純度高、免疫原性強(qiáng)等特點(diǎn)，此外該疫苗制備過(guò)程簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
-種豬圓環(huán)病毒Μ型病毒樣顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗及 其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒II型（Porcine circovirus 2，PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (postweaning multisystemic wasting syn化ome，PMWS)的主要病原，其主要感染6-15周 齡的仔豬，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、發(fā)熱、淋己結(jié)腫大、黃痘、呼吸困難等癥狀。此外，PCV巧 豬皮炎與腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征、A2型先天性震顫、豬增生性和壞死性肺炎、繁殖障 礙等疾病密切相關(guān)。PCV2的危害還在于能夠使感染的豬只免疫功能受到損傷，從而導(dǎo)致機(jī) 體抵抗力下降，使機(jī)體容易繼發(fā)或并發(fā)其它感染性疾病，造成更大危害。本病表現(xiàn)為世界流 行，已經(jīng)給世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但對(duì)PCV2的致病機(jī)制研究仍不透徹，目 前僅能通過(guò)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、疫苗接種等方法控制該病毒在豬群中的爆發(fā)。因此，研發(fā)一種廉 價(jià)且有效地豬圓環(huán)疫苗顯得尤為迫切。
[0003] 研究表明PCV2含有兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框，分別為0RF1和0RF2,其中0RF1與病毒 的復(fù)制相關(guān)，免疫原性較弱;0RF2為編碼該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap的基因，Cap是病毒的衣 殼蛋白，該蛋白含有可中和病毒的抗原表位，還可自我裝配成病毒樣粒子，因此0RF2是研制 新型疫苗的主要候選基因。
[0004] 此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，Cap蛋白的N端富含堿性氨基酸(如精氨酸），序列高度保守，其 中前41個(gè)氨基酸是化P蛋白的核內(nèi)化信號(hào)膚序列，而位于第12~18與34~41位的氨基酸對(duì) Cap蛋白的核定位起著決定性作用。還有研究表明，核定位信號(hào)膚區(qū)域含有潛在的抗原表 位，因此，要想獲得更好的保護(hù)效果，最好能表達(dá)完整的化P蛋白。但由于化P蛋白的N端大量 精氨酸的存在，嚴(yán)重影響了完整化P蛋白的大量表達(dá)，因此，大多研究人員選擇了截短或是 部分表達(dá)Cap蛋白，大量表達(dá)完整的化P蛋白目前仍是亟待解決的難題。通過(guò)本發(fā)明提供的 方法不僅可W大量表達(dá)完整的化P蛋白，而且表達(dá)的蛋白還是可溶的，活性高，易于大規(guī)模 生產(chǎn)。
[0005] 病毒樣顆粒(Virus Like hdicles，化P)是含有病毒一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空 屯、顆粒，不含遺傳物質(zhì)，其形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)及表面抗原和多膚表位與真正的病毒粒子相同 或相似，可通過(guò)與病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，具有 良好的免疫原性，且沒(méi)有毒副作用。目前，已有部分化Ps疫苗上市，如流感化Ps疫苗、乙肝 VLPs疫苗、乳頭瘤VLPs疫苗等，說(shuō)明該類疫苗有巨大的潛力。
[0006] 目前市場(chǎng)上的PCV2商品化疫苗主要有全病毒滅活苗和亞單位疫苗兩種，其中關(guān)于 全病毒滅活苗，由于病毒自身特點(diǎn)和生產(chǎn)工藝的問(wèn)題，經(jīng)常出現(xiàn)病毒滴度難W提高等問(wèn)題， 有時(shí)需要濃縮才能達(dá)到要求。國(guó)內(nèi)使用的亞單位疫苗主要是勃林格公司生產(chǎn)的，該公司生 產(chǎn)的PCV2亞單位疫苗是使用桿狀病毒表達(dá)目的蛋白，生產(chǎn)成本很高，造成很多養(yǎng)殖場(chǎng)難W 在生產(chǎn)中使用該疫苗。因此本發(fā)明使用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其操作簡(jiǎn)單、表達(dá)量高、成本 低廉等一系列優(yōu)點(diǎn)而具有很好的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種豬圓 環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法獲得的豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫 苗。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗的制 備方法，包括W下步驟：
[00川 （1)合成目的基因：WPCV2 119-GD01株(PCV2b基因亞型，由本實(shí)驗(yàn)分離保存）的 Cap蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，在保證此株化P蛋白的氨基酸不變的前提下，使用大腸桿菌 通用密碼子將氨基酸序列翻譯為核巧酸序列，使其適合在大腸桿菌中表達(dá)，然后委托華大 基因公司合成，基因合成時(shí)兩端加入酶切位點(diǎn)，氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID N0:1，合成后的基因 命名為r0RF2,基因序列見(jiàn)沈Q ID N0:2;
[0012] (2)重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建:將步驟（1)中獲得的r0RF2與祀T-43.1a空載體分別 進(jìn)行雙酶切，然后連接、轉(zhuǎn)化;獲取單菌落，培養(yǎng)后之后抽提質(zhì)粒保存待用，重組質(zhì)粒命名為 pET-43.1a-r0RF2；
[001引（3)重組表達(dá)菌株的構(gòu)建:將步驟(2)中獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌化-21 (DE3)，獲 得單菌落，經(jīng)檢測(cè)正確后保存，并命名為祀T-43. la-r0RF2菌株，即為重組表達(dá)菌株；
[0014] (4)重組蛋白的表達(dá)、純化和去標(biāo)簽:將步驟(3)中構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌株pET- 43. la-r0RF2進(jìn)行培養(yǎng)，并加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá);收集誘導(dǎo)后的菌體，破碎后經(jīng)Ni親和層析柱 純化，在純化后期加入蛋白酶將目的蛋白與標(biāo)簽切開(kāi)，收集目的蛋白；
[0015] (5)疫苗的制備:將步驟(4)中純化出來(lái)的目的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定，然后與佐劑混 合、乳化，獲得豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗。
[0016] 步驟(1)中所述的兩端加入酶切位點(diǎn)，優(yōu)選為BamHI和化ndin兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0017] 步驟(5)中所述的佐劑優(yōu)選為法國(guó)賽比克公司提供的201佐劑。
[0018] 步驟(5)中目的蛋白與佐劑的混合比例優(yōu)選為體積比1: 1。
[0019] -種豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗由上述制備方法獲得。
[0020] 上述獲得的豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗在制備防治斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜 合征的藥物中應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0022] 首先，本發(fā)明的基因是在保證氨基酸不變的情況下，使用大腸桿菌通用密碼子將 氨基酸序列翻譯為核巧酸序列，然后獲得基因，使被普遍認(rèn)為的全長(zhǎng)化P蛋白在原核表達(dá)系 統(tǒng)中表達(dá)量低，容易形成包涵體等局限性得到解決，獲得了表達(dá)量高，且目的蛋白可溶的重 組表達(dá)菌株，其中上清中目的蛋白約占總蛋白的43.1 %。
[0023] 其次，本發(fā)明表達(dá)的為化P蛋白全長(zhǎng)，它包含了 Cap蛋白氨基端41aa里面含有的潛 在抗原表位，因此本發(fā)明表達(dá)的化P蛋白相比截短表達(dá)的蛋白擁有更齊全的抗原表位，更接 近天然病毒衣殼蛋白，更易形成病毒樣顆粒，免疫原性更強(qiáng)。
[0024] -方面，使用本發(fā)明提供的純化與去標(biāo)簽聯(lián)合處理的方法制備蛋白，不僅操作簡(jiǎn) 便，純度很高，適于大規(guī)模生產(chǎn)，而且獲得的蛋白不帶有任何的標(biāo)簽（目前很多亞單位疫苗 都含有標(biāo)簽，如6x化S標(biāo)簽、分泌性信號(hào)膚等，運(yùn)些都不利于病毒樣顆粒的形成），運(yùn)樣也會(huì) 減少表達(dá)的蛋白與天然衣殼蛋白的差異，W至于獲得更接近天然病毒的顆粒
[0025] 又一方面，應(yīng)用上述方法制備的豬圓環(huán)病毒II型亞單位疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒(méi)有致病 性，且使用該疫苗免疫后，短時(shí)間內(nèi)能在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生高水平的豬圓環(huán)病毒抗體。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 構(gòu)成本申請(qǐng)一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意 性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。
[0027] 圖1為大腸桿菌表達(dá)的目的蛋白的可溶性的檢測(cè)結(jié)果圖；其中，Μ泳道是蛋白 marker; 1:祀Τ-43. la-r0RF2誘導(dǎo)表達(dá)破碎后上清；2: ρΕΤ-43. la-r0RF2誘導(dǎo)表達(dá)破碎后沉 淀;3: pET-43. la-r0RF2誘導(dǎo)表達(dá)后全菌;4:空載體誘導(dǎo)表達(dá)后全菌；圖中箭頭所指為融合 蛋白。
[002引圖2為電鏡觀察目的蛋白的結(jié)果圖，圖中病毒樣顆粒得直徑20nm左右。
[0029] 圖3為免疫仔豬后不同時(shí)間血清的抗體水平;其中：橫坐標(biāo)代表不同組別；縱坐標(biāo) 代表W450nm/630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)的樣品吸光度;2W、4W、6W、8W分別代表一免后2、4、6、8周。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0031] 實(shí)施例1化P蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
[0032] 化P蛋白基因的獲得
[0033] WPCV2 119-GD01株(PCV化基因亞型，由本實(shí)驗(yàn)分離保存）的化P蛋白的氨基酸序 列為基礎(chǔ)，在保證此株化P蛋白的氨基酸不變的前提下，使用大腸桿菌通用密碼子將氨基酸 序列翻譯為核巧酸序列，使其適合在大腸桿菌中表達(dá)，然后委托華大基因公司合成，基因合 成時(shí)兩端加入酶切位點(diǎn)，氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID NO: 1，合成后的基因命名為r0RF2,基因序列 見(jiàn)沈Q ID NO:2。
[0034] 重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建
[00巧]將r0RF2用Ba恤I和化ndin兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，然后回收純化。pET- 43.1曰也進(jìn)行與'01^^2同樣的處理。將處理好的祀1'-43.1曰和'01^^2在16°(：連接12}1，之后將連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨節(jié)青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)12-1化。挑 取平板上的單菌落，在含氨節(jié)青霉素的液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)4h左右，然后進(jìn)行菌液PCR鑒定和 送金唯智測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液1:1000加入到新鮮的含氨節(jié)青霉素的LB中，培養(yǎng)過(guò)夜，之 后抽提質(zhì)粒保存待用，重組質(zhì)粒命名為祀T-43. la-r0RF2。
[0036] 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0037] pET-43.1a-r0RF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌化-2UDE3)，同樣的，涂布含氨節(jié)青霉素 的LB平板，37°C培養(yǎng)12-1化，獲得重組表達(dá)菌株祀T-43.1a-r0RF2。
[0038] 實(shí)施例2重組蛋白的表達(dá)、純化
[0039] 化p蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0040] 取過(guò)夜培養(yǎng)的祀T-43. la-r0RF2菌株1:100接種到新鮮的含氨節(jié)青霉素的液體LB 培養(yǎng)基中，37 °C，200巧m搖床上培養(yǎng)化左右，使0D600的值達(dá)到0.6左右。然后加入終濃度為 0.5mmol/L的IPTG，16°C，150巧m進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)20h。樣品處理過(guò)后進(jìn)行SDS-PAGE分析(結(jié)果 見(jiàn)圖1)。
[0041] 化P蛋白的純化和去標(biāo)簽
[0042] 將誘導(dǎo)完成的菌液按下述步驟處理
[0043] (1)5000巧m離屯、5min，收集菌體，然后按照100ml菌液加入10ml PBS重懸菌體。
[0044] 間重懸后的菌體超聲破碎法破碎，破碎條件：功率200W，工作時(shí)間/間歇時(shí)間= 4sec/6sec，超聲次數(shù)根據(jù)菌液的多少?zèng)Q定。
[0045] 間將破碎完成的菌液離屯、，4°C、12000巧m、15min，收集上清待用。
[0046] (4)化P蛋白的純化按W下步驟進(jìn)行
[0047] ① Ni填料裝柱。
[004引②Binding buffer平衡。
[0049]③將收集的上清緩慢的通過(guò)處理后的含Ni填料的柱子。
[0化0] ④Binding buffer洗去雜蛋白。
[0化1 ] ⑤然后加入PBS稀釋后的蛋白酶，16 Γ、100巧m、2化。
[0052]⑥收集蛋白酶切下的蛋白，此蛋白即為去除標(biāo)簽的化P蛋白。
[0化3] (5)SDS-P AGE 電泳檢測(cè)、western-blot。
[0054] 實(shí)施例3電鏡觀察表達(dá)的化P蛋白
[0055] 取10倍稀釋的純化后的化P蛋白樣品20ul滴到200目銅網(wǎng)上，室溫靜置3min，用濾 紙輕輕吸去多余的液體。然后用3%的憐鶴酸染色3min，待完全干燥后在透射電鏡下觀察。 電鏡照片結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0056] 實(shí)施例4病毒樣顆粒疫苗的制備
[0057] 首先使用BCA試劑盒測(cè)定上述純化好的蛋白，將化P蛋白濃度調(diào)至0.6mg/ml，然后 按照1:1的體積比例將蛋白與法國(guó)賽比克公司提供的201佐劑混合，接著進(jìn)行超聲乳化。經(jīng) 檢測(cè)粘度和穩(wěn)定性合格后置于4°C保存。
[0058] 實(shí)施例5病毒樣顆粒蛋白的仔豬免疫試驗(yàn)
[0059] 將15只3周齡經(jīng)抗原抗體檢測(cè)雙陰性的仔豬隨機(jī)分為3組，每組5頭。各組均采用頸 部肌肉注射的方式免疫，共免疫兩次。
[0060] 第一組:每頭仔豬每次免疫2ml滅菌后的PBS。
[0061] 第二組:每頭仔豬每次免疫2ml某公司滅活疫苗。
[0062] 第Ξ組:每頭仔豬2ml由201佐劑乳化的化P蛋白，終濃度為0.3mg/ml。
[0063] -免后，每隔2周對(duì)每頭仔豬進(jìn)行采血，析出的血清使用豬圓環(huán)病毒化ISA檢測(cè)試 劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0064] 結(jié)果顯示:病毒樣顆粒疫苗免疫仔豬后能快速產(chǎn)生針對(duì)豬圓環(huán)病毒的抗體，且與 商品化的滅活疫苗相比產(chǎn)生抗體更加迅速、水平更高。
[0065] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗的制備方法，其特征在于:包括以下步驟： (1) 合成目的基因：合成兩端加入酶切位點(diǎn)的如SEQ ID N0:2的基因序列，基因命名為 rORF2； (2) 重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建:將步驟（1)中獲得的rORF2與pET-43. la空載體分別進(jìn)行 雙酶切，然后連接、轉(zhuǎn)化;獲取單菌落，培養(yǎng)后之后抽提質(zhì)粒保存待用，重組質(zhì)粒命名為pET-43.1a-rORF2； (3) 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建:將步驟(2)中獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21 (DE3)，獲得單 菌落，經(jīng)檢測(cè)正確后保存，并命名為pET-43. la-rORF2菌株，即為重組表達(dá)菌株； (4) 重組蛋白的表達(dá)、純化和去標(biāo)簽：將步驟（3)中構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌株pET- 43. la-rORF2進(jìn)行培養(yǎng)，并加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá);收集誘導(dǎo)后的菌體，破碎后經(jīng)Ni親和層析柱 純化，在純化后期加入蛋白酶將目的蛋白與標(biāo)簽切開(kāi)，收集目的蛋白； (5) 疫苗的制備:將步驟(4)中純化出來(lái)的目的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定，然后與佐劑混合、乳 化，獲得豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗的制備方法，其特征在于:步 驟(1)中所述的兩端加入酶切位點(diǎn)為BamHI和Hindlll兩個(gè)酶切位點(diǎn)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗的制備方法，其特征在于:步 驟(5)中所述的佐劑為法國(guó)賽比克公司提供的201佐劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗的制備方法，其特征在于:步 驟(5)中目的蛋白與佐劑的混合比例為體積比1:1。5. -種豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗由權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的制備方法獲得。6. 權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的制備方法獲得的豬圓環(huán)病毒II型病毒樣顆粒疫苗在制 備防治斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的藥物中應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/12GK105999255SQ201610333059
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】樊惠英, 苗配思, 劉潔, 高應(yīng)棋, 謝永生
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)