專利名稱：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型基因工程亞單位疫苗及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領域，具體而言，涉及一種豬圓環(huán)病毒II型基因工程亞單位疫苗的制備方法和應用。
背景技術(shù)：
1991年加拿大John Harding報道了斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS),后經(jīng)研究證實豬圓環(huán)病毒 II 型(Porcinecircovirus 2, PCV2)是該綜合征的主要病原?，F(xiàn)有研究表明 ，豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease, PCVD)是由PCV2感染而引起的一種臨床綜合征，其主要癥狀表現(xiàn)為漸進性消瘦、呼吸困難急促、貧血、腹瀉、黃疸、間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)炎及腎炎等。豬圓環(huán)病毒II型主要侵害5-12周齡斷奶仔豬，而且與近年來發(fā)生的PMWS、豬皮炎與腎炎綜合癥(porcine dermatitis and nephropathysyndrome, F1DNS)、豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、A2 型先天性振顫(congenital tremor, CT)、豬增生性和壞死性肺炎(Porcine Proliferativeand necrotizing Pneumonia,PNP)、繁殖障礙(Reproductive failure)等疾病都有密切關系。PCV2的危害在于能夠使感染豬只的免疫功能受到損害，導致機體抵抗力下降，經(jīng)常以亞臨床感染的形式出現(xiàn)，易被忽視。由于PCV2感染使免疫系統(tǒng)受到損害，容易繼發(fā)或并發(fā)其它感染性疾病，造成更大危害。本病呈世界流行，從2000年我國首次發(fā)現(xiàn)存在此病以來，已給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了相當大的經(jīng)濟損失。豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)在分類學上屬圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是已知的最小的動物病毒之一。病毒粒子直徑約17nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜。PCV具有兩個基因型，即:PCV1、PCV2，基因組大小約為1.76kb，含有2個主要閱讀框架，其中ORFl基因產(chǎn)物與病毒復制酶(Itep)相關，0RF2基因產(chǎn)物是構(gòu)成病毒衣殼蛋白(Capsid protein,簡稱:cap)的成分。PCVl是由Tischer等1974年首次在PK15細胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)，對豬無致病性。PCV2是于1991年首次在加拿大豬群中發(fā)現(xiàn)。1998年證實該病毒具有感染性和致病性，是養(yǎng)豬業(yè)需要防治的病毒類型。但由于PCV2在體外培養(yǎng)時不產(chǎn)生細胞病變,病毒增殖能力差，采用傳統(tǒng)的方法制備該病毒疫苗非常困難。用基因工程的方法制備豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)疫苗是控制該病的重要途徑。盡管目前市場上已有桿狀病毒表達的PCV2基因工程亞單位疫苗的供應，但人們?nèi)栽趯で笮碌牡统杀镜腜CV2疫苗的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種豬圓環(huán)病毒II型基因工程亞單位疫苗、及其制備方法和應用，以提供一種新的豬圓環(huán)病毒II型亞單位疫苗及其制備方法和應用。為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種可溶性融合蛋白。該可溶性融合蛋白包括由大腸桿菌表達豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因得到的蛋白，豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因經(jīng)過定位信號區(qū)域剪切和定點突變，定點突變包括將密碼子AGA或AGG突變?yōu)镃GC。進一步地，定點突變的部位包括位于豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的如下至少一組氨基酸殘基位點:1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；4)第186位；5)第222位。進一步地，定點突變的部位包括位于豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的如下氨基酸殘基位點:6)第 97，99，116 位;或 7)第 97，99，180，186 位。進一步地，定位信號區(qū)域剪切包括豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因5’端剪切掉39 159bp的DNA鏈；優(yōu)選地，69 123bp ;優(yōu)選地，105bp。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供上述可溶性融合蛋白在制備豬圓環(huán)病毒II型疫苗中的應用。根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供編碼上述可溶性融合蛋白的DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供一種載體。該載體包含上述編碼可溶性融合蛋白DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供一種宿主細胞。該宿主細胞包含上述載體。進一步地，該宿主細胞保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址為武漢市武漢大學)，保藏編號為CCTCC M2012474 ;保藏日期2012年11月23日，分類命名Escherichiacoli BL21/pET28a PCV2 MNdX Cap (埃希氏菌屬，大腸桿菌種)。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供一種豬圓環(huán)病毒II型疫苗。該疫苗包括上述可溶性融合蛋白。進一步地，該疫苗包括佐劑，佐劑包括氫氧化鋁膠和CpG-DNA。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供上述疫苗的制備方法。該制備方法包括通過上述宿主細胞培養(yǎng)、提取抗原蛋白，然后添加佐劑制備而來。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供上述豬圓環(huán)病毒II型疫苗在預防豬圓環(huán)病毒II型引起的豬相關疾病中的應用。進一步地，對21日齡的豬進行免疫注射。應用本發(fā)明的技術(shù)方案制備的豬圓環(huán)病毒II型疫苗抗原純度高、安全性好，免疫原性強，且對豬等動物沒有致病性。使用該疫苗免疫后的豬只增重明顯提高，呼吸道疾病明顯減少。并且，本發(fā)明的疫苗通過大腸桿菌表達，因此制備過程相對簡單，成本低。


構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中:圖1示出了根據(jù)本發(fā)明實施例的變異體篩選的工程菌E.col1.BL21/pET28a-PCV2MNd Xcap誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中，I泳道為E.col1.BL21/pET28a (空白對照)上清，2泳道為E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd X cap全菌，3泳道為E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd Xcap 全菌，4 泳道為 E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd X cap上清，5 泳道為 E.col1.BL21/pET28aPCV2MNd X cap 上清，M 為蛋白 marker ；以及圖2示出了根據(jù)本發(fā)明實施例的蛋白純化產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中，M泳道為蛋白質(zhì)低分子量標記物；1泳道為DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析洗脫液；2泳道為20 % -40 %飽和度硫酸銨沉淀蛋白。
具體實施例方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。在重組疫苗研究中PCV2的Cap蛋白基因是最為重要的備選基因，因為Cap蛋白是該病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，含有型特異性抗原決定簇。有研究資料報道，PCV2的中和性單克隆抗體和多克隆豬抗血清都能與Cap蛋白相識別和發(fā)生中和反應。在基因工程疫苗中，重組基因工程亞單位疫苗是最為安全的疫苗，而且其免疫的效果也最為確定，只要抗原蛋白的量足夠大就能產(chǎn)生相應的特異性抗體。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供了一種可溶性融合蛋白。該可溶性融合蛋白包括由大腸桿菌表達豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)衣殼蛋白(cap)基因得到的蛋白，豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因經(jīng)過定位信號區(qū)域剪切和定點突變，定點突變包括將密碼子AGA或AGG突變?yōu)镃GC。豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因經(jīng)過定位信號區(qū)域剪切和定點突變，使基因中編碼序列變短，刪除部分或全部信號區(qū)域甚至部分N端序列。使精氨酸殘基的稀有密碼子變成能在大腸桿菌中很好表達的密碼子，使該基因片段更適合于在大腸桿菌中表達?；蚋脑炀C合作用的結(jié)果是，表達產(chǎn)物具有天然cap蛋白的免疫原性，且在中性pH的緩沖溶液中有很好的溶解性。與傳統(tǒng)的疫苗制備方法相比，在大腸桿菌中表達制備疫苗其制備工藝相對簡單，成本低，且抗原純度高、安全性好，免疫原性強。對信號區(qū)域剪切可以是對豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白全基因刪除不同長度核苷酸序列，優(yōu)選地，定位信號區(qū)域剪切包括豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因5’端剪切掉39 159bp的DNA鏈；更優(yōu)選地，69 123bp ;進一步優(yōu)選地，105bp。

根據(jù)本發(fā)明一典型的實施方式，表達豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的核苷酸序列的獲得系用PCV2-FJ株，進行0RF2全基因克隆，然后對該基因進行5’端剪裁不同長度核苷酸序列后的剩余基因片段，它們分別為:Ndl3cap gene,Nd23cap gene,Nd35cap gene,Nd41capgene, Nd53cap gene (剪切核苷酸數(shù)目見表I)用這些基因片段作為進一步改造用基因。表I
剪接后基因名稱15'刪除核I SDS_PAGE檢測表達 苷酸數(shù)目蛋白相對含量(%)
NdO cap geneO bpO
ISid13 cap gene39 bp5.3
Nd23 cap gene69 bp11.2
Nd35 cap gene105 bp20.8
Nd41 cap gene123 bp10.5
Nd53 cap gene159 bp12.2注:誘導表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后，經(jīng)Biorad GelDoc XR凝膠成像分析系統(tǒng)中的Quantity One 1_D軟件分析,表達蛋白占可溶性蛋白總量的百分比；SDS-PAGE檢測表達蛋白相對含量(％)，指表達蛋白占可溶蛋白總量的百分比。
優(yōu)選地，定點突變的部位包括位于豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的如下至少一組氨基酸殘基位點:1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；4)第186位；5)第222位；其中較優(yōu)選的部位是:1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；最優(yōu)選的部位是:第97和第99位。當然，這些位點的突變也可以聯(lián)合使用，可以將最優(yōu)選的定點變異部位(第97和第99位)與116位定點變異位點進行組合(即6，第97，99，116位聯(lián)合突變)，或與180位和186位定點變異位點進行組合(即7，第97，99，180，186位聯(lián)合突變)變異操作；最優(yōu)的組合是:第97和第99位變異與第116位的組合(即6)第97，99，116位)。將以上7種突變后的表達菌，按菌體濕重的10倍加生理鹽水，超聲波破碎后，12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘后取上清，用瓊脂雙向免疫擴散實驗(AGP)進行抗原滴度檢測。結(jié)果如下表2:表 權(quán)利要求
1.一種可溶性融合蛋白，其特征在于，包括由大腸桿菌表達豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因得到的蛋白，所述豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因經(jīng)過定位信號區(qū)域剪切和定點突變，所述定點突變包括將密碼子AGA或AGG突變?yōu)镃GC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定點突變的部位包括位于豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的如下至少一組氨基酸殘基位點:1)第97和第99位；2)第116 位；3)第 180 位；4)第 186 位；5)第 222 位。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定點突變的部位包括位于豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白的如下氨基酸殘基位點:6)第97，99，116位；或7)第97，99，180，186 位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定位信號區(qū)域剪切包括所述豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因5’端剪切掉39 159bp的DNA鏈；優(yōu)選地，69 123bp ；優(yōu)選地，105bp。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的可溶性融合蛋白在制備豬圓環(huán)病毒II型疫苗中的應用。
6.編碼如權(quán)利要求1至4中任一項所述的可溶性融合蛋白的DNA序列。
7.—種載體,其特征在于,包含如權(quán)利要求6所述的DNA序列。
8.—種宿主細胞，其特征在于,包含如權(quán)利要求7所述的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCCM2012474。
10.一種豬圓環(huán)病毒II型疫苗，其特征在于，包括如權(quán)利要求1至4中任一項所述可溶性融合蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的疫苗，其特征在于，進一步包括佐劑，所述佐劑包括氫氧化鋁膠和CpG-DNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的疫苗、，其特征在于，通過如權(quán)利要求8或9所述的宿主細胞培養(yǎng)、提取抗原蛋白，然后添加佐劑制備而來。
13.如權(quán)利要求10或11所述的豬圓環(huán)病毒II型疫苗在預防豬圓環(huán)病毒II型引起的豬相關疾病中的應用。
14.根據(jù)如權(quán)利要求13所述的應用，其特征在于，對21日齡的豬進行免疫注射。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬圓環(huán)病毒II型基因工程亞單位疫苗及其制備方法和應用。其中，豬圓環(huán)病毒II型疫苗包括可溶性融合蛋白，該可溶性融合蛋白包括由大腸桿菌表達豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因得到的蛋白，豬圓環(huán)病毒II型衣殼蛋白基因經(jīng)過定位信號區(qū)域剪切和定點突變，定點突變包括將密碼子AGA或AGG突變?yōu)镃GC。應用本發(fā)明的技術(shù)方案制備的豬圓環(huán)病毒II型疫苗抗原純度高、安全性好，免疫原性強，對豬等動物沒有致病性。并且，本發(fā)明的疫苗抗原通過大腸桿菌表達，因此制備過程相對簡單，成本低。
文檔編號C12N1/21GK103204942SQ20131005000
公開日2013年7月17日 申請日期2013年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月8日
發(fā)明者榮俊, 杜元釗, 范根成, 韓建文, 蔡聯(lián)燊 申請人:青島易邦生物工程有限公司