鼠李糖乳桿菌grx19在調(diào)節(jié)腸道菌群中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及鼠李糖乳桿菌grx19(Lactobacillus rhamnosus grx19)的新應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了該菌在制備調(diào)節(jié)腸道菌群以及防止病毒性腹瀉的功能食品及藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明的乳酸菌grx19具有良好的耐酸耐膽鹽和抑制致病菌能力，表面疏水性較高、自聚合能力較強(qiáng)，細(xì)胞研究表明其對(duì)大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC?6細(xì)胞)具有顯著的黏附性。本發(fā)明的益生乳酸菌grx19除了具備一般益生乳酸菌所具備的對(duì)人體健康有益的作用外，還能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和防止病毒性腹瀉，用于功能性食品或藥品的生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
鼠李糖乳桿菌grx19在調(diào)節(jié)腸道菌群中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及食品生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一株具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)W及防止病 毒性腹瀉益生乳酸菌及其在功能食品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌黏附有利于維護(hù)腸道正常菌群結(jié)構(gòu)，維持腸粘膜形態(tài)與功能的完整性，預(yù) 防病毒性腹瀉。在維護(hù)腸道正常菌群結(jié)構(gòu)方面，乳酸菌主要是通過(guò)空間位阻效應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。 當(dāng)高黏附性的乳酸菌先于病原菌定植在腸道時(shí)，可W在腸道表面形成一層物理屏障，運(yùn)樣 就阻斷了病原菌與腸黏膜的接觸，有利于將病原菌清除。另外，高黏附性益生乳酸菌大量聚 集在腸道中，可產(chǎn)生足夠濃度的抑菌成分，如酸性物質(zhì)、生物酶、抗菌膚等，使病原菌的活性 受到抑制。因而乳酸菌可W預(yù)防或治療病原菌引發(fā)的急性腹瀉和腸道菌群失調(diào)。
[0003] 人體腸道是乳酸菌的重要來(lái)源，對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及降低膽固 醇水平等具有重要作用。乳酸菌發(fā)揮其益生作用必須對(duì)胃腸道中胃酸和膽汁等不良環(huán)境具 有一定的耐受性，同時(shí)它們的代謝產(chǎn)物可W對(duì)腸道內(nèi)致病菌的生長(zhǎng)起到抑制作用，從而維 持腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡，因此對(duì)人工胃液、人工腸液及膽鹽具有耐受性的乳酸菌，是發(fā)酵功能 特性的基礎(chǔ)。
[0004] 乳酸菌在腸道定植、抑制病原菌在腸道定植、與腸道細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)交流及提高機(jī) 體免疫力均依賴(lài)于乳酸菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附作用，因而乳酸菌的黏附性是評(píng)價(jià)其是否 具有良好調(diào)節(jié)免疫性能的重要指標(biāo)。測(cè)定乳酸菌的黏附特性有直接法和間接法，直接法是 通過(guò)乳酸菌與腸道上皮細(xì)胞體外黏附實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)乳酸菌的黏附能力，間接法是指通過(guò)測(cè)定乳 酸菌細(xì)胞表面物化性質(zhì)來(lái)間接反映其黏附能力，表面疏水性（C e 1 1 S U W a C e Hydrophobicity，CSH)是乳酸菌表面重要的理化特性之一，微生物黏著碳控化合物法 (Bacteria A化esion To Hy化oca;rbons，BATH)、菌體自聚合能力的測(cè)定及菌體表面電荷的 測(cè)定等都是反應(yīng)表面疏水性的常用方法。
[0005] 在先的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)《鼠李糖乳桿菌grxl9及其應(yīng)用》（申請(qǐng)?zhí)枺?011104416667)中 公開(kāi)了一株鼠李糖乳桿菌grxl9(CGMCC No.5519)及該菌在制備長(zhǎng)貨架期活菌型乳酸菌飲 料和發(fā)酵乳產(chǎn)品中的應(yīng)用，但未公開(kāi)該菌的其他應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明探究了云南傳統(tǒng)乳制品-乳扇中的乳酸菌耐酸、耐膽鹽能力及抑菌作用，對(duì) 初步篩選出具有良好耐受性及抑菌活性的乳酸菌進(jìn)行表面疏水性、自聚合能力及黏附特性 的研究，篩選出高黏附性乳酸菌，用于發(fā)酵乳制品及功能食品的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供鼠李糖乳桿菌g;rxl9(Lactobacillus rhamnosus grxig) (CGMCCNo. 5519)的一種新用途。
[000引本發(fā)明研究表明鼠李糖乳桿菌grxl9具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)W及防止病毒性腹瀉 的的功能，其表面疏水性較高、自聚合能力較強(qiáng)，對(duì)IEC-6細(xì)胞具有顯著的黏附性。
[0009] 本所述的鼠李糖乳桿菌grxl9的功能特性如下：
[0010] 本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌grxl9對(duì)致病菌具有一定的抑制能力:乳酸菌grxl9的發(fā)酵 上清液對(duì)金黃色葡萄球菌、沙口氏菌和大腸桿菌均具有抑菌作用，抑菌圈直徑分別為 17.15mm、16.33mm和13.17mm。
[0011] 本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌grxl9具有較好表面疏水性，為36.31 % ;自聚合能力較高， 為 35.：34%。
[0012] 本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌grxl9對(duì)腸道具有顯著的黏附性:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)大鼠 小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6細(xì)胞)的粘附數(shù)達(dá)到了 17.43個(gè)/細(xì)胞，顯著高于其它乳酸菌。
[0013] 本發(fā)明公開(kāi)了所述的鼠李糖乳桿菌grxl9在制備調(diào)節(jié)腸道菌群W及防止病毒性腹 瀉的功能食品及藥品中的應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步公開(kāi)了鼠李糖乳桿菌grxl9在制備具有調(diào)節(jié)腸道菌群W及防止病毒性腹瀉 的發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明篩選的鼠李糖乳桿菌grxl9在具有耐酸、耐膽鹽能力的同時(shí)，其抑制致病菌 性能、表面疏水性能和自聚合綜合能力綜合能力優(yōu)異;該菌株具有優(yōu)異的腸道定植能力，同 時(shí)具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及防止病毒性腹瀉功能。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖巧鼠李糖乳桿菌grxl 9在溶液中疏水性狀態(tài)性。
[0017]圖2為鼠李糖乳桿菌grxl9對(duì)IEC-6細(xì)胞的黏附情況。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 1、益生乳酸菌的分離及純化
[0019] 1.鼠李糖乳桿菌grxl9的分離與鑒定
[0020]
【發(fā)明人】通過(guò)從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵制品一乳扇中分離獲得的大量乳酸菌，通過(guò)比較它們 的加工W及耐熱特性，獲得一株加工及耐熱綜合性能最佳的乳酸菌菌株。并通過(guò)鑒定證實(shí) 了本發(fā)明的菌株是鼠李糖乳桿菌grxl9(Lactobacillus rhamnosusgrxig)。
[0021] 1.1樣品來(lái)源與采集
[0022] 本發(fā)明乳酸菌來(lái)源于云南大理民族乳制品一一乳扇。乳扇是我國(guó)云南極富特色的 傳統(tǒng)乳制品之一，是一種用牛乳加入采用乳酸菌天然發(fā)酵酸漿制作的酸凝拉伸型干酪。乳 扇樣品分別采集于中國(guó)云南大理白族自治州巧源地區(qū)。樣品存放于滅菌采樣瓶中，置于4°C 條件下保存。
[0023] 1.2從乳扇中分離出乳酸菌
[0024] 取l.Og乳扇樣品將其在MRS培養(yǎng)基42°C培養(yǎng)24小時(shí)富集。將該培養(yǎng)物涂布在MRS平 板上，然后在42Γ培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，收集在瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落，并進(jìn)一步純化，淘 汰非乳酸菌菌株。
[0025] 將分離獲得的菌株用含11 % (W/W)脫脂乳的肉湯培養(yǎng)物，培養(yǎng)、凍干、保存在-18 °C，然后用于各種檢測(cè)細(xì)菌特征的試驗(yàn)。
[0026] 1.3耐熱乳酸菌的篩選
[0027] 將從云南篩選獲得的213株乳酸菌的耐熱特性進(jìn)行了比較。將不同乳酸菌分別按 4%(W/W)的接種量接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至凝乳，分別測(cè)定凝乳時(shí)和經(jīng)60°C/5min， 60°C/10min，65°C/5min，65°C/10min和72°C/15s熱處理后的活菌數(shù)量，比較不同菌株的耐 熱特性，選擇耐熱能力最好的菌株。
[0028] 通過(guò)對(duì)篩選菌株耐熱能力的比較，可W看出，不同菌株耐熱特性存在很大差異。在 213株菌株中，有101株菌不耐受60°C/5min的熱處理強(qiáng)度，占試驗(yàn)菌株數(shù)量的47% W上，其 中本發(fā)明菌株grxl9在60°C/5min的熱處理強(qiáng)度后活菌數(shù)量能達(dá)到106CFU/mM但有47株菌 株仍能夠耐受60°C/10min的熱處理強(qiáng)度，占試驗(yàn)菌株數(shù)量的22%左右，其中本發(fā)明菌株在 60°C/10min的熱處理強(qiáng)度后活菌數(shù)量能達(dá)到10化FU/mL，為最高；有129株菌不耐受65°C/ 5min的熱處理強(qiáng)度，占試驗(yàn)菌株數(shù)量的60%，其中本發(fā)明菌株在65°C/5min的熱處理強(qiáng)度后 活菌數(shù)量能達(dá)到l〇3C即/mL，為最高;所有菌株在65°C/10min的熱處理強(qiáng)度下都不能存活； 有106株菌不耐受72°C/15s的熱處理強(qiáng)度，占試驗(yàn)菌株數(shù)量的50%，其中本發(fā)明菌株在72 °C/15s的熱處理強(qiáng)度后活菌數(shù)量能達(dá)到107CFU/mL，為最高。
[0029] 綜合比較菌株在相對(duì)低溫度長(zhǎng)時(shí)間處理和相對(duì)高溫度短時(shí)處理?xiàng)l件下均具有較 高存活菌株數(shù)的乳酸菌，篩選出耐熱特性最好的菌株，即為本發(fā)明菌株，命名為grxl9。該菌 株已公開(kāi)，可從CGMCC獲得，保藏編號(hào)No. 5519。
[0030] 2、益生乳酸菌耐酸耐膽鹽活性比較
[0031] (1)人工胃液耐受性的測(cè)定
[0032] 用Imol/L的鹽酸調(diào)節(jié)無(wú)菌蒸饋水的pH值分別為2.0和3.0,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.2%的化C1，1 %胃蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.22皿微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C冷藏備用。將 活化好的乳酸菌制成菌懸液，按10 %接種量接種于抑值分別為2.0和3.0的人工胃液中，37 °C培養(yǎng)，在化取樣，采用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算其存活率（％ )。
[0033]
[0034] (2)人工腸液耐受性的測(cè)定
[003引取K此P04 3.4g，加250mL蒸饋水溶解，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的NaOH溶液調(diào)節(jié)抑值至 6.8，加蒸饋水至500mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 %的化C1，1 %膜蛋白酶，充分溶解后，用孔 徑0.22WI1微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C冰箱冷藏備用。將活化好的乳酸菌制成菌懸液，按10%接 種量接種于人工腸液中，混勻，37°C培養(yǎng)。于化取樣，采用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì) 算其存活率（％)。
[0036]
[0037] (3)耐膽鹽能力的測(cè)定
[003引稱(chēng)取一定量的膽鹽于MRS和PTYG液體培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.0%、 0.1%、0.3%和0.5%，調(diào)節(jié)pH至6.5±0.2，12ΓC滅菌15min，冷卻備用。將活化好的乳酸菌 按5%的接種量分別接種至含0.0% (空白）、0.1%、0.3%及0.5%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)24h后觀察不同濃度膽鹽培養(yǎng)液中菌體的生長(zhǎng)情況，并測(cè)定其OD600值，計(jì)算乳酸菌對(duì)膽 鹽的耐受力。
[0039]
[0040] 對(duì)初步篩選出的119株菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)、凝乳性能、產(chǎn)酸特性及膽藏穩(wěn)定性研 究，篩選獲得凝乳特性良好、產(chǎn)酸速率中等、后酸化弱的57株菌，并初步鑒定為乳酸菌。將57 株乳酸菌分別接種至人工胃液、人工腸液及含有不同膽鹽濃度的培養(yǎng)基中，存活率結(jié)果如 表1。
[0041] 表1乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力
[0042]
[0043]
[0044]
[0045] 由表1可知，不同乳酸菌在人工胃液中的存活率存在差異性，且隨著pH值的降低菌 株存活率也隨之降低。在抑為2.0的人工胃液中培養(yǎng)化菌株存活率的范圍為0~49%，其中 菌株LV108存活率最高，為48.70%，表明菌株LV108具有良好的耐酸特性;而共有8株菌存活 率為0;存活率大于20%菌株共有31株，占所有菌株的54.4%，說(shuō)明大多數(shù)菌株在pH為2.0的 人工胃液中培養(yǎng)化存活率均大于20 %。
[0046] 57株乳酸菌對(duì)人工腸液具有不同程度的耐受性，菌株存活率的范圍為0~51%，其 中菌株XJH301存活率最高，為50.51 %; 35株乳酸菌在人工腸液中培養(yǎng)化存活率均大于 20%，占所有菌株的61.4%，說(shuō)明大多數(shù)菌株在人工腸液中培養(yǎng)化存活率均大于20%。其中 在pH為2.0的人工胃液和人工腸液中培養(yǎng)化存活率均大于20%的乳酸菌共有30株。
[0047] 57株乳酸菌存活率隨著膽鹽濃度的增加而逐漸降低，在膽鹽濃度為0.1 %培養(yǎng)基 中培養(yǎng)24h后菌株存活率大于20%共有31株，膽鹽濃度為0.3%培養(yǎng)基中菌株存活率大于 20%共有21株，膽鹽濃度為0.5%培養(yǎng)基中菌株存活率大于10%共有36株，菌株BH2、LV108、 XJH301及YF-C2在膽鹽濃度為0.5 %培養(yǎng)基中存活率均大于20.00%，表明它們對(duì)膽鹽具有 良好的耐受性。菌株LV108和XJH301在膽鹽濃度為0.1 %、0.3%、0.5%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h 后存活率均分別大于50.00 %、34.00 %及21.00 %。
[004引根據(jù)57株乳酸菌對(duì)人工胃液、人工腸液及膽鹽耐受能力的范圍，選擇在抑為2.0的 人工胃液培養(yǎng)化存活率大于20%，人工腸液中培養(yǎng)化存活率大于20%，膽鹽濃度為0.5%培 養(yǎng)基中培養(yǎng)24h存活率大于10 %的30株乳酸菌，對(duì)其抑菌特性進(jìn)一步研究。
[0049] 3.益生乳酸菌抑菌活性比較
[0050] 采用牛津杯法測(cè)定乳酸菌的抑菌活性，分別吸取各致病菌發(fā)酵液0.2mL，用無(wú)菌涂 抹棒均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，于超凈工作臺(tái)中放置30min左右，待表面的菌液固定 在平板的表面后平板無(wú)可見(jiàn)水滴為準(zhǔn)），每個(gè)平板上均勻放置3個(gè)滅菌牛津杯，吸取待測(cè) 樣品0.2mL加在牛津杯里，37°C靜置培養(yǎng)4她，做3個(gè)平行求平均值，測(cè)定抑菌圈大小并拍照。 判定標(biāo)準(zhǔn):不抑菌:無(wú)明顯抑菌圈；低度抑菌:抑菌圈直徑為11~15mm;中度抑菌:抑菌圈直 徑為16~20mm;高度抑菌:抑菌圈直徑大于20mm。
[0051] 乳酸菌是機(jī)體消化道內(nèi)重要的優(yōu)勢(shì)菌，不但有助于食物的消化吸收，而且能有效 抑制致病菌，從而可W預(yù)防疾病。采用牛津杯法測(cè)定篩選出的30株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球 菌、大腸桿菌和沙口氏菌的抑菌活性，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。
[0052] 表2乳酸菌對(duì)Ξ種致病菌的抑制作用
[0化3
[0化4
[0化日]注:抑菌圈直徑包含牛津杯外徑(8mm)。
[0056]由表2可知，30株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙口氏菌運(yùn)3種致病菌均 有一定抑制能力，抑菌活性高低不等。乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌具有較高的抑菌活性，抑菌 圈直徑大于16mm(中度抑菌和高度抑菌)共有21株菌，相較金黃色葡萄球菌，運(yùn)30株菌總體 對(duì)大腸桿菌和沙口氏菌的抑制作用較弱，對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑大于16mm的菌株共有18 株，對(duì)沙口氏菌菌抑菌圈直徑大于16mm的菌株共有13株。菌株LV108和XJH301對(duì)巧巾致病菌 具有較強(qiáng)的抑制作用，LV108對(duì)3種致病菌抑菌圈直徑分別為21.40mm、21.50mm及19.50mm， XJH301對(duì)巧巾致病菌抑菌圈直徑分別為20.33mm、19.07mm及17.17mm。選擇對(duì)至少巧巾致病菌 為中度抑制W上的21株乳酸菌表面疏水性進(jìn)行進(jìn)一步研究。
[0化7] 4.益生乳酸菌表面疏水性比較
[0058]通過(guò)乳酸菌對(duì)碳氨化合物的親和力反映菌株表面疏水性，采用微生物黏著碳氨化 合物法測(cè)定乳酸菌細(xì)胞表面疏水性。取4mL菌懸液，加入40化L二甲苯，滿(mǎn)旋混合60s后，靜置 15min分層;取水相，WPBS緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)量A6QQ值，記錄。每組平行做10管，分別記錄 0D值，進(jìn)行3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)W下公式計(jì)算：
[0化9]
[0060] 利用比濁法對(duì)篩選出的21株抑菌活性較強(qiáng)的乳酸菌表面疏水性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn) 表3。
[0061 ] 表3乳酸菌表面疏水性的測(cè)定(n = 3，x±sd)
[0062]
[0063] 注:同列比較，不同字母表示具有差異性(P<0.05)。
[0064] 由表3可知，21株乳酸菌的表面疏水性差異較大（10%~55%，P<0.05)，可能是由 于不同乳酸菌表面蛋白、糖類(lèi)及一些化合物存在多樣性，導(dǎo)致菌體表面疏水性差異顯著。表 面疏水性大于30%的乳酸菌共有9株，占所有乳酸菌的42.8%，表面疏水性為25%~30%的 乳酸菌共有4株，占所有乳酸菌的19.0%，表明大部分乳酸菌表面疏水性大于25%。其中菌 株LV108、M及XJH301的表面疏水性最高(P<0.05)，分別為55.：M%、47.22%及44.81%;菌 株grxl9及RBM7次之，分別為36.31%和35.12%;菌株4〇6、￥12及雙?7的表面疏水性最低。 <0.05)，分別為10.18%、10.22%及11.88%，菌株grxl9在溶液中疏水性狀態(tài)性見(jiàn)圖1。
[0065] 5.益生乳酸菌自聚合能力的比較
[0066] 3mL菌懸液經(jīng)蝸旋混合10s后，取0.1 mL上層懸液加入到含有2.9mL PBS的試管中， 混勻后測(cè)定其于600nm下的吸光值A(chǔ)g，后將菌懸液室溫下放置化后，再進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定At。 每株細(xì)菌平行做3管。
[0067]按下式計(jì)算自聚合百分率：
[006引
[0069] 其中Ao和At分別是在時(shí)間為化和化的吸光值。
[0070] 將活化的乳酸菌接種至培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2地，振蕩?kù)o置化和化后，利用比濁法 測(cè)定其自動(dòng)聚集能力，結(jié)果如表4所示。
[0071] 表4乳酸菌自聚合能力測(cè)定(n = 3，x±sd)
[0072]
[0073] 注:同列比較，不同字母表示具有差異性(P<0.05)。
[0074] 由表4可知，不同乳酸菌的聚合能力差異顯著（10%~55%，P<0.05)，表明乳酸菌 細(xì)胞表面的蛋白或糖蛋白類(lèi)物質(zhì)等顯示出差異性。自聚合百分率大于30%的乳酸菌共有5 株，占所有乳酸菌的23.8%，自聚合百分率為25%~30%的乳酸菌共有7株，占所有乳酸菌 的33.3%，表明大部分乳酸菌自聚合百分率大于25%。其中菌株1^^08、旨'^9、1^17及29自 聚合百分率最高(P<〇.〇5)，分別為32.09%、35.34%、32.12%及32.43%;菌株85及23自聚 合百分率最低(P<〇.05)，分別為10.22%及11.54%。
[0075] 6.益生乳酸菌黏附性能的比較
[0076] 調(diào)整細(xì)胞濃度為2X104cells/mL，接種于六孔培養(yǎng)板中，預(yù)先置入無(wú)菌 蓋玻片，使細(xì)胞貼附蓋玻片生長(zhǎng)，置于37°C、5%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層 后，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞2次，然后每孔加入ImL DMEM培養(yǎng)液和ImL上述制備好的菌懸液， 輕輕搖晃混勻，置于37°C、5%的C〇2培養(yǎng)箱繼續(xù)解育，每株菌重復(fù)Ξ孔。培養(yǎng)60min后，取出 六孔培養(yǎng)板，用PBS緩沖液洗涂細(xì)胞5次，除去未黏附的乳酸菌，然后加入無(wú)水甲醇固定 20min，取細(xì)胞玻片，進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下隨機(jī)選取20個(gè)視野，計(jì)算100個(gè)細(xì)胞上黏附 的乳酸菌個(gè)數(shù)，用平均每個(gè)細(xì)胞所黏附的乳酸菌個(gè)數(shù)表示黏附能力。
[0077] 將乳酸菌與IEC-6細(xì)胞共培養(yǎng)化后固定制成玻片，顯微鏡觀察乳酸菌黏附情況，結(jié) 果見(jiàn)圖2和表5。
[007引表5乳酸菌對(duì)IEC-6細(xì)胞的黏附數(shù)(n = 3，x±sd)
[0079]
[0080] 注：同列比較，不同字母表示具有差異性(P<0.05)。
[0081] 乳酸菌對(duì)細(xì)胞的黏附情況如表5所示，不同乳酸菌之間的黏附能力差異較大，乳酸 菌表面結(jié)構(gòu)和表面成分是影響其黏附性能的一個(gè)重要因素，許多研究表明，乳酸菌表面存 在的黏附素（如表層蛋白、膚聚糖及脂憐壁酸等成分)對(duì)黏附性影響較大。乳酸菌黏附平均 每個(gè)細(xì)胞個(gè)數(shù)大于12個(gè)的共有6株菌，占所有乳酸菌的28.6%;黏附數(shù)在8~11(個(gè)/細(xì)胞)之 間的共有6株，占所有乳酸菌的28.6%，表明大部分乳酸菌黏附數(shù)大于8(個(gè)/細(xì)胞）。其中菌 株LV108、M、grxl9、RBM7及XJ冊(cè)01的黏附數(shù)顯著高于其它乳酸菌(P<0.05)，均達(dá)到14(個(gè)/ 細(xì)胞似上，其中g(shù)rxl9的黏附數(shù)最高，達(dá)到17.43(個(gè)/細(xì)胞）；抗Μ的黏附數(shù)最低(P<0.05)， 平均為2(個(gè)/細(xì)胞）。
[0082] 7.表面疏水性、自聚合能力及黏附性相關(guān)性分析
[0083] 乳酸菌黏附腸上皮細(xì)胞或腸黏膜表層的能力是乳酸菌篩選的一個(gè)非常重要指標(biāo)， 乳酸菌影響機(jī)體免疫反應(yīng)的主要部位是腸道相關(guān)淋己組織，固有層的免疫活性細(xì)胞是反應(yīng) 的效應(yīng)部位，派伊爾結(jié)內(nèi)的免疫細(xì)胞是發(fā)揮效力的誘導(dǎo)部位。乳酸菌的黏附可根據(jù)作用介 質(zhì)不同分為特異性黏附和非特異性黏附，概括為兩步，第一步屬于非特異性黏附，趨化作用 使乳酸菌與機(jī)體細(xì)胞表面接近及定位，隨后乳酸菌黏附素與機(jī)體細(xì)胞表面處于靜電荷及疏 水性結(jié)合;第二步屬于特異性黏附，即黏附素進(jìn)一步與相應(yīng)的特異性受體結(jié)合。乳酸菌黏附 有助于維護(hù)腸道正常菌群結(jié)構(gòu)平衡，維持腸黏膜形態(tài)與功能的完整性，增強(qiáng)細(xì)胞間的信號(hào) 交流，因而黏附性的測(cè)定是篩選高免疫活性乳酸菌的必要指標(biāo)。間接評(píng)價(jià)乳酸菌的黏附性 能可通過(guò)測(cè)定乳酸菌表面疏水性的強(qiáng)弱（如果表面疏水性與黏附性具有某種確切的相關(guān) 性）。表面疏水性是乳酸菌細(xì)胞表面的一些物化性質(zhì)，通常利用乳酸菌對(duì)碳氨化合物的親和 力及自聚合能力反映菌株表面疏水性。本研究測(cè)定了乳酸菌的疏水性、自聚合能力及黏附 性，并進(jìn)行了相關(guān)性分析。
[0084] 表郎荒水性、自聚合百分率及黏附性相關(guān)性分析
[0085]
[0086] *.在0.05水平(雙偵U)上顯著相關(guān);**.在0.01水平(雙偵U)上顯著相關(guān)。
[0087] 表6分析表明，乳酸菌表面疏水性和乳酸菌對(duì)細(xì)胞的黏附性呈顯著正相關(guān)(P< 0.01)，乳酸菌自聚合能力與乳酸菌對(duì)細(xì)胞的黏附性呈顯著正相關(guān)(P<〇.01)，因而可W通 過(guò)疏水性及自聚合能力的測(cè)定方便快速地篩選出高黏附性乳酸菌，間接反映乳酸菌的黏附 性能，本研究將Ξ者結(jié)合在一起對(duì)乳酸菌的黏附性能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。由表3、4及5可知，表面 疏水性大于25%，自聚合百分率大于25%，每個(gè)細(xì)胞平均黏附菌數(shù)大于8個(gè)的乳酸菌共有12 株，表明它們表面疏水性較高、自聚合能力及黏附能力較強(qiáng)。
[0088] 實(shí)施例1:利用鼠李糖乳桿菌grxl9制備發(fā)酵乳
[0089] 將活化2代后的乳酸菌grxl9培養(yǎng)物按3%接種量接種于經(jīng)95°C/5min熱處理的復(fù) 原脫脂乳（10%)中，于37°c培養(yǎng)lOh，冷卻4°C用于制備發(fā)酵劑，該發(fā)酵劑的活菌數(shù)約為 l〇8cfu/mL。
[0090] 將復(fù)原全脂乳（11.5%)加熱到50°C左右，加入6%薦糖，經(jīng)充分溶解后將復(fù)原全脂 乳預(yù)熱到60°C左右，在20M化壓力下進(jìn)行均質(zhì)。然后將復(fù)原全脂乳在95°C/5min條件下熱處 理，待冷卻至38°C，按5%接種量接入乳酸菌grxl9發(fā)酵劑，在37°C下發(fā)酵至凝乳，冷卻后于4 °C膽藏，即得到具有高益生乳酸菌粘附性的發(fā)酵乳。
[0091] 實(shí)施例2:利用鼠李糖乳桿菌grxl9制備發(fā)酵乳飲料
[0092] 42kg的脫脂乳粉，用50°C的水溶解制備成復(fù)原脫脂乳350kg，經(jīng)充分溶解后，，將復(fù) 原脫脂乳在95°C/5min條件下熱處理，待冷卻至37°C，按5%接種量接入乳酸菌grxl9發(fā)酵 劑，在37°C下發(fā)酵2地左右，終點(diǎn)酸度控制在160°Τ左右，加入650kg經(jīng)110°C/5s殺菌的糖、穩(wěn) 定劑混合溶液(該混合溶液的組成為12%薦糖、0.1%單甘脂、0.1%薦糖醋和0.4%果膠）， 混合后預(yù)熱至60°C，在20MPa壓力下進(jìn)行均質(zhì)，然后在75°C/15s條件下熱處理，冷卻至15°C 左右，采用無(wú)菌灌裝，即得1000kg鼠李糖乳桿菌grxl9發(fā)酵乳飲料。
[0093] 實(shí)施例3:利用鼠李糖乳桿菌grxl9制備益生乳酸菌凍干粉
[0094] 將脫脂乳粉、低聚果糖、酵母粉、蛋白腺和純凈水分別按質(zhì)量百分比12.0%、 2.0%、0.8%、0.7%、84.5%充分混勻后，預(yù)熱到60°C，20M化壓力均質(zhì)。然后經(jīng)95°C/30min 熱處理，冷卻至37°C。按5%接種量接種實(shí)施例l制備的grxl9發(fā)酵劑，37°C培養(yǎng)10h，離屯、，真 空冷凍干燥至含水量小于3%，即得鼠李糖乳桿菌grxl9凍干粉。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鼠李糖乳桿菌grxl9在制備調(diào)節(jié)腸道菌群以及防止病毒性腹瀉的功能食品及藥品中 的應(yīng)用。2. 鼠李糖乳桿菌grxl9在制備具有調(diào)節(jié)腸道菌群以及防止病毒性腹瀉的發(fā)酵乳制品中 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23C9/123GK105920049SQ201610390305
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】顧瑞霞, 瞿恒賢, 劉東方, 薛梅, 黃玉軍, 陳霞, 陳大衛(wèi), 印佰星, 蔣欣榮, 瓦云超, 孟茜
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)