核酸配體修飾的金納米-石墨烯復合材料及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種核酸配體修飾的金納米?石墨烯復合材料及其制備方法和應用，所述復合材料包含核酸配體修飾的金納米粒子和氧化石墨烯，其中所述氧化石墨烯表面負載有所述核酸配體修飾的金納米粒子。本發(fā)明的核酸配體修飾的金納米?石墨烯復合納米材料水溶性和生物兼容性好，沒有明顯生物毒副作用，且對癌細胞尤其是乳腺癌具有極佳的靶向性，可以作為乳腺癌光熱療試劑，在生物醫(yī)學領域具有良好的應用價值。此外，本發(fā)明的制備流程簡單，操作方便，成本低。
【專利說明】
核酸配體修飾的金納米-石墨婦復合材料及其制備方法和 應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸配體修飾的金納米-石墨帰復合材料用于乳腺癌光熱療的 制備方法，屬于生物醫(yī)學材料領域。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，早在2006年我國因乳腺癌死亡的病 例已經(jīng)超過美國，目前我國女性乳腺癌發(fā)病率依然有逐年上升的趨勢。統(tǒng)計資料顯示，2011 年美國女性患乳腺癌的病例高達23萬，為女性惡性腫瘤發(fā)病率第一。預計到2020年，全球 患乳腺癌患者中將會有超過75 %的病例出現(xiàn)在發(fā)展中國家。乳腺癌已經(jīng)成為女性健康的頭 號殺手，為減少乳腺癌對我國社會及經(jīng)濟造成的嚴重影響，開展針對乳腺癌新型藥物和治 療方法的研究具有十分重要的社會意義。
[0003] 光熱療法是一種運用自然能量的治療方法，相對于傳統(tǒng)化學藥物療法及放射療 法，光熱療法并不會造成系統(tǒng)性影響且誘發(fā)的毒副作用較低。臨床試驗結果顯示，與正常 細胞相比癌細胞對溫度升高較為敏感，正常細胞在其周圍溫度超過48°C后會才會死亡，而 癌細胞在溫度大于42°C時即有死亡現(xiàn)象的出現(xiàn)。當癌細胞所處環(huán)境溫度范圍在42-45°C 時，細胞內(nèi)許多生物酶類或結構蛋白功能將會改變，導致細胞生長及細胞分化受到影響，進 而誘發(fā)細胞死亡。實現(xiàn)具有光熱療功能的納米材料在腫瘤醫(yī)療領域的應用必須滿足下列 條件：1.對目標癌細胞具有祀向性；2.所需光源具有良好穿透性；3.具有較高光熱轉(zhuǎn)換效 率；4.水溶性好；5.生物安全性高。
[0004] 近紅外光（near-infrared region,NIR)波長范圍為700-900nm,此范圍位于水與 血紅素光吸收量較低的波長，因此WNIR進行光熱療法治療癌癥，可減少對正常細胞的傷 害。氧化石墨帰和金納米粒子是目前NIR光熱療法較常用的光熱轉(zhuǎn)換納米材料，相關研究 成果認為送兩種材料均具有較高的生物安全性。一般而言，金納米粒子通過調(diào)整合成條件 來改變材料形狀及其粒徑大小，W確保金納米材料的波長符合NIR福射的吸收范圍，但是 金納米材料制作成本較高。氧化石墨帰除了具有NIR光熱轉(zhuǎn)換特性外，其生產(chǎn)成本低、物化 性質(zhì)穩(wěn)定且具有良好的親水性。此外，由于氧化石墨帰兩基面都可W吸附物質(zhì)，使得它在承 載金屬納米粒子或其他化學物質(zhì)的載藥量優(yōu)于其他納米材料。因此氧化石墨帰用于承載金 納米粒子所得到的氧化石墨帰-金屬復合材料對腫瘤光熱療法有良好的應用前景。
[0005] 光熱療法使用的局限在于；環(huán)境溫度的提升除了對癌細胞有殺傷作用外，高溫對 正常細胞也會造成一定程度的影響。因此如何提高納米材料對癌細胞的祀向性成為納米技 術在光熱療領域應用亟待解決的關鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于乳腺癌光熱治療的核酸配體修飾的金納米-石 墨帰復合納米材料及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供一種納米復合材料，所述納米復合材料包含核酸配體修 飾的金納米粒子和氧化石墨帰，其中所述氧化石墨帰表面負載有所述核酸配體修飾的金納 米粒子。
[0008] 本發(fā)明的納米復合材料，也稱為核酸配體修飾的金納米-石墨帰復合材料。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述氧化石墨帰的平均粒徑為0. 2-0. 8微米。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述金納米粒子的平均粒徑為8-20納米。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述核酸配體的序列如SEQ NO: 1-3所示。
[0012] 本發(fā)明的第二方面，提供第一方面所述的納米復合材料的制備方法，包括W下步 驟：
[0013] (a)將核酸配體與金納米粒子混合反應得到所述核酸配體修飾的金納米粒子；
[0014] 化）將所述步驟（a)得到的所述核酸配體修飾的金納米粒子與所述氧化石墨帰反 應，使所述氧化石墨帰表面負載所述核酸配體修飾的金納米粒子得到第一方面所述的納米 復合材料。
[0015] 本發(fā)明的第Η方面，提供一種藥物組合物，包含：
[0016] 第一方面所述的納米復合材料；W及
[0017] 藥學上可接受的載體。
[0018] 本發(fā)明的第四方面，提供第一方面所述的納米復合材料或第Η方面所述的藥物組 合物的應用，用于：
[0019] (1)制備預防和/或治療腫瘤的藥物；
[0020] 似體外非治療性地抑巧[J腫瘤細胞的增殖；
[0021] (3)體外非治療性地誘導腫瘤細胞的調(diào)亡；
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述治療包括抑制腫瘤細胞的增殖和/或誘導腫瘤細胞的調(diào) 亡。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤選自；肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結直腸癌、膜 腺癌、膀脫癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述治療為光熱治療。
[0025] 本發(fā)明的第五方面，提供一種體外非治療性的抑制腫瘤細胞的增殖或誘導腫瘤細 胞的調(diào)亡的方法，將第一方面所述的納米復合材料或第Η方面所述的藥物組合物與所述腫 瘤細胞接觸，從而抑制腫瘤細胞的增殖或誘導腫瘤細胞的調(diào)亡。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述接觸為培養(yǎng)接觸。
[0027] 本發(fā)明的第六方面，提供一種治療腫瘤的方法，對需要的對象給予安全有效量的 第一方面所述的納米復合材料或第Η方面所述的藥物組合物。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述治療為光熱治療。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述需要的對象為非人哺乳動物或人，較佳地，為人、小鼠或大 陽、。
[0030] 為提高乳腺癌光熱療法所用試劑的治療效率，并降低其制造成本，本發(fā)明提供了 一種核酸配體修飾的金納米-石墨帰復合納米材料及其制備方法，利用氧化石墨帰的特殊 性質(zhì)，在氧化石墨帰上負載核酸配體及其修飾的金納米粒子，使其對乳腺癌細胞表現(xiàn)出優(yōu) 越的祀向特性和良好的光熱療效果，用于乳腺癌光熱治療。
[0031] 應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可W互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0032] 圖 1 為本發(fā)明納米復合材料（G〇-Au-Aptamer Nanoparticals,G〇-Au-Apt NPs)合 成示意圖；
[003引圖2為本發(fā)明合成的氧化石墨帰（GO)的TEM圖（A)及拉曼光譜圖做；
[0034] 圖3為本發(fā)明的材料理化性質(zhì)特征圖，其中A為核酸配體-金納米粒子 (Aptamer-Au，Apt-Au)的TEM圖，B為本發(fā)明納米復合材料TEM圖，C為本發(fā)明納米復合材 料TEM圖，D為本發(fā)明納米復合材料AFM圖，E為本發(fā)明納米復合材料厚度分析數(shù)據(jù)，F(xiàn)為本 發(fā)明納米復合材料紫外吸收光譜圖；
[0035] 圖4為免疫英光技術檢測MC巧細胞與EA. hy926細胞的MUC1蛋白表達圖；
[0036] 圖5為Western Blotting技術檢測MCF7細胞與EA. hy926細胞的MUC1蛋白表達 圖；
[0037] 圖6為LDH檢測法對本發(fā)明納米復合材料生物毒性評估結果圖；
[0038] 圖7為本發(fā)明納米復合材料升溫效果圖，其中A為不同濃度納米復合材料于近紅 外808nm激發(fā)光3W3分鐘條件下升溫曲線，B為2nM納米復合材料與氧化石墨帰于近紅外 808nm激發(fā)光3W3分鐘條件下升溫對比曲線，C為0. 2nM納米復合材料與MC巧細胞賠育24 小時，洗脫除去未結合的納米復合材料的培養(yǎng)介質(zhì)，于近紅外808nm激發(fā)光3W5分鐘條件下 升溫曲線；
[0039] 圖8為異硫氯酸英光素標記本發(fā)明納米復合材料于MC巧細胞與EA. hy926細胞祀 向功能檢測圖；
[0040] 圖9為采用本發(fā)明納米復合材料和氧化石墨帰分別賠育MCF7細胞與EA. hy926細 胞24小時，洗脫除去未結合的納米復合材料和氧化石墨帰，于近紅外808nm激發(fā)光3W5分 鐘條件下光熱治療，繼續(xù)賠育12小時（A)或24小時度）后LDH檢測法檢測結果圖；
[0041] 圖10為本發(fā)明納米復合材料分別賠育MCF7細胞與EA. hy926細胞24小時，洗脫 除去未結合的納米復合材料，于近紅外808nm激發(fā)光3W5分鐘條件下光熱治療，繼續(xù)賠育24 小時后Western Blotting技術檢測抗調(diào)亡蛋白Bcl-2與調(diào)亡蛋白Bax表達比值變化圖。
【具體實施方式】
[0042] 本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，首次意外研發(fā)出一種氧化石墨帰表面負 載有核酸配體修飾的金納米粒子形成的納米復合材料，具有較佳的水溶性和生物相容性， 對癌細胞尤其是乳腺癌具有極佳的祀向性，可W作為乳腺癌光熱療試劑。在此基礎上，完成 了本發(fā)明。
[0043] MUC1 蛋白
[0044] MUC1蛋白是由mucl基因表達的一種高糖基化（糖化大于50% )、高分子量蛋白， 又稱附膜蛋白。它在上皮更新與分化，維持上皮完整性和腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等方面都起到 重要的作用。
[0045] MUCl蛋白是廣泛表達在多種腫瘤細胞膜上的糖蛋白，已確定在多種腫瘤細胞中高 表達，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結直腸癌、膜腺癌、膀脫癌、前列腺癌、多發(fā)性 骨髓瘤等。由于MUC1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和預后有密切的關系，有其特有 的結構和功能特點，并在多種腫瘤中有過量表達，使其有可能成為一種廣譜的腫瘤標記物 和多種腫瘤治療的祀標分子。例如，由于MUC1在乳腺腫瘤組織中的異常表達，使其成為一 種重要的乳腺腫瘤生物學標志物。MUC1廣泛分布并異常豐富地表達于乳腺癌細胞表面，糖 基化不完全，因此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細胞攻擊祀點，也是光熱納米材 料藥物的祀向位點。
[004引 核酸配體
[0047] 核酸配體是指利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)，該技術可W從隨機單鏈核酸序列庫中篩選 出特異性與祀物質(zhì)高度親和的核酸適體（Aptamer)。將特定腫瘤細胞的核酸配體應用于氧 化石墨帰載藥系統(tǒng)的制備上，可W大幅提高腫瘤的光熱治療效率。
[0048] 金納米粒子
[0049] 金納米粒子是指金的微小顆粒，通常直徑在1~lOOnm，具有高電子密度、介電特 性和催化作用，能與多種生物大分子結合，且不影響其生物活性。通常由氯金酸通過還原法 可W方便地制備各種不同粒徑的納米金，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。
[0050] 本發(fā)明中，優(yōu)選的金納米粒子的平均粒徑為8-20皿，更優(yōu)選地為10-18皿。
[0051] 本發(fā)明中，所述平均粒徑是指在TEM譜圖中隨機選取20個金納米粒子測量粒徑后 計算得到的平均值，其中粒徑=(a+b)/2,其中a為選取的金納米粒子的長徑、b為選取的金 納米粒子的短徑。
[0052] 氧化石墨帰
[0053] 氧化石墨帰是石墨粉末經(jīng)化學氧化及剝離后的產(chǎn)物，氧化石墨帰是單一的原子 層，可W隨時在橫向尺寸上擴展到數(shù)十微米，因此，其結構跨越了一般化學和材料科學的典 型尺度。氧化石墨帰可視為一種非傳統(tǒng)型態(tài)的軟性材料，具有聚合物、膠體、薄膜，W及兩性 分子的特性。氧化石墨帰長久W來被視為親水性物質(zhì)，因為其在水中具有優(yōu)越的分散性，但 是，相關實驗結果顯示，氧化石墨帰實際上具有兩親性，從石墨帰薄片邊緣到中央呈現(xiàn)親水 至疏水的性質(zhì)分布。因此，氧化石墨帰可如同界面活性劑一般存在界面，并降低界面間的能 量。
[0054] 本發(fā)明中，優(yōu)選的氧化石墨帰的平均粒徑為0. 2-0. 8微米，較佳地為0. 3-0. 7微 米。
[00巧]本發(fā)明中，所述平均粒徑是指在TEM譜圖中隨機選取20個氧化石墨帰測量粒徑后 計算得到的平均值，其中粒徑=(a+b)/2,其中a為選取的氧化石墨帰的長徑、b為選取的氧 化石墨帰的短徑。
[0056] 納米復合材料
[0057] 本發(fā)明提供的納米復合材料，包含核酸配體修飾的金納米粒子和氧化石墨帰，其 中所述氧化石墨帰表面負載有所述核酸配體修飾的金納米粒子。
[005引較佳地，所述核酸配體的序列如下所示：
[0059] SEQ N0:1 ：
[0060] 5> -TTTTTTTTTTTTTTTGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTG-3> ;
[0061] SEQ NO:2 ：
[0062] -ATCCAGAGTGACGCAGCACGGCACTCACTCTTTGTTAAGTGGTCTGCTTCTTAACCTTCATCGACA CGGTGGCTTA-3';
[0063] SEQ NO:3 ：
[0064] 5> -CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGCTTTTTTTT-3>。
[0065] 在另一優(yōu)選例中，納米復合材料的厚度為12-20nm。
[0066] 制備方法
[0067] 本發(fā)明提供了一種可W將金納米粒子與氧化石墨帰結合制備納米復合材料的方 法，該方法使用核酸配體值NA單鏈）將分別制備的金納米粒子和氧化石墨帰結合在一起， 所涉及的納米復合材料合成過程如圖1所示。具體過程分為四個部分；氧化石墨帰的制備； 金納米粒子制備；金納米粒子與核酸配體的結合形成核酸配體修飾的金納米粒子；核酸配 體修飾的金納米粒子被氧化石墨帰負載形成納米復合材料。
[0068] 本發(fā)明的制備方法，包括W下步驟：
[0069] (a)將核酸配體與金納米粒子混合反應得到所述核酸配體修飾的金納米粒子（核 酸配體-金納米粒子）；
[0070] 化）將所述步驟（a)得到的所述核酸配體修飾的金納米粒子與所述氧化石墨帰反 應，使所述氧化石墨帰表面負載所述核酸配體修飾的金納米粒子得到第一方面所述的納米 復合材料（氧化石墨帰-金-核酸配體）。
[0071] 藥物組合物
[0072] 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包含本發(fā)明的納米復合材料；W及藥學上可接受 的載體。
[0073] "藥學上可用的載體"是指一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適 合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。"相容性"在此指的是組合物中各組 份能和本發(fā)明的納米復合材料W及它們之間相互滲和，而不明顯降低活性成分的藥效?？?藥用的載體部分例子有纖維素及其衍生物（如駿甲基纖維素鋼、己基纖維素鋼、纖維素己 酸醋等）、明膠、滑石、固體潤滑劑（如硬脂酸、硬脂酸鎮(zhèn)）、硫酸巧、植物油（如豆油、芝麻 油、花生油、橄攬油等）、多元醇（如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等）、乳化劑巧日化溫磨)、 潤濕劑（如十二烷基硫酸鋼）、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。
[0074] 本發(fā)明的納米復合材料和藥物組合物可W是多種形式，可W通過如膠囊、片劑、顆 粒劑、溶液狀、粉劑、散劑或糖漿等形式口服給藥或W注射劑的形式非口服給藥，本發(fā)明的 納米復合材料和藥物組合物可W存在于適宜的固體或液體載體中和適宜的用于注射或滴 注的消毒器具中。上述制劑可通過常規(guī)制藥方法制備。
[00巧]本發(fā)明的納米復合材料和藥物組合物可用于哺乳動物臨床使用，包括人和動物， 可W通過口、鼻或胃腸道等途徑給藥。最優(yōu)選的給藥途徑為口服。
[0076] 本發(fā)明的納米復合材料和藥物組合物對腫瘤細胞尤其是乳腺癌細胞、肝癌細胞、 卵巢癌細胞、胃癌細胞、結直腸癌細胞、膜腺癌細胞、膀脫癌細胞、前列腺癌細胞、多發(fā)性骨 髓瘤細胞表現(xiàn)出優(yōu)越的祀向特性和良好的光熱療效果，可W作為治療腫瘤的光熱療試劑。
[0077] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺蒞任意組合。本案說明書所掲示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所掲示的各個特征，可w被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所掲示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[007引本發(fā)明的有益之處在于：
[0079] (1)本發(fā)明提供一種新型的氧化石墨帰表面負載有核酸配體修飾的金納米粒子構 成的納米復合材料及包含該材料的藥物組合物；
[0080] (2)本發(fā)明的納米復合材料水溶性和生物兼容性好，沒有明顯生物毒副作用；
[0081] (3)本發(fā)明的納米復合材料及藥物組合物對癌細胞尤其是乳腺癌具有極佳的祀向 性，可用于制備預防和/或治療尤其是光熱治療腫瘤的藥物。
[0082] (4)本發(fā)明的制備方法簡單，操作方便，成本低。
[0083] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，送些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克??；實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。
[0084] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0085] 實施例1
[008引氧化石墨帰的制備
[0087] 將 90ml H2SO4巧5. 0-97. 0% )與 10ml H3PO4巧5. 0-97. 0% )在雙口瓶內(nèi)混合均勻； 加入0. 75g石墨粉形成混合液。
[0088] 將混合液水浴加熱至5(TC，再緩慢加入4. 5g高儘酸鐘；于5(TC下反應12小時。
[0089] 停止加熱后，冰浴條件下，緩慢加入100ml去離子水；加入32%雙氧水，直到溶液 變成黃色。
[0090] W磯酸鹽緩沖液（PB，lOmM，抑7. 4)將溶液置換至抑接近7,離必35000g，30分鐘， 將大、小片氧化石墨帰分離，取上清液。
[00川圖2是合成的氧化石墨帰（GO)的TEM圖（A)及拉曼光譜圖度）。TEM結果顯示 所合成的氧化石墨帰大小均勻，平均粒徑為0. 56 + 0. 1 μ m。拉曼光譜顯示在1350cm 1與 1590cm 1處有明顯峰值，即D帶與G帶，表明石墨帰被氧化，得到氧化石墨帰。
[0092] 利用可見紫外吸收光譜測定上清液Abs229 = 0. 276 ;經(jīng)冷凍干燥測定氧化石墨帰 的濃度為1. 74mg/mL。
[009引 實施例2
[0094] 金納米粒子制備
[0095] 將所有實驗用玻璃器皿，如圓底瓶、量筒和攬拌子等，用王水浸泡5-10分鐘，W蒸 傭水沖洗干凈。
[0096] 圓底瓶內(nèi)加入50ml4mM巧樣酸鋼，加熱攬拌溶液至均勻沸騰。
[0097] 保持巧樣酸鋼溶液在均勻沸騰狀態(tài)下將0. 1M四氯金酸溶液500 μ 1迅速加入，溶 液顏色逐漸變化；持續(xù)攬拌8分鐘后停止加熱，移去加熱攬拌裝置并將圓底瓶冷卻處理。
[0098] 冷卻后的金納米粒子溶液存放于潔凈干燥的血清瓶中，血清瓶外包裹鉛巧避光， 存放于4°C冰箱。
[0099] 經(jīng)檢測，合成的金納米粒子濃度為15nM。
[0100] 實施例3
[0101] 核酸配體修飾的金納米粒子的制備
[0102] 取100μΜ核酸配體（序列如沈Q N0:1所示）20μ1置于微量離必管中，再加 入實施例2制備的15ηΜ的金納米粒子1ml，均勻混合后，靜置反應。反應2小時后，加入 17μ 150mM化C1 ;再反應2小時后，加入67μ 150mM化C1。
[0103] 反應過夜，即完成制備核酸配體修飾的金納米粒子，濃度為15nM，在金納米粒子 上，核酸配體修飾密度為2.0。
[0104] 進一步純化；離必35000g，20分鐘，去除上清液，W5mM PB (抑7)溶解；重復Η次純 化，再利用Ab巧20nm(金納米粒子特征吸收峰），將核酸配體修飾的金納米粒子的濃度定回 至 15nM。
[0105] 圖3中A為透射電子顯微鏡檢測所合成的核酸配體修飾的金納米粒子（核酸配 體-金納米粒子，Aptamer-Au，Apt-Au))圖像，結果顯示金納米粒子連接核酸配體后分布及 粒徑大小均勻，平均粒徑為13. 86 + 2. 1皿。
[0106] 實施例4
[0107] 納米復合材料的制備
[0108] 取1576. 1 μ 1去離子水置于微量離必管中，再依序加入350X (倍）G0(6. 09mg/ 57. 14 μ 1和150nM核酸配體修飾的金納米粒子266. 7 μ 1均勻混合后，避光反應。
[0109] 反應 1 小時后，加入 lOOmM ΡΒ(ρΗ7)100μ 1。
[0110] 反應1小時后，即完成于2ml的5mM ΡΒ環(huán)境下lOXGCKO. 174mg/ml)吸附上20ηΜ 核酸配體修飾的金納米粒子。
[0111] 圖3中B-F為納米復合材料理化性質(zhì)分析結果，其中，B-C圖為納米復合材料 ΤΕΜ(透射電子顯微鏡）結果圖片，顯示納米復合材料分散均勻，有較多的金納米-核酸配體 吸附于氧化石墨帰表面；D-E圖為納米復合材料AFM(原子力顯微鏡）結果圖片，顯示納米 復合材料厚度均勻，平均厚度為17nm;F圖為納米復合材料可見紫外分光光譜檢測結果，其 在520nm有明顯金離子吸收峰。
[011引 實施例5
[0113] 乳腺癌細胞光熱療效果檢測
[0114] 為驗證本發(fā)明金納米粒子-氧化石墨帰復合材料對乳腺癌細胞的光熱療效果，選 用了 MCF7細胞（人類乳腺癌細胞）及EA. hy926細胞（人廝靜脈細胞融合細胞）進行試驗。 [011引 5. 1MUC1蛋白表達檢測
[0116] 分別培養(yǎng)MC巧及EA. hy926細胞，取生長狀態(tài)良好的兩種細胞，分別使用PBS清洗 2次，每次5分鐘。4%多聚甲醒溶液室溫固定細胞30分鐘，PBS清洗2次，每次5分鐘。于 免疫英光封閉液中室溫封閉1小時。兩種細胞分別賠育兔抗MUC1蛋白抗體（PBS稀釋1000 倍），并于4°C放置過夜。PBS清洗3次，每次10分鐘，W除去未結合的MUC1抗體。添加抗 兔-488標記英光二抗（PBS稀釋1000倍），于室溫賠育2小時。添加化echst33342 (PBS稀 釋2000倍）標記細胞核，于室溫賠育15分鐘。PBS清洗3次，每次10分鐘。于英光顯微鏡 下拍照觀察。其中MC巧細胞為MUCl蛋白陽性，EA. hy926細胞為MUCl蛋白陰性（圖4)。
[0117] 接著分別提取兩種細胞總蛋白，并通過Western Blotting技術檢測兩種細胞總蛋 白中MUC1含量。配制12%及4%聚丙帰醜胺凝膠，恒壓100V條件下對總蛋白電泳分離，并 通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2小時后，添加兔抗 MUC1蛋白抗體燈BS稀釋1000倍），室溫搖床賠育過夜，TBST清洗3次，每次10分鐘，除去 未結合一抗。添加 HRP-抗兔二抗燈BS稀釋1000倍），室溫搖床賠育2小時，TBST清洗3 次，每次10分鐘，除去未結合二抗。曝光拍照，目-actin蛋白作為對照。結果發(fā)現(xiàn)MCF7細 胞有MUC1蛋白表達，而EA.hy926細胞無 MUC1蛋白表達（圖5)。
[0118] 5. 2生物毒性評價
[0119] 對本發(fā)明納米復合材料生物毒性進行評估。取生長狀態(tài)良好的MC巧細胞接種于 96孔細胞培養(yǎng)板，約5000細胞/孔。培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度復合材料（細胞培養(yǎng)液稀 釋），濃度范圍為0. 002-0. 2nM(Au)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去 上清，加 DMS0各100 μ 1，室溫震蕩10分鐘后于多功能微孔板檢測儀檢測0D490,并計算細 胞活力變化。結果發(fā)現(xiàn)在復合材料最高濃度為2ηΜ條件下，細胞活力在82. 67%，證明納米 復合材無明顯生物毒性（圖6)。
[0120] 5. 3光熱轉(zhuǎn)換效果檢測
[012。 分別使用808nm激發(fā)光于3W條件下對不同濃度納米復合材及細胞培養(yǎng)液進行光 照，每10砂記錄溫度變化，并繪制升溫曲線（圖7A)，結果顯示濃度越高，材料升溫效果越明 顯。相同條件下對比2nM納米復合材料（GO-Au-Apt)及氧化石墨帰（GO)光熱轉(zhuǎn)換能力，繪 制升溫曲線（圖7B)，結果顯示GO-Au-Apt比GO有較好的光熱轉(zhuǎn)化能力。0. 2nM GO-Au-Apt 與MCF7細胞賠育24小時，PBS清洗，除去未結合的GO-Au-Apt，于808nm激發(fā)光于3W條件 下檢測溫度變化（圖7C),結果顯不結合G0-Au-Apt后，MCF7細胞有明顯的升溫現(xiàn)象。
[0122] 5. 4對乳腺癌細胞祀向功能檢測
[0123] 使用異硫氯酸英光素（羅丹明B)修飾納米復合材料，取0.2nM分別與MCF7及 EA. hy926細胞于37°C環(huán)境下賠育24小時，PBS清洗3次，每次10分鐘，除去未結合的納米 復合材料。于英光顯微鏡下拍照觀察，結果顯示MC巧細胞中有較多的羅丹明B的陽性信 號，而EA. hy926細胞中幾乎檢測不到（圖8)，說明本發(fā)明的納米復合材料對乳腺癌細胞具 有較好的祀向能力。
[0124] 5. 5納米復合材料光熱療效果檢測
[01巧]取生長狀態(tài)良好的MCF7與EA. hy926細胞，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板，賠育 0. 2nM金納米粒子-氧化石墨帰復合材料24小時后，進行PBS洗脫，除去未結合的納米材 料。通過近紅外808nm激發(fā)光于3W5分鐘的條件下分別對兩種細胞進行光熱療處理，繼續(xù) 賠育12小時或24小時后通過Μ?Τ細胞活力檢測法檢測兩種細胞活力變化情況，結果如圖 9所示，其中9A為熱療后賠育12小時后細胞活力變化，圖9B為熱療后賠育24小時后細胞 活力變化。
[0126] 統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)MC巧細胞活力變化相對EA. hy926細胞具有顯著性差異，說明本發(fā) 明修飾核酸配體的納米復合材料對乳腺癌細胞具有較強的光熱療殺傷作用。
[0127] 5. 6光熱療后細胞調(diào)亡相關蛋白表達檢測
[0128] 取生長狀態(tài)良好的MCF7與EA. hy926細胞，分別接種于24孔細胞培養(yǎng)板，賠育 0. 2nM金納米粒子-氧化石墨帰復合材料24小時后，進行PBS洗脫，除去未結合的納米材 料。通過近紅外808nm激發(fā)光于3W5分鐘的條件下分別對兩種細胞進行光熱療處理，繼續(xù) 賠育24小時后分別提取細胞總蛋白進行Western Blotting檢測抗調(diào)亡蛋白Bcl-2與促調(diào) 亡蛋白Bax表達比值變化（圖10)。
[0129] 結果顯示光熱療后MCF7細胞中Bcl-2/Bax蛋白表達比值明顯低于EA. hy926細 胞，意味著光熱療對乳腺癌細胞中調(diào)亡相關蛋白影響更明顯，有效促進乳腺癌細胞的調(diào)亡。
[0130] 實施例6
[0131] 納米復合材料的制備及檢測
[0132] 采用實施例3和4的方法制備納米復合材料，不同之處在于，采用序列如下的核酸 配體取代序列如SEQ NO: 1所示的核酸配體：
[0133] SEQ NO:2 ：
[0134] -ATCCAGAGTGACGCAGCACGGCACTCACTCTTTGTTAAGTGGTCTGCTTCTTAACCTTCATCGACA CGGTGGCTTA-3,；或
[0135] SEQ NO:3 ：
[0136] 5 > -CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGCTTTTTTTT-3 >。
[0137] 采用實施例5的方法對制備的復合材料進行檢測，不同之處在于采用肝癌細胞 化ep3B細胞）進行試驗，結果表明核酸配體的納米復合材料對肝癌細胞具有較強的光熱療 殺傷作用，有效促進肝癌細胞的調(diào)亡。
[013引由W上實施例可知，本發(fā)明的核酸配體并不限于實施例中所用的配體，針對治療 的腫瘤，如肝癌、胃癌、卵巢癌或白血病，可應用相應的核酸配體修飾納米金，并載于氧化石 墨帰表面制備納米復合材料，用于預防和/或治療相應的腫瘤，具有較好的祀向功能，降低 對正常細胞的毒副作用，提高治療效率。
[0139] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考郝樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可 W對本發(fā)明作各種改動或修改，送些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種納米復合材料，其特征在于，所述納米復合材料包含核酸配體修飾的金納米粒 子和氧化石墨烯，其中所述氧化石墨烯表面負載有所述核酸配體修飾的金納米粒子。2. 如權利要求1所述的納米復合材料，其特征在于，所述氧化石墨烯的平均粒徑為 0· 2-0. 8 微米。3. 如權利要求1所述的納米復合材料，其特征在于，所述金納米粒子的平均粒徑為 8-20納米。4. 如權利要求1所述的納米復合材料，其特征在于，所述核酸配體的序列如SEQ NO: 1-3 所示。5. 如權利要求1所述的納米復合材料的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步 驟： (a) 將核酸配體與金納米粒子混合反應得到所述核酸配體修飾的金納米粒子； (b) 將所述步驟（a)得到的所述核酸配體修飾的金納米粒子與所述氧化石墨烯反應， 使所述氧化石墨烯表面負載所述核酸配體修飾的金納米粒子得到權利要求1所述的納米 復合材料。6. -種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含： 權利要求1所述的納米復合材料；以及 藥學上可接受的載體。7. 如權利要求1所述的納米復合材料或權利要求7所述的藥物組合物的應用，其特征 在于，用于： (1) 制備預防和/或治療腫瘤的藥物； (2) 體外非治療性地抑制腫瘤細胞的增殖； (3) 體外非治療性地誘導腫瘤細胞的凋亡；8. 如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述治療包括抑制腫瘤細胞的增殖和/或誘 導腫瘤細胞的凋亡。9. 如權利要求7或8所述的應用，其特征在于，所述腫瘤選自：肺癌、肝癌、乳腺癌、卵 巢癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤。10. 如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述治療為光熱治療。
【文檔編號】A61K41/00GK105879027SQ201410209071
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年5月16日
【發(fā)明人】林家驊, 黃志清, 楊令延, 范蘭蘭, 曾于庭
【申請人】中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所