一種三氧化二砷白蛋白納米藥物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種三氧化二砷納米給藥系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：（1）將三氧化二砷粉末溶解于氫氧化鈉溶液，然后用稀鹽酸調(diào)pH，配成三氧化二砷溶液，備用于白蛋白載藥；將標(biāo)記葉酸分子的人血清白蛋白溶解于不含鈣鎂離子的杜氏磷酸鹽緩沖液中，得人血清白蛋白溶液，向人血清白蛋白溶液中加入二硫鍵還原劑于水浴鍋中輕柔攪拌反應(yīng)，得二硫鍵還原劑處理過(guò)的白蛋白溶液；（2）向二硫鍵還原劑處理過(guò)的白蛋白溶液中加入三氧化二砷溶液，室溫?cái)嚢?，得三氧化二砷白蛋白混合溶液；?）將三氧化二砷白蛋白混合溶液放入透析袋，并于低溫D?PBS溶液透析除去多余的三氧化二砷和二硫鍵還原劑及其副產(chǎn)物，得三氧化二砷白蛋白納米藥物。
【專利說(shuō)明】
一種三氧化二砷白蛋白納米藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三氧化二砷的白蛋白載藥納米系統(tǒng)的構(gòu)建及抗癌應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]三氧化二砷(As2O3,ΑΤ0)是中藥砒霜的主要成分，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)藥領(lǐng)域中，已經(jīng)被廣泛用于治療惡性腫瘤等多種疾病，尤其是對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocytic leukemia，APL)的治療取得了完全緩解的顯著療效，誘導(dǎo)APL分化和凋亡。天然砷劑化合物作為藥物應(yīng)用已有2400多年的臨床應(yīng)用。最近研究表明，ATO對(duì)慢性骨髓性白血病和惡性實(shí)體瘤亦具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，但是單純ATO對(duì)非APL的治療存在一些問(wèn)題:(I)ATO的水溶液形式為亞砷酸(As(OH)3),易于透過(guò)磷脂雙分子層，嚴(yán)重制約了ATO在細(xì)胞內(nèi)滯留；(2)ATO在生物體有85%?95%先與血液中的血紅蛋白結(jié)合再分布到其他組織中，故在生物體內(nèi)分布快，血漿中砷的半衰期短(約35分鐘)，給藥后短時(shí)間內(nèi)就會(huì)被迅速清除，同時(shí)引起毒副作用；(3)現(xiàn)有ATO抗癌給藥途徑為靜脈滴注，由于血液循環(huán)可使ATO彌散至周圍組織，這樣不僅使到達(dá)腫瘤部位的藥物濃度相對(duì)較低，而且還會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)；(4)AT0發(fā)揮抗癌效應(yīng)依賴于其很強(qiáng)的毒性，故局限于其直接使用時(shí)劑量要保持比較低，這隨之限制了 ATO的抗癌療效指數(shù)低;對(duì)針對(duì)慢性隨性白血病和其他惡性腫瘤需當(dāng)治療劑量比較高時(shí)，單純的ATO帶來(lái)的毒副作用更加顯著，嚴(yán)格限制了其臨床治療的推廣使用。
[0003]針對(duì)這些問(wèn)題，提高ATO的血液循環(huán)時(shí)間，降低其毒性，已成為國(guó)內(nèi)外研究者重點(diǎn)關(guān)注解決的科學(xué)問(wèn)題。近年來(lái)，廣大科研工作者提出將砷化合物制備成緩釋制劑，以延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，其中尤以脂質(zhì)體研究最為廣泛。但脂質(zhì)體穩(wěn)定性不夠好，包封藥物后容易泄露，會(huì)帶來(lái)一定的毒副作用，且對(duì)離子型ATO的包裹技術(shù)難度比常規(guī)的有機(jī)小分子藥物要求更高。另外，傳統(tǒng)緩釋制劑沒(méi)有靶向性，給藥后分布全身各個(gè)器官，很大程度上減弱了藥物的抗癌療效；同時(shí)，脂質(zhì)體的納米尺寸比有機(jī)小分子或蛋白質(zhì)的要大許多(通常在100?200nm)，脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)進(jìn)入人體后，難以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞對(duì)異物的吞噬作用，導(dǎo)致最終達(dá)到病變部位發(fā)揮藥效的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低。此外，脂質(zhì)體的制備工藝相對(duì)比較復(fù)雜，需要根據(jù)藥物分子性質(zhì)調(diào)整脂質(zhì)體組成的比例和有機(jī)溶劑溶媒等。鑒于上述因素，構(gòu)建一種可以簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定地裝載ATO的靶向抗腫瘤納米給藥系統(tǒng)，提高其抗癌效果，降低毒副作用，拓展臨床使用范圍，具有十分重大的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有三氧化二砷在非急性早幼粒細(xì)胞白血病癌癥臨床治療中存在嚴(yán)重毒副作用、沒(méi)有靶向性及半衰期短等不足，構(gòu)建了一種新型、操作簡(jiǎn)單及具有靶向的三氧化二砷納米載藥系統(tǒng)的制備方法。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0006]所述三氧化二砷白蛋白納米藥物的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0007](I)將三氧化二砷(As203，AT0)粉末溶解于氫氧化鈉溶液，然后用濃度為IM的稀鹽酸調(diào)PH至5.0—6.5,配成濃度為5—10mg/mL的三氧化二砷儲(chǔ)備溶液，備用于白蛋白載藥;將標(biāo)記葉酸分子的人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)溶解于不含I丐鎂離子的杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline，D_PBS，50mg/mL)中，得白蛋白濃度為30—10mg/mL，優(yōu)選為50mg/mL的人血清白蛋白溶液，向人血清白蛋白溶液中加入二硫鍵還原劑谷胱甘肽(GSH)于37°C水浴鍋中輕柔攪拌反應(yīng)0.5—2h，優(yōu)選lh，二硫鍵還原劑加入到人血清白蛋白溶液中的終濃度為30—lOOmM，得二硫鍵還原劑處理過(guò)的白蛋白溶液；
[0008](2)向二硫鍵還原劑處理過(guò)的白蛋白溶液中加入三氧化二砷溶液，三氧化二砷加入到白蛋白溶液中的終濃度為0.5—5mg/mL，室溫?cái)嚢鐸 一 6h，優(yōu)選2h，得三氧化二砷白蛋白混合溶液；
[0009](3)將三氧化二砷白蛋白混合溶液放入透析袋(分子量為8-14KD)，并于低溫D-PBS溶液透析除去多余的三氧化二砷和二硫鍵還原劑及其副產(chǎn)物后(數(shù)次，24h)，得三氧化二砷白蛋白納米藥物。
[0010]優(yōu)選地，步驟(I)所述二硫鍵還原劑GSH的濃度為30—lOOmM，優(yōu)選60mM的谷胱甘肽(GSH)。步驟(2)所述三氧化二砷溶液中三氧化二砷濃度為0.5—5mg/mL。步驟(3)所述三氧化二砷白蛋白納米藥物中三氧化二砷與人血清白蛋白的摩爾分子比為(3—8):1。
[0011 ]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明:
[0012]本發(fā)明步驟(I)中所用氫氧化鈉濃度不低于IM為好，利于充分溶解ΑΤ0，具體取決于ATO配備的濃度；所用稀鹽酸濃度為1M，但不局限于1M;AT0的儲(chǔ)備用濃度不局限于5—10mg/mL;pH值為5.0—6.5。步驟(I)中所用D-PBS可用PBS等緩沖溶液替代，白蛋白濃度可為30—100mg/mL，最優(yōu)化50mg/mL; GSH終濃度為30—I OOmM，最優(yōu)化60mM;于37 °C水浴鍋中輕柔攪拌反應(yīng)時(shí)間可為0.5—2h，最優(yōu)為I小時(shí)。
[0013]步驟(2)中所加入ATO的終濃度可為0.5—5mg/mL，最優(yōu)化2.5mg/mL；室溫輕柔攪拌反應(yīng)時(shí)間可為I 一6小時(shí)，最優(yōu)為2小時(shí)。
[0014]步驟(3)中所用透析袋可用透析管或其他替代裝置，分子截留大小不低于1000即可。
[0015]本發(fā)明采用機(jī)體需要的人血清白蛋白和腫瘤細(xì)胞異常高表達(dá)的葉酸受體的配體葉酸(Folate，F(xiàn)A)作為載藥載體和靶向介導(dǎo)，利用人血清白蛋白可生物吸收降解，完全生物相容，良好溶解性，低維納米尺寸，長(zhǎng)半衰期，癌癥被動(dòng)靶向及其富含二硫鍵等特點(diǎn)，通過(guò)GSH還原人血清白蛋白內(nèi)部分二硫鍵，利用亞砷酸的三價(jià)砷-硫鍵親和作用，成功構(gòu)建了一種尺寸均一，分散性好的三氧化二砷白蛋白納米靶向給藥系統(tǒng)，有望應(yīng)用于癌癥尤其葉酸受體高表達(dá)腫瘤的革G向治療。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的制備方法示意圖；
[0017]圖2為三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的UV-Vis圖；
[0018]圖3為三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的TEM圖；
[0019]圖4為三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的DLS圖；
[0020]圖5為三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的-SH檢測(cè)圖；
[0021]圖6為三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的CD圖；
[0022]圖7為三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性；
[0023]圖8為三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的釋放情況。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下通過(guò)實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)實(shí)際需要選擇性在人血清白蛋白表明單獨(dú)修飾靶向分子FA及同時(shí)標(biāo)記熒光監(jiān)測(cè)分子FITC，CY5等，從而可以獲得三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)。
[0025]本發(fā)明使用的載體為人血清白蛋白HSA，示范為葉酸FA修飾的HSA(FA-HSA)及同時(shí)標(biāo)記FITC的FA/FITC-HSA，也可以為其他靶向分子修飾的HSA，如核酸適配體、靶向肽或其他靶向配體及同時(shí)標(biāo)記熒光監(jiān)測(cè)分子FITC，CY5等。
[0026]實(shí)施例1三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的制備(FA-HSA-ATO)，如圖1所示:
[0027](I)將三氧化二砷(As2O3, ΑΤΟ)粉末1mg溶解于少量體積氫氧化鈉溶液，然后用IM的稀鹽酸調(diào)pH至5.0-6.5左右，配成ATO濃度為5mg/mL的砷溶液，備用于白蛋白載藥;將標(biāo)記葉酸分子的人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)100mg(見(jiàn)圖2)溶解于2ml不含I丐鎂離子的杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco ’ s Phosphate Buffered Saline，D_PBS)中(50mg/mL)，加入谷胱甘肽(GSH)于37°C水浴鍋中輕柔攪拌反應(yīng)lh，谷胱甘肽(GSH)加入到人血清白蛋白溶液中的終濃度為50mM;
[0028](2)取含5mg ATO的水溶液加入GSH處理過(guò)的白蛋白溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)；
[0029 ] (3)將ATO白蛋白混合溶液放入透析袋(分子量為8-14KD)于低溫D-PBS溶液透析除去多余的AT0、GSH及其氧化產(chǎn)物GSSG后(數(shù)次，24小時(shí))，即得ATO的白蛋白納米載藥顆粒，經(jīng)ICP-OES測(cè)定，ATO與HSA的摩爾分子比為3.5:1。
[0030]得到的FA-HSA-ATO納米顆粒納米尺寸均一，分布均勻(見(jiàn)圖3和圖4)，平均粒徑約1nm;游離巰基檢測(cè)和圓二色譜(CD)測(cè)定發(fā)現(xiàn)HSA與ATO是通過(guò)砷-硫鍵結(jié)合裝載，且沒(méi)有明顯改變?nèi)搜灏椎鞍椎亩?jí)結(jié)構(gòu)(圖5和圖6);在含10 %胎牛血清的1640培養(yǎng)基和人血清中24h內(nèi)穩(wěn)定(圖6)。當(dāng)體外模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)還原(GSH 1-1OmM)和弱酸環(huán)境(pH 5_6)時(shí)，該載藥系統(tǒng)具有良好釋放率。
[0031]實(shí)施例2三氧化二砷白蛋白納米給藥系統(tǒng)的制備(FA-HSA-ATO)，如圖1所示:
[0032](I)將三氧化二砷(As2O3, ΑΤΟ)粉末20mg溶解于少量體積氫氧化鈉溶液，然后用IM的稀鹽酸調(diào)pH至5.0-6.5左右，配成ATO濃度為10mg/mL的砷溶液，備用于白蛋白載藥;將標(biāo)記葉酸分子的人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA) 160mg(見(jiàn)圖2)溶解于2ml不含I丐儀離子的杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco ’ s Phosphate Buffered Saline，D_PBS)中(80mg/mL)，加入谷胱甘肽(GSH)于37°C水浴鍋中輕柔攪拌反應(yīng)I小時(shí)，谷胱甘肽(GSH)加入到人血清白蛋白溶液中的終濃度為80mM;
[0033](2)取含1mg ATO的水溶液加入GSH處理過(guò)的白蛋白溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)；
[0034](3)將ATO白蛋白混合溶液放入透析袋(分子量為8-14KD)于低溫D-PBS溶液透析除去多余的AT0、GSH及其氧化產(chǎn)物GSSG后(數(shù)次，24小時(shí))，即得ATO的白蛋白納米載藥顆粒，經(jīng)ICP-OES測(cè)定，ATO與HSA的摩爾分子比為5.5:1。
[0035]得到的FA-HSA-ATO納米顆粒納米尺寸均一，分布均勻(見(jiàn)圖3和圖4)，平均粒徑約1nm;游離巰基檢測(cè)和圓二色譜(CD)測(cè)定發(fā)現(xiàn)HSA與ATO是通過(guò)砷-硫鍵結(jié)合裝載，且沒(méi)有明顯改變?nèi)搜灏椎鞍椎亩?jí)結(jié)構(gòu)(圖5和圖6);在含10 %胎牛血清的1640培養(yǎng)基和人血清中24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(圖6)。當(dāng)體外模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)還原(GSH 1-1 OmM)和弱酸環(huán)境(pH 5-6)時(shí)，該載藥系統(tǒng)具有良好釋放率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種三氧化二砷白蛋白納米藥物的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將三氧化二砷粉末溶解于氫氧化鈉溶液，然后用稀鹽酸調(diào)PH至5.0-6.5,配成濃度為5—10mg/mL的三氧化二砷溶液，備用于白蛋白載藥;將標(biāo)記葉酸分子的人血清白蛋白溶解于不含鈣鎂離子的杜氏磷酸鹽緩沖液中，得白蛋白濃度為30—100mg/mL的人血清白蛋白溶液，向人血清白蛋白溶液中加入二硫鍵還原劑于370C水浴鍋中輕柔攪拌反應(yīng)0.5—2h，二硫鍵還原劑加入到人血清白蛋白溶液中的終濃度為30—lOOmM，得二硫鍵還原劑處理過(guò)的白蛋白溶液； (2)向二硫鍵還原劑處理過(guò)的白蛋白溶液中加入三氧化二砷溶液，三氧化二砷加入到白蛋白溶液中的終濃度為0.5—5mg/mL，室溫?cái)嚢鐸 一 6h，得三氧化二砷白蛋白混合溶液； (3)將三氧化二砷白蛋白混合溶液放入透析袋，并于低溫D-PBS溶液透析除去多余的三氧化二砷和二硫鍵還原劑及其副產(chǎn)物，得三氧化二砷白蛋白納米藥物。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述二硫鍵還原劑為谷胱甘肽。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述三氧化二砷溶液中三氧化二砷濃度為0.5—5mg/mL04.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述三氧化二砷白蛋白納米藥物中三氧化二砷與人血清白蛋白的摩爾分子比為(3—8):1。
【文檔編號(hào)】A61P35/02GK105832676SQ201610180297
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月28日
【發(fā)明人】譚蔚泓, 彭詠波, 趙子龍, 張曉兵, 劉騰
【申請(qǐng)人】湖南大學(xué)