專利名稱：人血清白蛋白-siRNA納米尺寸載體系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本說(shuō)明書(shū)涉及SiRNA結(jié)合到人血清白蛋白的人血清白蛋白-SiRNA載體系統(tǒng)及其應(yīng)用，更具體地講，涉及一種通過(guò)將人血清白蛋白和si RNA結(jié)合而制備并具有改善的體內(nèi)穩(wěn)定性的人血清白蛋白-siRNA納米尺寸載體系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療分為在因基因缺失或基因變異使特異性蛋白質(zhì)在相應(yīng)的細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)時(shí)，通過(guò)使特異性基因?qū)?傳遞)到細(xì)胞中或在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)來(lái)恢復(fù)受損功能的方法；通過(guò)諸如siRNA的基因傳遞來(lái)選擇性地抑制導(dǎo)致疾病的蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)或不必要的蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)來(lái)恢復(fù)正常功能的方法。這樣的在基因水平對(duì)蛋白質(zhì)的控制是針對(duì)疾病的成因，因此，其被認(rèn)為是理想的療法。使用siRNA的基因治療的關(guān)鍵在于如何以最小副作用和給藥效率將具有強(qiáng)負(fù)電荷的si RNA傳遞到期望組織。然而，siRNA具有低的細(xì)胞透性，并且因在生理環(huán)境下等對(duì)基因的降解酶敏感而不能維持必要的濃度，從而易于分解，這些導(dǎo)致siRNA作為藥物使用受到限制。為了克服該問(wèn)題，需要開(kāi)發(fā)這樣基因載體系統(tǒng)可以有效地循環(huán)而不被活體等中的免疫細(xì)胞移除或排出，以穩(wěn)定傳遞/積累在特異疾病位點(diǎn)上并被適當(dāng)?shù)厣锝到?。作為體內(nèi)多聚體，血清白蛋白是一種生物相容性好并且也非常穩(wěn)定(在血液中具有19天的半衰期)的蛋白質(zhì)。如所公知的，血清白蛋白具有高親和力并具有有效的腫瘤積累能力，從而適合于用作基因載體系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了克服上面提到的問(wèn)題，詳細(xì)描述的方面提供了能夠提高siRNA體內(nèi)穩(wěn)定性和傳遞效率的新型siRNA載體系統(tǒng)以及包含該siRNA載體系統(tǒng)的藥理學(xué)組合物。為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本說(shuō)明的目的的方面，如這里所實(shí)施和寬泛描述的，提供了一種使用結(jié)合的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)能夠通過(guò)與siRNA形成復(fù)合物而以納米尺寸顆粒的形式存在于水溶液中，并且可以在特定的生理環(huán)境下從siRNA裂解下，從而提高在活體內(nèi)的傳遞效率。通過(guò)下面給出的詳細(xì)描述，本申請(qǐng)適用性的其他范圍將變得更明顯。然而，應(yīng)該理解的是，由于通過(guò)下面的詳細(xì)描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和變形對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，所以在表示本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的同時(shí)，僅通過(guò)舉例說(shuō)明的方式給出了詳細(xì)的描述和具體的示例。


附圖示出了示例性實(shí)施例并與說(shuō)明書(shū)一起用于解釋本發(fā)明的原理，包括附圖以提供本發(fā)明的進(jìn)一步理解，附圖包括在本說(shuō)明書(shū)中并構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分。
在附圖中圖1是通過(guò)使用2-亞氨氫氯化硫醇(Traut ’ s reagent)將-SH (硫醇基)導(dǎo)入包含胺基的人血清白蛋白(HSA)來(lái)制備硫醇化人血清白蛋白(T-HSA)的示意圖；圖2是使在其兩端包含-SH (硫醇基)的多SiRNA與硫醇化人血清白蛋白(T-HSA) 反應(yīng)以通過(guò)二硫鍵形成復(fù)合物的示意圖；圖3是通過(guò)二硫鍵制備的多SiRNA和T-HSA的復(fù)合物的電泳圖；圖4示出了通過(guò)根據(jù)每個(gè)濃度使用用于紅色熒光蛋白(RFP)基因的T-HSA/多 siRNA復(fù)合物處理RFP基因過(guò)度表達(dá)細(xì)胞而對(duì)RFP基因表達(dá)的抑制效果；圖5示出了在將通過(guò)示例2的方法制備的T-HSA/多siRNA復(fù)合物施用到小鼠體內(nèi)之后在表達(dá)RFP的腫瘤組織中的基因表達(dá)抑制效果；圖6是當(dāng)通過(guò)示例2的方法使用用于腫瘤生長(zhǎng)因子VEGF的多siRNA而制備的 T-HSA/多siRNA復(fù)合物以施用到被植入人前列腺癌細(xì)胞系的小鼠中時(shí)，被VEGF多siRNA傳遞體抑制的小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式在下文中將詳細(xì)地描述本說(shuō)明書(shū)。為了在活體內(nèi)有效地傳遞SiRNA，本說(shuō)明書(shū)提供了通過(guò)將人血清白蛋白聚合物結(jié)合到siRNA而制備的siRNA載體系統(tǒng)，具體地講，提供了通過(guò)生物可降解共價(jià)鍵將人血清白蛋白聚合物結(jié)合到siRNA而制備的siRNA載體系統(tǒng)。該siRNA載體系統(tǒng)是通過(guò)將人血清白蛋白結(jié)合到各種形式的siRNA而制備的。所述結(jié)合可以通過(guò)生物可降解共價(jià)鍵獲得，并且該siRNA載體系統(tǒng)可以如以下進(jìn)行表示。A-B(A 人血清白蛋白，B 各種形式的多siRNA)其中，A表示具有導(dǎo)入其中的生物可降解反應(yīng)物的人血清白蛋白。具體地講，人血清白蛋白A可以在水溶液中與各種形式的siRNA形成復(fù)合物以創(chuàng)造納米尺寸的自組裝， 從而選擇性地積累在特異性疾病位點(diǎn)(例如，血管生成靶向EPR、腫瘤、風(fēng)濕病、炎病性疾病
等)-t ο作為體內(nèi)多聚體物質(zhì)之一的血清白蛋白具有優(yōu)異的生物相容性。此外，作為在血液中具有19天半衰期的非常穩(wěn)定的蛋白的血清白蛋白具有與腫瘤(癌)組織的高親和力， 從而表現(xiàn)出有效的腫瘤積累能力。因此，血清白蛋白可以化學(xué)結(jié)合到具有低分子量的各種化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)、抗體等，從而用于提高各種藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性并用于將這樣的藥物傳遞到目標(biāo)腫瘤組織。例如，已報(bào)道了研究將阿霉素(Drug Delivery 6(1999) 1-7)或甲氨蝶呤(MTX Anticancer Drugs 8 (1997) 835-844)化學(xué)結(jié)合到白蛋白來(lái)提高血液中藥物的腫瘤靶向性和穩(wěn)定性。關(guān)于將血清白蛋白用作藥物傳遞體，已報(bào)道了研究(Cancer Research 46(1986)6387-6392)當(dāng)基于白蛋白對(duì)癌組織的高靶向性而將具有結(jié)合熒光團(tuán)或標(biāo)記同位素的白蛋白注入到癌移植的小動(dòng)物，然后進(jìn)行成像時(shí)，大量的白蛋白選擇性地積累在腫瘤組織上。因此，可知這樣的選擇性積累通過(guò)發(fā)生在腫瘤組織附近的疏松血管中的增強(qiáng)滲透滯留(EPR)效應(yīng)而發(fā)生。這樣，已經(jīng)介紹了作為抗癌傳遞體的白蛋白的優(yōu)點(diǎn)，但白蛋白本身不能提供強(qiáng)到足以能夠用作具有強(qiáng)負(fù)電荷的siRNA載體系統(tǒng)的結(jié)合力。因此，需要具有提高的結(jié)合力并保持白蛋白特異性特征的變異。
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所以本發(fā)明的發(fā)明人研究了用于穩(wěn)定地將人血清白蛋白與SiRNA結(jié)合，來(lái)制備憑借人血清白蛋白與siRNA的有效結(jié)合而能夠在活體內(nèi)穩(wěn)定地傳遞siRNA的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)的方法。因此，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了當(dāng)通過(guò)生物可降解共價(jià)鍵將siRNA結(jié)合到人血清白蛋白時(shí)，siRNA和人血清白蛋白可以彼此穩(wěn)定地結(jié)合并可以有效地在體內(nèi)分解，從而適合作為siRNA載體系統(tǒng)。作為參考，發(fā)明人提供了對(duì)于具有提高的體內(nèi)穩(wěn)定性和 siRNA的基因表達(dá)效果的專利申請(qǐng)(PCT/KR2010/001296)和文獻(xiàn)(Journal of controlled release, 2010. 141(3) :339-346):通過(guò)將硫醇基引入到siRNA的5，端以通過(guò)二硫鍵結(jié)合 siRNA，這樣增大了 siRNA的尺寸。此外，已證實(shí)了 siRNA載體系統(tǒng)的可能性(專利申請(qǐng) No. 2010-0089081)通過(guò)同時(shí)將電荷和共價(jià)鍵引入到來(lái)源于活體的多聚體中來(lái)制備具有改善的反應(yīng)性的納米粒。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)的人血清白蛋白A和siRNA B通過(guò)生物可降解共價(jià)鍵彼此結(jié)合。生物可降解共價(jià)鍵的示例可以包括二硫鍵、酯鍵、酐鍵、腙鍵、 酶特異性肽鍵等，但不限于此。由于在特定的生理環(huán)境下可分解，所以這樣的生物可降解共價(jià)鍵會(huì)是有用的。在siRNA和人血清白蛋白之間的通過(guò)各種酶和不同的酸度而在生理環(huán)境下是生物可降解的生物可降解鍵可以允許siRNA(通過(guò)體內(nèi)酶的特異性而溶解)抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，當(dāng)將作為用于生物可降解鍵的反應(yīng)物的硫醇基引入到siRNA的端部和多聚體的端部時(shí)，siRNA和多聚體具有被稱作二硫鍵的生物可降解鍵。二硫鍵被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)還原。當(dāng)將具有二硫鍵的siRNA-人血清白蛋白載體系統(tǒng)引入到活體中時(shí)，所述鍵被存在于活體內(nèi)的谷胱甘肽消化，使得siRNA可以從載體系統(tǒng)分離。具體地講， 對(duì)于谷胱甘肽的濃度在癌細(xì)胞中增大的報(bào)道，可以注意到，即使在腫瘤組織中，人血清白蛋白-siRNA納米尺寸載體系統(tǒng)的諸如二硫鍵的生物可降解鍵也可以有效地生物降解，從而有效地將siRNA傳遞到目標(biāo)組織。對(duì)于生物可降解共價(jià)鍵，生物可降解反應(yīng)物被引入到人血清白蛋白A，此外，反應(yīng)物被引入到siRNA B的一端或兩端，以使siRNA B與人血清白蛋白A形成生物可降解共價(jià)鍵。引入的反應(yīng)物的類型可以取決于共價(jià)鍵的目標(biāo)類型。在以上描述中，B表示均具有反應(yīng)物的各種形式的siRNA。siRNA可以是單體 siRNA、通過(guò)生物可降解鍵與若干siRNA結(jié)合的多siRNA或者聚合siRNA。優(yōu)選地，siRNA可以是15至30個(gè)核苷酸的單體siRNA或者可以是由作為聚合體的100至600個(gè)核苷酸組成的聚合siRNA。siRNA的分子量?jī)?yōu)選地可以在10，000至1，000，000范圍內(nèi)。為了治療的目的，siRNA序列可以優(yōu)選地使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的堿基序列、Bcl2、EGFR、NF_kB 等，但不限于此。為了通過(guò)熒光來(lái)檢查siRNA的傳遞效率，下面的示例使用了紅色熒光蛋白 (RFP)的siRNA堿基序列。人血清白蛋白A和siRNA B優(yōu)選地可以以大約10 1的重量比混合ο根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的通過(guò)將人血清白蛋白A和siRNA B結(jié)合來(lái)制備siRNA載體系統(tǒng)的方法可以包括(a)將用于生物可降解共價(jià)鍵的反應(yīng)物引入到人血清白蛋白中；(b)將反應(yīng)物引入或活化到各種形式的SiRNA的一端或兩端；(c)將在步驟(a)制備的人血清白蛋白和在步驟(b)制備的siRNA通過(guò)生物可降解共價(jià)鍵穩(wěn)定地結(jié)合來(lái)制備納米粒。
可以根據(jù)結(jié)合機(jī)理可選擇地將該方法設(shè)定成同時(shí)執(zhí)行這些步驟。在本說(shuō)明書(shū)的一個(gè)實(shí)施例中，將硫醇基引入到人血清白蛋白中來(lái)制備硫醇化的人血清白蛋白(見(jiàn)圖1)。此外，然后將硫醇化的人血清白蛋白結(jié)合到均具有硫醇基引入端的聚合的多siRNA。因此，人血清白蛋白和多siRNA可以通過(guò)由引入的硫醇基得到的二硫鍵而形成復(fù)合物。這樣，硫醇基或除硫醇基之外的反應(yīng)物可以引入到人血清白蛋白和siRNA中，從而通過(guò)人血清白蛋白和siRNA之間的共價(jià)鍵形成復(fù)合物。如上所述，具有引入的反應(yīng)物的各種形式的siRNA和引入反應(yīng)物的人血清白蛋白可以在水溶液中有效地形成復(fù)合物來(lái)形成納米尺寸的自組裝，納米尺寸的自組裝也可以積累在特異性疾病(血管生成靶向EPR、腫瘤、風(fēng)濕病、炎病性疾病等)位點(diǎn)上。關(guān)于此，僅 siRNA因其充足的負(fù)電荷而難以滲透到細(xì)胞中，但結(jié)合到siRNA的人血清白蛋白是非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，人血清白蛋白在血液中具有19天的半衰期并且被試圖用作用于改善各種藥物體內(nèi)穩(wěn)定性的藥物傳遞系統(tǒng)。因此，siRNA和人血清白蛋白可以憑借人血清白蛋白的化學(xué)修飾而形成納米尺寸自組裝?？梢愿鶕?jù)修飾度來(lái)控制siRNA等的藥物結(jié)合水平。當(dāng)使用根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的載體系統(tǒng)傳遞siRNA時(shí)，siRNA可允許有效的體內(nèi)藥物循環(huán)，并可以用作針對(duì)腫瘤組織具有高循環(huán)能力的藥物傳遞系統(tǒng)。通過(guò)所述方法制備的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)的尺寸可以為IOnm至 2000nm,并且可以在活體內(nèi)形成納米粒，從而通過(guò)EI3R效應(yīng)有效地積累在腫瘤組織上并適用于癌癥的治療。此外，對(duì)于諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的炎癥性疾病，分泌的/催生的炎癥物質(zhì)可以擴(kuò)展血管，并且血壓和滲透性可以增加，從而抗炎劑可以傳遞到存在于血管壁的發(fā)炎細(xì)胞。因此，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的siRNA載體系統(tǒng)也可以適合于治療炎癥性疾病。同時(shí)，siRNA載體系統(tǒng)可以用作藥理學(xué)組合物的重要成分。因此，本說(shuō)明書(shū)提供了一種由有效劑量的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)組成的藥理學(xué)組合物。除人血清白蛋白-SiRNA載體系統(tǒng)之外，該藥理學(xué)組合物還可以包括一種或多種藥理學(xué)允許的載體以用于施用。藥理學(xué)允許的載體可以與所述重要成分相容?？梢允褂蒙睇}水、無(wú)菌水、林格氏液、緩沖生理鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇以及它們中的至少一種的混合物來(lái)作為藥理學(xué)允許的載體，或者如果需要，可以添加諸如抗氧化劑、緩沖溶液、抑菌劑等的其他典型的賦形劑。此外，可以另外添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、結(jié)合劑和潤(rùn)滑劑等來(lái)制備成諸如水溶液、懸浮液、乳劑等的注射液的形式?？梢詫⑺幚韺W(xué)組合物制備成諸如粉末、片劑、膠囊、藥水、注射劑、軟膏、糖漿等的各種形式，并可以通過(guò)使用例如密封的安瓿和瓶等的單位劑量或多劑量的容器來(lái)提供藥物學(xué)組合物。藥理學(xué)組合物可以允許口服或腸外施用。可以通過(guò)包括口服施用、靜脈注射施用、 肌注施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、髓內(nèi)施用、硬膜內(nèi)施用、心臟內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、皮下施用、腹腔內(nèi)施用、腸道施用、舌下施用和局部施用的方法中的一種來(lái)執(zhí)行藥理學(xué)組合物的施用?？梢酝ㄟ^(guò)公知的技術(shù)將藥理學(xué)組合物制備成合適的形式以用于這樣的臨床施用。例如，對(duì)于口服施用，可以將藥理學(xué)組合物與非活性稀釋劑或可食性載體混合，密封在硬的或軟的膠囊中或者壓成片劑來(lái)施用。對(duì)于口服施用，可以將活性組合物與稀釋劑混合，從而以可消化片劑、 含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙(wafer)等的形式來(lái)使用。此外，可以根據(jù)在本說(shuō)明書(shū)的領(lǐng)域內(nèi)的已知技術(shù)或通常使用的技術(shù)來(lái)制備用于例如注射、腸外施用等的各種形式。組合物的劑量可以根據(jù)所有與病人相關(guān)的體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、施用時(shí)間、施用方式、排泄率、疾病的嚴(yán)重度等在寬的范圍內(nèi)變化，并可以由本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的典型使用而決定。在下文中，將參照幾個(gè)示例來(lái)詳細(xì)地描述本說(shuō)明書(shū)。下面的示例僅是示出性的，并且不應(yīng)該被解釋為限定本公開(kāi)。示例1 硫醇基引入到人血清白蛋白(T-HSA制備)大量的人血清白蛋白存在于活體內(nèi)，無(wú)毒性并有效地積累在腫瘤組織上。然而，人血清白蛋白其自身不能結(jié)合到具有強(qiáng)負(fù)電荷的siRNA。因此，通過(guò)使用2-亞氨氫氯化硫醇作為交聯(lián)劑(這里，SPDP交聯(lián)劑可以用來(lái)代替2-亞氨氫氯化硫醇)將硫醇基引入到白蛋白的胺基中。在水溶液中可以容易地執(zhí)行使用2-亞氨氫氯化硫醇將硫醇基引入到白蛋白中，并且包含硫醇基的白蛋白可以有效地具有與siRNA結(jié)合的二硫鍵，其中，所述siRNA在其一端或兩端具有硫醇基。二硫鍵可使得二硫鍵結(jié)合的部分被細(xì)胞質(zhì)中的谷胱甘肽特異水解而使siRNA釋放。將IOmg的人血清白蛋白(HSA，分子量為66. 5kDa)溶解在IOml的pH為8. 0的磷酸鹽緩沖液中，并分別與0. 2mg,0. %ig、aiig*%ig的2-亞氨氫氯化硫醇(分子量為137. 63Da, 與白蛋白的分子數(shù)的比為10倍、20倍、100倍和200倍)在4V反應(yīng)1小時(shí)。然后，使用具有12，OOODa的分離點(diǎn)(cut-off)的透析膜透析溶液M小時(shí)，以除去未反應(yīng)的2-亞氨氫氯化硫醇，接下來(lái)進(jìn)行冷凍干燥，從而制備硫醇化的人血清白蛋白(T-HSA)(見(jiàn)圖1)。示例2 具有硫醇基的聚合的寡核苷酸與人血清白蛋白多聚體的結(jié)合將聚合的多siRNA結(jié)合到T-HSAHSA，聚合的多siRNA的穩(wěn)定性和負(fù)電荷量通過(guò)將硫醇基引入其端部而增加。人血清白蛋白(T-HSA)和siRNA通過(guò)二硫鍵形成復(fù)合物。將 50 μ g 的多 siRNA (50mM 磷酸鈉緩沖液，5mMEDTA,pH 8. 0)和 500 μ g 的 T-HSA 溶解在 50 μ 1 的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中并混合，以在37°C彼此反應(yīng)M小時(shí)，從而制備穩(wěn)定的復(fù)合物 (見(jiàn)圖2)。在8%的聚丙烯酰胺凝膠中將通過(guò)以幾個(gè)重量比和濃度比混合多siRNA和T-HSA 并在37°C彼此反應(yīng)對(duì)小時(shí)而制備的復(fù)合物在150V電泳35分鐘(見(jiàn)圖幻。然后，用肚-Br 將電泳的復(fù)合物染色，從而通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察未反應(yīng)形成復(fù)合物而剩下的多siRNA。因此，觀察到當(dāng)將2-亞氨氫氯化硫醇以100倍的摩爾比添加到T-HSA以及將 T-HSA以10倍的重量比添加到siRNA并進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，T-HSA和多siRNA的最有效復(fù)合物形成。此外，觀察到不發(fā)生多siRNA與沒(méi)有反應(yīng)物引入的純的人血清白蛋白的任何結(jié)合。因此，將理解的是，siRNA和T-HSA之間憑借除了電荷之外的硫醇基形成復(fù)合物而使二硫鍵形成。示例3 通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證通過(guò)使用引入硫醇基的人血清白蛋白(T-HSA)多聚體和聚合寡核苷酸(多siRNA)的復(fù)合物的siRNA傳遞體的基因表達(dá)抑制在作為黑色素瘤細(xì)胞系的RFP_B16/F10(1. 2*105/皿)中處理根據(jù)示例2制備的多siRNA和T-HSA的復(fù)合納米粒，使得siRNA的濃度可以為20nM、50nM和ΙΟΟηΜ，其中，黑色素腫瘤細(xì)胞系過(guò)度表達(dá)RFP。在M小時(shí)之后，在熒光顯微圖像中觀察處理過(guò)的納米粒的紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)抑制效應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)中，使用siRNA靶向的RFP作為熒光蛋白。為了在細(xì)胞水平驗(yàn)證基因表達(dá)抑制效果，劃分為未處理的組(對(duì)照組)、僅多siRNA被處理過(guò)而無(wú)載體系統(tǒng)的組(自由多si-RNA)、被處理過(guò)的多siRNA/LF的組和被處理過(guò)的多siRNA/ T-HSA的組來(lái)執(zhí)行該實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖4)。所述多siRNA/LF的LF表示Lipofectamine 2000, Invitrogen公司的一種產(chǎn)品。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)觀察到通過(guò)T-HAS的多siRNA傳遞體表現(xiàn)出RFP 基因表達(dá)的有效抑制。示例4 通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用T-HSA多聚體和多siRNA來(lái)驗(yàn)證基因表達(dá)抑制效果將1X106RFP-B16/F10黑色素瘤細(xì)胞系從裸鼠背部的腰以下的部分注入到裸鼠內(nèi)，從而制備動(dòng)物癌癥模型。分三次(第O天、第1天、第3天)將通過(guò)示例2的方法制備的T-HSA/多siRNA復(fù)合物注入到動(dòng)物癌癥模型的尾靜脈中，從此時(shí)起通過(guò)光學(xué)成像系統(tǒng)檢測(cè)到RFP熒光，從而觀察通過(guò)血管傳遞的多siRNA對(duì)來(lái)自癌組織的RFP表達(dá)抑制效果。觀察到，當(dāng)注入T-HSA/多siRNA復(fù)合物時(shí)，顯著地減少了來(lái)自癌組織的RFP表達(dá)(見(jiàn)圖5)。 此外，通過(guò)在第6天撕開(kāi)來(lái)自小鼠的癌組織并通過(guò)熒光顯微鏡比較來(lái)自癌組織的RFP的表達(dá)量的方式，觀察到來(lái)自注入了 T-HSA/多siRNA復(fù)合物的小鼠的組織的RFP的有效減少。示例5 通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)檢查經(jīng)由T-HSA多聚體和多siRNA的復(fù)合物的傳遞的腫瘤體積的減小將IX 106PC_3人前列腺癌細(xì)胞系從裸鼠背部的腰以下的部分注入到裸鼠內(nèi)，從而制備動(dòng)物癌癥模型。制備直接影響腫瘤擴(kuò)散的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的多siRNA，并且通過(guò)示例2的方法制備T-HSA/多siRNA復(fù)合物。從腫瘤的體積變成大約50mm3 IOOmm3時(shí)開(kāi)始，每隔兩天將T-HSA/多siRNA復(fù)合物注入到動(dòng)物癌癥模型的尾靜脈中，從而三周后測(cè)量腫瘤體積通過(guò)經(jīng)由血管傳遞的VEGF多siRNA的減小。觀察到，通過(guò)注入T-HSA/多siRNA 復(fù)合物，癌組織內(nèi)的腫瘤擴(kuò)散通過(guò)VEGF抑制而受到明顯的抑制。如上所述，通過(guò)生物可降解共價(jià)鍵制備的具有新形式的納米尺寸人血清白蛋白載體系統(tǒng)可以在水溶液中形成納米粒并可以在活體內(nèi)穩(wěn)定地將siRNA傳遞到靶位點(diǎn)，從而提高通過(guò)siRNA的治療功效。因此，人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)可以有效地應(yīng)用于各種癌癥和疾病模型。前面的實(shí)施例和優(yōu)點(diǎn)僅是示例性的并且不被解釋為限制本公開(kāi)。本教導(dǎo)可以容易地應(yīng)用于其他類型的設(shè)備。本描述意在是示例性的，并且不意圖限制權(quán)利要求的范圍。許多選擇、變型和改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。可以以各種方式將這里描述的示例性實(shí)施例的特性、結(jié)構(gòu)、方法和其他特征結(jié)合來(lái)得到另外的和/或可選擇的示例性實(shí)施例。由于在不脫離本特性的特征的情況下，可以以多種形式實(shí)施本特性，所以也應(yīng)該理解的是，除非另外明確地指出，否則上述實(shí)施例不受前面描述的任何細(xì)節(jié)的限制，而是相反，應(yīng)該在權(quán)利要求限定的范圍內(nèi)進(jìn)行寬泛的解釋，因此落入權(quán)利要求的界限和邊界內(nèi)的所有改變和變形或者這樣的界限和邊界的等同物因此意圖包含于權(quán)利要求。
權(quán)利要求
1.一種人血清白蛋白-SiRNA載體系統(tǒng)，具有在人血清白蛋白A和SiRNAB之間的生物可降解共價(jià)鍵，所述載體系統(tǒng)具有下面的結(jié)構(gòu)，A-B其中，A表示具有引入的生物可降解反應(yīng)物的人血清白蛋白多聚體，B表示具有引入到其一端或兩端的反應(yīng)物的siRNA。
2.如權(quán)利要求1所述的載體系統(tǒng)，其中，人血清白蛋白A和siRNAB分別具有用于在人血清白蛋白A和siRNA B之間的生物可降解共價(jià)鍵的引入反應(yīng)物。
3.如權(quán)利要求1所述的載體系統(tǒng)，其中，在人血清白蛋白A和siRNAB之間的生物可降解共價(jià)鍵選自于二硫鍵、酯鍵、酐鍵、腙鍵、酶特異性肽鍵。
4.如權(quán)利要求1所述的載體系統(tǒng)，其中，所述siRNAB是單體siRNA、通過(guò)生物可降解鍵與幾個(gè)siRNA結(jié)合的多siRNA或者聚合siRNA。
5.如權(quán)利要求1所述的載體系統(tǒng)，其中，所述siRNAB是15個(gè)至30個(gè)核苷酸的單體 siRNA或者是由作為聚合體的100個(gè)至600個(gè)核苷酸組成的聚合siRNA。
6.如權(quán)利要求1所述的載體系統(tǒng)，其中，人血清白蛋白A和siRNAB以10 1的重量比混合。
7.如權(quán)利要求1所述的載體系統(tǒng)，其中，所述載體系統(tǒng)的尺寸為IOnm至2000nm。
8.如權(quán)利要求1至7所述的載體系統(tǒng)，其中，所述人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)用于癌癥治療。
9.一種由有效劑量的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)組成的抗癌組合物。
10.一種制備siRNA載體系統(tǒng)的方法，所述方法包括以下步驟(a)將用于生物可降解共價(jià)鍵的反應(yīng)物引入到具有正電荷的人血清白蛋白多聚體中；(b)將反應(yīng)物引入或活化到siRNA、多siRNA或聚合siRNA的一端或兩端；(c)將在步驟(a)制備的人血清白蛋白和在步驟(b)制備的siRNA通過(guò)生物可降解共價(jià)鍵穩(wěn)定地結(jié)合來(lái)制備納米粒。
全文摘要
一種人血清白蛋白-siRNA納米尺寸載體系統(tǒng)。本發(fā)明公開(kāi)了具有結(jié)合到人血清白蛋白的siRNA的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)及其應(yīng)用，具體地講，本發(fā)明公開(kāi)了一種在人血清白蛋白多聚體和siRNA之間具有的可降解共價(jià)鍵并且在活體內(nèi)穩(wěn)定的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)及其應(yīng)用。在人血清白蛋白和siRNA之間具有可降解共價(jià)鍵的人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)在活體內(nèi)表現(xiàn)出向靶位點(diǎn)的高siRNA傳遞效率。因此，人血清白蛋白-siRNA載體系統(tǒng)即使以相對(duì)低的濃度施用也可以允許用于治療的siRNA在活體內(nèi)有效地傳遞到諸如癌組織的靶位點(diǎn)，這可以使較寬地用于治療各種疾病。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102441175SQ20111030935
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月5日
發(fā)明者尹仁燦, 崔貴元, 權(quán)翊贊, 李素珍, 許明淑, 金光明 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院