專利名稱：一種藥物組合物在制備抑制白蛋白外漏藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及養(yǎng)血清腦顆粒在制備抑制白蛋白外漏藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
世界上腦血管疾病的平均發(fā)病率140 200/10萬人口，平均死亡率100/10萬人口，是 發(fā)病率和死亡率較高的病種。改善腦血管損傷對挽救生命和降低醫(yī)療財政都有著重要的意義。
缺血再灌注引起的腦血管損傷約占腦血管損傷原因的60%左右。缺血再灌注后，黏附于血管 內(nèi)皮的白細(xì)胞釋放大量過氧化酶和蛋白酶，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜，引起血管通透性增 加和血漿白蛋白漏出，造成血管周圍組織的水腫。過氧化物刺激又可引起血管周圍的肥大細(xì) 胞脫顆粒釋放發(fā)炎性黏附和白蛋白外漏，血管周圍組織的水腫從血管外壓迫血管，血管內(nèi)皮 細(xì)胞的腫脹和白細(xì)胞黏附，血小板積聚等都稱為阻礙血流的因素，導(dǎo)致再灌注后不復(fù)灌的區(qū) 域形成。
養(yǎng)血清腦顆粒是由當(dāng)歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細(xì)辛為主要成 分構(gòu)成的中藥復(fù)方制劑，1996年被中國國家食品與藥品監(jiān)督管理局(SFDA)作為治療頭痛， 眩暈和腦血管疾病的中藥復(fù)方制劑，批準(zhǔn)在中國臨床應(yīng)用。我們以往的研究已經(jīng)證實了養(yǎng)血 清腦顆?？梢砸种谱园l(fā)性高血壓和腦中風(fēng)易發(fā)性大鼠的血壓、延緩腦中風(fēng)的發(fā)病時間、改善 腦血流量。但是，有關(guān)養(yǎng)血清腦顆粒對缺血再灌注引起的腦微循環(huán)障礙是否具有改善作用未 見報告，尤其是關(guān)于養(yǎng)血清腦顆粒抑制白蛋白外漏作用而改善微循環(huán)的研究也不曾報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種藥物組合物在制備抑制白蛋白外漏藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備抑制 細(xì)靜脈內(nèi)白蛋白外漏藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物在制備預(yù)防和治療白蛋白外漏所致微循環(huán)障礙藥物中的 應(yīng)用，尤其是在心腦血管藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明是通過以下方案實施
本發(fā)明的一種藥物組合物在制備抑制白蛋白外漏藥物中的應(yīng)用，其中組合物是由以下重量百分比含量的原料藥制成，當(dāng)歸4 9% 川粵4~9% 白芍2~8% 熟地2~8% 勾藤 10~15% 雞血藤10 15%夏枯草10 15% 決明子10~15% 珍珠母10~15% 元胡 4 9% 細(xì)辛0.5~2%。
本發(fā)明優(yōu)選的藥物組合物由以下重量百分比含量的原料藥制成當(dāng)歸6.75%川芎 6.75% 白芍5.4% 熟地5.4% 勾藤13.5% 雞血藤13.5% 夏枯草13.5% 決明子 13.5% 珍珠母13.5% 元胡6.75% 細(xì)辛1.34%。
本發(fā)明的藥物組合物制成藥學(xué)上可以接受的制劑，優(yōu)選顆粒劑。
本發(fā)明的藥物組合物制劑通過以下步驟制備
按上述比例取藥材，加水提取3次，每次1小時，合并提取液，適當(dāng)濃縮，加2倍量的乙 醇，靜置24小時沉淀，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.3 1.4，出膏率為10%，取清膏、 蔗糖和糊精按l: 3: 1的比例制成顆粒。其中，制劑部分還可以按照常規(guī)的工藝方法制成其 它藥劑學(xué)上的任何一種劑型。
經(jīng)過大量的試驗研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物組合物有抑制白蛋白外漏的作用，尤其是在制 備抑制細(xì)靜脈內(nèi)白蛋白外漏藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明藥物組合物還可以用在制備治療白蛋白 外漏所導(dǎo)致的微循環(huán)障礙藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選制備治療心腦血管微循環(huán)障礙藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過對FITC標(biāo)記白蛋白細(xì)靜脈外漏的動態(tài)、連續(xù)、可視化觀察，首次證明了中藥 組合物預(yù)給藥可以抑制缺血再灌注后沙鼠大腦皮層細(xì)靜脈白蛋白血管的外漏。
缺血再灌注后由血管內(nèi)皮細(xì)胞和黏附白細(xì)胞產(chǎn)生過氧化物是血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管基底膜 損傷和血漿白蛋白外漏的主要原因之一，同時本發(fā)明中掃描電鏡觀察的結(jié)果也表明再灌注1 小時后的沙鼠大腦皮層細(xì)靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞突起增多，連接間隙增寬，周圍出現(xiàn)水腫，也促 使血漿白蛋白外漏。藥物組合物的預(yù)給藥則抑制了再灌注后沙鼠大腦皮層細(xì)靜脈血管內(nèi)皮細(xì) 胞連接間隙的增寬，內(nèi)皮相對變得光滑，其血管周圍水腫減輕，從而減輕缺血再灌注后腦血 管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，抑制缺血再灌注后腦血管的白蛋白外漏的作用，改善腦血管微循環(huán)作用。
本發(fā)明中掃描電鏡觀察的結(jié)果證明了藥物組合物的預(yù)給藥減輕缺血再灌注后腦血管內(nèi)皮 細(xì)胞的損傷和藥物組合物抑制缺血再灌注后腦血管的白蛋白外漏的作用可能與保護(hù)血管內(nèi)皮 作用相關(guān)，而其保護(hù)血管內(nèi)皮的作用可能與其抑制白細(xì)胞血管內(nèi)皮的黏附和血管壁過氧化物 的產(chǎn)生有關(guān)。
下面結(jié)合試驗例對本發(fā)明的有益效果進(jìn)一步說明
試驗例 一 養(yǎng)血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈血漿白蛋白滲出的影響 (一)實驗方法1、材料
動物蒙古沙土鼠，雄性，體重65 90g，購于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，合格證號
SCXK (京)2000-0012。在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心，按北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物處理規(guī)定， 自由進(jìn)食飲水，單籠詞養(yǎng)，溫度22°。，相對濕度40%， 12小時切換燈源(早晨7點開燈)。
養(yǎng)血清腦顆粒實施例一的中藥組合物制劑即養(yǎng)血清腦顆粒由天津天士力制藥股份有限 公司生產(chǎn)，批號Z10960082。生產(chǎn)過程根據(jù)嚴(yán)格的現(xiàn)代生產(chǎn)工藝，藥物成分標(biāo)準(zhǔn)化。養(yǎng)血清 腦顆粒的主要成分是當(dāng)歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細(xì)辛，實驗前配 制成80mg/ml和160mg/ml的水溶液。
化學(xué)試劑Dihydrorhodamine 123 (DHR)購買于美國Eugene公司；異硫氰酸熒光素標(biāo) 記白蛋白(FITC-albumin)購買于美國SIGMA公司;Rhodamine 6G perchlorate購買于美國 FLUKA公司；烏來糖(Urethane)購買于中國上海天蓮精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)。
2、 試驗組和對照組的動物模型制備
(1) 缺血再灌注組
取20%烏拉坦，按2.0g/kg.bw的用量，經(jīng)腹腔注射麻醉蒙古沙土鼠。在頸部正中切開， 分離氣管，連接小動物呼吸機(jī)(ALC-V8)，在整個觀察過程保持機(jī)械通氣。特殊設(shè)計的閉合器
(一根細(xì)的聚乙烯導(dǎo)管和一根粗的塑料管組成的套索)放置在雙側(cè)頸總動脈而不影響血流。 暴露股靜脈，插入并留置直徑為5mm的聚乙烯導(dǎo)管。切開腦部皮毛，用手提式顱鉆在前囟點 前開一3X3mm的顱窗。將37度的人工腦脊液連續(xù)滴加在顱窗上以保持大腦表面濕潤。用連 接于熒光攝像機(jī)(C7190, HAMAMATSU， J鄰an)的正立生物顯微鏡(DMLFS， LEICA， Germany), 用10倍物鏡選擇直徑在30-50 um， 200um長沒有明顯彎曲的細(xì)靜脈，在監(jiān)視器上基礎(chǔ)觀察
(J2118A， TCL， Huizhou, China) 10分后，閉索蒙古沙土鼠雙側(cè)頸動脈(缺血)，30分后解 除閉索(再灌注)。連續(xù)觀察并用連接于熒光攝像機(jī)刻錄機(jī)(DVR-R25， Malata, China)記錄 微循環(huán)動態(tài)60分鐘。
(2) 假手術(shù)組
即不閉索雙側(cè)頸動脈，其它操作同缺血再灌注組。
(3) 養(yǎng)血清腦顆粒給藥組
在缺血再灌注90分鐘前,用灌胃管，灌胃給予養(yǎng)血清腦顆粒水溶液0.4g/kg.bw，其它操 作同缺血再灌注組。
3、 測定方法
在基礎(chǔ)觀察前10分鐘，將50mg/kg. bw的FITC標(biāo)記的血漿白蛋白經(jīng)股靜脈緩慢推注。用波長488nm的氦氖激光束照射在開顱部位，用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)觀察并紀(jì)錄在缺血前，以及再 灌注開始、10分、30分、60分時同一視野內(nèi)細(xì)靜脈內(nèi)外FITC標(biāo)記熒光圖像。用圖像分析軟 件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc， USA)測定各個時間點細(xì)靜脈內(nèi)(Iv)和 血管外(Ii) FITC標(biāo)記白蛋白的螢光強(qiáng)度。以缺血再灌注前的細(xì)靜脈血管外的FITC螢光強(qiáng) 度(Ii)與細(xì)靜脈血管內(nèi)的FITC螢光強(qiáng)度(Iv)的比值為基礎(chǔ)值，用各時間Ii/Iv的比值與 基礎(chǔ)值的比表示FITC螢光強(qiáng)度的變化，以判定細(xì)靜脈內(nèi)白蛋白向血管外漏出的動態(tài)。
數(shù)據(jù)是每組6只沙鼠平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示。數(shù)據(jù)分析用單因素方差分析oneiay analisis of variance (ANOVA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設(shè)p〈0. 05為顯著性差異。 (二)結(jié)果
圖1是假手術(shù)組，缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒組蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白漏 出的圖像。在缺血再灌注前，假手術(shù)蒙古沙鼠，缺血再灌注蒙古沙鼠和養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再 灌注蒙古沙鼠均沒有觀察到FITC標(biāo)記白蛋白漏出細(xì)靜脈外。在再灌注60分時，假手術(shù)蒙古 沙鼠幾乎沒有觀察到腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。缺血再灌注蒙古沙鼠，可以觀察到 FITC標(biāo)記白蛋白的明顯漏出。養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注蒙古沙鼠，在再灌注后60分時，只 有少量FITC標(biāo)記白蛋白的漏出于細(xì)靜脈外?？梢婐B(yǎng)血清腦顆粒組有明顯抑制細(xì)靜脈血漿白蛋 白外漏的作用
試驗例二不同劑量的養(yǎng)血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈血漿白蛋白滲出影響
(一) 試驗方法
1、 材料同試驗例一
2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術(shù)組同試驗例一
(3) 養(yǎng)血清腦顆粒給藥組養(yǎng)血清腦顆粒0^g/kg+缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆0. 8g/kg + 缺血再灌注組在缺血再灌注90分鐘前，分別用灌胃管，灌胃給予養(yǎng)血清腦顆粒水溶液 0. 4g/kg. bw和0. 8g/kg. bw，其它操作同試驗例一。
3、 測定方法同試驗例一
(二) 結(jié)果
圖2表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.紐/kg+缺血再灌注組，養(yǎng)血清 腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白漏出的連續(xù)變化。假手術(shù)組在本觀察期間，腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的僅有少量的漏出。缺血再灌注 組從再灌注開始就可觀察到FITC標(biāo)記白蛋白的漏出，并持續(xù)增加。養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺 血再灌注組在再灌注60分顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。 養(yǎng)血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在再灌注30分以后顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細(xì)靜 脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。
試驗例三養(yǎng)血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響
(一) 試驗方法
1、 材料同試驗例一
2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術(shù)組同試驗例一
(3) 養(yǎng)血清腦顆粒給藥組同試驗例一
3、 投射電鏡標(biāo)本的制備
在再灌注60分鐘后，經(jīng)左心室以10ml/分鐘灌注生理鹽水將血管內(nèi)的血液沖洗干凈后， 以3ml/分鐘的速度灌注固定液，固定液成分為4%甲醛，2%戊二醛，0. 1M磷酸緩沖液。 灌注40分鐘后，然后迅速取下整個大腦，冠狀切面切成卜2mm厚組織片，然后轉(zhuǎn)移到3%戊 二醛固定液中4。C固定過夜，然后用0. 1M磷酸緩沖液沖洗三次，再用1%俄酸固定液41:固定 2小時。再用系列丙酮脫水，用Epon812樹脂包埋劑包埋，6CTC孵育48小時。然后進(jìn)行修 塊，切成60nm厚的組織片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，再用JEM-1230透射電鏡觀察(JEM 1230， JEOL, J印an) o
4、 掃描電鏡標(biāo)本制備
灌流后迅速取下整個大腦，切成大約幾個毫米寬的小方薄片。先用戊二醛固定2小時， 用O. 1M磷酸緩沖液沖洗，再用O. 1M磷酸緩沖液配置的0A固定2小時，用系列酒精脫水， 標(biāo)本移入醋酸戊酯。樣品放在干燥器樣品盒，用C02臨界點干燥法，使樣品干燥而不變形。用 導(dǎo)電膠將樣品粘在樣品托上，然后在離子鍍膜儀中鍍金3分鐘，以使樣品表面導(dǎo)電。最后在 掃描電鏡JSM-5600LV(JSM-5600LV, JE0L， Japan)下觀察。
(二) 結(jié)果
圖3是假手術(shù)組，缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙鼠再灌注60分后 的大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管的透射電鏡和掃描電鏡的圖象。圖a， b， c是透射電鏡圖像，假手術(shù)組a可以觀察到血管內(nèi)皮光滑，血管周圍組織的無水腫現(xiàn)象。缺血再灌注組b可以觀察到血管 周圍組織出現(xiàn)明顯水腫。養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組c可以觀察到血管周圍水腫明顯減輕。 圖d, e， f是掃描電鏡圖像，假手術(shù)組d蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部細(xì)靜脈血管內(nèi)皮光滑，內(nèi)皮細(xì)胞 間連接緊密。缺血再灌注組e蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部細(xì)靜脈血管內(nèi)皮可以觀察到血管內(nèi)細(xì)胞眾多 的隆起，內(nèi)皮細(xì)胞連接處，細(xì)胞間相互嵌合的指狀突起肥大，且內(nèi)皮表面出現(xiàn)許多突起的小 泡。養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組f蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部細(xì)靜脈血管內(nèi)皮較光滑，連接處指狀突 起和小泡明顯減少。


圖1養(yǎng)血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈血漿白蛋白滲出的影響
圖2不同劑量養(yǎng)血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈血漿白蛋白滲出的影響 圖3蒙古沙鼠再灌注60分后的大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管的透射電鏡和掃描電鏡的圖象。 其中圖l中所示Sham:假手術(shù)組，I/R:缺血再灌注組，CG+I/R:養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再
灌注組；圖2中CG0.4+I/R:養(yǎng)血清腦顆粒0.4g/kg+缺血再灌注組，CG0.8+I/R:養(yǎng)血清腦顆
粒0.8+缺血再灌注組。圖3中所示的圖a、 b、 c是投射電鏡圖象，圖d、 e、 f是掃描電鏡圖
象；CJ:細(xì)胞連接；V:小囊泡。
具體實施例
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，下述各實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本 發(fā)明的限制。
實施例一 藥物組合物制劑
(1)取當(dāng)歸67.5g，川芎67.5g，白芍54g，熟地54g，勾藤135g，雞血藤135g，夏枯草135g， 決明子135g，珍珠母135g，元胡67.5g，細(xì)辛14.5g;
(2)將上述藥材加水提取3次，每次l小時，合并提取液，適當(dāng)濃縮，加2倍量的乙醇，靜 置24小時沉淀，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.4，出膏率為10%，取清膏、蔗糖和糊 精按l: 3: 1的比例制成顆粒劑125袋。 實施例二藥物組合物制劑
(1)取當(dāng)歸80g，川萼80g，白芍80g,熟地80g，勾藤120g，雞血藤120g，夏枯草120g,決明子120g，珍珠母120g，元胡70g，細(xì)辛10g;
(2)將上述藥材加水提取3次，每次1小時，合并提取液，適當(dāng)濃縮，加2倍量的乙醇，靜 置24小時沉淀，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.3，出膏率為10%，取清膏、蔗糖和糊 精按l: 3: 1的比例制成片劑200片。
實施例三中藥組合物制劑
(1) 取當(dāng)歸40g，川芎40g，白芍20g，熟地20g，勾藤100g,雞血藤100g，夏枯草100g， 決明子100g，珍珠母100g，元胡70g，細(xì)辛10g;
(2) 將上述藥材加水提取3次，每次1小時，合并提取液，適當(dāng)濃縮，加2倍量的乙醇，靜 置24小時沉淀，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.3，出膏率為10%，取清膏、蔗糖和糊 精按l: 3: 1的比例制成膠囊100粒。
權(quán)利要求
1、一種藥物組合物在制備抑制白蛋白外漏藥物中的應(yīng)用，其中，所述的組合物是由以下重量百分比含量的原料藥制成當(dāng)歸4～9％川芎4～9％白芍2～8％熟地2～8％勾藤10～15雞血藤10～15％夏枯草10～15％決明子10～15％珍珠母10～15％元胡4～9％細(xì)辛0.5～2％。
2、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物組合物是由以下重量百分比含量的原 料藥制成當(dāng)歸6.75% 川芎6.75% 白芍5.4% 熟地5.4°/。 勾藤13.5% 雞血藤 13.5%夏枯草13.5% 決明子13.5% 珍珠母13.5% 元胡6.75% 細(xì)辛1.34%。
3、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述的白蛋白是指細(xì)靜脈內(nèi)白蛋白。
4、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抑制白蛋白外漏是指改善白蛋白外漏所導(dǎo) 致微循環(huán)障礙。
5、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抑制白蛋白外漏是指改善白蛋白外漏所導(dǎo) 致冠心病。
6、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抑制白蛋白外漏是指改善白蛋白外漏所導(dǎo)致腦微循環(huán)障礙。
7、 如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物組合物制成藥學(xué)上可以接受的制劑。
8、 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物組合物制成顆粒劑。
9、 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物組合物是按照下列方法制成按比例取藥材，加水提取3次，每次1小時，合并提取液，適當(dāng)濃縮，加2倍量的乙醇， 靜置，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.3 1.4，制成制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及藥物組合物在制備抑制白蛋白外漏藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對缺血再灌注引起沙鼠大腦皮層細(xì)靜脈內(nèi)FITC標(biāo)記白蛋白細(xì)靜脈外漏的動態(tài)、連續(xù)、可視化觀察，首次證明了藥物組合物預(yù)給藥可以抑制缺血再灌注后沙鼠大腦皮層細(xì)靜脈白蛋白血管的外漏，是理想的預(yù)防和治療白蛋白外漏所致的微循環(huán)障礙藥物。
文檔編號A61K36/185GK101428093SQ20071015007
公開日2009年5月13日 申請日期2007年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月6日
發(fā)明者徐想順, 韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司