抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑噭┰谥苽溆糜谝种颇[瘤細胞增殖的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬?(hypotaurine)生物合成的試劑在制備用于抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦膠質(zhì)瘤（glioma)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率約占顱內(nèi)腫 瘤的一半，其中膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma)大約占惡性膠質(zhì)瘤的60-70%。雖然膠質(zhì)瘤 相對較低的年發(fā)病率（〇. 05%。），但致死率極高[1]。惡性膠質(zhì)瘤的中位數(shù)生存期僅15個月 左右B^The Cancer Genome Atlas(TCGA)是國際間的協(xié)作組織，旨在通過大規(guī)模隊列研究 系統(tǒng)揭示腫瘤發(fā)生過程中基因組層面的改變。該組織進行的第一項研究就是針對GBMs的 基因拷貝數(shù)、表達程度和DNA甲基化異常 [3]。研究發(fā)現(xiàn)了一些涉及ERBB2，NF1和TP53等基 因和途徑的新的改變。Parsons等人對22例GBMs標本的20661個蛋白編碼基因進行了測 序分析，發(fā)現(xiàn)了許多基因存在變異，其中最為重要的是異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)的點突變， 這種突變可見于60%以上的II、III級膠質(zhì)瘤患者 [46]。
[0003] 最近，Xu等人[7]發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤IDH1突變可導(dǎo)致其不能正常催化異檸檬酸生成 α -酮戊二酸（2-KG)，而是大量生成α -羥基戊二酸（2-HG)，后者能與2-KG競爭結(jié)合脯 氨酸輕化酶PHD2。PHD2為α -酮戊二酸依賴的雙加氧酶（a -Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases，2-KDDs)家族成員之一，其正常生理作用的發(fā)揮需要2-KG、氧分子和鐵離子 的存在。有氧條件下PHD2可以羥基化缺氧誘導(dǎo)因子-1 a (HIF-1 α )特定位點的脯氨酸殘 基，羥基化后的HIF-la可通過泛素-蛋白酶體途徑被降解M。2-HG的競爭導(dǎo)致PHD2不 能有效使HIF-la被羥基化和降解，導(dǎo)致后者入核，促進多種與腫瘤細胞增殖有關(guān)基因的 表達，因而具有促使膠質(zhì)瘤發(fā)生的作用。不僅如此，2-HG還能競爭性抑制許多其他2-KDDs， 包括組蛋白去甲基化酶、TET家族的5-甲基胞嘧啶羥化酶等，導(dǎo)致細胞組蛋白呈現(xiàn)高甲基 化狀態(tài)和5-羥甲基胞嘧啶的減少等腫瘤細胞的典型表型特征。上述酶系已被證明在膠質(zhì) 瘤的發(fā)生中具有重要作用，NATURE期刊曾在一期雜志上頁碼連續(xù)地發(fā)表3篇文章闡述IDH1 突變及2-HG在腫瘤發(fā)生中的作用 [9 11]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是采用干預(yù)一種人體內(nèi)天然存在的化合物的細胞內(nèi)含量，達到干預(yù) 腫瘤細胞增殖的方法。
[0005] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及抑制內(nèi)源性代謝物一一亞?；撬?(hypotaurine)生物合成的試劑在制備用于抑制受試者中腫瘤細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
[0006] 其中所述抑制內(nèi)源性代謝物亞牛磺酸生物合成的試劑應(yīng)該包括所有能夠抑制內(nèi) 源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑噭?，例如抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制劑（例如，DL-高 半胱氨酸、D-半胱氨酸、天冬氨酸、鄰二氮雜菲、乙二胺四乙酸等）、抑制酶EC4. 1. 1.29的抑 制劑（例如，磺基丙氨酸、高半胱氨酸、L-半胱亞磺酸、L-天冬氨酸）、抑制酶EC1. 13. 11. 19 的抑制劑（例如，KCN、胱胺、鄰二氮雜菲、8-羥基喹啉等）等（www.brenda-enzymes. info)。
[0007] 優(yōu)選地，所述抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑噭┌?，但不限于，高半胱 氨酸或?；撬帷?br>[0008] 其中所述受試者為哺乳動物，例如，人、小鼠，優(yōu)選為人受試者。
[0009] 所述腫瘤細胞為膠質(zhì)瘤細胞，例如，腦膠質(zhì)瘤細胞。
[0010] 本發(fā)明還涉及通過干預(yù)競爭性抑制α -酮戊二酸依賴性雙加氧酶 (a -Ketoglutarate-dependent dioxygenases)的內(nèi)源性代謝物--亞牛橫酸 (hypotaurine)的生物合成來抑制腫瘤細胞生長的方法，所述方法包括：給受試者施用有 效量的能夠抑制內(nèi)源性代謝物亞牛磺酸生物合成的試劑。
[0011] 其中所述能夠抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑噭┛梢赃x自，但不限于， 高半胱氨酸或?；撬?。
[0012] 其中所述腫瘤細胞為膠質(zhì)瘤細胞，例如，腦膠質(zhì)瘤細胞。
[0013] 本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了通過干預(yù)"競爭性抑制α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶 (a -Ketoglutarate-dependent dioxygenases)的內(nèi)源性代謝物--亞?；撬?生物合成 能夠抑制腫瘤細胞生長，并在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。內(nèi)源性亞牛磺酸生物合成途徑也成 為治療腫瘤的靶標，通過抑制內(nèi)源性亞牛磺酸的生物合成能夠抑制腫瘤細胞的增殖，起到 治療腫瘤的效果。并且，內(nèi)源性亞?；撬嵘锖铣赏緩揭部梢宰鳛楹Y選新型腫瘤治療藥物 的靶標。
[0014] 綜上所述，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案：
[0015] 1.抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑噭┰谥苽溆糜谝种剖茉囌吣[瘤細胞 增殖的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 2.根據(jù)第1項所述的應(yīng)用，其中所述抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑噭?為抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制劑、抑制酶EC4. 1. 1. 29的抑制劑或抑制酶EC1. 13. 11. 19的 抑制劑。
[0017] 3.根據(jù)第2項所述的應(yīng)用，其中所述抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制劑選自DL-高半 胱氨酸、D-半胱氨酸、天冬氨酸、鄰二氮雜菲或乙二胺四乙酸。
[0018] 4.根據(jù)第2項所述的應(yīng)用，其中所述抑制酶EC4. 1. 1. 29的抑制劑選自磺基丙氨 酸、高半胱氨酸、L-半胱亞磺酸或L-天冬氨酸。 _9] 5.根據(jù)第2項所述的應(yīng)用，其中所述抑制酶EC1. 13. 11. 19的抑制劑選自KCN、胱 胺、鄰二氮雜菲或8-羥基喹啉。
[0020] 6.根據(jù)第1項所述的應(yīng)用，其中所述抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑噭?選自高半胱氨酸或牛磺酸。
[0021] 7.根據(jù)第1項所述的應(yīng)用，其中所述受試者為哺乳動物。
[0022] 8.根據(jù)第7項所述的應(yīng)用，其中所述受試者為人或小鼠。
[0023] 9.根據(jù)第1項所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤細胞為膠質(zhì)瘤細胞。
[0024] 10.根據(jù)第9項所述的應(yīng)用，其中所述膠質(zhì)瘤細胞為腦膠質(zhì)瘤細胞。
[0025] 11. -種抑制哺乳動物受試者中腫瘤細胞生長的方法，所述方法包括給所述受試 者施用有效量的能夠抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑噭?br>[0026] 12.根據(jù)第11項所述的方法，其中所述抑制內(nèi)源性代謝物亞?；撬嵘锖铣傻脑?劑為抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制劑、抑制酶EC4. 1. 1. 29的抑制劑或抑制酶EC1. 13. 11. 19 的抑制劑。
[0027] 13.根據(jù)第12項所述的方法，其中所述抑制酶EC1. 13. 11. 20的抑制劑選自DL-高 半胱氨酸、D-半胱氨酸、天冬氨酸、鄰二氮雜菲或乙二胺四乙酸。
[0028] 14.根據(jù)第12項所述的方法，其中所述抑制酶EC4. 1. 1. 29的抑制劑選自磺基丙氨 酸、高半胱氨酸、L-半胱亞磺酸或L-天冬氨酸。
[0029] 15.根據(jù)第12項所述的方法，其中所述抑制酶EC1. 13. 11. 19的抑制劑選自KCN、 胱胺、鄰二氮雜菲或8-羥基喹啉。
[0030] 16.根據(jù)第1項所述的方法，其中所述抑制內(nèi)源性代謝物亞牛磺酸生物合成的試 劑選自高半胱氨酸或?；撬帷?br>[0031] 17.根據(jù)第11項所述的方法，其中所述哺乳動物受試者為人或小鼠。
[0032] 18.根據(jù)第11項所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤細胞為膠質(zhì)瘤細胞。
[0033] 19.根據(jù)第18項所述的應(yīng)用，其中所述膠質(zhì)瘤細胞為腦膠質(zhì)瘤細胞。
【附圖說明】
[0034] 從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中：
[0035] 圖1顯示細胞內(nèi)亞?；撬岷铣赏緩绞疽鈭D（斜體字代表相應(yīng)酶抑制劑）。HCA : homocysteic acid(高半脫氨酸）。
[0036] 圖2顯示在培養(yǎng)基中添加不同濃度高半胱氨酸對U251生長的抑制作用。實驗數(shù) 據(jù)表明，培養(yǎng)基中添加不同濃度高半胱氨酸對U251生長的抑制源于降低細胞內(nèi)亞牛磺酸 含量（均值土s.d.，n = 8,下同）。細胞量（cell mass)以WST-1染色后0D45。表示。細胞 內(nèi)亞?；撬幔╤ypotaurine)和牛磺酸（taurine)濃度以μg/ml/(g細胞干重）表示。
[0037] 圖3顯示在培養(yǎng)基中添加不同濃度的半胱胺（cysteamine)對U251的增殖促進作 用。實驗數(shù)據(jù)表明，半胱胺對U251的增殖促進作用也源于升高細胞內(nèi)亞?；撬岷俊?br>[0038] 圖4顯示在培養(yǎng)基外加?；撬岷骍251細胞的細胞量（以WST-1染色后0D45。表 示）、細胞內(nèi)亞?；撬岷团；撬岬臐舛龋ㄒ詙g/mV(g細胞干重）表示）。實驗數(shù)據(jù)表明， 在培養(yǎng)基中外加?；撬峥山档图毎麅?nèi)亞牛磺酸量，抑制U251增殖。說明外源?；撬岬臄z入 可抑制內(nèi)源牛磺酸經(jīng)由亞?；撬岷铣?，表現(xiàn)為反饋抑制。
[0039] 圖5顯示將各種化合物添加到U251細胞培養(yǎng)基后細胞蛋白提取物的Western Blot結(jié)果。實驗數(shù)據(jù)表明，細胞內(nèi)高濃度亞?；撬岷繉μ岣遀251細胞內(nèi)HIF-la的含量 有促進作用。試驗中牛磺酸、HCA和半胱胺培養(yǎng)基中添加量分別為45 μ M，250 μ Μ和200 μ M。
[0040] 圖6顯示分子模擬預(yù)測顯示亞?；撬?，2-KG與2-HG與PHD2能競爭結(jié)合同一位點。
[0041] 圖7顯示U251免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果。細胞分別給予生理鹽水（A)，半胱胺（B)， HCA(C)和?；撬幔―)刺激，應(yīng)用濃度與圖5的實驗濃度相同?？梢娚呒毎麅?nèi)亞牛磺酸量 使細胞內(nèi)HIF-la量增加（圖7B)，而且HIF-la有向核內(nèi)分布傾向。降低細胞內(nèi)亞?；撬?含量使HIF-1 a量減少，而且傾向于胞漿內(nèi)分布（圖7C，D)。
[0042] 圖8顯示荷瘤（U251)裸鼠腫瘤大小變化。Control表示生理鹽水飲水對照組 (-*-)，taurine為1%?；撬犸嬎M s A圖顯示雄性荷瘤（U251)裸鼠腫瘤大小變化， B圖顯示雄性荷瘤（U251)裸鼠腫瘤大小變化。
【具體實施方式】
[0043] 下面參照具體的實施例進一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā) 明并不限于這些具體的實施例。
[0044] 實施例1.高半胱氨酸抑制細胞內(nèi)亞?；撬岬纳锖铣桑M而抑制腫瘤細胞增殖
[0045] 人體內(nèi)亞?；撬岬暮铣赏緩揭妶D1。
[0046] 利用U251細胞系（購自凱基生物，目錄號為KG050,為人源膠質(zhì)瘤細胞）在含10% FBS (購自杭州四季青和哈爾濱賽拓公司）的DMEM高糖培養(yǎng)基（購自HYCL0NE公司）中， 37°C，5%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加250-500 μΜ的高半胱氨酸（HCA)(購自上海 SIGMA)。HCA能夠抑制細胞內(nèi)亞牛磺酸的合成。24小時后，利用WST-1 (北京ROCHE)染色 法檢測細胞量即可發(fā)現(xiàn)，細胞的增殖受到抑制（圖2)。該種增殖抑制伴隨著細胞內(nèi)亞牛磺 酸量的減少。
[0047] 圖2中可見隨著培養(yǎng)基中的HCA添加量不斷增加，細胞增殖的數(shù)量在不斷減少，具 有統(tǒng)計學(xué)差異。這種細胞數(shù)目的變化與細胞內(nèi)亞?；撬岬暮砍室恢滦缘淖兓厔?，具有 統(tǒng)計學(xué)差異。其中HCA加入量在0-250 μ Μ之間時，由于其抑制了細胞內(nèi)亞牛磺酸合成，因 此也導(dǎo)致沒有足夠的亞?；撬峥晒┖铣膳；撬幔虼伺；撬釢舛纫搽S之降低。但是當加入 HCA到500 μ Μ時，這種影響與加入250 μ Μ幾乎相當。這說明細胞內(nèi)牛磺酸濃度不僅受亞牛 磺酸濃度影響，可能還有其他諸如分泌機制等