] 更換脫鈣液后，連續(xù)5天測(cè)定脫鈣液pH值，與初始脫鈣液的pH值差距低于0.5，則為 脫鈣完全，脫鈣完全后用蒸餾水沖洗過(guò)夜，用pH計(jì)檢測(cè)沖洗水pH值為7后停止沖洗，再將骨 片用雙氧水沖洗，再用蒸餾水沖洗，沖洗后去除骨組織表面的雜質(zhì)保留骨片備用；
[0046] 先用夾具將柔軟的脫鈣骨片加緊使其平整，然后連夾具一起放入-80冰箱中凍存 72小時(shí)，從冰箱中拿出冷凍好的骨片立刻進(jìn)行低溫負(fù)壓冷凍干燥；
[0047] a)打開(kāi)低溫負(fù)壓冷凍干燥機(jī)，冷凍溫度-30 °C時(shí)，打開(kāi)真空栗；
[0048] b)當(dāng)真空度低于10Pa時(shí)，將凍結(jié)的骨片放入干燥容器內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥72h;
[0049] c)冷凍干燥完畢后，關(guān)閉冷凍干燥儀，取出樣品；
[0050] 冷凍干燥后的脫礦皮質(zhì)骨片應(yīng)平整且硬度可達(dá)到數(shù)控機(jī)床加工的要求，將骨片置 于粗加工機(jī)床內(nèi)進(jìn)行修整磨平，隨后使用高精度數(shù)控機(jī)床將修整后的骨片加工成脫礦皮質(zhì) 骨半月板支架。
[0051] 將支架掃描電鏡觀察，脫鈣骨放大后呈現(xiàn)網(wǎng)格狀的膠原網(wǎng)絡(luò)，表面結(jié)構(gòu)凹凸不平， 皮質(zhì)骨表面有5_50μπι孔徑，使用納米壓痕儀器測(cè)定支架的強(qiáng)度和彈性模量結(jié)果分別為： 2.516Gpa和0.0942Gpa，脫礦皮質(zhì)骨圍觀結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1和圖2。
[0052] 實(shí)施例2
[0053] 選取動(dòng)物的股骨或者脛骨，去除肌肉、骨膜和骨髓，得到股骨干中段和脛骨平臺(tái)下 方無(wú)松質(zhì)骨的管狀長(zhǎng)骨部分，僅保留股骨干中段和脛骨平臺(tái)下方無(wú)松質(zhì)骨的管狀長(zhǎng)骨部 分，用骨分割機(jī)將骨管切割成骨片，選取較平整骨片作為制備組織工程半月板的材料； [0054]用1.5mol/L的緩沖鹽酸脫鈣液進(jìn)行脫鈣，用pH計(jì)檢測(cè)脫鈣液pH值大于1.5更換脫 鈣液，脫鈣時(shí)間為90天，每天用搖床攪動(dòng)骨片及脫鈣液，使骨片與脫鈣液接觸完全；
[0055] 更換脫鈣液后，連續(xù)5天測(cè)定脫鈣液pH值，與初始脫鈣液的pH值差距低于0.5，則為 脫鈣完全，脫鈣完全后用蒸餾水沖洗過(guò)夜，用pH計(jì)檢測(cè)沖洗水pH值為7后停止沖洗，再將骨 片用雙氧水沖洗，再用蒸餾水沖洗，沖洗后去除骨組織表面的雜質(zhì)保留骨片備用；
[0056] 先用夾具將柔軟的脫鈣骨片加緊使其平整，然后連夾具一起放入-80冰箱中凍存 72小時(shí)，從冰箱中拿出冷凍好的骨片立刻進(jìn)行低溫負(fù)壓冷凍干燥；
[0057] a)打開(kāi)低溫負(fù)壓冷凍干燥機(jī)，冷凍溫度-30 °C時(shí)，打開(kāi)真空栗；
[0058] b)當(dāng)真空度低于10Pa時(shí)，將凍結(jié)的骨片放入干燥容器內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥72h;
[0059] c)冷凍干燥完畢后，關(guān)閉冷凍干燥儀，取出樣品；
[0060] 冷凍干燥后的脫礦皮質(zhì)骨片應(yīng)平整且硬度可達(dá)到數(shù)控機(jī)床加工的要求，將骨片置 于粗加工機(jī)床內(nèi)進(jìn)行修整磨平，隨后使用高精度數(shù)控機(jī)床將修整后的骨片加工成脫礦皮質(zhì) 骨半月板支架。
[0061] 將支架掃描電鏡觀察，脫鈣骨放大后呈現(xiàn)網(wǎng)格狀的膠原網(wǎng)絡(luò)，表面結(jié)構(gòu)凹凸不平， 皮質(zhì)骨表面有5_50μπι孔徑，使用納米壓痕儀器測(cè)定支架的強(qiáng)度和彈性模量結(jié)果分別為： 2.677Gpa和0.0899Gpa。
[0062] 實(shí)施例3 [0063]膨脹率測(cè)定
[0064] 1)對(duì)實(shí)施例1和2的支架進(jìn)行冷凍干燥處理
[0065] 2)對(duì)干燥完全的支架進(jìn)行微量稱重，記錄為W0
[0066] 3)浸入PBS(pH=7.4)溶液內(nèi)，37°C進(jìn)行孵育
[0067] 4)在5分鐘、10分鐘、30分鐘、1、4、12、24、48小時(shí)后取出支架，
[0068] 5)用濾紙清除表面粘帶的液體，進(jìn)行微量稱重。記錄為Wt
[0069] 6)計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)支架的平衡膨脹率ESR(Equilibrium swelling ratio): Γ ? Wt - Ψ0 0070] ESR =- ro
[0071 ]實(shí)施例1的水合支架在8.9分鐘達(dá)到飽和，實(shí)施例2的水合支架在9.1分鐘達(dá)到飽 和。實(shí)施例1和2都能快速的達(dá)到膨脹的結(jié)束點(diǎn)，滿足移植手術(shù)的需要。
[0072] 實(shí)施例4
[0073] 在進(jìn)行移植手術(shù)前，將實(shí)施例1所制備的脫礦皮質(zhì)骨支架浸泡于BMP-4的PBS溶液， 所述BMP-4的PBS溶液是由2ugBMP-4蛋白加入500ml無(wú)菌PBS溶液制成，浸泡超過(guò)30分鐘。
[0074] 使用納米壓痕生物力學(xué)測(cè)試儀儀器，測(cè)定所述水和后的脫礦皮質(zhì)骨支架的硬度和 彈性模量分別為:彈性模量〇. 〇〇5039GPa強(qiáng)度0.000339Gpa。
[0075] 實(shí)施例5
[0076] 在進(jìn)行移植手術(shù)前，將實(shí)施例2所制備的脫礦皮質(zhì)骨支架浸泡于BMP-4的PBS溶液， 所述BMP-4的PBS溶液是由2ug BMP-4蛋白加入500ml無(wú)菌PBS溶液制成，浸泡超過(guò)30分鐘。
[0077] 使用納米壓痕生物力學(xué)測(cè)試儀儀器，測(cè)定所述水和后的脫礦皮質(zhì)骨支架的硬度和 彈性模量分別為:彈性模量〇. 〇〇5005GPa強(qiáng)度0.000376Gpa。
[0078] 實(shí)施例6
[0079] 將實(shí)施例3中的水合型的支架上，將制備好的5 X106的lml滑膜干細(xì)胞混懸液和 1.5 X 107的lml半月板細(xì)胞混懸液均勻鋪于脫礦皮質(zhì)骨支架上，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于37 °C 的C02培養(yǎng)箱中48小時(shí)。術(shù)前取出使用將所述水合支架移植如半月板受損的豬的體內(nèi)，術(shù)后 不固定膝關(guān)節(jié)，動(dòng)物籠內(nèi)飼養(yǎng)，可在籠內(nèi)自由活動(dòng)。術(shù)后連續(xù)3天分別給予青霉素160萬(wàn)單位 肌肉注射。
[0080] 術(shù)后6個(gè)月，半月板的細(xì)胞已完全長(zhǎng)入，組織特點(diǎn)及細(xì)胞表型接近于正常半月板， 細(xì)胞表型為纖維軟骨細(xì)胞。組織工程半月板組的彈性模量隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)有向正常半月 板接近的趨勢(shì)。
[0081 ] 實(shí)施例7
[0082]將實(shí)施例4中的水合型的支架上，將制備好的5 X106的lml滑膜干細(xì)胞混懸液和 1.5 X 107的lml半月板細(xì)胞混懸液均勻鋪于脫礦皮質(zhì)骨支架上，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于37 °C 的C02培養(yǎng)箱中48小時(shí)。術(shù)前取出使用。術(shù)前取出使用將所述水合支架移植如半月板受損的 豬的體內(nèi)，術(shù)后不固定膝關(guān)節(jié)，動(dòng)物籠內(nèi)飼養(yǎng)，可在籠內(nèi)自由活動(dòng)。術(shù)后連續(xù)3天分別給予青 霉素160萬(wàn)單位肌肉注射。
[0083]術(shù)后6個(gè)月，半月板的細(xì)胞已完全長(zhǎng)入，組織特點(diǎn)及細(xì)胞表型接近于正常半月板， 細(xì)胞表型為纖維軟骨細(xì)胞。組織工程半月板組的彈性模量隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)有向正常半月 板接近的趨勢(shì)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種半月板支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 選取動(dòng)物的股骨或者脛骨，去除肌肉、骨膜和骨髓，得到股骨干中段和脛骨平臺(tái)下方 無(wú)松質(zhì)骨的管狀長(zhǎng)骨部分，僅保留股骨干中段和脛骨平臺(tái)下方無(wú)松質(zhì)骨的管狀長(zhǎng)骨部分， 用骨分割機(jī)將骨管切割成骨片，選取較平整骨片作為制備組織工程半月板的材料； 2) 用0.5-1.5mol/L的緩沖鹽酸脫鈣液進(jìn)行脫鈣，用pH計(jì)檢測(cè)脫鈣液pH值大于1.5更換 脫鈣液，脫鈣時(shí)間為80-100天，每天用搖床攪動(dòng)骨片及脫鈣液，使骨片與脫鈣液接觸完全； 3) 脫鈣完全后，脫鈣完全后用蒸餾水沖洗過(guò)夜，用pH計(jì)檢測(cè)沖洗水pH值為中性后停止 沖洗，再將骨片用雙氧水沖洗，再用蒸餾水沖洗，沖洗后去除骨組織表面的雜質(zhì)保留骨片備 用； 4) 先用夾具將柔軟的脫鈣骨片加緊使其平整，然后連夾具一起放入低溫冰箱中凍存 60-80小時(shí)，從冰箱中拿出冷凍好的骨片立刻進(jìn)行低溫負(fù)壓冷凍干燥； 5) 冷凍干燥后的脫礦皮質(zhì)骨片應(yīng)平整且硬度可達(dá)到數(shù)控機(jī)床加工的要求，將骨片置于 粗加工機(jī)床內(nèi)進(jìn)行修整磨平，隨后使用高精度數(shù)控機(jī)床將修整后的骨片加工成脫礦皮質(zhì)骨 半月板支架，并測(cè)定支架的微觀孔隙，膨脹標(biāo)準(zhǔn)，以及使用納米壓痕儀器測(cè)定支架的納米壓 痕強(qiáng)度和彈性模量，所述納米壓痕強(qiáng)度和彈性模量應(yīng)符合正常動(dòng)物或人半月板生物力學(xué)要 求。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述動(dòng)物為牛。3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中緩沖鹽酸脫鈣液為lmol/L的 RapidCal. Immuno脫|丐液，脫|丐時(shí)間為90天。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述的脫鈣完全的標(biāo)準(zhǔn)為，更換 脫鈣液后，連續(xù)5天測(cè)定脫鈣液pH值，與初始脫鈣液的pH值差距低于0.5。5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述低溫冰箱為-80°C冰箱，凍存 72小時(shí)。6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述的低溫負(fù)壓冷凍干燥包括以 下步驟： a) 打開(kāi)低溫負(fù)壓冷凍干燥機(jī)，冷凍溫度_30°C時(shí)，打開(kāi)真空栗； b) 當(dāng)真空度低于10Pa時(shí)，將凍結(jié)的骨片放入干燥容器內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥72h; c) 冷凍干燥完畢后，關(guān)閉冷凍干燥儀，取出樣品。7. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5)所述的微觀孔隙為5-50μπι，膨脹 標(biāo)準(zhǔn)為在8-12分鐘膨脹達(dá)到飽和。8. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，還包括： 步驟6)所述步驟5)中脫礦皮質(zhì)骨半月板支架的水合過(guò)程，水合過(guò)程為脫礦皮質(zhì)骨半月 板支架浸泡于水或者溶液中膨脹的過(guò)程，得到水合型脫礦皮質(zhì)骨半月板支架。9. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述溶液為ΒΜΡ-4的roS溶液，所述ΒΜΡ-4 為骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4，PBS為磷酸緩沖溶液。10. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，還包括： 步驟7)所述步驟6)中的水合型脫礦皮質(zhì)骨半月板支架與促進(jìn)軟骨分化細(xì)胞體系共培 養(yǎng)，所述支架和細(xì)胞體系共同組成半月板移植物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種半月板支架的制備方法，由動(dòng)物的脫礦皮質(zhì)骨制備而成，制備步驟包括動(dòng)物股骨或者脛骨的預(yù)處理、切片、脫鈣、固定冷凍干燥，修整骨片；該半月板支架還包括BMP?4水合溶液水合步驟，水合后的半月板支架可應(yīng)用在組織工程半月板移植的過(guò)程中，該方法具有選材易得，方法步驟少，制備成功率高的優(yōu)點(diǎn)，且有利于半月板移植過(guò)程中，半月板細(xì)胞長(zhǎng)入該支架的骨質(zhì)孔隙中，提高移植的成功率，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】A61L27/50, A61F2/38, A61L27/56, A61L27/36
【公開(kāi)號(hào)】CN105709277
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610185898
【發(fā)明人】敖英芳, 謝興, 朱敬先, 胡曉青
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)第三醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年6月29日
【申請(qǐng)日】2016年3月29日