一種半月板支架的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設計一種半月板支架的制備方法，屬于生物材料和組織工程領域。
【背景技術】
[0002] 動物或人的半月板損失常常導致各種嚴重的疼痛甚至無法行動。而臨床上常用方 式是采用半月板移植進行治療。
[0003]組織工程半月板指利用天然或人工合成的有機或無機材料制作為支架，加入種子 細胞通過一定條件復合培育而成的一種特殊半月板組織。
[0004] 半月板支架作為組織工程半月板三要素中最基本也是最重要的部分是組織工程 半月板能否獲得成功的關鍵。一種好的支架材料應當包括以下幾條重要特性:與受體的相 容性，可降解性，并且降解的時間要與細胞長入的進度相匹配，允許細胞長入的孔隙，足夠 的初始強度等。支架主要分為兩大類，自然來源和人工合成，人工合成的半月板雖然有來源 容易易于加工等優(yōu)勢，但大多數(shù)人工合成材料降解時間、孔隙率以及降解產物等條件都不 適合作為組織工程半月板的支架。
[0005] 在天然材料中，現(xiàn)有技術很多選用牛的松質骨進行半月板支架的制作，發(fā)明人在 試驗中發(fā)現(xiàn)，此類材料加工后脆性增加，無法達到植入時的初始強度，而皮質骨進行脫礦加 工后具備了與半月板相近的生物力學特性。但目前國內外尚未有人使用脫礦皮質骨進行半 月板支架移植研究，且脫礦皮質骨加工困難，脫礦后質地變軟無法準確加工，因此制備具有 固定形狀的脫礦皮質骨半月板支架，且具有一定硬度，是目前的技術難題。
[0006] 作為半月板支架，在組織工程半月板應用中，需要具有足夠的孔隙，超過長入細胞 的直徑，適合細胞長入，因此這也是對于脫礦皮質骨的孔隙提出要求。
[0007] 而且脫水的脫礦皮質骨的硬度常常達不到所被移植的動物的半月板的硬度，因此 需要對脫水的脫礦皮質骨進行水合作用，使其吸水膨脹從而達到接近被移植動物半月板的 強度。因此選用何種溶液對其進行水合也是目前繼續(xù)解決的技術難題。
[0008] 對于半月板組織來說經典的生物力學實驗無法準確描述半月板的生物力學特性， 有文獻報道半月板的不同位置其生物力學特性是不同的，這可能與半月板內部纖維走形差 異導致。在本實驗室早前對半月板組織的經典生物力學拉斷往復加壓的檢測中發(fā)現(xiàn)，因半 月板組織較小導致無法直接連接于經典的生物力學測試機，雖然為測量半月板的生物力學 數(shù)據(jù)專門設計制造了夾具，但測量數(shù)據(jù)的重復性及穩(wěn)定性較差，因此選用合適的測試機器 和測試參數(shù)，通過涉及合適的制備方法控制，獲得復合正常生物力學要求的支架，是目前行 業(yè)內要解決的難題。

【發(fā)明內容】

[0009] 為了提供一種脫礦皮質骨半月板支架，既具有固定的形狀和合適的空隙，又可以 通過水合作用達到所需的移植強度。
[0010] 本發(fā)明提供了一種半月板支架的制備方法，包括以下步驟：
[0011] 1)選取動物的股骨或者脛骨，去除肌肉、骨膜和骨髓，得到股骨干中段和脛骨平臺 下方無松質骨的管狀長骨部分，僅保留股骨干中段和脛骨平臺下方無松質骨的管狀長骨部 分，用骨分割機將骨管切割成骨片，選取較平整骨片作為制備組織工程半月板的材料；
[0012] 2)用0.5-1.5mol/L的緩沖鹽酸脫鈣液進行脫鈣，用pH計檢測脫鈣液pH值大于1.5 更換脫鈣液，脫鈣時間為80-100天，每天用搖床攪動骨片及脫鈣液，使骨片與脫鈣液接觸完 全；
[0013] 3)脫鈣完全后，脫鈣完全后用蒸餾水沖洗過夜，用pH計檢測沖洗水pH值為中性后 停止沖洗，再將骨片用雙氧水沖洗，再用蒸餾水沖洗，沖洗后去除骨組織表面的雜質保留骨 片備用；
[0014] 4)先用夾具將柔軟的脫鈣骨片加緊使其平整，然后連夾具一起放入低溫冰箱中凍 存60-80小時，從冰箱中拿出冷凍好的骨片立刻進行低溫負壓冷凍干燥；
[0015] 5)冷凍干燥后的脫礦皮質骨片應平整且硬度可達到數(shù)控機床加工的要求，將骨片 置于粗加工機床內進行修整磨平，隨后使用高精度數(shù)控機床將修整后的骨片加工成脫礦皮 質骨半月板支架，并測定支架的微觀孔隙，膨脹標準，以及使用納米壓痕儀器測定支架的納 米壓痕硬度及折合模量，所述納米壓痕強度和彈性模量應符合正常動物或人半月板生物力 學要求。
[0016]強度:力學上，材料在外力作用下抵抗破壞(永久變形和斷裂)的能力稱為強度。強 度是機械零部件首先應滿足的基本要求。
[0017] 彈性模量:一般地講，對彈性體施加一個外界作用，彈性體會發(fā)生形狀的改變(稱 為"應變""彈性模量"的一般定義是:應力除以應變。
[0018] 材料在彈性變形階段，其應力和應變成正比例關系（即符合胡克定律），其比例系 數(shù)稱為彈性模量。彈性模量的單位是達因每平方厘米。"彈性模量"是描述物質彈性的一個 物理量，是一個統(tǒng)稱，表示方法可以是"楊氏模量"、"體積模量"等。
[0019] 由于半月板組織較小導致無法直接連接于經典的生物力學測試機，雖然為測量半 月板的生物力學數(shù)據(jù)專門設計制造了夾具，但測量數(shù)據(jù)的重復性及穩(wěn)定性較差，
[0020] 故在對脫礦皮質骨的生物力學檢測中我們選擇使用了納米壓痕生物力學檢測的 方法。此種方法對組織塊要求較低，且測量簡便重復性和數(shù)據(jù)穩(wěn)定好。
[0021 ]其中，所述的動物優(yōu)選牛。
[0022]異種異體脫鈣骨移植物經過脫鈣和嚴格的消毒后可能出現(xiàn)的免疫排斥及傳染病 等風險極大下降，而且已用于臨床。本發(fā)明使用的牛皮質骨經脫脂、脫細胞、脫鈣以及深低 溫冷凍后可用于異種異體移植。
[0023]我們選擇了脫礦皮質骨作為制作支架的原材料，因為豬半月板厚度問題，豬自身 的皮質骨無法達到材料加工所需的厚度，所以最后選擇了牛皮質骨作為加工組織工程半月 板的原材料。
[0024] 本發(fā)明還提供了 一種制備方法，所述的步驟2)中緩沖鹽酸脫鈣液為lmol/L RapidCal. Immuno脫|丐液，脫|丐時間為90天。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種制備方法，所述的步驟3)所述的脫鈣完全的標準為，更換脫 鈣液后，連續(xù)5天測定脫鈣液pH值，與初始脫鈣液的pH值差距低于0.5。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種制備方法，所述的步驟4)所述低溫冰箱為_80°C冰箱，凍存72 小時。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種制備方法，所述的步驟4)所述的低溫負壓冷凍干燥包括以下 步驟：
[0028] a)打開低溫負壓冷凍干燥機，冷凍溫度-30 °C時，打開真空栗；
[0029] b)當真空度低于10Pa時，將凍結的骨片放入干燥容器內進行冷凍干燥72h;
[0030] c)冷凍干燥完畢后，關閉冷凍干燥儀，取出樣品；
[0031] 本發(fā)明還提供了一種制備方法，所述的步驟5)所述的微觀孔隙為5_50μπι，膨脹標 準為在10分鐘內膨脹達到飽和。
[0032] 支架在進行手術之前需要進行水合，為防止植入物洗水后體積改變過大或有持續(xù) 膨脹趨勢，進行植入物膨脹率檢測。結果顯示在37°C的環(huán)境內，脫礦皮質骨迅速吸收水分， 出現(xiàn)一定的體積膨脹，但在10分鐘后達到飽和，不具有逐漸吸水膨脹的特性，適合進行植 入。
[0033] 發(fā)明人通過一系列的體外實驗來檢查脫礦皮質骨作為組織工程半月板支架的可 行性?？紫堵适潜ＷC種子細胞有足夠空間長入的必然條件，通過對脫礦皮質骨的掃描電鏡 觀測發(fā)現(xiàn)，同種異體脫礦皮質骨有大量的孔洞直徑為5_50um，超過各種半月板相關細胞的 直徑。其孔洞相通可以自由通過小分子蛋白等物質，利于物質交換。
[0034] 因此本發(fā)明還提供了一種方法，還包括步驟6)所述步驟5)中脫礦皮質骨半月板支 架的水合過程，水合過程為脫礦皮質骨半月板支架浸泡于水或者溶液中膨脹的過程，得到 水合型脫礦皮質骨半月板支架。其中溶液優(yōu)選BMP-4的PBS溶液，所述BMP-4為骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-4，PBS為磷酸緩沖溶液。
[0035] 而骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)是TGF-β家族的成員，最初被發(fā)現(xiàn)是由于其具有體內異位 誘導新骨形成作用。眾所周知，BMP家族所有成員均具有誘導成骨的作用而在誘導成軟骨方 面則僅有BMP-2、BMP-4、BMP-7有比較突出的表現(xiàn)。BMP-2和BMP-4具有相同的分子構成，在大 多數(shù)理化條件下BMP-4比BMP-2更穩(wěn)定。
[0036] PBS溶液可以是脫水的脫礦皮質骨半月板支架膨脹到所需的硬度，而BMP-4,可以 促進軟骨生長，有利于該支架移植到動物體內后，能夠有效促進半月板細胞的分化，從而提 高移植的成功率。
[0037]對于半月板組織來說經典的生物力學實驗無法準確描述半月板的生物力學特性， 有文獻報道半月板的不同位置其生物力學特性是不同的，這可能與半月板內部纖維走形差 異導致。在本實驗室早前對半月板組織的經典生物力學拉斷往復加壓的檢測中發(fā)現(xiàn)，因半 月板組織較小導致無法直接連接于經典的生物力學測試機，雖然為測量半月板的生物力學 數(shù)據(jù)專門設計制造了夾具，但測量數(shù)據(jù)的重復性及穩(wěn)定性較差，故在對脫礦皮質骨的生物 力學檢測中我們選擇使用了納米壓痕生物力學檢測的方法。此種方法對組織塊要求較低， 且測量簡便重復性和數(shù)據(jù)穩(wěn)定好。
[0038]本發(fā)明還提供了一種制備方法，還包括7)所述步驟6)中的水合型脫礦皮質骨半月 板支架與促進軟骨分化細胞體系共培養(yǎng)，所述支架和細胞體系共同組成半月板移植物。
【附圖說明】
[0039]圖1:脫礦皮質骨掃描電鏡圖（200Χ100μπ〇;
[0040] 圖2:脫礦皮質骨掃描電鏡圖（5000 X 5μπι);
【具體實施方式】
[0041] 以下優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過下述優(yōu)選實施 例已經對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上 對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍
[0042] 實施例1
[0043] 選取動物的股骨或者脛骨，去除肌肉、骨膜和骨髓，得到股骨干中段和脛骨平臺下 方無松質骨的管狀長骨部分，僅保留股骨干中段和脛骨平臺下方無松質骨的管狀長骨部 分，用骨分割機將骨管切割成骨片，選取較平整骨片作為制備組織工程半月板的材料； [0044]用lmol/L的緩沖鹽酸脫鈣液進行脫鈣，用pH計檢測脫鈣液pH值大于1.5更換脫鈣 液，脫鈣時間為90天，每天用搖床攪動骨片及脫鈣液，使骨片與脫鈣液接觸完全；
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