一種竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法及其在光動力療法中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于具有光動力活性的光敏劑技術領域，涉及一種通過金屬鍵螯合偶聯(lián)竹紅菌甲素光敏劑與靶向分子的方法，以及通過該方法制備得到的竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系在光動力療法中的應用。
【背景技術】
[0002]光動力療法(photodynamic therapy，簡稱PDT)是近年來發(fā)展起來的一種新型腫瘤臨床療法，因其抗瘤譜廣、無嚴重副反應、微創(chuàng)以及經(jīng)濟方便等獨特的優(yōu)點受到廣泛關注。尤其對于那些屬于癌癥晚期和由于年齡、體質(zhì)等原因不適合使用傳統(tǒng)治療技術的病人，光動力療法仍然是一種理想的治療手段。光動力療法主要通過使用適當波長的光源激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧，活性氧通過一系列生理生化反應最終導致腫瘤細胞死亡。
[0003]竹紅菌甲素(HypocrellinA，簡稱HA)具有光敏產(chǎn)生各種活性氧的能力。與目前已經(jīng)商品化的光敏劑(如血卟啉類衍生物)相比，其具有易得、易純化、化學修飾性好、三重態(tài)量子產(chǎn)率高、單重態(tài)氧量子產(chǎn)率高、光毒性高、體內(nèi)代謝快等優(yōu)點，在光動力抗艾滋病毒、治療腫瘤和微血管類疾病等方面有廣泛的潛在應用價值。
[0004]然而，理想的光動力療法藥物除需具備較強的活性氧產(chǎn)生能力外，還需具備一定的腫瘤組織靶向能力，這樣才可以將光療藥物有效的運送至靶組織、靶器官、靶細胞以及細胞內(nèi)的特定部位，提高治療效果，同時可以保護機體正常組織和細胞不受傷害。
[0005]在眾多靶向系統(tǒng)中，受體介導的主動靶向系統(tǒng)因其具有高特異性、高選擇性、飽和性、親合力強和生物效應明顯等特點而受到廣泛關注。利用配體為藥物的載體，通過受體介導作用，增加病灶局部藥物濃度，提高療效，降低毒副作用，達到靶向治療目的。
[0006]轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin-Transferr in Receptor ,Tf-TfR)受體介導的腫瘤細胞靶向給藥體系是近年來的研究熱點。轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)是人體血液中主要的含鐵蛋白質(zhì)，負責體內(nèi)鐵的運輸。鐵是細胞生長增殖及機能活動所必需的微量元素之一，而腫瘤細胞主要是通過高表達轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)來攝取鐵。腫瘤細胞表面大量表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物載體提供了可能。轉(zhuǎn)鐵蛋白與藥物結合在一起，在組織中的分配性好，延長了藥物在胞漿中的半衰期，同時還可達到控釋目的。
[0007]傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)鐵蛋白-藥物給藥體系(Tf-Drug)的構建主要是通過兩種途徑，一是通過偶聯(lián)反應形成藥物與蛋白之間的西佛堿從而形成一個穩(wěn)定的給藥體系，但該化學反應過程會在一定程度上影響轉(zhuǎn)鐵蛋白的構象及活性;而且，穩(wěn)定化學鍵可能影響后期藥物的釋放過程。另外一種方法是通過藥物與蛋白之間簡單的相互作用力，如靜電力、疏水鍵、氫鍵等將蛋白與藥物連接，這種方法反應體系簡單、對蛋白構象及活性影響小，但因為以上三種作用力強度不高，因此該方法得到的給藥體系在給藥過程中往往發(fā)生所載藥物從蛋白上脫落，造成給藥體系的崩解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服竹紅菌甲素不具有主動的腫瘤組織靶向的缺點，提供一種竹紅菌甲素靶向給藥體系的制備方法，利用竹紅菌甲素易與金屬離子螯合的特點，通過金屬鍵將竹紅菌甲素與轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)，制備出具有臨床應用前景的竹紅菌甲素靶向給藥體系，并將該靶向給藥體系應用于光動力療法領域。
[0009]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是:
[0010]—種竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法，其特征在于，采用全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白作為載體，在生理緩沖溶液中，使用尿素、巰基乙醇將全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白失活，使其三維結構松散露出Fe離子配位點后，將過量竹紅菌甲素加入(優(yōu)選按HA與Tf按2:1比例加入)，4°(:恒溫震蕩10_24h，透析除掉未結合的竹紅菌甲素(HA)及尿素、β-巰基乙醇，還原全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白三維結構，制得竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系。
[0011]上述竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系，是一種適合靜脈注射的制劑，樣品經(jīng)冷凍干燥后可獲得凍干粉，使用之前用水溶解，溶解后可制成適合靜脈注射的制劑。
[0012]本發(fā)明針對傳統(tǒng)方法的缺陷，利用轉(zhuǎn)鐵蛋白的獨特性質(zhì)及竹紅菌甲素的特性，在經(jīng)典的蛋白變性-復性體系(尿素、巰基乙醇)中，利用變性劑將轉(zhuǎn)鐵蛋白螺旋結構打開后，進行其攜帶的鐵離子與竹紅菌甲素進行配位，而后通過透析除掉變性劑后，蛋白恢復構象，將竹紅菌素裝載于其內(nèi)部，構建通過竹紅菌甲素中的酚羥基與醌羰基與轉(zhuǎn)鐵蛋白中Fe3+螯合進而將茈醌類光敏劑緊密結合在轉(zhuǎn)鐵蛋白上的方法來實現(xiàn)竹紅菌素的靶向給藥。竹紅菌甲素非常容易與金屬離子螯合，這種螯合的作用力強度又遠大于普通的作用力，如靜電力、疏水鍵、氫鍵等，而且這種螯合是物理作用并沒有發(fā)生化學反應，因此對蛋白的活性和構象都沒有太大的影響。本發(fā)明采用的利用蛋白變性復性體系實現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白藥物裝載的方法從未見報道;因此通過金屬螯合鍵將竹紅菌甲素與轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)既不影響蛋白活性及構象，又能實現(xiàn)竹紅菌甲素靶向給藥，該類載體在光動力療法領域具有極大的潛力。
[0013]完成本發(fā)明第二項發(fā)明任務的方案是:所述方法制得的竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系在制備光動力療法藥物中的應用。
[0014]本發(fā)明的一種竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法所制得的竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系具有如下的優(yōu)點:
[0015]1.本發(fā)明的靶向給藥體系制備方法簡單、條件溫和，有效地保持了轉(zhuǎn)鐵蛋白的構象，對其靶向功能的維持非常重要；
[0016]2.與單獨存在的竹紅菌甲素相比，該竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系不但水溶性高、分散性好，且在生理環(huán)境穩(wěn)定分散性質(zhì)佳；
[0017]3.竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系具有腫瘤細胞靶向功能，體外癌細胞實驗結果表明，該給藥體系能有效增加腫瘤細胞對竹紅菌甲素光敏劑的攝取進而增強其光動力活性。
【附圖說明】
[0018]圖1為竹紅菌甲素(HA)裝載入轉(zhuǎn)鐵蛋過程中，轉(zhuǎn)鐵蛋白構象變化及還原過程;其中
[0019](A)Tf、Tf+尿素+β-巰基乙醇+HA透析前及Tf+尿素+β-巰基乙醇+HA透析后圓二色信號的疊加圖；
[0020](B)Tf圓二色信號以及軟件計算得到的蛋白各種