通過單步過程制備雙層支架的方法以及利用由該制備方法獲得的雙層支架進行組織再生 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及通過單步過程制備雙層支架的方法W及利用由該制備方法獲得的雙 層支架進行組織再生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 支架是為了對組織細胞進行體外培養(yǎng)和移植而制備的物理支撐和貼附基底;支架 用于為人組織再生進行的細胞移植;并且，支架對于細胞的大量培養(yǎng)和增殖十分重要。其原 因在于上皮細胞的細胞貼附W及相伴的遷移和增殖發(fā)生在細胞和基底之間的接觸部分。
[0003] 在體內(nèi)或體外與物質(zhì)相接觸時，大部分具有生物活性的細胞首先通過細胞貼附而 存活。特別地，在成纖維細胞和組織細胞的存活中，細胞優(yōu)先貼附至基底，隨后細胞質(zhì)中的 細胞器代謝變得活躍，并移向新的位點，從而促進增殖和營養(yǎng)供應(yīng)。
[0004] 因此，用于使細胞有效堆積的表面對于細胞的增殖而言是最基本的手段?？山柚?基底的組分對細胞基底的貼附性能進行人為控制。支架是細胞再生和生長的支撐載體(即， 人工基底中作為基礎(chǔ)的材料），近來被用作大量培養(yǎng)和增殖的容器或燒瓶的涂層。
[0005] 另一方面，韓國專利公開號2004-0016984公開了用于培養(yǎng)細胞和組織的載體及其 培養(yǎng)方法，其中，成纖維細胞的過度生長可被阻抑，并且祀組織或器官可有效再生。然而，上 述支架存在諸多問題:其貼附性并不足W對細胞進行大量培養(yǎng)，其物理性質(zhì)并不出眾，制備 方法也并不簡便和符合期望。
[0006] 此外，傳統(tǒng)的雙層支架是通過在分別制造各聚合物支架后將其彼此附著來制備 的，然而，所述雙層支架不能完全附著，存在很大的分離可能，并且，由于聚合物支架的制備 為兩步法，工藝很復(fù)雜。
[0007] 因此，本發(fā)明的發(fā)明人通過將陰離子表面活性劑加入至兩種聚合物共混的溶液 中，在高溫高速下攬拌反應(yīng)W誘導(dǎo)相分離，并確認了由此產(chǎn)生的支架是結(jié)構(gòu)和化學(xué)上特異 的雙層支架，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引技術(shù)問題
[0009] 本發(fā)明的一個目的在于提供通過簡單的單步過程制備結(jié)構(gòu)和化學(xué)上特異的、不會 分離的雙層支架的方法。
[0010] 此外，本發(fā)明的另一目的在于提供利用所述雙層支架進行組織再生的方法。
[00川技術(shù)方案
[0012]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了通過簡單的單步過程制備雙層支架的方 法，所述方法包含:制備第一聚合物水性溶液;將第二聚合物加入至所述第一聚合物水性溶 液中，并對反應(yīng)物進行攬拌;將表面活性劑加入至經(jīng)攬拌的反應(yīng)物中，并對所述反應(yīng)物進行 高溫高速攬拌;對經(jīng)攬拌的反應(yīng)物進行冷凍干燥，從而獲得海綿狀物(sponge);將所述海綿 狀物浸潰于交聯(lián)劑中，使其交聯(lián);W及對經(jīng)交聯(lián)的反應(yīng)物進行冷凍干燥。
[0013] 本發(fā)明提供了制備雙層支架的方法，所述方法包含:通過在60-70°C的溫度下W 100-30化pm的速度對水中的明膠進行攬拌W使其完全溶解，制備明膠水性溶液;將聚乙締 醇(PVA)加入至所述明膠水性溶液中，并對溶液進行攬拌;將十二烷基硫酸鋼加入至經(jīng)攬拌 的溶液中，并在80-120°C的溫度下W800-2000rpm進行攬拌;對經(jīng)攬拌的溶液進行冷凍干 燥，從而獲得海綿狀物;將所述海綿狀物浸潰于交聯(lián)劑中，使其交聯(lián)，所述交聯(lián)劑選自于由 戊二醒或乙基二乙基氨基丙基碳化二亞胺化DC)所組成的組；W及對經(jīng)交聯(lián)的反應(yīng)物進行 冷凍干燥。
[0014] 本發(fā)明提供了通過在由上述制備方法制備的雙層支架中培養(yǎng)細胞進行組織再生 的方法。
[0015] 此外，本發(fā)明提供了用于組織再生和創(chuàng)傷愈合的組合物，所述組合物包含上述雙 層支架。
[0016] 有益效果
[0017] 與通過分別制造各聚合物支架后將其粘合的兩步過程而制備的傳統(tǒng)雙層支架不 同，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可通過單步過程制備完全附著的雙層支架，并且，可通過在制 備的雙層支架中培養(yǎng)細胞，并將其施用至進行組織再生或創(chuàng)傷愈合的皮膚缺陷位點；或者 在制備的雙層支架中對軟骨細胞和骨細胞進行共培養(yǎng)，并將其施用至組織(例如骨和軟骨） 彼此接觸的位點，促進由于創(chuàng)傷、燒傷、腫瘤等損失的皮膚組織的再生。
【附圖說明】
[0018] 圖1描繪了根據(jù)本發(fā)明的雙層支架制備過程的示意流程圖。
[0019] 圖2為根據(jù)本發(fā)明的雙層支架的掃描電子顯微圖像。
[0020] 圖3為根據(jù)本發(fā)明的雙層支架的數(shù)字圖像(A:含水的雙層支架;B:干燥的雙層支 架;C:交聯(lián)前的干燥的雙層支架）。
[0021] 圖4為根據(jù)本發(fā)明的雙層支架的FT-IR顯微圖像和曲線圖（明膠層）。
[0022] 圖5為根據(jù)本發(fā)明的雙層支架的FT-IR顯微圖像和曲線圖(PVA層）。
[0023] 圖6為根據(jù)本發(fā)明的雙層支架的顯微CT圖像(A:雙層支架;B:明膠層）。
[0024] 圖7為在根據(jù)本發(fā)明的雙層支架中培養(yǎng)1天的細胞的掃描電子顯微圖像。
[0025] 圖8為在根據(jù)本發(fā)明的雙層支架中培養(yǎng)5天的細胞的掃描電子顯微圖像。
[00%]圖9和10展示了利用根據(jù)本發(fā)明的雙層支架處理的創(chuàng)傷組織中的組織再生效果。
[0027] 圖11為利用雙層支架處理創(chuàng)傷組織后將其切下進行的RT-PCR分析。
【具體實施方式】
[0028] 本發(fā)明提供了通過單步過程制備雙層支架的方法，所述方法包含：制備第一聚合 物水性溶液;將第二聚合物加入至所述第一聚合物水性溶液中，并對反應(yīng)物進行攬拌;將表 面活性劑加入至經(jīng)攬拌的反應(yīng)物中，并對所述反應(yīng)物進行高溫高速攬拌;對經(jīng)攬拌的反應(yīng) 物進行冷凍干燥，從而獲得海綿狀物;將所述海綿狀物浸潰于交聯(lián)劑中，使其交聯(lián)；W及對 經(jīng)交聯(lián)的反應(yīng)物進行冷凍干燥。
[0029] 所述第一聚合物和所述第二聚合物可彼此不同，并可選自于由如下聚合物所組成 的組：明膠、殼聚糖山111*03曰11)、彈性蛋白、透明質(zhì)酸、徑基憐灰石、藻酸鹽、膠原、纖維素、聚 乙二醇(PEG)、聚環(huán)氧乙燒(PEO)、聚己內(nèi)醋(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚（乳酸-共-乙醇酸）（化64)、聚[(3-徑基下酸醋)-共-(3-徑基戊酸醋）](P皿V)、聚二嗯燒酬(PD0)、 聚[化-丙交醋）-共-(己內(nèi)醋）]、聚醋型聚氨醋（9〇17(63*61'山"61：11日]16)，？61]1])、聚[化-丙交 醋)-共-(D-丙交醋）]、聚（乙締-共-乙締醇KPV0H)、聚丙締酸(PAA)、聚乙締醇(PVA)、聚乙 締化咯燒酬(PVP)、聚苯乙締(PS)和聚苯胺(PAN)。優(yōu)選地，所述第一聚合物可W是明膠，所 述第二聚合物可W是聚乙締醇(PVA)。
[0030] 所述表面活性劑可W是陰離子表面活性劑，例如可選自于由如下表面活性劑所組 成的組：十二烷基硫酸鋼（SDS)、月桂基硫酸錠(ALS)、月桂基乙締硫酸鋼（Sodium Lauryl Ethylene Sulfate，化ES)、直鏈烷基苯橫酸鹽化AS)、a-締控橫酸鹽(AOS)、烷基硫酸鹽 (AS)、烷基酸硫酸鹽(AES)和鏈燒橫酸鋼(Sodium A化ane Sulfonate，SAS);優(yōu)選地，所述表 面活性劑為十二烷基硫酸鋼(SDS)。
[0031] 高溫高速攬拌優(yōu)選在80-12(TC的溫度下W800-2000巧m進行。
[0032] 所述交聯(lián)劑可選自于由如下交聯(lián)劑所組成的組:戊二醒、乙基二乙基氨基丙基碳 化二亞胺化DC)、京尼平(gen巧in)和轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(TG)。
[0033] 此外，本發(fā)明提供了制備上述雙層支架的方法，其中，所述方法包含:通過在60-70 °(：的溫度下W100 -3(K)rpm的速度對水中的明膠進行攬拌W使其完全溶解，制備明膠水性溶 液;將聚乙締醇(PVA)加入至所述明膠水性溶液中，并對溶液進行攬拌;將十二烷基硫酸鋼 加入至經(jīng)攬拌的溶液中，并在80-120°C的溫度下W800-2000rpm進行攬拌;對經(jīng)攬拌的溶液 進行冷凍干燥，從而獲得海綿狀物;將所述海綿狀物浸潰于交聯(lián)劑中，使其交聯(lián)，所述交聯(lián) 劑選自于由戊二醒或乙基二乙基氨基丙基碳化二亞胺化DC)所組成的組；W及對經(jīng)交聯(lián)的 反應(yīng)物進行冷凍干燥。
[0034] 進而，本發(fā)明提供了通過在由上述方法制備的雙層支架中培養(yǎng)細胞進行組織再生 的方法。<