豬痢疾疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)及包含化achyspira hyodysenteriae(豬頻疾短螺旋體)細(xì)菌的組合物， 尤其設(shè)及針對(duì)豬頻疾的免疫領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬頻疾（SD)，由螺旋體化achyspira hyodysenteriae結(jié)腸感染引起，仍是全世界 范圍內(nèi)的重大問題。它主要影響育肥期的豬。Brachyspira hyodysenteriae是一種革蘭氏 陰性耐氧厭氧螺旋菌，其定殖在豬大腸，引起豬頻疾(SD)。此疾病的特征在于嚴(yán)重粘膜出血 性腹瀉，主要影響生長育肥周期期間的動(dòng)物，且在所有主要豬飼養(yǎng)國家中均有發(fā)現(xiàn) (Hidalgo,A.et al.,Journal of clinical microbiologyUOlO),48(8):2859-2865)。
[0003] SD是一種在世界各地廣泛分布的疾病，但有關(guān)的流行病學(xué)研究稀缺，且已報(bào)道的 患病率差異顯著。因此已報(bào)道的，B. hyodysenteriae患病率范圍在0 %至接近40 %之間?；?病率的變化可能源自診斷方法的不同，或各國之間的圍欄、管理和飼養(yǎng)制度等差異。另外， 許多國家的患病率可能因使用抗微生物劑作為飼料添加劑而被掩蓋，在其他國家，禁止抗 生素作為生長促進(jìn)劑，則可能導(dǎo)致了SD患病率的提高（Alvarez-C)rd6fiez，A.etal.， International Journal of Environmental Research and Public Health(2013),10: 1927-1947)。
[0004] 帶菌豬在豬頻疾的流行中起到了主要作用，并且被認(rèn)為是畜群之間的主要傳染 源。B.hyodysenteriae能夠長期存活在環(huán)境中，尤其是在糞坑和化糞池內(nèi)所含的液體糞便 中，可W在其中保持傳染性達(dá)60天。例如，它可W在豬的糞便中低溫存活數(shù)月。該螺旋體也 可自然地定殖于小鼠、美洲駝、雞和野鴨，并通過物理載體或污染物增加，使得 B.hyodysenteriae可在畜群內(nèi)部和畜群之間傳播（Hidalgo,A.et al.,Journal of Clinical Microbiology(2010),48(8):2859-2865)〇
[0005] 運(yùn)種疾病在食物轉(zhuǎn)化率降低、死亡率、育肥期加長方面導(dǎo)致重大直接經(jīng)濟(jì)損失，同 時(shí)也導(dǎo)致間接損失，例如增加獸醫(yī)費(fèi)用、用藥等，尤其是對(duì)規(guī)?；i場而言。通過藥物治療 消滅疾病是相當(dāng)困難的，因?yàn)樵S多臨床上已恢復(fù)的動(dòng)物在充當(dāng)帶菌體的同時(shí)，在很長時(shí)間 內(nèi)持續(xù)排出該微生物。
[0006] SD的治療設(shè)及抗生素的使用。歐盟巧U)已將截短側(cè)耳素(泰妙菌素和沃尼妙林)用 于此目的。泰妙菌素和沃尼妙林是天然存在的二祗抗生素截短側(cè)耳素的半合成衍生物，其 顯示出抗厭氧菌優(yōu)秀活性，僅用于動(dòng)物中，主要是豬。還有大環(huán)內(nèi)醋類(泰樂菌素，W及近年 來的泰伐洛星)和緊密相關(guān)的林可霉素(林可酷胺)也常被包括在SD的治療策略中。然而，對(duì) 上述一種或多種抗生素的易感性降低的B.hyodysenteriae菌株的出現(xiàn)，W及基因多樣性多 重抗藥性菌株的存在，已經(jīng)在一些國家得到了證實(shí)。運(yùn)一事實(shí)使得SD的治療和控制復(fù)雜化， 并應(yīng)給獸醫(yī)和養(yǎng)豬戶帶來警示，需要一種戰(zhàn)略性方法來選擇抗生素，其必須只能在適當(dāng)?shù)?現(xiàn)場和實(shí)驗(yàn)室診斷后用于嚴(yán)格的適應(yīng)癥，W保證其用于治療SD的長期效力（Alvarez-Ordofiez,A. et al. , International Journal of Environmental Research and Public Health(2013),10:1927-1947)〇
[0007]藥物成本高，再加上在許多情況下不可能完全根除感染，且對(duì)藥物殘留在肉類產(chǎn) 品和環(huán)境的憂慮越來越多，因此，需要開發(fā)有效的免疫預(yù)防方法來控制SD(Diego，R.et al.，化ccine(1995)，13(7):663-667)。
[000引 Joens及其共同作者（Joens,L.A. ,et al. ,American Journal of Veterinary Research ( 1979 )，40 : I 352-I 35 4)報(bào)告了從急性SD康復(fù)的豬在此后再次接種 B. hyodysenter iae時(shí)不再得病，表明感染可能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答(Al varez-0rci6fiez,A. et al.,International Journal of Environmental Research and Public Health(2013), 10:1927-1947)，此后，已有許多開發(fā)疫苗W控制SD的嘗試。然而，開發(fā)用于控制SD的疫苗的 嘗試僅獲得了有限的成功?；痙sorKHudson,M.J.et al.,British Veterinary Journal (1974),130:37-40;Hudson,M.J.et al.,Research in Veterinary Science(1976),21: 366-367)開發(fā)了一種減毒活疫苗，其無法預(yù)防后續(xù)接觸感染。Glock(Glock，R. D. et al.， Proceedings of the 6th International Pig Veterinary Society Congress(1980), Copenhagen ,Denmark ,p. 521)報(bào)告了一種滅活疫苗在進(jìn)行共六次每隔6天一次的靜脈注射 后，對(duì)病菌起到了一定保護(hù)。減毒或遺傳修飾的活無毒疫苗可能表現(xiàn)出定殖降低，并使得免 疫刺激降低（Alvarez-Ordoncz'A. et al. , International Journal of Environmental Research and Public Health(2013),10:1927-1947)0
[0009] 另一種替代性方法是，產(chǎn)生可W通過重組B. hyodysenteriae蛋白在細(xì)菌遞送載體 上的表達(dá)來遞送的亞單位疫苗。已有鑒別B.hyodysenteriae蛋白質(zhì)W用于亞單位疫苗的嘗 試，但W重組38kDa鞭毛蛋白進(jìn)行疫苗接種，未能防止其在實(shí)驗(yàn)性感染的豬中定植(Gabe et alInfection and Immunity(1995) ,63:142-148)。另一方面，W重組29.7kDa外膜脂蛋白 (Bhlp29.7)進(jìn)行疫苗接種，得到了部分保護(hù)，發(fā)展疾病的動(dòng)物少于對(duì)照組。運(yùn)項(xiàng)研究的作者 得出結(jié)論認(rèn)為，免疫接種也傾向于延遲螺旋體隨糞便排出的發(fā)作，但并不一定能阻止其發(fā) 生(Xa,T.et al. ,Veterinary Mic;robiology(2004) ,102:97-109)。由Holden等人進(jìn)行的一 項(xiàng)研究中，評(píng)估了 WsmpB(B.hyodysente;riae的外膜蛋白）疫苗接種的療效。然而，在蛋白質(zhì) 疫苗接種后的應(yīng)答只對(duì)疾病提供了中度保護(hù)（Ho Iden, J. et al . ,Veterinary Microbiology(2008) ,128:354-363)。在大多數(shù)情況下，測試的重組疫苗未能對(duì)豬提供足夠 保護(hù)（Alv曰rez-Ord她ez,A. et 曰1International Journal of Environment曰I Research and Public Health(2013),10:1927-1947)〇
[0010]由全細(xì)胞菌苗組成的疫苗能誘導(dǎo)對(duì)化achyspira hyodysenteriae的血清抗體反 應(yīng)，但通常不能預(yù)防豬感染疾病。使用從全細(xì)胞裂解物中制備的B.hyodysenteriae菌苗，甚 至可能加劇疾病感染(Waters,W.R.et al.，Vaccine(2000) ,18:711-719)。此外，菌苗疫苗 往往是脂多糖血清群特異性的，其需要使用自體菌苗。此外，由于厭氧螺旋體挑剔的增長需 求(Xa,T.et al. ,Veterinary Mic;robiology(2004), 102:97-109) ,B.hyodysenteriae菌苗 的生產(chǎn)大規(guī)模相當(dāng)困難和昂貴。在一些國家中，SD菌苗疫苗可購得，并提供一定程度的保 護(hù)。然而，如上所述，其往往是脂寡糖化OS)血清群特異性的，需要使用自體或多價(jià)制劑化a, T.et al. ,Veterinary Microbiology(2004), 102:97-109)。本領(lǐng)域中的SD疫苗其它參考文 獻(xiàn)可在下列專利文獻(xiàn)中找到：
[0011] US4748019:研究人員發(fā)現(xiàn)，接種疫苗的有效方案包括腸胃外給予豬能有效刺激豬 免疫反應(yīng)的滅活強(qiáng)毒或病原T.hyodysente;riae(菌株"P18A"，NCTC11615)初次劑量，并在 大約同時(shí)或其后給藥無毒或非致病活菌株的T.hyodysenteriae后續(xù)劑量(菌株"VSr，NCTC 11628)。
[0012] US5750118:本發(fā)明設(shè)及包含滅活且含佐劑的有效劑量T.hyodysenteriae抗原(強(qiáng) 毒或減毒的菌株)的用于皮內(nèi)給藥的SD疫苗。疫苗抗原是從滅活的菌株27164ATCC制備的。
[0013] US5281416:本發(fā)明設(shè)及抗SD的豬免疫接種方法，其特征在于通過非腸道方式，優(yōu) 選為肌內(nèi)給藥方式，^T.hyodysenteriae活菌株或氧處理的非活性株向豬給藥的方法?？?使用的代表性菌株為參考菌株ATCC 31287,ATCC 31212和參考無毒菌株ATCC 27164。
[0014] 但是，據(jù)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)些疫苗的效力是可變的。自體制劑(也稱為"自體疫苗"，可W定義 為使用從患病動(dòng)物自身組織或分泌物中分離的生物體的培養(yǎng)物制備的疫苗）已被用于進(jìn)一 步改善運(yùn)些疫苗。運(yùn)種方法雖然有效，卻具有極高的金錢和時(shí)間成本，且僅能針對(duì) B.hyodysenteriae單一菌株提供保護(hù)。此外，免疫接種發(fā)生在致病菌株已被鑒定后的一段 時(shí)間W后，運(yùn)可能需要幾個(gè)星期(例如，按照標(biāo)準(zhǔn)程序，從農(nóng)場樣品的分離過程、初始培養(yǎng)和 自體疫苗的生產(chǎn)，可能需要至少6周）。運(yùn)一延遲時(shí)間往往造成細(xì)菌從牛群傳播到其他動(dòng)物， 或在極端情況下，甚至傳播到其他養(yǎng)豬場。運(yùn)還引發(fā)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且其本身作為常規(guī)應(yīng) 用是一種昂貴的過程。SD因而仍然是許多養(yǎng)豬國家的一個(gè)重要流行傳染病。有效的經(jīng)濟(jì)適 用CD疫苗具有巨大的必要性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 豬頻疾（SD)是由化achyspira hyodysenteriae導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的豬出血性腸道 疾病，對(duì)豬生產(chǎn)有很大的影響，并通過死亡率和次佳績效而導(dǎo)致重大損失。考慮到多重耐藥 菌株的出現(xiàn)，W及對(duì)藥物殘余可W存在于肉制品或環(huán)境中的擔(dān)憂，迫切需要高效的免疫預(yù) 防方法來控制SD。然而，現(xiàn)有的疫苗無法W令人滿意的程度賦予針對(duì)感染的保護(hù)，而且即使 它們賦予了一定程度的保護(hù)，卻不提供針對(duì)不同血清群菌株的充足交叉保護(hù)免疫。此外，自 體疫苗的制造和商業(yè)化目前存在許多不便。因此，需要一種能夠針對(duì)不同血清型提供強(qiáng)力 保護(hù)的抗SD疫苗，即一種有效的通用SD疫苗。
[0016] 本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了針對(duì)SD的疫苗，出乎意料的是，其與自體疫苗一樣有效，盡管 其組合物中不具有能導(dǎo)致該感染的菌株。運(yùn)種效果是非常令人驚奇的，因其與自體疫苗理 論矛盾。本發(fā)明提供了一種具有抗化achyspira hyodysenteriae的高效普遍保護(hù)的疫苗， 即"通用疫苗"。
[0017] 在第一方面，包含來自化achyspira hyodysenteriae的至少兩種基因多樣菌株的 細(xì)菌的組合物。本發(fā)明的組合物可包含滅活的菌株，且所述基因多樣性可通過從不同克隆 復(fù)合體中篩選所述來自化achyspira hyodysenteriae的至少兩種基因多樣菌株而獲得的。 在一個(gè)優(yōu)選的方面中，所述基因多樣性菌株在目標(biāo)區(qū)域中檢測為占總檢測菌株的比例為至 少1%。目標(biāo)區(qū)域可W是任意區(qū)域，優(yōu)選為西班牙。
[0018] 在第二方面中，本發(fā)明設(shè)及本發(fā)明的組合物及其作為疫苗的用途，優(yōu)選為一種針 對(duì)Rrachyspira hyodysenteriae所引起的豬頻疾的疫苗。
[0019] 此外，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明的組合物的方法，其包括選取至少兩種基因 多樣性菌株，并將其等量混合，W達(dá)到至少在IO 8至IO9總細(xì)菌數(shù)/mL之間的濃度。
【附圖說明】
[0020] 圖1.本研究中發(fā)現(xiàn)并Wupgma聚類的44種B.hyodysenteriae MLVA類型的系統(tǒng)樹 圖。羅馬數(shù)字I至VI表示在單位點(diǎn)變異體水平上定義的克隆復(fù)合體。比例尺表示遺傳距離， 顯示為基因型之間的標(biāo)記等位基因差異的絕對(duì)數(shù)量。圖中所示為含40%的自展支持