抑制呼吸鏈復合物v在結直腸癌干細胞治療中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及寡霉素A(01igOmycin A，呼吸鏈復合物V功能抑制劑)對結直腸癌干細胞(Colon Cancer Stem Cells，cCSCs)增殖的抑制作用，探討復合物V在結直腸癌干細胞治療中的應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells，CSCs)屬于癌細胞的亞細胞群，具有和成體干細胞相似的自我更新和多分化潛能。常見的腫瘤干細胞標記物包括⑶133、⑶44、CD2ni 4、EpCAM、THYl、ATP-binding cassette B5和CD200<XD44是細胞粘附分子，調節(jié)細胞信號傳導、迀移和歸巢，廣泛用于標記結直腸癌干細胞。正常成體干細胞能用泡體包裹化療藥物并將其栗出細胞外而表現(xiàn)出對化療藥物天然的耐受性。腫瘤干細胞對傳統(tǒng)的化療和放療同樣具有耐受性，主要是其自我更新能力和多分化潛能導致腫瘤復發(fā)和轉移，是目前腫瘤治療需要攻克的一個難題，因此腫瘤干細胞也是腫瘤治療的重要靶點。
[0003]線粒體(mitochondr1n)是一種存在于大多數(shù)細胞中由兩層膜包被的細胞器，其直徑在0.5到10微米左右，是細胞進行呼吸作用為生物體提供能量的主要場所。呼吸作用包括檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化兩個過程，檸檬酸循環(huán)又稱為三羧酸循環(huán)或Krebs循環(huán)，主要在線粒體基質(matrix)中完成。線粒體氧化磷酸化的電子傳遞鏈，又叫線粒體呼吸鏈，位于線粒體內膜上，是指電子經一系列膜結合的電子載體(即呼吸鏈)從NADH或FADH2到02，同時產生線粒體內外膜質子電勢差而驅動復合物V催化合成ATP的過程。呼吸電子傳遞鏈由四個分子量很大的跨膜蛋白復合體(線粒體呼吸鏈膜蛋白復合體1、11、111、和1￥)、以及介于1/11與III之間的泛醌和介于III與IV之間的細胞色素C共同組成。復合物V(ATP synthase,EC3.6.1.3,又稱為F1Fo-ATP酶)主要是與呼吸鏈四個酶復合物偶聯(lián)完成氧化磷酸化生成ATP，因此常又稱為ATP合酶。
[0004]復合物V(ATP合成酶或者F1Fo-ATP酶)，主要是在細胞內催化能源物質ATP的合成，在呼吸過程中通過電子傳遞鏈釋放的能量先轉化為跨膜質子(H+)梯度，質子流順質子梯度差通過復合物V的Fo部分使ADP和Pi合成ATP ^TP合成酶主要由FjPFo兩個部分組成，其中F1為起催化作用的水溶性球蛋白，從內膜突出于基質中，由3α、3β、I γ、Iδ和I ε等9個亞基組成，3個α和3個β亞基交替排列在γ亞基的α螺旋結構的氨基和羧基末端。α和β亞基上均有核苷酸結合位點，其中β亞基的結合位點具有催化ATP合成或水解的活性，α3，β3共同旋轉以調節(jié)三個β亞基催化位點的開放和關閉。γ與ε亞基具極強的親和力，結合在一起形成“轉子”，ε亞基還有抑制酶水解ATP的活性，還能堵塞氫離子通道以減少氫離子泄露的功能。ATP合成酶的Fo部分是嵌合在內膜上的疏水蛋白復合體，主要形成一個跨膜質子通道而起質子轉移作用。其類型在不同物種中差別很大，在細菌中Fo由a，2b，9-12c三種亞基組成。多拷貝的c亞基形成一個環(huán)狀結構，a亞基和b亞基二聚體排列在c亞基聚體環(huán)狀外側，a亞基，b亞基和Fi部分的δ亞基共同組成“定子”。在Fi和Fo之間還有寡霉素敏感蛋白(OligomycinSensitivity-Conferring Protein, 0SCP)柄相連，寡霉素可與寡霉素敏感蛋白結合，阻止質子從Fo通道內流動而合成ATP。質子不能內流導致膜兩側電化學梯度增高，影響質子栗的功能，進而抑制電子傳遞。
[0005]復合物V的作用是在?工部位催化ADP和Pi形成ATP，在線粒體內膜上，呼吸鏈組分間氫與電子交替?zhèn)鬟f，使質子(H+)從內膜的內側栗到外側，而電子和O結合生成O2—，由于膜對H+的不通透性，從而形成跨膜的質子濃度梯度和電化學梯度，因此，氧化所釋放的能量首先轉換為跨膜質子梯度，當H+跨梯度內流到線粒體基質與02—結合生成水，這種內流的驅動力促使ATP的生成。其釋放的能量使Fo的c亞基環(huán)和與之相連的γ、3和￡亞基旋轉，γ亞基的旋轉為α3β3六聚體合成ATP提供能量。其具體機制為Fi#基上的3個β亞基對ATP和[ADP+Pi]結合具有不同的親和性，分別具有緊密結合狀態(tài)(tight，Τ態(tài))，松散結合狀態(tài)(loosed態(tài))和空置狀態(tài)(open，0態(tài))。在任何一個時刻，3個β亞基的構象總是互不相同的。在ATP的合成過程中，ADP和Pi首先結合在匕位，質子流經過Fo回流到線粒體基質驅動Fi亞基上的3個β亞基構象發(fā)生依次變化，即L位轉變?yōu)門位，同時原T位轉變?yōu)镺位，原O位轉變?yōu)長位，進入T位的ADP和Pi合成ΑΤΡ，并隨著進一步構象的改變釋放出去，ADP和Pi再依次進入L位合成ΑΤΡ。每一個β催化亞基經過幾次伴隨構象改變而發(fā)生的結合變化最后形成I個ATP分子，這樣的過程反復進行以不斷合成ΑΤΡ。在ATP水解時，則使用相反的途徑，這些構象的轉變都是通過Y亞基的旋轉實現(xiàn)的。可以簡單概括為:通過內膜呼吸鏈的電子傳遞所釋放的能量首先轉變?yōu)榭缒さ馁|子梯度差，然后質子濃度梯度驅動ATP合酶的Fo的c亞基發(fā)生轉動，并繼而帶動卩工亞基的γ亞基的轉動而使3個β亞基的構象發(fā)生交替變化來合成ΑΤΡ。也可以形象的描述為:當質子跨膜運輸時，帶動ATP合酶的類車輪結構和連桿轉動，就像水流帶動水輪機轉動一樣，然后再引起其他部分的轉動，在這種轉動下，ATP合酶上三個催化部位構象以抓住底物ADP和Pi合成ΑΤΡ。寡霉素A與質子栗的Fo部分結合并特異地抑制質子的運輸，從而抑制ATP的合成和分解。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明研究了寡霉素A對結直腸癌干細胞線粒體呼吸鏈氧化磷酸化功能抑制而抑制結直腸癌干細胞生存和增殖。傳統(tǒng)的觀點認為，腫瘤細胞主要是以糖酵解為主對其生長提供能量，而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在腫瘤干細胞中，主要以線粒體的氧化磷酸化為主要供能方式為腫瘤干細胞的生長提供能量。我們用寡霉素A抑制呼吸鏈復合物V的ATP合成酶功能證明呼吸鏈對于維持結直腸癌干細胞生存和增殖的重要性，這為臨床上治療由腫瘤干細胞引起的腫瘤復發(fā)和腫瘤轉移的治療提供有效的藥物作用靶點。
[0007]首先，檢測不同結直腸癌細胞株中干細胞比例，并選擇細胞生長狀態(tài)良好和干細胞比例高的細胞株進行干細胞的分選和培養(yǎng)。最后選出ΗΤ29和HCT116這兩株結直腸癌細胞株的腫瘤干細胞標記物CD44陽性比例分別為10.2%和7.7%，并通過磁珠分選出ΗΤ29和HCTl 16兩株結直腸癌細胞中的腫瘤干細胞進行培養(yǎng)，裸鼠成瘤模型說明結直腸癌干細胞的成瘤性對CD44陽性細胞具有依賴性。
[0008]其次，以非干細胞為對照，分析結直腸癌干細胞線粒體形態(tài)差異和呼吸鏈復合物V功能。磁珠分選后的結直腸癌干細胞(CD44陽性)和非干細胞(CD44陰性)，用透射電子顯微鏡觀察線粒體的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)結直腸癌干細胞ΗΤ29和HCTl 16線粒體直徑大于非干細胞，嵴結構之間沒有顯著的界限。線粒體內膜染色后用流式細胞技術檢測同樣證明兩株結直腸癌干細胞(HT29/CD44+和HCTl 16/CD44+)的內膜面積顯著大于非干細胞。ATP合成酶活性檢測，SP呼吸鏈復合物V活性檢測的結果顯示在兩株干細胞中(HT29/⑶44+和HCTl 16/⑶44+)該酶的活性高于非干細胞。
[0009]最后，檢測細胞增殖活性，證明結直腸癌干細胞對寡霉素A的敏感性。使用呼吸鏈復合物V酶活性抑制劑寡霉素A處理的結直腸癌干細胞(HT29/⑶44+和HCT116/⑶44+)并檢測其增殖活性，結果顯示在處理的第一天細胞增殖活性出現(xiàn)完全下降，對應的非干細胞的增殖活性并沒有出現(xiàn)降低。上述結果說明結直腸癌干細胞呼吸鏈復合物V代謝功能活躍，抑制其功能能使結直腸癌干細胞的活性和增殖受到顯著抑制，這對針對腫瘤干細胞的治療具有重要的意義。
【附圖說明】
[0010]圖1.結直腸癌細胞HT29和HCT116用熒光標記的⑶44抗體檢測腫瘤干細胞標記物0)44的表達。細胞流式分析儀檢測到肌29和!1(:1'116細胞0)44陽性的比例分別為10.2%(見圖1A)和 7.7%(見圖 1B)。
[0011]圖2.HT29和HCT116細胞經過磁珠分選法分離出⑶44陽性和⑶44陰性細胞，陽性細胞在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，陰性細胞在正常細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。CD44陽性細胞在培養(yǎng)5天后長出干細胞球(見圖2右)。
[0012]圖3.將正常結直腸癌細胞HT29、HCT116和分選后的CD44陰性細胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-以1\106個細胞在免疫缺陷鼠服]/服]皮下注射。50天后，皮下注射的正常肌29細胞形成腫瘤，CD44-陰性細胞沒有形成腫瘤；正常HCT116細胞形成的腫瘤體積明顯大于HCT116/CD44-細胞(見圖 3)。
[0013]圖4.HT29和HCT116的CD44陰性細胞和CD44陽性細胞經過戊二醛固定，在透射電子顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)為10000倍(上行)和50000倍(下行)放大倍數(shù)下觀察線粒體形態(tài)，其中箭頭指示為線粒體(見圖4)，發(fā)現(xiàn)結直腸癌干細胞線粒體直徑大于非干細胞，嵴結構之間沒有顯著的界限。
[0014]圖5.HT29和HCT116的CD44陰性和陽性細胞用線粒體膜染料Mito-Tracker Green和Mito-Tracker Red進行標記，并用流式細胞儀進行分析。經過線粒體內膜染料Mito-Tracker Green和Mito-Tracker Red標記的HT29 CD44陽性細胞的熒光強度是395666和104667，顯著高于CD44陰性細胞的兩個熒光強度142000和58666(見圖5A、B)。經過線粒體內膜染料Mito-Tracker Green和Mito-Tr