M、6. 5mM、7,mM、8mM、9mM、10mM、10.ImM、10. 2mM、10. 3mM、10. 5mM或llmM至 約 15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、75mM、100mM或 250mM時會獲得最佳結果。在某些實 施方式中，在所述緩沖的鈣溶液中的鈣離子濃度為約5-10mM、約5-25mM、約20-100mM、或從 約 25mM至約 50-75mM，包括 5mM、5.ImM、5. 2mM、5. 3mM、5. 4mM、5. 5mM、5. 6mM、5. 7mM、5. 8mM、 5. 9mM、6mM、6. 5mM、7,mM、8mM、9mM、10mM、10.ImM、10. 2mM、10. 3mM、10. 5mM、llmM、12mM、13mM、 14mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、110mM、150mM、200mM、300mM或 更1?。
[0055] 為了獲得所述恢復所需溶液的體積可根據(jù)鈣離子濃度改變，但在大多數(shù)情況中， 可由約1.0-10. 0樹脂體積的溶液獲得最佳結果，在很多情況中，可用約1、1. 1、1.2、1.3、 1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或約2樹脂體積來獲得最佳結果。在一些情況中，所述體積可 達約6樹脂體積，包括2、3、4或5樹脂體積。在一些情況中，所述體積小于3柱體積。在一 些情況中，可使用的高鈣離子濃度的體積小于一個樹脂體積（例如小于約〇. 9、0. 7、0. 5體 積）。
[0056] 各種緩沖液都適用于用于磷灰石再生的緩沖的鈣溶液。在一些實施方式中，用于 在溶液中不明顯形成金屬絡合物（例如在緩沖溶液的pH下不形成與鈣的絡合物）的緩沖 的鈣溶液的緩沖劑可包含緩沖的鈣溶液的緩沖組分。在一些實施方式中，不含有伯胺或仲 胺（即R2_N，其中R不是H)的緩沖劑可包含緩沖的鈣溶液的緩沖組分。在一些實施方式中， 優(yōu)選兩性離子緩沖劑。在一些實施方式中，優(yōu)選含有磺酸部分的緩沖劑（例如兩性離子緩 沖劑）。在一些實施方式中，優(yōu)選含有磺酸和叔胺（即R3_N，其中R不是H)的緩沖劑。示例 性的適用于作為緩沖的鈣溶液中的緩沖劑的兩性離子緩沖劑包括但不限于以下物質：MES、 PIPES、ACES、MOPSO、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、POPSO或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO、CHES、MOBS、TABS或AMPSO。在一些實施方式中，所述緩沖的鈣溶液的緩沖劑 含有伯胺、仲胺或叔胺。在一些實施方式中，所述緩沖的鈣溶液的緩沖劑含有伯胺、仲胺或 叔胺以及一個或多個羧酸酯/鹽基團或羥甲基。在一些實施方式中，所述緩沖的鈣溶液的 緩沖劑是N-(三（羥基甲基）甲基）甘氨酸、N，N-二（2-羥基乙基）甘氨酸、或氨基丁三 醇。在一些實施方式中，所述緩沖的鈣溶液的緩沖劑是二（2-羥乙基）-氨基-三（羥甲 基）_甲烷）、或1，3-二（三（羥甲基）甲基氨基）丙烷。
[0057] 緩沖的鈣溶液中的緩沖劑濃度可改變，但通常會選擇的濃度至少與溶液的鈣離子 濃度一樣高。此外，所述濃度可基于選擇的緩沖劑，或任何前述緩沖劑的選擇的組成改變。 因此，緩沖劑濃度與鈣離子濃度之比通常至少為約1，例如1、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、 1. 7、1. 8、1. 9、2、2. 1、2. 2、2. 5、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，也選擇所述緩沖劑濃度，從 而使其低于緩沖劑的溶解度極限。在一些情況中，優(yōu)選的緩沖劑包括那些具有高溶解度極 限的緩沖劑。
[0058] 緩沖的鈣溶液的pH可變化，但通常會選擇能減少、消除或逆轉在磷灰石使用過程 中（例如在純化過程中，在洗脫過程中，或在清潔/剝離過程中）發(fā)生的樹脂劣化的任何 量。此外，所述pH可基于選擇的磷灰石固體表面、選擇的緩沖劑、選擇的一種或多種組分的 濃度、或選擇的任何前述緩沖液的組成改變。通常，所述pH為，或至少為約5、5. 1、5. 2、5. 3、 5. 4、5. 5、5. 6、6、6. 2、6. 5、7、7. 5或8。在一些實施方式中，所述pH為，或至少為約5. 5、6、 6. 5、7、7. 5或8。在一些實施方式中，所述pH為5. 5、6、6. 5、7、7. 5或8。在一些實施方式 中，所述pH為5. 1、5.2、5. 3或5. 4。在一些情況中，所述pH為5. 3。在一些情況中，所述pH 為 5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9、7、7· 1、7· 2、7· 3、7· 4 或7. 5。在一些情況中，所述pH為7.0。在一些情況中，所述pH為5. 6。在一些情況中，所 述pH為6. 2。在一些情況中，所述pH為5. 4。
[0059] 在一些實施方式中，所述緩沖的鈣溶液的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑。在這些情況下， 可選擇所述鈣濃度和磷酸根濃度以及溶液的pH以提供再生，同時避免沉淀形成，或避免過 飽和溶液。例如，磷酸鹽緩沖的鈣溶液的pH可選擇足夠低（例如，pH為約，或低于約6. 5、 6· 4、6· 3、6· 2、6· 1、6、5· 9、5· 8、5· 7、5· 6、5· 5、5· 4、5· 3、5· 2、5· 1 或 5)。在一些情況中，所述 pH為5. 1、5. 2、5. 3、5. 4或5. 5。在一些情況中，所述pH為5. 3。作為另一實施例，磷酸鹽緩 沖的鈣溶液的鈣濃度可為約，或低于約50mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、7mM、 6mM、5. 9mM、5. 8mM、5. 7mM、5. 6mM、5. 5mM、5. 4mM、5. 3mM、5. 2mM、5.ImM或 5mM。在一些情況下， 所述磷酸鹽緩沖的溶液的鈣濃度為，或約為15mM、14mM、13mM、12mM、llmM、10. 5mM、10. 4mM、 10. 3mM、l(X2mM、l(XlmM、10mM或 9. 5mM。在一些情況下，所述鈣濃度為 10 或 1(λ2mM。在一 些情況下，所述鈣濃度為10mM。作為另一實施例，磷酸鹽緩沖的鈣溶液的磷酸根濃度可為 約，或低于約 50mM、40mM、35mM、30mM、29mM、28mM、27mM、26mM、25mM、24mM、23mM、2ImM、20mM、 18mM、17mM、16mM或15mM。在一些情況下，使用磷酸鹽緩沖的緩沖的鈣溶液提供了具有或不 具有前述或后續(xù)高摩爾濃度的（例如〇.l、〇. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9或1M)磷酸 鹽緩沖步驟的再生。
[0060] 在一些實施方式中，所述磷灰石固體表面在柱中，例如色譜柱，所述緩沖的鈣溶液 可以一定流速施加到所述磷灰石固體表面上。所述流速可變化，但通常會選擇能減少、消除 或逆轉在磷灰石使用過程中（例如在純化過程中，在洗脫過程中，或在清潔/剝離過程中） 發(fā)生的樹脂劣化的任何速率。合適的流速，包括在磷灰石的平衡、加載、洗脫、清潔/剝離、 消毒或沖洗過程中通常使用的速率。示例性的流速為400厘米/小時。在一些情況中，所 述流速基本低于400厘米/小時（例如，300、200、100或50厘米/小時或更低）。低流速 的使用可允許磷灰石固體表面與緩沖的鈣溶液之間的接觸時間更長。當鈣或緩沖劑的濃度 較低或緩沖的鈣溶液的體積較小時，可特別優(yōu)選低流速。當緩沖的鈣溶液或前述溶液是粘 性的或所述柱被吸附的生物化合物污染時，也可優(yōu)選低流速?；蛘撸隽魉倏筛哂?00厘 米/小時。在一些情況下，鈣的松散結合層的形成是快速的，高流速有利于減少磷灰石再生 所需的時間。
[0061] 在一些實施方式中，以批次形式將所述磷灰石固體表面與緩沖的鈣溶液接觸。在 批次形式中，可通過將所述緩沖的鈣溶液倒在所述磷灰石固體表面上，或將所述磷灰石固 體表面的漿料倒入緩沖的鈣溶液中來施加緩沖的鈣溶液。所述接觸時間可變化，但通常會 選擇能減少、消除或逆轉在磷灰石使用過程中（例如在純化過程中，在洗脫過程中，或在清 潔/剝離過程中）發(fā)生的樹脂劣化的任何時間。
[0062] 在一些實施方式中，隨后清洗或沖洗所述磷灰石固體表面。本領域技術人員可容 易地選擇合適的清洗緩沖液。在一些情況中，在獨立再生處理之間用清洗溶液處理所述樹 脂以去除任何過量的鈣、磷酸鹽或氫氧根離子。通常，所述清洗緩沖液可以具有基本不浸出 磷灰石表面組分、不釋放累積的水合氫離子或不形成不希望的沉淀的pH值、組成和濃度。 例如，所述清洗緩沖液可以是與前述和后續(xù)緩沖液相容的，從而當混合時不產生沉淀。如 另一個實施例，可選擇所述清洗緩沖液，從而不浸出在將所述磷灰石固體表面與所述緩沖 的鈣溶液接觸過程中形成的任何松散結合的鈣層。合適的清洗緩沖液可包括通常用于磷灰 石的平衡、加載、或流動通過的緩沖組合物。在一些情況中，用低摩爾濃度的磷酸鹽緩沖液 (例如磷酸鹽的濃度小于約100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固 體表面。清洗緩沖液的pH可至少為約5,至少為約5. 5,至少為約6,或至少為約6. 5、7或 8。在一些情況中，進行水清洗，并且水的量可廣泛變化。典型的水清洗至少為約0.2樹脂 體積，在大多數(shù)情況下水清洗為約0. 2-1. 5樹脂體積，或為約0. 2-2樹脂體積。
[0063] B.磷酸鹽緩沖的溶液
[0064] 當將所述磷灰石與緩沖的鈣溶液接觸后，可將所述磷灰石固體表面與含磷酸鹽的 緩沖液接觸?；蛘?，在所述磷灰石與緩沖的鈣溶液接觸之前，可將含磷酸鹽的緩沖液與磷灰 石接觸。在一些情況中，在緩沖的鈣溶液和含磷酸鹽的緩沖液之間可施加插入的清洗步驟。 所述含磷酸鹽的緩沖液的磷酸鹽濃度和通過樹脂的含磷酸鹽的緩沖液的量可變化，但通常 會選擇能減少、消除或逆轉在使用磷灰石的過程中（例如在純化過程中，在洗脫過程中，或 在清潔/剝離過程中）發(fā)生的樹脂劣化的任何量。不希望受理論限制，相信含磷酸鹽的緩 沖液與磷灰石固體表面，或與在與緩沖的鈣溶液接觸過程中形成的松散結合的鈣層相互反 應，以在磷灰石固體表面上形成松散結合（例如非共價結合）的磷酸鹽層。在一些情況中， 所述磷酸鹽層替代了一些或全部（或更多）的之前純化步驟中的磷酸鹽損失。因此，磷酸 鹽的量、體積、濃度等，或會減少、消除或逆轉在磷灰石使用過程中發(fā)生的樹脂劣化的含磷 酸鹽的緩沖液的任何其它組分或方面，可以是允許足夠形成松散結合的磷酸鹽層的量。
[0065] 含有磷酸鹽的緩沖液的磷酸鹽濃度通常選擇低于在緩沖液的pH和溫度下磷酸鹽 的溶解度極限。此外，所述濃度可基于緩沖液其它組分的存在或不存在，或任何前述緩沖液 選擇的組成而改變。在此概念的某些實施方式中，采用以下磷酸鹽濃度將獲得最佳結果： 從約10mM至約1、1.5或2M;約20mM-1.5M;或約25mM-lM;或約50mM-lM;包括至少約，或 約 10mM、15mM、20mM、25mM, 30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、llOmM、150mM、 200mM、300mM、500mM、750mM、lM或更高。在一些情況中，所述磷酸鹽濃度為10mM、15mM、 20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、200mM、300mM、 500mM、750mM、lM或更高。在一些情況中，所述磷酸鹽濃度從或從約0. 1或2M至或至約 0. 4M、0. 5M、或1M。在一些情況中，將所述柱與低濃度磷酸鹽緩沖液（例如2、5、10、15、20或 25mM