磷灰石原位恢復(fù)的制作方法
【專利說明】磷灰石原位恢復(fù)
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求于2014年6月23日提交的美國臨時申請第62/015, 894號和2014年 11月19日提交的美國臨時申請第62/082, 017號的優(yōu)先權(quán)，兩者的全部內(nèi)容通過引用納入 本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 在其它磷灰石固體表面之中，將磷灰石固體支持面，包括羥基磷灰石、陶瓷磷灰 石、氟磷灰石和氟強化磷灰石（fluoride enhanced apatite)，用于各種目標(biāo)分析物的純 化。磷灰石最常用于生物分析物純化，所述生物分析物包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、多核苷酸 和病毒顆粒。磷灰石具有作為純化支持物的獨特性質(zhì)，因為其在單一支持物中提供親和性、 陽離子和陰離子交換形式。磷灰石純化通?？梢詢煞N方式進行：（i)流動通過純化；和（ii) 結(jié)合和洗脫純化。
[0004] 通常，對于流動通過純化，操作人員（a)在合適的緩沖液中平衡柱；(b)在一定條 件下向柱中加入樣品，在所述條件中雜質(zhì)與所述柱結(jié)合而目標(biāo)分子流動通過并被收集；（c) 用清潔/剝離溶液（例如高摩爾濃度磷酸鹽溶液）清潔或剝離所述柱以去除吸附的生物化 合物；以及（d)用強堿性氫氧化物溶液再生或消毒所述柱從而可以重新使用所述柱。在一 些情況下，用低摩爾濃度的清洗液替代所述強堿性氫氧化物溶液，以用于長期保存或重新 平衡。
[0005] 通常，對于結(jié)合和洗脫純化，操作人員（a)在合適的緩沖液中平衡柱；(b)在一定 條件下向所述柱中加入樣品，在所述條件中目標(biāo)分子與所述柱結(jié)合；（c)洗脫所述目標(biāo)分 子（例如用高摩爾濃度磷酸鹽溶液和/或堿性鹵化物溶液）；(d)用清潔溶液（例如高摩爾 濃度磷酸鹽溶液）清潔或剝離所述柱以去除吸附的生物化合物；以及（e)用強堿性氫氧化 物溶液再生或消毒所述柱從而可以重新使用所述柱。在一些情況下，用低摩爾濃度的清洗 液替代所述強堿性氫氧化物溶液，以用于長期保存或重新平衡。
[0006] 這些常規(guī)的磷灰石純化方法的缺點在于差的再現(xiàn)性和/或過早的磷灰石劣化。在 一些情況下，該劣化是由于在暴露于平衡、加載或色譜緩沖液的過程中磷灰石表面水合氫 離子（H30+)的累積。水合氫離子的累積可在暴露于pH等于或低于8.0的堿金屬鹽的過程 中發(fā)生。水合氫離子的累積也可在暴露于pH小于約6. 5的磷酸鹽緩沖液的過程中發(fā)生。其 它緩沖組合物也可引起水合氫離子累積。隨后，當(dāng)暴露于后續(xù)緩沖液，例如洗脫緩沖液（例 如在結(jié)合和洗脫純化過程中）或清潔/剝離緩沖液（例如流動通過純化之后）時，這些水 合氫離子解吸。所述解吸導(dǎo)致樹脂隨時間劣化，導(dǎo)致樹脂質(zhì)量損失和/或樹脂的顆粒強度 降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在由樣品純化目標(biāo)分子的色譜過程中或之后，可通過用緩沖的鈣 溶液處理磷灰石固體表面，接著用磷酸鹽緩沖的溶液處理，接著用堿性氫氧化物處理而明 顯減少、消除或逆轉(zhuǎn)磷灰石固體表面的劣化。所述緩沖的鈣溶液、磷酸鹽緩沖溶液和堿性氫 氧化物可接下來應(yīng)用于結(jié)合和洗脫或流動通過純化過程。
[0008] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用磷灰石固體表面純化目標(biāo)分析物的方法，所述方 法包括：(a)用目標(biāo)分析物接觸磷灰石固體表面，從而將目標(biāo)分析物與一種或多種污染物 分離；(b)收集所述目標(biāo)分析物；以及（c)再生所述磷灰石固體表面，所述再生包括：（i)用 緩沖的鈣溶液（包含濃度至少約為5mM的鈣離子和緩沖劑）接觸所述磷灰石固體表面，其 中緩沖劑濃度與鈣離子濃度的比例至少為約1、1. 5或2,所述溶液的pH至少為約5、5. 1、 5. 2、5. 3、5. 4或5. 5 ; (ii)用pH至少為約6. 5的磷酸鹽緩沖溶液與所述磷灰石固體表面接 觸；以及（iii)用含有氫氧化物的溶液接觸所述磷灰石固體表面。在一個實施方式中，所述 緩沖劑是兩性離子緩沖劑。在一個實施方式中，所述緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑。
[0009] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種用磷灰石固體表面純化目標(biāo)分析物的方法， 所述方法包括：(a)用目標(biāo)分析物接觸磷灰石固體表面，從而從一種或多種污染物中分離 目標(biāo)分析物；(b)收集所述目標(biāo)分析物；以及（c)再生所述磷灰石固體表面，所述再生包括： (i)用緩沖鈣溶液（包含濃度至少約為10mM的鈣離子和兩性離子緩沖劑）接觸所述磷灰 石固體表面，其中兩性離子緩沖劑濃度與鈣離子濃度的比例至少為約2,所述溶液的pH至 少為約6. 5 ; (ii)用pH至少為約6. 5的磷酸鹽緩沖溶液與所述磷灰石固體表面接觸；以及 (iii)用含有氫氧化物的溶液接觸所述磷灰石固體表面。
[0010] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述方法（a)包括將所述目標(biāo) 分析物與磷灰石固體表面結(jié)合，以及（b)包括從所述磷灰石固體表面洗脫所述目標(biāo)分析 物。在另一個實施方式中，所述方法（a)包括將所述磷灰石固體表面與所述目標(biāo)分析物接 觸，從而將所述目標(biāo)分析物流動通過所述磷灰石固體表面，以及（b)包括在流動通過物中 收集所述目標(biāo)分析物。
[0011] 在一些情況中，所述兩性離子緩沖劑是含磺酸的緩沖劑。在一些情況中，所述含磺 酸的緩沖劑是MES、PIPES、ACES、M0PS0、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、P0PS0 或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO或CHES。在一些情況中，所述含磺酸的緩沖劑是MES。
[0012] 在一個實施方式中，所述f丐離子至少為約lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM(例如 10.ImM、10. 2mM、10. 3mM、10. 4mM或 10. 5mM)，20mM、25mM或至少為約 50mM。在另一個實施方 式中，緩沖劑濃度（例如兩性離子緩沖劑濃度）與鈣離子濃度的比例至少為約2. 5、3或4。 在另一個實施方式中，所述緩沖的鈣溶液包含氯化鈣或硝酸鈣。在另一個實施方式中，所述 磷酸鹽緩沖溶液包含含有約〇. 1M或0. 2M至10M磷酸鹽，或0. 1M或0. 2M至0. 5M磷酸鹽， pH為約6. 5-8的溶液，。在一些情況中，所述磷酸鹽緩沖溶液包含400mM磷酸鹽，pH為7. 0。
[0013] 在一個實施方式中，所述氫氧化物包括堿性氫氧化物。在一些情況中，所述堿性氫 氧化物包括氫氧化鈉或氫氧化鉀。在一個實施方式中，所述再生逆轉(zhuǎn)或消除了在蛋白質(zhì)純 化或柱清潔步驟中發(fā)生的所述柱的降解。在另一個實施方式中，所述再生將磷灰石固體表 面的強度增加了至少約1 %、5%、10%、15%、20%或更多。
[0014] 在一個實施方式中，所述再生在洗脫吸附的生物化合物的磷酸鹽清潔/剝離步驟 之前進行或替代上述步驟進行。在一些情況中，所述再生步驟在洗脫目標(biāo)分析物之后進行。
[0015] 在一個實施方式中，所述（ii)將所述磷灰石固體表面與含有磷酸鹽，pH至少為約 6. 5的溶液接觸的步驟還包括：將所述磷灰石固體表面與含有磷酸鹽濃度為10mM或低于約 10mM，pH至少為約6. 5或7的溶液接觸；隨后將所述磷灰石固體表面與含有磷酸鹽濃度至 少為約100mM、200mM、400mM或500mM，pH至少為約6. 5或7的溶液接觸。
[0016] 在一個實施方式中，所述再生包括（i)、清洗、（ii)和（iii)。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :顯示了進行實施例7,表X的磷灰石純化表征的結(jié)果。
[0018] 圖2 :顯示了所示原位再生溶液的應(yīng)用之后，進行實施例7,表X的純化表征的結(jié) 果。
[0019] 圖3 :顯示了所示原位再生溶液的應(yīng)用之后，進行實施例7,表X的純化表征的結(jié) 果。
[0020] 圖4 :顯示了所示原位再生溶液的應(yīng)用之后，進行實施例7,表X的純化表征的結(jié) 果。
[0021] 圖5 :顯示了所示原位再生溶液的應(yīng)用之后，進行實施例7,表X的純化表征的結(jié) 果。
[0022] 定義
[0023] "磷灰石"是指通式為Ca5(P04)3(X)的磷酸鹽和鈣的礦物，其中X為帶負(fù)電荷的離 子。通常X是F、C1或0H。不過磷灰石的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)允許有多種替代，包括替代結(jié)構(gòu) 中Ca的各種金屬陽離子（例如K、Na、Mn、Ni、Cu、Co、Zn、Sr、Ba、Pb、Cd、Sb、Y、U或各種稀 土元素中的一種或多種），以及替代結(jié)構(gòu)中P〇43的陰離子復(fù)合物（例如AsO43、S042、C032、 Si044等）。
[0024] "羥基磷灰石"是指包含結(jié)構(gòu)式為Ca1(] (P04) 6 (0H) 2的不可溶的磷酸鈣的羥基化礦物 的混合式固體支持物。其相互作用的主要模式是磷?；栯x子交換和鈣金屬親和力。羥基 磷灰石是市售可得的，其有各種形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶體形式和復(fù)合材料形式。 復(fù)合材料形式包含包埋在瓊脂糖或其它珠的孔內(nèi)的羥基磷灰石微晶。
[0025] "氟磷灰石"是指包含結(jié)構(gòu)式為Ca1(](P04)6F2的不可溶的磷酸鈣的加氟 (fluoridated)礦物的混合式支持物。其相互作用的主要模式是磷?；栯x子交換和鈣金 屬親和力。氟化磷灰石是市售可得的，其有各種形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶體形式和 復(fù)合材料形式。
[0026] "磷灰石固體表面"是指稠合的納米晶體（陶瓷磷灰石）、微晶或化合的磷灰石的 微晶。磷灰石固體表面包括但不限于羥基磷灰石或氟磷灰石。陶瓷磷灰石包括但不限于陶 瓷羥基磷灰石（例如CHT?)或陶瓷氟磷灰石。陶瓷磷灰石是磷灰石礦物的一種形式，其中 納米晶體團聚成顆粒并在高溫下熔凝以形成適用于色譜應(yīng)用的穩(wěn)定的陶瓷微球?；系?微晶包括但不限于HAUltragel?(珀爾公司（PallCorp.))。微晶包括但不限于Bio-Gel HTP、HT、DNA級HT(伯樂公司（Bio-Rad))和HypatiteC(克拉克森色譜公司(ClarksonChromatography))。
[0027] "樣品"是指含有感興趣的目標(biāo)分子或顆粒的任何組合物。樣品可以未純化或部分 純化。樣品可包括生物來源的樣品，包括但不限于：血液或血液組分（包括但不限于血清）、 尿液、唾液、排泄物以及組織。樣品可來源于未純化的、部分純化的或純化的細(xì)胞裂解物或 用過的細(xì)胞生長介質(zhì)。
[0028] 使用后出現(xiàn)的樹脂劣化可造成樹脂顆粒失去其強度，并因而斷裂成導(dǎo)致柱內(nèi)阻塞 的較小顆粒。劣化也可以磷灰石的化學(xué)破損形式出現(xiàn)，造成質(zhì)量損失，這可轉(zhuǎn)而導(dǎo)致出現(xiàn) 柱體積損失、顆粒強度損失、顆粒斷裂增加或其組合。在本發(fā)明的一些實施方式中，通過本 發(fā)明逆轉(zhuǎn)這類作用?？赏ㄟ^實踐本發(fā)明而實現(xiàn)的劣化的逆轉(zhuǎn)可導(dǎo)致較低的樹脂質(zhì)量損失速 率、較低的顆粒強度減弱速率，或同時導(dǎo)致上述兩者。在許多情況中，劣化的逆轉(zhuǎn)可伴隨樹 脂質(zhì)量增加、顆粒強度增加或兩者均有。
[0029] 可通過例如稱重干燥的磷灰石樣品，例如清洗掉緩沖液組分和吸附的生物化合物 后的樣品，來測定磷灰石固體表面的質(zhì)量?？赏ㄟ^例如測量耐攪動力（例如攪拌）、耐超聲 處理或耐壓縮（例如單軸壓縮力的應(yīng)用）來測定磷灰石介質(zhì)強度?？赏ㄟ^檢查處理后的磷 灰石固體表面以測量細(xì)小物質(zhì)的生成來測定對超聲處理或攪動力的耐受性?？赏ㄟ^測量將 給定質(zhì)量的磷灰石壓縮到設(shè)定的恒定終端力所需的力并測定壓縮距離來測量耐壓縮性?？?相對于沒有經(jīng)受過磷灰石純化（例如使用磷灰石的目標(biāo)分子的純化）或磷灰石再生過程的 樣品來測定磷灰石劣化或降解。
[0030] "堿性氫氧化物"是指包含元素周期表第1族中任何陽離子元素（包括例如鋰 (Li)、鈉（Na)、鉀（K)、銣（Rb)、銫（Cs)和鈁（Fr))的堿金屬氫氧化物。