一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的制備方法，為一種新型 的病毒液純化工藝。屬于獸用生物制品制造領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫（Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV)引起的禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟。以 高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、粘膜和漿膜出血為特征。該病死亡率高，對養(yǎng)雞業(yè)危害嚴(yán) 重，0ΙΕ將其列為A類疾病。
[0003] 雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitious，IB)是由禽傳染性支氣管炎病毒 (Infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性的、高度接觸性的二類動物傳 染病。自1931年雞傳染性支氣管炎首次被發(fā)現(xiàn)于美國后，關(guān)于該病發(fā)生和流行的報(bào)道在世 界各地相繼出現(xiàn)，而我國IB和IBV的情況更為嚴(yán)重和復(fù)雜。目前，雞傳染性支氣管炎所引 起的生產(chǎn)效益下降的損失要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于直接死亡，對養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)快速穩(wěn)定發(fā)展造成了極大 的影響，是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一，但雞傳染性支氣管炎尚無有效的治療藥物，疫 苗免疫為該病的主要防治手段，故開展疫苗的研究對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。
[0004] 我國防控新城疫和傳染性支氣管炎主要依靠疫苗免疫。目前，控制新城疫和傳染 性支氣管炎發(fā)病的主要手段是接種滅活苗或弱毒苗，其生產(chǎn)主要依靠雞胚法實(shí)現(xiàn)。提高疫 苗抗原含量、純度，能夠有效提高疫苗的免疫原性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為在疫苗制備過程中提高疫苗抗原的含量和純度，使之有效提高 疫苗的免疫效力和安全性。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] 1. -種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于該方法包 括以下步驟：制苗用病毒液的制備，使用深層過濾裝置進(jìn)行過濾，分裝，凍干。
[0008] 2.如權(quán)利要求1所述的雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特 征在于具體包括以下步驟：
[0009] (1)病毒液的制備：將生產(chǎn)用種毒接種10日齡SPF雞胚，收獲雞胚液；
[0010] (2)病毒液經(jīng)深層過濾裝置處理，即：雞胚液與深層過濾裝置接觸，以300L/m2/ hr~500L/m2/hr的流速過濾具有大粒徑分布的蛋殼碎片、殼膜和血液，分離目的抗原與雜 質(zhì)；
[0011] (3)分裝及凍干：加入適量的5%蔗糖脫脂牛奶作穩(wěn)定劑及抗生素，定量分裝，每 羽份病毒含量：La sota 彡 106EID5(];H120 彡 10 3'5EID50;
[0012] (4)迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。
[0013] 3.如權(quán)利要求1和2所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的制備方 法，其特征在于其中的病毒經(jīng)深層過濾裝置處理方法在用禽蛋作為病毒復(fù)制原料制備的活 疫苗中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明詳細(xì)描述
[0015] 為了完成上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一種高效的禽病病毒液純化抗原工藝，包 括以下步驟：
[0016] 1.提供禽病病毒培養(yǎng)液和深層過濾裝置：分別使病毒培養(yǎng)液與深層過濾裝置接 觸，以300L/m2/hr~500L/m2/hr的流速過濾具有大粒徑分布的蛋殼碎片、殼膜和血液，分離 目的抗原與雜質(zhì)。
[0017] (1)本發(fā)明提供一種深層過濾裝置（瑞士 FILTR0X公司），AF09深層過濾濾濾膜， 包括具有30~10 μ m多個分級的深層濾器介質(zhì)，用于初步澄清和去除聚集的殼膜和血液團(tuán) 塊，提高未澄清的進(jìn)料流的通量而沒有不期望的濾餅過濾效應(yīng)；
[0018] (2) AF09濾膜有非常高的深度以分散尿囊液中的雜質(zhì)，防止會導(dǎo)致介質(zhì)中的內(nèi)部 濾餅過濾的內(nèi)部絮狀物橋接，在介質(zhì)的外部或內(nèi)部以避免壓力的濃度降低引起絮狀物分 解；
[0019] (3)具有各向異性深層濾器層，即孔徑逐步減少，匹配料液中絮狀物大小的群體；
[0020] (4)對于平均粒徑大于10 μπι的目標(biāo)抗原的初步澄清（通常是采用絮凝劑和化學(xué) 處理的料液的初步澄清）；
[0021] (5) AF09濾膜具有開放標(biāo)稱孔徑評級的非織造纖維和纖維素/硅藻土 (diamatoceous earth)的復(fù)合分級層，能夠過濾具有大量固體的聚合物絮凝劑處理的進(jìn)料 流；
[0022] (6) AF09濾膜具有較大通透性，但對于聚合物絮凝劑處理的進(jìn)料流有較好的保持 特性。
[0023] 2.經(jīng)以上純化處理的雞胚液，按規(guī)定羽份加入適量的5%蔗糖脫脂牛奶作穩(wěn)定劑 及抗生素，定量分裝后，迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。
[0024] 使用兩種或以上病毒抗原液制備多價疫苗，是根據(jù)傳染性支氣管炎病毒型的種 類，可分別制備不同亞型傳染性支氣管炎病毒株的雞胚培養(yǎng)液經(jīng)以上純化處理后，按規(guī)定 羽份加入適量的5%蔗糖脫脂牛奶作穩(wěn)定劑及抗生素，定量分裝后，迅速進(jìn)行冷凍真空干 燥。。
[0025] 本發(fā)明使用微生物資源信息
[0026] 本發(fā)明疫苗生產(chǎn)用新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV)為La Sota株 (CVCC AV1615)，生產(chǎn)用傳染性支氣管炎病毒（Intfectious Bronchitis Vaccine)為 H120 株（CVCC AV1514)、H52株（CVCC AV1513)，均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。
[0027] 本發(fā)明積極意義
[0028] 本發(fā)明提供了一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的制備方法。該方法包 括以下步驟：（1)制苗用毒液的制備。（2)病毒的雞胚液使用深層過濾裝置以300L/m2/hr~ 500L/m2/hr的流速進(jìn)行過濾；（3)分裝；（4)凍干。此方法制備的疫苗產(chǎn)量和安全性得到提 高且具有良好的免疫效果。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] -一新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗制備
[0032] 將SPF雞胚分別接種新城疫病毒La Sota株、傳染性支氣管炎病毒H120株，經(jīng)以 下方法純化處理、分裝凍干，用于新城疫、傳染性支氣管炎的預(yù)防。SPF雞胚購自北京梅里亞 維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。
[0033] 1.提供新城疫、傳染性支氣管炎病毒液和深層過濾裝置。
[0034] (1)本發(fā)明疫苗生產(chǎn)用新城疫病毒為La Sota株，傳染性支氣管炎病毒為H120株， 均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；兩種毒株分別接種10日齡SPF雞胚培養(yǎng)獲得抗 原液。
[0035] (2)用于深層過濾的裝置使用硅藻土作助濾劑，病毒抗原液與深層過濾裝置接觸， 以300L/m2/hr~500L/m2/hr的流速過濾具有大粒徑分布的蛋殼碎片、殼膜和血液，分離目 的抗原與雜質(zhì)。本實(shí)施例所用的深層過濾裝置適用病毒抗原液最佳流速為300L/m2/hr。
[0036] 2.將檢驗(yàn)合格的雞胚液混合于同一容器內(nèi)，按規(guī)定羽份加入適量的5%蔗糖脫脂 牛奶作穩(wěn)定劑，同時每lml疫苗加適量抗生素，充分搖勾，定量分裝。
[0037] 3.迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。
[0038] 實(shí)施例2
[0039] -一新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗產(chǎn)品檢驗(yàn)
[0040] 疫苗的質(zhì)量檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行（中國獸藥典委員會編，中華人民共和 國獸藥典三部二〇一〇年版，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，以下本發(fā)明稱《中國獸藥典》）。
[0041] 1.疫苗的物理性狀、無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、剩余水分測 定及真空度測定均證明制備的疫苗合格。過濾處理的水相料液澄清度明顯高于原工藝處理 的料液。
[0042] 2.疫苗的安全檢驗(yàn)
[0043] 試驗(yàn)分兩組進(jìn)行，A組采用原純化方法制備疫苗，B組采用本發(fā)明所用工藝制備疫 苗。
[0044] 將疫苗用生理鹽水稀釋，用4~7日齡SPF雞，每組10只各滴鼻接種0.05