魚精蛋白納米膠囊的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于活性成分給藥的包含基于魚精蛋白的納米級(jí)納米膠囊的系統(tǒng)，還 涉及包含所述系統(tǒng)的藥學(xué)組合物，及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 將活性成分裝入納米級(jí)系統(tǒng)中幫助解決了這些分子的制劑限制，還附帶地提高了 其治療潛力。活性分子的納米膠囊化或其在聚合物外殼中的吸附所提供的部分優(yōu)點(diǎn)在于， 提高了溶解性，防止降解，或提高活性成分滲透。還已知，所述系統(tǒng)穿越外部屏障進(jìn)入有機(jī) 體內(nèi)部的能力取決于其尺寸和成分。小分子的給藥程度高于較大分子，而直徑小于1 μm的 納米系統(tǒng)滿足該標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 此外，可以用聚合物材料涂覆所述納米膠囊。為此，魚精蛋白是其中一種可能的材 料，其屬于富含精氨酸的天然多肽族，在許多動(dòng)植物的精子生成過程中的最后精細(xì)胞期中 合成。Friedrich Miescher早在1868年就開始相關(guān)研究，至今已有許多研究工作來表征這 一分子量約為4000 - 1000 ODa的強(qiáng)堿性脂肪族多肽種類。魚精蛋白被證實(shí)為一種藥學(xué)賦形 劑，其目前主要應(yīng)用在于胰島素制劑NPH(中性魚精蛋白鋅胰島素）的緩釋制劑中，且由于 是肝素中毒的解毒劑而被用作活性物質(zhì)。
[0004] 已有許多關(guān)于該賦形劑的研究，主要是與脂質(zhì)體聯(lián)用以從細(xì)胞內(nèi)部釋放 DNA(Gene Ther. 1997. 4, 961 - 968)，標(biāo)記寡核苷酸，用作血管活性腸肽釋放的納米顆粒 (稱為 proticle)(J Control Release. 2008. 10; 130 (2) :192-8)，利用其理論抗菌活性（J Antimicrob Chemother. 2008Mar;61 (3) :651-7)等等。
[0005] 上述研究中，鑒于魚精蛋白的內(nèi)在活性，其與遺傳物質(zhì)形成復(fù)合物的能力得到了 廣泛應(yīng)用和研究，該能力是通過精氨酸基團(tuán)與核酸陰離子基團(tuán)的相互作用所賦予的高正電 荷的靜電相互作用，由此，魚精蛋白可在用作給藥載體的結(jié)構(gòu)中與DNA結(jié)合并沉淀。
[0006] 還有研究證明，該多肽的佐劑能力能夠提高白細(xì)胞介素2和干擾素 γ的分泌，以 及 T 細(xì)胞增殖（J Control Release. 2008; 10; 130 (2): 161-7)。
[0007] 盡管如此，魚精蛋白尚不能用于含有油性核心的魚精蛋白納米膠囊制劑中，因?yàn)?該多肽會(huì)破壞油/水乳劑的穩(wěn)定性。鑒于此，有必要設(shè)計(jì)一種穩(wěn)定性不受魚精蛋白影響并 能從其性質(zhì)受益的新型納米膠囊系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人研究出了一種納米膠囊系統(tǒng)，其含有魚精蛋白，但不會(huì)因此而失 去穩(wěn)定性。該納米膠囊系統(tǒng)穩(wěn)定，易生產(chǎn)，且還能有效地聯(lián)合不同種類的親水和親脂活性成 分。所述納米膠囊的小尺寸（直徑小于Iym)和魚精蛋白的表面正電荷能夠與帶負(fù)電荷的 有機(jī)體生物表面（例如粘膜）相互作用，能夠穿越所述表面進(jìn)入細(xì)胞。聚合物外殼的存在 還給納米膠囊提供了更高的穩(wěn)定性和魚精蛋白的典型有益特征。
[0009] 因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種用于活性成分給藥的納米膠囊系統(tǒng)（下文中稱 "本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)"），該納米膠囊系統(tǒng)包括：
[0010] a.含有多肽魚精蛋白或由多肽魚精蛋白組成的表面層；
[0011] b.油性核心；
[0012] c.表面活性劑，其親水-親油比率（親水-親油平衡值（HLB))大于8 ;以及
[0013] d.可選地，至少一種活性物質(zhì)，
[0014] 其中，所述活性劑不是磷脂。
[0015] 適用于實(shí)施本發(fā)明的表面活性劑的例子為：聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫 80Φ )，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（吐溫20? )，聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂酸酯（吐 溫61?:)，聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫81?)，聚氧乙烯脫水山梨醇三硬脂酸酯（吐 溫65?:)，聚氧乙烯山梨糖醇三油酸酯（吐溫85Φ)，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（吐溫 21? )，聚乙二醇單硬脂酸酯，聚乙二醇硬脂酸酯，聚乙二醇二月桂酸酯，聚乙二醇單棕櫚酸 酯，聚乙二醇硬脂酸酯，泊洛沙姆124,泊洛沙姆188,泊洛沙姆237,泊洛沙姆338,泊洛沙 姆407, S0LUT0L HSI5 h TPGS，三乙醇銨油酸酯，油酸鈉，膽酸鈉，脫氧膽酸鈉，月桂基硫酸 鈉，油酸三乙醇胺，黃蓍膠，十二烷基硫酸鈉，或上述表面活性劑的任意組合。所述表面活性 劑選自：膽酸鈉，聚乙二醇硬脂酸酯，Solutol HS15?，TPGS，聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯 (吐溫幼? )，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（吐溫20? )，或所述表面活性劑的任意組合。
[0016] 適用于實(shí)施本發(fā)明的油性核心為：棉籽油，橄欖油，蓖麻油，大豆油，紅花油，棕櫚 油，α生育酸（維生素 E)，肉豆蔻酸異丙酯，藍(lán)稀，Miglyol?，Labrafi.l·?，: Labrafac?，. Peceol⑧和 Miusine?或其任意組合。優(yōu)選地，該油性核心選自：Miglyd? (例如Miglyol 812)，鯊稀，α 生育酚，或其任意組合。
[0017] 本發(fā)明的第一方面的一個(gè)特定實(shí)施例中，本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)包括：
[0018] a.含有多肽魚精蛋白或由多肽魚精蛋白組成的表面層；
[0019] b.選自Miglyd#、鯊烯、α生育酚或其任意組合的油性核心；
[0020] c.表面活性劑，其親水-親油比率（親水-親油平衡值（HLB))大于8,選自膽酸 鈉，聚乙二醇硬脂酸酯，SOLUT()LK.HSI5, 'IPGS，聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫:8C_ )， 聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（吐溫20? )或其任意組合；以及
[0021] d.可選地，至少一種活性物質(zhì)。
[0022] 本發(fā)明的第一方面的又一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)的特征在于，其為 凍干形式。
[0023] 本發(fā)明的第二方面涉及用于制備本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)（下文稱為"本發(fā)明的制 備方法"）的方法。因此，為了制備期望尺寸范圍的納米膠囊，該方法制得含有油和一種或 多種表面活性劑的油性核心，并通過不同類型相互作用在其表面上結(jié)合聚合物涂層。因此， 其為一種溶劑分散方法，其以可控形式進(jìn)行，并為該系統(tǒng)提供穩(wěn)定性，而無需在成分之間制 造共價(jià)鍵。
[0024] 因此，本發(fā)明的第二方面的一個(gè)特定實(shí)施例中，本發(fā)明的制備方法是一步式溶劑 擴(kuò)散方法，包括以下步驟：
[0025] a.制備含有多妝魚精蛋白的水溶液；
[0026] b.制備含有油性核心成分和一種或多種特征親水-親油比率大于8的表面活性劑 成分的有機(jī)溶液；
[0027] c.攪拌混合根據(jù)步驟a和b制得的所述溶液，生成納米膠囊；以及
[0028] d.可選地，令根據(jù)前述步驟所制得的混合物中的有機(jī)溶劑全部蒸發(fā)或部分蒸發(fā)至 恒定體積，
[0029] 其中，所述表面活性劑不是磷脂。
[0030] 本發(fā)明的第二方面的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的制備方法是兩步式溶劑擴(kuò)散 方法，包括以下步驟：
[0031] a.制備含有油性核心成分和一種或多種特征親水-親油比率大于8的表面活性劑 成分的有機(jī)溶液；
[0032] b.將步驟a制得的所述溶液添加到可選地包含水溶性表面活性劑的水相中，攪拌 生成納米乳劑；
[0033] c.可選地，令有機(jī)溶劑全部蒸發(fā)或部分蒸發(fā)至恒定體積；以及
[0034] d.將根據(jù)前述步驟所制得的納米乳劑與含魚精蛋白的水溶液共培養(yǎng)，以涂覆所述 納米乳劑，
[0035] 其中，所述表面活性劑不是磷脂。
[0036] 當(dāng)本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)包含活性物質(zhì)時(shí)，本發(fā)明的制備方法可包含：若所述活 性成分若為親脂性，則添加到所述有機(jī)溶液中，若為親水性，則添加到所述水溶液中。優(yōu)選 地，所述活性物質(zhì)選自多西紫杉醇，重組乙肝抗原（rHBsAg)，HlNl流感抗原，核酸，糖類化 合物，肽，蛋白質(zhì)或其任意組合。
[0037] 本發(fā)明的第三方面涉及本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)的治療用途。
[0038] 本發(fā)明的第三方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)包含多西紫杉醇 作為活性物質(zhì)，且用于治療癌癥，優(yōu)選為肺癌或胰腺癌。
[0039] 本發(fā)明的第三方面的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)包含重組乙肝 抗原（rHBsAg)作為活性物質(zhì)，且用于治療或預(yù)防乙肝。
[0040] 本發(fā)明的第三方面的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)包含HlNl流 感重組抗原（HI)作為活性物質(zhì)，且用于治療或預(yù)防HlNl流感。
[0041] 本發(fā)明的第四方面涉及包含本發(fā)明的納米膠囊系統(tǒng)且可選地包含一種或多種藥 學(xué)可接受的賦形劑的藥物組合物。
【附圖說明】
[0042] 圖I :A549癌細(xì)胞系與載有DCX的魚精蛋白納米膠囊、空白魚精蛋白納米膠囊、DCX 的乙醇溶液和乙醇接觸24小時(shí)和48小時(shí)后的細(xì)胞活性。
[0043] 圖2 :H460癌細(xì)胞系與載有DCX的魚精蛋白納米膠囊、空白魚精蛋白納米膠囊、DCX 的乙醇溶液和乙醇接觸24小時(shí)和48小時(shí)后的細(xì)胞活性。
[0044] 圖3 =MiaPaCa 2癌細(xì)胞系與載有DCX的魚精蛋白納米膠囊、空白魚精蛋白納米膠 囊、DCX的乙醇溶液和乙醇接觸24小時(shí)和48小時(shí)后的細(xì)胞活性。
[0045] 圖4 :BxPC3癌細(xì)胞系與載有DCX的魚精蛋白納米膠囊、空白魚精蛋白納米膠囊、 DCX的乙醇溶液和乙醇接觸24小時(shí)和48小時(shí)后的細(xì)胞活性。
[0046] 圖5 :經(jīng)載有乙肝抗原（IOyg)的鯊烯油（SQL)和α生育酚（TCPH)魚精蛋白納 米膠囊的鼻腔給藥（in) (3劑）、肌肉內(nèi)給藥（im) (2劑）和聯(lián)合給藥（im, in)(肌肉內(nèi)1劑， 鼻腔2劑）的小鼠，與經(jīng)氫氧化鋁吸附抗原的肌肉內(nèi)給藥（2劑）的小鼠相比的血液IgG抗 體水平。
[0047] 圖6 :經(jīng)載有劑量為2和7. 5 μ g的流感抗原的α生育酚（TCPH)魚精蛋白納米膠 囊的皮下給藥的小鼠的血液IgG抗體水平的相應(yīng)吸光度水平。
[0048] 圖7 :魚精蛋白納米膠囊中吸附的重組乙肝抗原在凍干處理后的免疫印跡分析。
[0049] 圖8 :RAW 264. 7巨噬細(xì)胞系與鯊烯（SQL)或α生育酚（TCPH)核心的魚精蛋白納 米膠囊接觸24小時(shí)和48小時(shí)后的細(xì)胞活性。
[0050] 圖9 :以PEG硬脂酸/膽酸鈉表面活性劑和MiglyoKS)油組合制備的魚精蛋白納米膠 囊的透射電子顯微鏡（TEM)圖像。
[0051] 圖10 :以PEG硬脂酸/膽酸鈉表面活性劑和α生育酚油制備的魚精蛋白納米膠 囊的共聚焦顯微鏡圖像。其裝載了流感（HlNl)抗原作為活性分子。
[0052] 圖11 :魚精蛋白納米膠囊誘導(dǎo)的補(bǔ)體活化的免疫印跡分析。研究了不同濃度的α 生育酚（TCPH，左）或鯊烯（SQL，右）魚精蛋白納米膠囊。陰性對(duì)照是PBS (C-)，陽性對(duì)照是 眼鏡蛇毒（C+)。
[0053] 圖12 :: α生育酚（TCPH)核心的魚精蛋白納米膠囊對(duì)RM 264. 7活性的影響，通 過xCELLigence測(cè)定。培養(yǎng)了不同濃度的魚精蛋白納米膠囊（25為灰色，50為虛線，100為 黑色實(shí)線，單位μg/ml)。數(shù)值表示相對(duì)于對(duì)照（僅以培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞）的正態(tài)化細(xì)胞指 數(shù)。
[0054] 圖13 :室溫下保存的載有凍干riffisAg并重懸浮的魚精蛋白納米膠囊的物化表征。
[0055] 圖14 :載有rHBsAg的凍干魚精蛋白納米膠囊室溫下保存一年后的抗原（rHBsAg) 免疫印跡分析。
[0056] 圖15 :通過瓊脂糖凝膠電泳分析pDNA與魚精蛋白納米膠囊的結(jié)合。電泳道：1 :分 子量標(biāo)記；2 :對(duì)照pDNA ;3 :魚精蛋白納米膠囊+pDNA ;4 :肝素+對(duì)照pDNA ;5 :魚精蛋白納米 膠囊+pDNA。將樣品與過量肝素共培養(yǎng)，以允許pDNA從制劑中轉(zhuǎn)移（2h，37°C )。每道使用 Iyg pDNA。使用siRNA得到了類似實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0057] 圖16 :魚精蛋白納米膠囊結(jié)合的pEGFPF轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的熒光顯微鏡圖像。每孔 含1 μ g pEGFPF (24孔板），培養(yǎng)4h。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)生成圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0058] 本發(fā)明涉及用于活性物質(zhì)給藥的納米膠囊系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和開發(fā)，其中該系統(tǒng)中的納 米膠囊的平均直徑小于1 μπι，且特征性地包含（a)魚精蛋白外殼，（b)油性核心和一種或多 種表面活性劑，其親水-親油比率（親水-親油平衡值（HLB))大于8,其中所述活性劑不是 磷脂。
[0059] 已知魚精蛋白令油/水乳劑不穩(wěn)定。事實(shí)上，哪怕使用表面活性劑，例如脂蛋白或 其他具有磷脂結(jié)構(gòu)的表面活性劑（例如卵磷脂，磷脂酰甘油，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇， 雙磷脂酰甘油，磷脂酸，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺），也無法穩(wěn)定含有魚精蛋白的油/水 乳劑。本發(fā)明的實(shí)施例1確認(rèn)了該事實(shí)，其中發(fā)明人試圖使用磷脂（例如卵磷脂、修飾卵磷 脂或溶血卵磷脂）作為表面活性劑來制備以包含（a)魚精蛋白外殼和（b)油性核心為特 征、平均直徑小于I ym的納米膠囊系統(tǒng)，但沒有成功。
[0060] 因此，無法使用魚精蛋白制備此類制劑。因此，為了解決該問題，本發(fā)明的發(fā)明人 設(shè)計(jì)了不被魚精蛋白破壞穩(wěn)定性且能受益于其性質(zhì)的新型納米膠囊系統(tǒng)。
[0061] 在此意義上，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用特征為親水-親脂比率（親水-親脂平衡 (HLB))大于8(優(yōu)選為大于12)的某些類型的表面活性劑，可以生產(chǎn)包含以含有（a)魚精蛋 白外殼和（b)油性核心為特征的魚精蛋白納米膠囊的系統(tǒng)。因此，實(shí)施例2. 1至2. 18說明 了如何使