含有CpG寡核苷酸的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明總體上涉及一種含有CpG寡核苷酸的藥物組合物，具體而言，本發(fā)明涉及 基于CpG寡核苷酸與鋁佐劑的協(xié)同作用的用于加強(qiáng)針對抗原的免疫反應(yīng)的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)是危害公眾健康的全球性重大問題，使用疫苗能有效預(yù)防 HBV感染，降低慢性肝炎攜帶率，控制乙肝流行。據(jù)WT0報道，自1982年以來，全世界已經(jīng)使 用了 10億劑量的乙型肝炎病毒疫苗，對預(yù)防和控制乙型肝炎病毒的傳播起到了非常重要 的作用。由于HBV采用的是易出錯的基于RNA的復(fù)制，從而導(dǎo)致乙肝表面抗原（HBsAg)改變 的HBV抗性逃避突變株的出現(xiàn)。目前市場上預(yù)防用乙型肝炎疫苗均用氫氧化鋁（A1(0H)3) 作為佐劑，其能夠增強(qiáng)Th2類免疫應(yīng)答和體液免疫，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生和分泌保護(hù)性抗體 IgGl，氫氧化鋁起貯藏作用且推遲抗原清除的時間，延長抗原暴露于免疫系統(tǒng)的時間；同時 活化補(bǔ)體，提高淋巴結(jié)誘捕能力和淋巴細(xì)胞的滯留時間；吸附抗原并轉(zhuǎn)運(yùn)抗原至淋巴結(jié)，產(chǎn) 生免疫應(yīng)答；包裹抗原并緩慢地釋放，起到抗原倉庫的作用。但近年隨著疫苗學(xué)及免疫學(xué)的 發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)其局限性：氫氧化鋁主要刺激Th2相關(guān)抗體的產(chǎn)生（包括IgE)，但不能誘導(dǎo)產(chǎn) 生Thl細(xì)胞免疫反應(yīng)，不能刺激Thl活性，也不能加強(qiáng)細(xì)胞免疫（CTL)，阻斷CD8+CTL的激 活。這種抗體雖能中和掉細(xì)胞外的病毒，但不能徹底清除掉潛伏在感染細(xì)胞中的乙型肝炎 病毒，往往導(dǎo)致患者體內(nèi)乙型肝炎病毒的藏匿。而且人群中有10%左右的人對該疫苗反應(yīng) 力低下或無反應(yīng)。如何提高現(xiàn)有乙型肝炎病毒疫苗的免疫活性或研制出能有效激發(fā)清除藏 匿于細(xì)胞中的乙型肝炎病毒的疫苗尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于誘導(dǎo)受治者體內(nèi)的免疫反應(yīng)的藥物 組合物，其包含：（a) 1iig/ml-100iig/ml抗原，（b) 25iig/ml-500iig/ml含有序列 5' -tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3' 的CpG寡核苷酸，和（c)25iig/ml-500iig/ml錯佐劑。
[0004] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述CpG寡核苷酸的序列為 5' -tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3'，所述錯佐劑為氫氧化錯，所述抗原為與病毒相關(guān)的抗 原；優(yōu)選地，所述病毒選自：肝炎病毒，例如，重組人乙型肝炎病毒，所述抗原為乙肝表面抗 原。
[0005] 在本發(fā)明的藥物組合物中，所述鋁佐劑的濃度為：25iig/ml_125iig/ml，或 125ug/ml-500ug/ml，或 125ug/ml-400ug/ml，或 125ug/ml-300ug/ml，或 250ug/ ml-500ug/ml，或 300ug/ml-400ug/ml，或 400ug/ml-500ug/ml，或 300ug/ml-500ug/ ml。所述含有序列 5'-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3' 的CpG寡核苷酸（CpG-ODN)的濃度 為：125ug/ml-500ug/ml，或 25ug/ml-125ug/ml，或 125ug/ml-250ug/ml，或 250ug/ ml-500iig/ml。所述抗原的濃度為：20iig/mL。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的藥物組合物中，所述抗原的濃度為：20ii g/ ml，所述鋁佐劑的濃度為：250ii g/ml-500ii g/ml或300ii g/ml-500ii g/ml，所述CpG-ODN的 濃度為：125 ii g/ml-500 ii g/ml。
[0007] 在本發(fā)明更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原的濃度為：20ii g/ml，所述鋁佐劑的濃 度為：125 y g/ml、250 y g/ml、300 y g/ml、400 y g/ml或00 y g/ml，所述CpG-〇DN的濃度為： 125 u g/ml、250 u g/ml或500 u g/ml。
[0008] 在本發(fā)明尤為優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原的濃度為20 ii g/ml，所述鋁佐劑的濃 度為25 ii g/ml，所述CpG-ODN的濃度為500 ii g/ml ;或者所述抗原的濃度為20 ii g/ml，所 述鋁佐劑的濃度為25 ii g/ml，所述CpG-ODN的濃度為125 ii g/ml;或者所述抗原的濃度為 20 ii g/ml，所述鋁佐劑的濃度為125 ii g/ml，所述CpG-ODN的濃度為25 ii g/ml;或者所述抗 原的濃度為20 ii g/ml，所述鋁佐劑的濃度為300 ii g/ml，所述CpG-〇DN的濃度為125 ii g/ ml;或者所述抗原的濃度為20 ii g/ml，所述鋁佐劑的濃度為400 ii g/ml，所述CpG-〇DN的濃 度為125ii g/ml;或者所述抗原的濃度為20ii g/ml，所述鋁佐劑的濃度為125ii g/ml，所述 CpG-〇DN的濃度為500 y g/ml。
[0009] 本發(fā)明的藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑，所述賦形劑選自：溶劑、分散 介質(zhì)、包被劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑（例如，抗菌劑、抗真菌劑），等滲劑、延遲吸收 劑、鹽、藥物穩(wěn)定劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、顏料，以及它們的組合或類似 物。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明的藥物組合物在制備用于誘導(dǎo)受治者體內(nèi)針 對抗原的免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。通過使用藥物領(lǐng)域常用的賦形劑可將本發(fā)明的藥物組 合物配制為用于腸胃外給藥的劑型，例如，注射劑型；用于口服給藥的劑型，例如，片劑、藥 丸、膠囊、凝膠、糖漿、漿狀物和懸浮液，或用于透皮給藥的劑型，或者其他本領(lǐng)域常用的劑 型。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，通過本發(fā)明的藥物組合物配制的用于誘導(dǎo)受治者體內(nèi)針 對抗原的免疫反應(yīng)的藥物可為乙肝疫苗或丙肝疫苗，可選地，通過本發(fā)明的藥物組合物配 制的用于誘導(dǎo)受治者體內(nèi)針對抗原的免疫反應(yīng)的藥物為基因工程乙肝疫苗，包括重組酵母 乙肝疫苗和重組CH0乙肝疫苗。
[0011] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種誘導(dǎo)受治者體內(nèi)針對抗原的免疫反應(yīng)的方法，所 述方法包括：將有效量的本發(fā)明的藥物組合物給藥于所述受治者。所述方法還可包括將有 效量的本發(fā)明的藥物組合物再次給藥于所述受治者。其中，所述再次給藥的時間間隔為2 周至12周。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述再次給藥的時間間隔為4周。通過向受治者 給藥兩次本發(fā)明的藥物組合物即可誘導(dǎo)受治者體內(nèi)針對抗原的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生保護(hù)性抗體 應(yīng)答水平，這相對于目前給藥三次來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法而言，減少了給藥次數(shù)，縮短了誘 導(dǎo)受治者體內(nèi)的免疫反應(yīng)的全程免疫時間。
【附圖說明】
[0012] 圖1表示聯(lián)合使用不同濃度的CpG和不同濃度的鋁佐劑誘導(dǎo)HBsAg產(chǎn)生IgG的總 量的變化；
[0013] 圖2表示使用不同濃度的CpG和不同濃度的鋁佐劑聯(lián)合誘導(dǎo)HBsAg產(chǎn)生IgG2a亞 型的量的變化；
[0014] 圖3表示使用不同濃度的CpG和不同濃度的鋁佐劑聯(lián)合誘導(dǎo)HBsAg產(chǎn)生IgG2a與 IgGl的比值的變化；
[0015] 圖4表示使用不同濃度的CpG和不同濃度的鋁佐劑聯(lián)合在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)HBsAg產(chǎn) 生抗-HBs抗體滴度的變化；
[0016] 圖5表示使用不同濃度的CpG和不同濃度的鋁佐劑聯(lián)合在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)IFN-Y 產(chǎn)生的量的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明涉及的多個方面進(jìn)行詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用于舉 例說明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解的是，本發(fā)明不受實(shí)施例中所描述的具體操作步驟的 限制。
[0018] 除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語通常具有與本發(fā)明所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。
[0019] 術(shù)語釋義
[0020] 免疫佐劑
[0021] 本發(fā)明的免疫佐劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的免疫佐劑，其一般分為如下四 類：（1)微生物及其產(chǎn)物，常用的微生物有分枝桿菌、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌以及革蘭 氏陰性桿菌的提取物脂多糖，分枝桿菌的提取物胞壁酰二肽等；(2)多聚核苷酸，例如，多 聚肌苷酸：胞苷酸（poly1 :C)，多聚腺苷酸（poly1:A:ii)等；(3)弗氏佐劑，（4)無機(jī)物，例 如明礬，等。免疫佐劑主要通過以下機(jī)制起效：（1)刺激單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其對抗 原的處理和提呈能力；（2)延長抗原在體內(nèi)的存留期，增加與免疫細(xì)胞接觸的機(jī)會；（3)誘 發(fā)抗原注射部位及其局部淋巴結(jié)的炎癥反應(yīng)，有利于刺激免疫細(xì)胞的增殖作用。
[0022] CdG宴核苷酸
[0023] 本發(fā)明中所述的CpG寡核苷酸屬于新型免疫佐劑，其是由磷酸二酯鍵連接成的非 甲基化的二核苷酸，具有免疫刺激作用。CpG-ODN能促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化并分泌IL-6,從而 誘導(dǎo)抗體的分泌；激活單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子 (例如，IL-12,IL-6，TNF_a，IFN-a和IFN-3等）。通過細(xì)胞因子間接促進(jìn)殺傷性T細(xì)胞 (CTL)和天然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)病原體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，并誘導(dǎo)NK細(xì)胞 和T細(xì)胞分泌IFN-Y。除了誘導(dǎo)天然免疫反應(yīng)之外，CpG-ODN還可以增強(qiáng)抗原特異性反應(yīng)， 這是由于（1)通過B細(xì)胞抗原受體引發(fā)的信號傳導(dǎo)途徑和通過CpG引發(fā)的B細(xì)胞信號傳導(dǎo) 途徑之間存在強(qiáng)烈的協(xié)同作用；（2)能夠增加抗原特異性的T輔助的Thl樣細(xì)胞因子，從而 增強(qiáng)了B細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原特異型反應(yīng)，以及（3)細(xì)胞反應(yīng)需要有共刺激分子的正調(diào)控。
[0024] 早在19世紀(jì)90年代，人們就發(fā)現(xiàn)給癌癥患者注射細(xì)菌提取物能明顯減輕病情，后 來研究表明，細(xì)菌DNA具有直接的免疫刺激作用和抗腫瘤作用。通過合成的寡聚脫氧核苷 酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA的免疫刺激作用和其中的非甲基化CpG二核苷酸有關(guān)。
[0025] 具有免疫刺激活性的CpG-ODN的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如下：
[0026] a.CpG基序是CpG-ODN產(chǎn)生免疫刺激作用的基本結(jié)構(gòu)，其由CpG二核苷酸及其5' 端和3'端的各兩個堿基構(gòu)成。
[0027] b. CpG兩側(cè)的嘌呤和嘧啶以及CpG的間隔都會影響CpG-ODN的免疫刺激活性及其 作用特點(diǎn)。
[0028] c. 0DN所含CpG基序的數(shù)目，通常含有2-4個CpG基序是最佳的，CpG基序間的間 隔，通常至少要間隔兩個堿基，而且最好是胸腺嘧啶。
[0029] d.含有poly-G序列（3個或以上鳥嘌呤組成）的CpG-ODN具有較強(qiáng)的刺激漿細(xì)胞 樣樹樹突細(xì)胞（pDC)產(chǎn)生干擾素-a的作用；全部硫代修飾的CpG-ODN最穩(wěn)定，且對B細(xì)胞 的刺激作用最佳，但全部硫代修飾的CpG-ODN刺激pDC產(chǎn)生IFN- a的作用卻不及部分硫代 修飾的CpG-ODN。