育1小時， 然后將其轉(zhuǎn)移至涂覆hST2-hFc的微量滴定盤。在RT下孵育1小時之后，然后清洗孔槽，并 且以綴合HRP的鏈霉親和素 （Thermo Scientific，#N200)來檢測盤-結(jié)合biot-hIL-33。 將所有的樣品使用TMB溶液（BD biosciences，#51-2607KC)顯影，以產(chǎn)生比色反應(yīng)并然后 通過用IM硫酸酸化來淬滅，然后在Victor X5盤式讀數(shù)器（PerkinElmer)上測量450nm處 的吸收度。使用Prism?軟件內(nèi)的s型劑量反應(yīng)模型來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定義為阻斷50% biot-hIL-33與hST2-mFc結(jié)合所需要的詰抗劑分子濃度的所計算IC5。值被用作阻斷效力 的指標(biāo)。最大阻斷值表示相對于基線的拮抗劑阻斷IL-33結(jié)合的能力。在劑量曲線上在恒 定量的hIL-33下測量的吸收度定義為0%阻斷，而沒有添加 IL-33的吸收度定義為100% 阻斷。使用含有對每種拮抗劑所測試的最高濃度的孔槽的吸收值測定最大阻斷百分比。
[0149] 表8 :通過IL-33拮抗劑的生物素-hIL-33與hST2-hFc的ELISA阻斷
[0150]
[0151] 所測試的四種IL-33拮抗劑以范圍從112pM至6. 34pM的IC5。值阻斷生物 素-hIL-33與hST2-mFc結(jié)合，最大阻斷百分比范圍為從97%至100%，如表8所示。
[0152] 實施例4.通過IL-33拮抗劑對IL-33-介導(dǎo)的受體信號傳遞的抑制
[0153] 白介素-33 (IL-33)為ST2的配體，一種與輔助蛋白IL-IRAcP相關(guān)聯(lián)的toll樣 /白介素-1受體超家族成員（就回顧文獻(xiàn)，參見Kakkar和Lee，（2008)，Nat Rev Drug Discovery，10 月；7 (10) :827-840)。當(dāng) ST2/IL-lRAcP 被 IL-33 激活時，通過下游分子例如 MyD88(髓樣分化因子88)和TRAF6(TNF受體相關(guān)因子6)觸發(fā)信號傳遞級聯(lián)，從而尤其導(dǎo)致 NFk B(核因子-K B)的激活。為了發(fā)展測試IL-33拮抗劑的生物學(xué)相關(guān)生物測定系統(tǒng)，將 人胚胎腎細(xì)胞（HEK293)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染以表達(dá)人ST2 (登錄號NP_057316的1-556氨基酸）以 及熒光素酶受體[[NFDB反應(yīng)元件（5x)-熒光素酶-IRES-GFP] (HEK293/hST2/NFkB-熒光素 酶細(xì)胞系）。HEK293細(xì)胞系內(nèi)源性表達(dá)IL-lRAcP，并且在HEK293中通過IL-33激活NF κ B 已在先前證實（Schmitz等人，（2005) ,Immunity 23:479-490)。將穩(wěn)定的細(xì)胞系分離并維 持在10% FBS、DMEM、NEAA、青霉素/鏈霉素和G418中。
[0154] 就生物測定來說，將HEK293/hST2/NF κ B-熒光素酶細(xì)胞以每孔10, 000個細(xì) 胞、以溶于含〇. 1 % FBS和0Ρ??ΜΕΜ的低血清培養(yǎng)基（Invitrogen，#31985-070)接種在 96-孔測定盤上，并且然后在37°C及5% CO2中孵育過夜。次日，為測定IL-33的劑量反 應(yīng)，將人IL-33 (hIL-33 ;R&D Systems，#3625-IL)、表達(dá)為具有C-端六組氨酸標(biāo)簽的食蟹 猴 IL-33(MfIL-33-6His ;SEQ ID :11)或小鼠 IL33(mIL-33 ;R&D Systems，#3626-IL)以 I : 3(hIL33 :15nM-0. 3pM 或 lOnM-O. 2pM，mfIL33 :1. 5ηΜ-0· 03pM 或 lnM-0. 05pM，mIL33 : 15nM-0. 3pM或IOnM-O. 2pM)連續(xù)稀釋，并且加入細(xì)胞中。將含有稀釋緩沖液但不含IL-33 的對照組加入細(xì)胞的一個樣品中。為測量抑制，將IL-33 Trap和可溶性受體蛋白連續(xù)稀 釋并加入細(xì)胞中，并且接著加入恒定濃度的IL-33 (針對hIL-33測定為5pM或20pM，針對 MfIL-33-6His測定為5pM或3pM，并且針對mIL-33測定為30pM)。在加入細(xì)胞之前將可溶 性受體和Trap進(jìn)行1 : 3連續(xù)稀釋，并且以約15nM、150nM、IOOnM或200nM開始且范圍變化 降至約0. 3pM、3pM或2pM，另外將不含Trap和可溶性受體蛋白對照的對照樣品加入細(xì)胞中。 也將人Fc蛋白（對照蛋白）以1 : 3連續(xù)稀釋，范圍從798nM變化至0.0 lnM或IOOnM變化 至0. 002nM，并且以與Trap和受體蛋白相同的方式，用hIL-33、MfIL-33-6His和mIL-33進(jìn) 行測試。在37°C下、5% CO2中孵育5. 5小時之后，使用Victor X(Perkin Elmer)盤式讀數(shù) 器測量熒光素酶活性，并且使用非線性回歸（4-參數(shù)邏輯）以Prism 5軟件分析結(jié)果。結(jié) 果在表9示出。
[0155] 表9 :通過IL-33 Trap蛋白和可溶性人ST2受體對HEK293/hST2/NFkB-熒光素酶 細(xì)胞的人IL-33、猴IL-33和小鼠 IL-33激活的抑制
[0156]
[0157] NB =非阻斷劑
[0158] 如表9所示，所有5個受測試IL-33拮抗劑在這個以細(xì)胞為基礎(chǔ)的測定中有效地 阻斷（IC 5Q< InM)人、食蟹猴和小鼠 IL-33的刺激。
[0159] 實施例5. IL-33拮抗劑抑制IL-33-介導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞激活
[0160] 為進(jìn)一步評估 IL-33 拮抗劑 hST2-hILlRAcP-mFc 和 hST2-hILlRAcP-hFc 的體外特 性，測量它們阻斷IL-33誘發(fā)的嗜堿性粒細(xì)胞激活的能力。
[0161] 從來自四個不同人類捐贈者的新鮮全血，通過密度梯度離心純化周邊血液單核細(xì) 胞（PBMC)。將 K2 EDTA 全血以 I : 1 在 RPMI 1640 中稀釋，小心地在 Ficoll-Paque(GE Healthcare，#17-1440-03)上分層并離心以分離PBMC。將含PBMC的界面層吸出，轉(zhuǎn) 移到新的試管，并以MACS緩沖液清洗兩次，其中所述MACS緩沖液由溶于MACS沖洗液 (Militenyi Biotec，#130-091-222)的1 : 20稀釋度的MACS BSA溶液（Militenyi Biotec， #130-091-376)所組成。然后將純化的PBMC以溶于MACS緩沖液的約3. OxlO6個細(xì)胞/mL 的最終濃度涂覆于（每個孔槽100 μ L) V形底聚丙烯96-孔盤中。為引出包含在PBMC群體 中的嗜堿性粒細(xì)胞，將 Ing 的 IL-3 (Sigma，#H7166-10UG)溶于 50 μ L 無 Ca++或 Mg ++ (DPBS) 的Dulbeccc/ s磷酸緩沖鹽水中溶液加到細(xì)胞懸浮液中，并且然后在37°C下培養(yǎng)10分鐘。 制造人IL-33拮抗劑（hST2-hILlRAcP-mFc或hST2-hILlRAcP-hFc)或無關(guān)對照蛋白的連續(xù) 稀釋液（針對捐贈者655675和655676為1 : 3,并且針對捐贈者655685、655686、698846 和698847為1 : 4)，針對捐贈者655675和655676范圍從IOnM變化至4. 6pM，并且針對捐 贈者655685、655686、698846和698847范圍從5nM變化至0. 3pM。另外，包括不含IL-33拮 抗劑或無關(guān)對照蛋白的對照組。將溶液與固定濃度的IOOpM(最終濃度）的人IL-33(R&D Systems，#6325-IL/CF)或無 IL-33陰性對照組混合，之后加入PBMC中。所有樣品進(jìn)行兩 次平行測試。
[0162] 將人IL-33和人IL-33拮抗劑加入細(xì)胞后，將它們在37°C下孵育20分鐘，以促進(jìn) 嗜堿性粒細(xì)胞激活。然后通過將測定盤在濕冰上冷卻5分鐘來停止激活作用。為了使嗜堿性 粒細(xì)胞群體的分析能用于測量激活，將20 μ L (按照制造商說明）抗-HLA-DR-FITC (Beckman Coulter，#頂0463U)、抗-CD123-APC(BD，#560087)和抗-CD203c-PE (Beckman Coulter， #頂3575)中的每一種加入各樣品中，并在4°C下將樣品在黑暗中放置20分鐘。然后將細(xì) 胞離心，以DPBS清洗，并且然后在4°C下懸浮于2%甲醛（固定緩沖液）中。次日，在BD FACSCanto II上分析固定的細(xì)胞，用以測定嗜堿性粒細(xì)胞激活的量。根據(jù)以下流式細(xì)胞術(shù) 參數(shù)鑒定嗜堿性粒細(xì)胞：淋巴細(xì)胞門/CD1237HLA-DR2。嗜堿性粒細(xì)胞激活被定義為細(xì)胞 表面表達(dá)標(biāo)志物的增加，所述標(biāo)志物即為受刺激嗜堿性粒細(xì)胞上的CD203c。激活被定義為 ⑶203c陽性嗜堿性粒細(xì)胞的出現(xiàn)頻率（％)。結(jié)果概述于表10和11中（"NB" =未阻斷； "ND"=在單項試驗中未測定）。數(shù)據(jù)以對每一個捐贈者進(jìn)行3次生物學(xué)平行測試的平均值 示出。
[0163] 表10.通過人IL-33激發(fā)誘發(fā)的人嗜堿性粒細(xì)胞的激活百分比
[0168] 如表10所示，在IOOpM下，人IL-33在六個不同捐贈者中誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞激活， 平均激活百分比范圍為從22. 1 %至52. 60%。
[0169] 如表11所示，IL-33拮抗劑hST2-hILlRAcP-mFc阻斷通過IOOpM人IL-33激發(fā)來 誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞激活，對于捐贈者655675來說，IC 5。值為19pM ;對于捐贈者655676來 說，IC5。值為15. IpM ;對于捐贈者655685來說，IC 5。值為23pM ;對于捐贈者655686來說， IC5。值為20. 9pM ;對于捐贈者698846來說，IC 5。值為36pM ;并且對于捐贈者698847來說， IC5。值為11. lpM。IL-33拮抗劑hST2-hILlRAcP-hFc阻斷通過IOOpM人IL-33激發(fā)來誘導(dǎo) 的嗜堿性粒細(xì)胞激活，對于捐贈者698846來說，IC 5。值為19. 7pM，并且對于捐贈者698847 來說，IC5。值為9. 79pM。不相關(guān)對照蛋白不阻斷來自任何受測試捐贈者的嗜堿性粒細(xì)胞激 活。
[0170] 實施例6. IL-33拮抗劑抑制IL-33介導(dǎo)的細(xì)胞激活
[0171] 為進(jìn)一步測試人 IL-33 拮抗劑 hST2-hILlRAcP-mFc 和 hST2-hILlRAcP-hFc 的阻 斷性質(zhì)，使用利用周邊血液單核細(xì)胞（PBMC)的以原代細(xì)胞為基礎(chǔ)的測定（參見，例如， Smithgall 等人，International Immunology，2008,第 20(8)卷，第 1019-1030 頁）。
[0172] 從來自六個不同捐贈者的新鮮人全血，以密度梯度離心純化PBMC。簡單來說，將K2 EDTA全血在RPMI 1640 中稀釋 2倍，小心地于Ficoll-Paque (GE Healthcare，#17-1440-03) 上分層并離心20分鐘。將含PBMC的界面層吸出，轉(zhuǎn)移到新的試管，并以PBS緩沖液清洗 兩次。將分離的PBMC以溶于添加10% FBS、2mM L-谷酰氨酸、lOOU/mL青霉素和100 μ g/ mL鏈霉素的RPMI 1640中的最終濃度5xl05個細(xì)胞/mL涂覆于（每個孔槽200 μ L)圓底 96-孔盤中。然后將細(xì)胞用單獨 IOnM至 0. 64ρΜ 的 50ng/mL 人 IL-12(hIL-12 ;R&D Systems， #219-IL-025/CF)和人 IL-33 的連續(xù)稀釋液（hIL-33 ;R&D Systems，#3625-IL-010/CF)， 或以與20nM至0. 43pM的人IL-33拮抗劑或含無關(guān)mlgG的對照蛋白的連續(xù)稀釋液組合的 260pM的hIL-33孵育。每孔最終體積為200 μ L。各樣品以重復(fù)進(jìn)行三次平行測試。當(dāng)有 人IL-33拮抗劑或含無關(guān)mlgG的對照蛋白存在時，首先以hIL-33預(yù)孵育30分鐘，并且然 后將其加入細(xì)胞中。
[0173] 在37°C下將細(xì)胞在濕化孵育器中以5% C0J?育過夜，并且然后以ELISA(R&D Systems，#DY285)測量孵育上清液中IFNy量。就ELISA來說，根據(jù)制造商的說明將96-孔 平底盤涂覆俘獲抗體。清洗并阻斷后，將100 μ L未稀釋培養(yǎng)物上清液加入盤中并孵育2小 時。按照制造商的說明進(jìn)行后續(xù)的清洗和檢測。結(jié)果概述于表12和13中（"ΝΒ"=未阻 斷；"ND"=未測定）。
[0174] 表12 :IL_33誘發(fā)的IFNy從來自四個捐贈者的人PBMC的釋放。
[0176] 表13 :通過IL-33拮抗劑阻斷IL-33誘發(fā)的IFN- γ從人PBMC的釋放
[0177]
[0179] 如在這個實施例中所示，在hIL-12存在下，人IL-33誘導(dǎo)IFNy從受測試的四個 不同捐贈者的人總PBMC的釋放，并且EC 5。值在204pM至315pM之間，如表12所示。人IL-33 拮抗劑hST2-hILlRAcP-mFc阻斷通過260pM IL-33誘導(dǎo)的IFNy從人PBMC的釋放，并且 IC5。值范圍為從2. 13pM至334pM，如表13所示。不相關(guān)的含有mlgG的對照蛋白在受測試 的任何捐贈者中不顯現(xiàn)IFNy釋放的任何可測量阻斷。
[0180] 實施例7. mST2-mILlRacP-mFc在炎性關(guān)節(jié)疼痛模型中的功效
[0181] 為確定mST2-mILlRacP-mFC在相關(guān)體內(nèi)模型中的作用，在從杰克遜實驗室 (The Jackson Laboratory) (Bar Harbor，ME)獲得的 12 周齡雄性 C57BL/6 小鼠中進(jìn) 行單側(cè)炎性關(guān)節(jié)疼痛模型。在實驗第〇天，向單獨的小鼠小組皮下施用50mg/kg的 mST2-mILlRacP_mFc(n = 15-16)或 50mg/kg 的同種型對照抗體（η = 15-16)。在初始治 療給藥之后二十四小時，一半小鼠接受完全弗氏佐劑（IA-CFA ;Sigma，#F5881) (η = 7-8) 的30 μ L關(guān)節(jié)內(nèi)和50 μ L關(guān)節(jié)周注射，并且另一半小鼠在相同位置接受對照鹽水注射（η = 7-8)。關(guān)節(jié)炎癥引發(fā)之后并會持續(xù)后續(xù)四周的一周，在動態(tài)承重測定（BioSeb，Vitrolles， FR)中測試之前24小時，所有小鼠接受50mg/kg的mST2-mILlRacP-mFc或50mg/kg的同種 型對照抗體的皮下增強注射。記錄所有小鼠的患病肢體上負(fù)荷的重量百分比和患病肢體 上耗費的時間百分比。這個實驗的結(jié)果在表14和表15中示