丁酸梭菌屬，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9830。
[0035]實(shí)施例2 丁酸梭菌(Clostridium butyricum) WZMC1018益生菌制劑組合物的制備
[0036]1.種子液制備:挑取丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018單菌落，接種于50mL改良MRS液體培養(yǎng)基中，pH為7.0±0.5，37°C，厭氧培養(yǎng)24h，即為種子液；
[0037]改良MRS培養(yǎng)基的配方:蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，K2HPO4 2g，MgSO4.7H20 0.5g，MnSO4.4H20 0.2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，蒸餾水1L，調(diào) pH 至 7.0，115°C滅菌 15min。
[0038]2.發(fā)酵培養(yǎng):取步驟I的種子液，以I %接種量接種至新的改良MRS培養(yǎng)基中，37 0C，厭氧培養(yǎng)24h，結(jié)束培養(yǎng)；
[0039]3.收集菌體:取步驟2發(fā)酵液，以12，OOOrpm, 1min條件，去除發(fā)酵上清液，離心分離出菌體；
[0040]4.菌粉制備:取步驟3收集的菌體加入含有重量5%的谷氨酸鈉和5%多脂奶粉凍干保護(hù)液中混合冷凍干燥后即可得到丁酸梭菌菌粉。
[0041]5.成品制備:取步驟4所得干燥菌粉，依據(jù)丁酸梭菌的活菌數(shù)，按比例與藥用載體(低聚果糖，葡萄糖，海藻糖等)混合，制備丁酸梭菌制劑組合物成品，成品的活菌數(shù)不低于I X 107CFU/g 或 I X 17CFlVmL。
[0042]實(shí)施例3腦缺血再灌注損傷的治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0043]目的:觀察本發(fā)明丁酸梭菌制劑對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶、腦內(nèi)氧化指標(biāo)和神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響。
[0044]一、材料與方法:
[0045]1.藥物:丁酸梭菌(Clostridium butyricum) WZMC1018 菌粉，含活菌數(shù)為I X 10sCFU/g，具體制備方法，詳見上面的實(shí)施例2。
[0046]2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:ICR雄性小鼠，體重18_22g。
[0047]3.模型制備及動(dòng)物分組:腦缺血再灌注損傷小鼠模型制備:小鼠被和腹腔注射350mg/kg水合氯醛麻醉，正中切口的頸部腹側(cè)暴露的右側(cè)和左側(cè)頸總動(dòng)脈。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞引起的腦缺血/再灌注模型(用血管夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈)20分鐘，去除閉塞再灌注。假手術(shù)對(duì)照組接受同樣的手術(shù)，但無(wú)頸動(dòng)脈閉塞。每次注射前，均對(duì)注射部位和注射器針頭進(jìn)行嚴(yán)格消毒，以防小鼠感染。全部小鼠均給予標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料常規(guī)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一周對(duì)全部小鼠進(jìn)行水迷宮神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試，神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，快速取盲腸內(nèi)容物和小鼠海馬組織。另一部分小鼠進(jìn)行灌注固定，HE染色、TUNEL染色的病理學(xué)檢測(cè)。
[0048]4.腦組織IL-1 β ,TNF- α定量ELISA測(cè)定:稱重，取生理鹽水按重量體積比1: 9，用玻璃勻漿器研磨，制成10%的腦組織勻漿，離心，分離，取上清液，于-20°c凍存?zhèn)溆?，按照試劑盒的說明書操作。
[0049]5.病理組織學(xué)觀察:用4%的多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流固定，取腦，石蠟包埋，切片，用于HE染色和TUNEL染色檢測(cè)。
[0050]5.1 HE染色:將石蠟切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，石蠟切片常規(guī)脫蠟下行至蒸餾水中待染；切片置蘇木素染色5min，自來水洗去多余的染料；切片入鹽酸酒精中分化數(shù)秒；自來水充分水洗切片；1%伊紅水溶液中5min，洗去多余的伊紅；梯度酒精脫水、封片。
[0051]5.2 TUNEL染色:TUNEL染色操作按說明書進(jìn)行，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核染成棕黃色。
[0052]6.應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)測(cè)定腸道菌群變化，計(jì)算物種豐度指數(shù)，Shannon-Wiener指數(shù)，物種均勻度指數(shù)。行為測(cè)試后，將小鼠處死，迅速取出盲腸內(nèi)容物。新鮮標(biāo)本立即轉(zhuǎn)移到冰盒實(shí)驗(yàn)室和存儲(chǔ)在-80°C在進(jìn)一步分析制備，然后，DNA抽提試劑盒的糞便樣品中提取細(xì)菌的基因組DNA。
[0053]7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way AN0VA)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異采用q檢驗(yàn)，P < 0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0054]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0055]1.模型組的腦組織IL-1 β顯著高于假手術(shù)組(P < 0.05) ;丁酸梭菌WZMC1018治療組的IL-1 β含量降低，與模型組相比有顯著性差異(P < 0.01)。模型組的腦組織TNF- α顯著高于假手術(shù)組(P <0.01) ;丁酸梭菌WZMC1018治療組的TNF-α含量降低，與模型組相比有顯著性差異(P <0.05)。TNF-α是一種細(xì)胞因子，屬于前炎癥因子，數(shù)量增多可促進(jìn)腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，加重腦損害。TNF-a可以引起白細(xì)胞激活聚集并釋放炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)缺血神經(jīng)元壞死和調(diào)亡。以上研究結(jié)果，提示丁酸梭菌WZMC1018的抗炎作用，丁酸梭菌WZMClO 18可能對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
[0056]2.HE 染色
[0057]假手術(shù)組:可見到正常神經(jīng)元的形態(tài)，胞體、軸突、樹突清晰可見，核膜完整，核仁清晰可見，核呈橢圓形。模型組:神經(jīng)細(xì)胞有受損征象，細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)不正常，胞體和胞核固縮、深染，核仁不清楚，胞核被推向一側(cè)或溶解，部分胞核碎裂成顆粒狀，周圍區(qū)胞質(zhì)亦固縮深染，呈深伊紅染色，核漿不易區(qū)分，核碎裂明顯。丁酸梭菌WZMC1018治療組:可見神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變減輕，細(xì)胞輕度腫脹，神經(jīng)細(xì)胞間隙增大有所減輕。神經(jīng)細(xì)胞缺血壞死數(shù)量明顯減少，細(xì)胞胞體有固縮，核仁可見，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，神經(jīng)細(xì)胞的層次改善、損傷較腦缺血再灌注損傷模型組明顯減輕。
[0058]3.TUNEL 染色
[0059]假手術(shù)組中偶有陽(yáng)性凋亡細(xì)胞表達(dá)。腦缺血再灌注損傷模型組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)可見大量深棕黃色顆粒(TUNEL陽(yáng)性)細(xì)胞數(shù)增加，與假手術(shù)組比較，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)有顯著增高(P < 0.01)。丁酸梭菌WZMC1018治療組的神經(jīng)細(xì)胞染色較淺，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較好，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，與模型組比較，丁酸梭菌WZMC1018治療組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)顯著減少(P < 0.01)。
[0060]TUNEL染色結(jié)果顯示:本發(fā)明的丁酸梭菌具有明顯的抗凋亡作用。
[0061]4.對(duì)腸道菌群影響
[0062]丁酸梭菌治療組在腸道菌群豐度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)(H’ )和物種均勻度指數(shù)上顯著性優(yōu)于腦缺血再灌注損傷模型小鼠。
[0063]結(jié)論:對(duì)于卒中的神經(jīng)保護(hù)治療日益重視，腦缺血以后給予神經(jīng)保護(hù)劑治療，有助于減輕缺血損傷，主要通過降低腦缺血后損傷因子、增加保護(hù)因子及減少調(diào)亡等方式達(dá)到保護(hù)缺血受損腦組織和促進(jìn)腦功能恢復(fù)的目的。
[0064]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明創(chuàng)造性地以腸道菌群為治療靶點(diǎn)，開創(chuàng)防治腦缺血再灌注損傷的新模式，研制出了一種療效好、無(wú)毒副作用的防治腦缺血再灌注損傷的藥物，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，明顯改善腦缺血后的病理形態(tài)學(xué)改變，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，還可抑制炎癥因子IL-1 β、TNF-α作用。
[0065]本發(fā)明選用丁酸梭菌WZMC1018菌株來防治腦缺血再灌注損傷，療效顯著，療效加強(qiáng)，且未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用，使用方便，可作為營(yíng)養(yǎng)制劑和其他營(yíng)養(yǎng)素一起用于臨床患者的輔助治療，讓患者在平時(shí)飲食的過程中就能完成輔助治療，能夠大大減輕腦缺血再灌注損傷患者痛苦。
[0066]綜上所述，丁酸梭菌WZMC1018菌株對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。腦缺血再灌注損傷是一個(gè)多途徑、多因素、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜病理生理過程，腦缺血再灌注損傷是一個(gè)多環(huán)節(jié)復(fù)雜的病理生理過程，其機(jī)制互為因果、相互影響。丁酸梭菌WZMC1018菌株具有多靶點(diǎn)、多向調(diào)節(jié)、防治結(jié)合的特點(diǎn)，并且安全性高、不良反應(yīng)較少、改善臨床癥狀好、可以降低致殘率，有望成為一種有效的神經(jīng)保護(hù)藥物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.丁酸梭菌在制備防治腦缺血再灌注損傷組合物中的應(yīng)用，所述組合物包括藥品、保健品和飲品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述丁酸梭菌在制備防治腦缺血再灌注損傷組合物中的應(yīng)用，其特征在于丁酸梭菌(Clostridium butyricum) WZMC1018，該菌株已于2014年10月22日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)=CGMCC N0.9830ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述丁酸梭菌是活細(xì)胞形式。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于組合物是以丁酸梭菌作為活性成份制成的組合物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述組合物包含丁酸梭菌的活菌數(shù)不低于IX17CFlVg06.丁酸梭菌在防治腦缺血再灌注損傷組合物的制備方法，包括如下步驟:將丁酸梭菌WZMC1018菌株種子液按重量I %接種量接入已滅菌后的含有重量蛋白胨1%，牛肉霄1%，酵母膏 0.5%，葡萄糖 2%, K2HPO40.2%, MgSO4.7Η20 0.05%, MnSO4.4Η20 0.02%，低聚果糖0.3%，檸檬酸二銨0.2%液體培養(yǎng)基中，經(jīng)36°C?38°C厭氧發(fā)酵后，離心分離菌體，將菌體加入含有重量5%的谷氨酸鈉和5%多脂奶粉凍干保護(hù)液中，混合冷凍干燥后即可得到丁酸梭菌活菌菌粉，所得干燥菌粉，與藥用載體混合，即得到所述最終劑型益生菌組合物。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，涉及益生菌制劑在制備治療與預(yù)防腦缺血再灌注損傷中的應(yīng)用，具體涉及益生菌丁酸梭菌防治腦缺血再灌注損傷的藥物新用途。腦缺血再灌注損傷是指各種原因造成的局部腦組織的缺氧缺血，腦神經(jīng)細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象，本發(fā)明公開了一種具有防治腦缺血再灌注損傷，且未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用的益生菌制劑。本發(fā)明創(chuàng)造性地以腸道菌群為治療靶點(diǎn)，開創(chuàng)防治腦缺血再灌注損傷的新模式，既減輕疾病癥狀又減緩神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有很好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，值得推廣應(yīng)用。該制劑以丁酸梭菌為活性成份，加入常規(guī)的賦形劑，可以制成適合于臨床上使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、口服液、灌腸劑等劑型。CGMCC No.983020141022
【IPC分類】A23L2/38, A61P9/10, A61K35/741, A23L1/29
【公開號(hào)】CN104997812
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510491145
【發(fā)明人】孫晶, 胡雪珍, 林燕, 鄭園園, 劉佳明
【申請(qǐng)人】溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院
【公開日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年8月6日