ACT GTG GAT GG-3’)。
[0052]通過虛擬PCR驗證所有這些引物，引物濃度經(jīng)過優(yōu)化以避免形成引物二聚體。使用2x SYBR綠色PCR主要混合液進行實時PCR擴增。2微升RT反應用于25 μ I總體積的定量PCR反應。SYBR實時PCR熱分布是95°C 10分鐘，隨后在95°C 15s和60°C I分鐘循環(huán)50次。根據(jù)在各樣品中規(guī)范化甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)定量所確定的基因表達的相對倍數(shù)增加或減少對數(shù)據(jù)進行分析。
[0053]微孔比佴NF-K B試駘
[0054]為了評估NF- K B的結(jié)合活性，根據(jù)制造商的方案使用P65轉(zhuǎn)錄因子ELISA試劑盒。在10mm培養(yǎng)皿中種下并通宵孵育一百萬個PANC-1和BxPC-3細胞，隨后用PJ或?qū)φ仗幚?2小時，并且對每份樣品提取核酸蛋白。然后在涂有抗P6OTNA序列的微板中孵育2 μ g的每份樣品。過氧化物酶綴合的抗DNA抗體用于檢測p65-DNA結(jié)合復合物，隨后對過氧化物酶用ABTS基底進行彩色顯影。記錄并分析樣品的化學發(fā)光和體積。
[0055]數(shù)據(jù)分析
[0056]結(jié)果表示成平均值土平均數(shù)標準誤差(SEM)，并且使用單因素方差分析在各組之間進行統(tǒng)計比較。P〈0.05值被認為統(tǒng)計意義上的顯著性，并且在圖中示出單獨的P值。
[0057]
[0058]PJ對PaCa細胞的細胞生長/存活的影響
[0059]如圖1所示，通過用不同濃度的PJ和培養(yǎng)基處理PANC-1和BxPC_3細胞，隨后進行MTS和集落形成試驗來評估PJ對胰腺癌的細胞毒素潛能。圖1示出了 PJ對胰腺癌細胞系PANC-1和BxPC-3存活和生長(A和B)及集落形成(C和D)的影響。
[0060]用增加濃度的PJ處理兩種癌細胞系。結(jié)果表示成三次試驗重復結(jié)果的平均值土SEM。參見圖1，*表示P〈0.05，并且林表示P〈0.01，對應各自的DMSO處理對照。對照處理中統(tǒng)計的細胞數(shù)看成是100%，并且相對于此對照計算PJ處理的細胞中的細胞數(shù)。
[0061]在PANC-1細胞系中，用20、30、40和50 μ I/ml的PJ處理72小時，分別得到相對于對照的35 %、51 %、75 %和91 %的細胞生長抑制。類似地，用20、30、40和50 μ I/ml的PJ處理BxPC-3細胞系72小時，分別得到相對于對照的12 %、30 %、54%和75 %的細胞生長抑制。這些結(jié)果表明PJ作為胰腺癌細胞生長抑制劑的效率。
[0062]圖1C和圖1D所示的集落形成試驗通過揭示用增加濃度的PJ (30和40 μ I/ml)處理PANC-1和BxPC-3得到集落形成數(shù)的更大減少(如減少的結(jié)晶紫著色所示)來確認PJ對細胞生長的效果。如圖1所示，集落形成試驗的結(jié)果與MTS數(shù)據(jù)一致，其中PJ明顯抑制胰腺癌細胞的生長?？偨Y(jié)兩種試驗發(fā)現(xiàn)，PJ抑制兩種細胞系的細胞增殖和集落形成，其中對于所有測試濃度而言，PANC-1細胞比BxPC-3細胞對PJ的影響更敏感。
[0063]PJ誘導的細胞凋亡
[0064]圖2示出了用組蛋白/DNA ELISA方法(A和B)以及流式細胞儀(C和D)分析PJ的細胞凋亡能力。在孵育72小時之前用增加濃度的PJ處理細胞或者用DMSO作為空白載體處理細胞作為對照。隨后用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶對孵育進行著色，以供流式細胞儀分析。細胞的流式細胞儀細胞分布圖示為虛線(圖2C和圖2D)。值代表一式三份樣品的土SEM。*表示P〈0.05，并且#表示P〈0.01，對應DMSO處理的對照組。
[0065]圖2A和圖2B以劑量依賴方式示出了 PANC-1 (圖2A)和BxPC-3 (圖2B)細胞系中的細胞凋亡。圖2C和圖2D示出了在用20和30 μ Ι/ml的PJ處理之后通過膜聯(lián)蛋白V著色所檢測的凋亡細胞的定量結(jié)果，從而確定PJ在兩種細胞系中的細胞凋亡誘導效果。結(jié)果表明，在兩種胰腺癌細胞系中，在IC5tl劑量的PJ，PJ處理在凋亡細胞百分比中是統(tǒng)計意義上的顯著(#P〈0.01)增加。
[0066]在用PJ處理之后分析細胞周期分布
[0067]分析用不同濃度的PJ處理PANC-1和BxPC_3細胞的細胞周期分布以確定細胞增殖抑制的可能潛在的機制，如圖3A(PANC-1)和圖3B(BxPC-3)所示。在72小時孵育之后，通過使用流式細胞儀來量化不同細胞周期階段中的種群分布。
[0068]圖3A和圖3B以劑量依賴方式示出了 PJ使兩種細胞系停滯在S期。對于PANC-1細胞(圖3A)而言，在處理組(40 μ Ι/ml)中，約28%的細胞停滯在S期中，而在對照細胞中為25%。對BxPC-3細胞(圖3B)進行類似觀察，在處理組(50 μ Ι/ml)中，52%的細胞停滯在S期，而在對照細胞中為21 %。
[0069]連同細胞周期階段GO-Gl、G2_M和S期的百分比示出了用增加濃度的PJ處理的癌細胞的細胞周期分布。這些發(fā)現(xiàn)反映了 PJ誘導兩種癌細胞系的細胞周期停滯在S期。
[0070]PJ既上調(diào)促凋亡基因又下調(diào)抗細胞凋亡基因
[0071]免疫印跡代表在用增加的PJ濃度處理72小時之后PANC-1和BxPC_3癌細胞系中PARP裂解、半胱天冬酶、Bcl-xL和存活素的表示，以進一步詳細說明胰腺癌細胞的PJ誘導細胞凋亡的分子機制。在此實驗中，肌動蛋白用作蛋白負荷對照。
[0072]具體地講，分析了活化型半胱天冬酶依賴型細胞凋亡(半胱天冬酶3，半胱天冬酶9)、抗細胞凋亡Bcl-2族((Bcl-xL)和抗細胞凋亡蛋白存活素誘導所涉及的蛋白表達。圖4示出了 PJ在兩種癌細胞系中增加了促凋亡蛋白、活化型半胱天冬酶3和9以及PARP的表達，而在兩種PANC-1和BxPC-3細胞系中則減少了例如Bcl-xL和存活素的抗細胞凋亡蛋白的產(chǎn)生。
[0073]此分析證實，PJ通過雙機制方法在兩種癌細胞中誘導細胞凋亡:激活細胞凋亡誘導半胱天冬酶并且抑制細胞存活蛋白。
[0074]P T抑制NF-κ B的活件
[0075]進行微孔比色NF- K B試驗以表征PJ對NF- κ B活性的影響。圖5示出了 NF- κ B活性隨著處理PANC-1和BxPC-3細胞所使用的PJ濃度的增大而下調(diào)。圖5A和圖5B示出了 PANC-1和BxPC-3中p65活性的分析。P65激活在兩種細胞系中經(jīng)過PJ處理之后以類似劑量依賴的方式減少。兩種PANC-1和BxPC-3在處理中使用的高濃度PJ表現(xiàn)出顯著降低的 NF-κ B (p65)活性。
[0076]圖5C和圖示出了 PJ相對于DMSO處理的對照對VEGF和MMP-9的影響。VEGF和MMP-9表達在用PJ處理中以劑量依賴的方式顯著減小。從圖5C和圖可以看到，MMP-9的效果在兩種癌細胞系中更明顯。作為NF-kB下游基因的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)負責癌細胞侵襲和迀移表達。在逆轉(zhuǎn)錄PCR之后通過實時PCR來測量VEGF和MMP9的表達。這些結(jié)果強烈表明PJ抑制NF_kB活性及其靶基因表達。
[0077]結(jié)果表示成三次重復試驗的平均值土SEM，*表示P〈0.05，并且**表示P〈0.01，對應各自的DMSO處理對照。
[0078]PJ抑制細胞遷移和侵襲
[0079]細胞侵襲和傷口愈合試驗用于分析PJ對胰腺癌細胞系的侵襲和迀移的影響。圖6示出了 PJ以劑量依賴的方式抑制PA