蟲夏草子實(shí)體、紫蘇籽、香菇、木耳，作為原料，按照15. 7ml 蒸餾水/lg原料的量加入水，于常溫下放置〇. 5h使其充分溶脹，用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液 pH值為2. 0,同時(shí)按照原料質(zhì)量百分比2. 5%的量加入胃蛋白酶、1. 5%的量加入胰蛋白酶、 0. 5%的量加入中性蛋白酶，在42°C下恒溫振蕩酶解4h ;隨后將溶液煮沸l(wèi)Omin，使其中的 酶滅活。冷卻后，4500r · HiirT1離心10min，取上清液，經(jīng)截留分子量為5000D的超濾柱過 濾，得到分子量在5000以下的酶解液。
[0068] 將上述酶解液，經(jīng)濃縮，噴霧干燥得活性多肽組合物粉末D。
[0069] 對(duì)比例2
[0070] 本對(duì)比例的多肽組合物制備方法與實(shí)施例1中的方法基本相同，區(qū)別僅在于：
[0071] 所用的原料為重量份比為3:2:1:1的猴頭菇、紫蘇籽、香菇和木耳。
[0072] 參照實(shí)施例1中的方法進(jìn)行酶解，得到多肽組合物粉末E。
[0073] 對(duì)比例3
[0074] 本對(duì)比例的多肽組合物制備方法與實(shí)施例1中的方法基本相同，區(qū)別僅在于：
[0075] 所用的原料為重量份比為3:2:2:1:1的猴頭菇、北冬蟲夏草子實(shí)體、黑芝麻、香菇 和木耳。
[0076] 參照實(shí)施例1中的方法進(jìn)行酶解，得到多肽組合物粉末F。
[0077] 實(shí)驗(yàn)例1對(duì)A β?lián)p傷PC12細(xì)胞的抗凋亡作用
[0078] 將上述實(shí)施例和對(duì)照例制備得到的多肽組合物粉末進(jìn)行對(duì)Αβ?lián)p傷PC12細(xì)胞的 抗凋亡作用的實(shí)驗(yàn)。
[0079] 一、材料
[0080] 1.多肽組合物，通過上述實(shí)施例和對(duì)比例制備得到的多肽組合物A-F。
[0081] 2. A β H2，購自 Sigma公司，用 0· Olmol/L PBS (ρΗ7· 2)配成溶液，密封后置于 37°C， 孵育7天使之聚集。
[0082] 3. Annexin V-FITC，F(xiàn)ITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V，購自晶美生物工程有限公司。
[0083] 4. PI溶液，碘化丙啶溶液。
[0084] 5.大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12)，購自中科院上海細(xì)胞庫。
[0085] 二、方法
[0086] 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多肽組合物對(duì)抗A β ^巧女大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12)凋亡 作用。取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，接種于96孔板中，分別設(shè)對(duì)照組；A β i_42&理組；多肽組 合物A-F組。
[0087] I. PC12細(xì)胞的培養(yǎng)
[0088] PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含20% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱 中傳代培養(yǎng)，細(xì)胞為上皮樣貼壁生長，每隔2天換培養(yǎng)液1次。按I X 106/L密度接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期待用。
[0089] 2. A 液制備
[0090] 將100 μ g Αβ H2溶解于2ml的RPMI1640培養(yǎng)基中，過濾除菌，即為Αβ hJ#、液， 置于37°C孵箱中孵育24h，4°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0091] 3.實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理
[0092] 實(shí)驗(yàn)分為
[0093] 對(duì)照組：用20% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后檢測(cè)；
[0094] A β ^組：加入終濃度為10 μ g/mL的A β 作用24h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后檢測(cè)；
[0095] 多肽組合物A-F組：分別加入終濃度為100 μ g/mL的多肽組合物A-F預(yù)處理2h， 換培養(yǎng)液，再加入終濃度為10 μ g/mL的A β i_42作用24h，繼續(xù)培養(yǎng)24h后檢測(cè)。
[0096] 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
[0097] 取100 μ L的細(xì)胞懸液于流式管中，加入5 μ L Annexin V-FITC和10 μ L PI溶液 混勻，室溫避光孵育15分鐘，加400 μ L PBS，流式細(xì)胞儀分析。
[0098] 三、結(jié)果
[0099] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。
[0100] 表1多肽組合物抗A β ^致PC12細(xì)胞的凋亡作用
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具改善老年癡呆癥作用的多肽組合物，其特征在于，所述多肽組合物的有效成 分主要由以下重量份的原料，通過酶解制備而成： 猴頭菇2-4份、北冬蟲夏草子實(shí)體1-3份、紫蘇籽1-3份、香菇0. 5-1. 5份、木耳0. 5-1. 5 份。
2. 權(quán)利要求1所述的多肽組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 胃蛋白酶酶解：按重量份稱取猴頭菇、北冬蟲夏草子實(shí)體、紫蘇籽、香菇和木耳， 按照10-20ml水/Ig原料的量加入水，調(diào)節(jié)溶液pH值為1. 0-3. 0,按照原料重量百分比 2.0% -3.0%的量加入胃蛋白酶，酶解3-5h ;隨后將溶液煮沸，使其中的酶滅活，再將溶液 經(jīng)截留分子量為25000D-35000D的超濾柱過濾，得到酶解液1 ; (2) 胰蛋白酶酶解：取上述酶解液1，調(diào)節(jié)溶液pH值為7. 0-9.0,按照原料質(zhì)量百分比 1. 0% -2. 0%的量加入胰蛋白酶，酶解3-5h ;隨后將溶液煮沸，使其中的酶滅活，再將溶液 經(jīng)截留分子量為8000D-12000D的超濾柱過濾，得到酶解液2 ; (3) 中性蛋白酶酶解：取上述酶解液2,調(diào)節(jié)溶液pH值為6. 5-7. 5,按照原料質(zhì)量百分 比0.25% -0.75%的量加入中性蛋白酶，酶解3-5h ;隨后將溶液煮沸，使其中的酶滅活，將 溶液經(jīng)截留分子量為3000D-7000D的超濾柱過濾，得到酶解液3,即得多肽組合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽組合物的制備方法，其特征在于，在（1)胃蛋白酶酶解步 驟之前，還包括預(yù)處理步驟，該預(yù)處理步驟為：按重量份稱取猴頭菇、北冬蟲夏草子實(shí)體、紫 蘇籽、香菇和木耳，加入石油醚浸泡，過濾得濾渣，濾渣烘干，即得脫脂的原料。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽組合物的制備方法，其特征在于，所述預(yù)處理步驟中， 按重量份稱取猴頭菇、北冬蟲夏草子實(shí)體、紫蘇籽、香菇和木耳，粉碎，以原料：石油醚為 1:2-4的質(zhì)量體積比加入餾程為60-90°C的石油醚，在50-60°C下振蕩浸泡2-4h，過濾得濾 渣，濾渣于40-50°C下烘干，即得粉末狀脫脂的原料。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)胃蛋白酶 酶解中，酶解溫度為37-45°C ;所述步驟（2)胰蛋白酶酶解中，酶解溫度為37-45°C ;所述步 驟（3)中性蛋白酶酶解中，酶解溫度為37-45 °C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)胃蛋白酶 酶解中，超濾柱的截留分子量為30000D ;所述步驟（2)胰蛋白酶酶解中，超濾柱的截留分子 量為10000D ;所述步驟（3)中性蛋白酶酶解中，超濾柱的截留分子量為5000D。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)胃蛋白酶 酶解中，使溶液中酶滅活后，先以4000-5000r ^mirT1離心5-15min，再取上清液過超濾柱過 濾。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)所述的多肽組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟（3) 中性蛋白酶酶解后，得到的多肽組合物中，分子量在1000D-3000D范圍內(nèi)的多肽占多肽總 量的80% -90%，分子量在3000D-5000D范圍內(nèi)的多肽占多肽總量的5% -8%。
9. 權(quán)利要求1所述的多肽組合物在制備預(yù)防和治療老年癡呆癥的藥物或保健食品中 的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽組合物在制備預(yù)防和治療老年癡呆癥的藥物或保健食 品中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物或保健食品的劑型為片劑、顆粒劑、硬膠囊、軟膠囊、口 服液、丸劑或滴丸。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具改善老年癡呆癥的多肽組合物及其制備方法和應(yīng)用。該多肽組合物的有效成分主要由以下重量份的原料通過酶解制備而成：猴頭菇2-4份、北冬蟲夏草子實(shí)體1-3份、紫蘇籽1-3份、香菇0.5-1.5份、木耳0.5-1.5份。本發(fā)明的多肽組合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有非常好的保護(hù)及營養(yǎng)作用，還能夠顯著改善老年癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，因此，可將該活性多肽組合物用于預(yù)防和/或治療老年癡呆癥中，也將會(huì)有顯著療效，從而產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【IPC分類】A61P25-28, A61K38-00, A23L1-305, A61K36-535
【公開號(hào)】CN104826086
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510190493
【發(fā)明人】苑廣信, 杜培革, 安麗萍, 盛瑜, 徐廣宇, 李洪宇, 趙南晰, 孫晶波, 王曼力, 謝立亞, 王廣紅, 陳麗娜, 侯志東
【申請(qǐng)人】北華大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月21日