牙鲆鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是牙鲆鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鈣是機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)不可缺少的離子，對(duì)于維持細(xì)胞膜生物電位、正常的神 經(jīng)傳導(dǎo)和肌肉伸縮與舒張都具有重要作用。鈣調(diào)蛋白（calmodulin, CaM)和鈣網(wǎng)蛋白 (Calreticulin，Crt)均是Ca2+結(jié)合蛋白，在媽代謝中扮演重要角色。CaM廣泛存在于真核 生物細(xì)胞中，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca 2+的濃度；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，CaM還可以被用作Ca2+的儲(chǔ)存介質(zhì)。 CaM參與介導(dǎo)的生命活動(dòng)有炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)以及免疫反應(yīng)等。 Crt是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中能夠結(jié)合Ca 2+的蛋白，具有維持胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的作用。Crt還可作為分子伴 侶，幫助新合成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白正確折疊。另外，Crt還出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面及細(xì)胞外環(huán)境中， 參與細(xì)胞粘附、抗原呈遞、基因表達(dá)調(diào)控以及細(xì)胞凋亡和抗腫瘤免疫應(yīng)答等過(guò)程。目前魚類 鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白研宄很少，其功能亦未知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供牙鲆鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 牙鲆鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的應(yīng)用，所述鈣調(diào)蛋白或鈣網(wǎng)蛋白用于制備抗細(xì)菌感染 的制劑。
[0006] 具體為：以牙鲆CDNA為模板，分別用引物F1/R1或F2/R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn) 物分別與載體PCN3連接，即獲得鈣調(diào)蛋白質(zhì)粒pCNCam或鈣網(wǎng)蛋白質(zhì)粒pCNCrt ;所述F1為 5'-GATATCGCCACCATGGCTGATCAGCTTACAGAAGAGC-3'；R1 為 5'-GATATCCTTCGCTGTCATCATTTGT ACGAACT-3' ；F2 為 5' -CCCGGGGCCACCATGAAGGTCCTCGGCGTAGCAG-3' ；R2 為 5' -CCCGGGAAGCTC ATCTTTAAGTTTTGCTTCCTCCTC-3'。
[0007] 所述表達(dá)媽調(diào)蛋白和媽網(wǎng)蛋白的質(zhì)粒pCNCam或pCNCrt在制備增強(qiáng)魚類抗細(xì)菌感 染制劑中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)質(zhì)粒注射牙鲆后能夠顯 著提高魚類的抗細(xì)菌能力。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0010] 在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法：
[0011] 1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相應(yīng)試劑盒。
[0012] 2?大腸桿菌用 Hanahan 方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)〇
[0013] 3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北京。
[0014] 實(shí)施例1
[0015] 媽調(diào)蛋白和媽網(wǎng)蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCNCam和pCNCrt的構(gòu)建：
[0016] 牙鮮媽調(diào)蛋白和媽網(wǎng)蛋白的序列已被報(bào)道（GenBank accession number : EU519228和DQ535486)。鈣調(diào)蛋白有一個(gè)典型鈣離子結(jié)合域（氨基酸85-147);鈣網(wǎng)蛋白 有一個(gè)典型的鈣網(wǎng)蛋白結(jié)構(gòu)域（氨基酸20-331)。pCNCam的構(gòu)建如下：以牙鲆cDNA為模 板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增鈣調(diào)蛋白基因。PCR條件為：94°C 60s預(yù)變性模板DNA， 然后94°〇4〇8,63°〇6〇8,721：6〇8,5個(gè)循環(huán)后改為941：4〇8,651：6〇8,721：6〇8,30個(gè) 循環(huán)。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T(購(gòu)自于"天根 生化科技有限公司"，北京）于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a 后在含有100 U g/ml安卡青霉素（Ap)、40 y g/ml 5-溴-4-氯-3-H引噪-0-D-乳糖苷和 24 μg/ml異丙基-0-D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，挑出白色 轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pBSCam。將表達(dá)載體pCN3 (構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn)Jiao XD，Zhang M, Hu YH, Sun L Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine 2009 ;27:5195 - 202.)用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切后回收5. 4kb 片段，同時(shí)將pBSCam用EcoRV酶切回收0. 5kb片段。將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶 于室溫連接2 - 4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a，在氨芐青霉素（lOOug/ml)的LB培 養(yǎng)基培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為pCNCam。通過(guò)DNA測(cè)序分析證明了 pCNCam為含有1?調(diào)蛋白基因序列和結(jié)構(gòu)域的表達(dá)質(zhì)粒。
[0017] pCNCrt的構(gòu)建如下：以牙鲆cDNA為模板，用引物F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增鈣網(wǎng)蛋白 基因。？〇?條件為 ：94°0 608預(yù)變性模板0嫩，然后941：408,651：608,721：608,5個(gè)循 環(huán)后改為94°C 40s，70°C 60s，72°C 60s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒 純化后與PCR克隆載體pBS-T (同上）于室溫連接2 - 4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5 a后在含有1〇〇 y g/ml安卡青霉素、40 y g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -D-乳糖苷和 24 y g/ml異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn) 化子，提取質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pBSCrt。將表達(dá)載體pCN3(同上）用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶 切后回收5.4kb片段，同時(shí)將pBSCrt用SmaI酶切回收1.3kb片段。將上述回收的兩片 段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a，在含氨芐青霉素 (lOOug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為pCNCrt。通 過(guò)DNA測(cè)序分析證明了 pCNCrt為含有鈣網(wǎng)蛋白基因序列和結(jié)構(gòu)域的表達(dá)質(zhì)粒。
[0018]所述LB組成成分按重量百分比計(jì)：1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化 鈉，97. 5%蒸餾水。所述 Fl 為 5'-GATATCGCCACCATGGCTGATCAGCTTACAGAAGAGC-3' ;R1 為 5' -GATATCCTTCGCTGTCATCATTTGTACGAACT-3' ；F2 為 5' -CCCGGGGCCACCATGAAGGTCCTCGGCGTAGC AG-3' ；R2 為 5' -CCCGGGAAGCTCATCTTTAAGTTTTGCTTCCTCCTC-3'。
[0019] 實(shí)施例2
[0020] 媽調(diào)蛋白和媽網(wǎng)蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCNCam和pCNCrt的應(yīng)用
[0021] 步驟1)質(zhì)粒注射
[0022] 將上述實(shí)施例1的pCNCam和pCNCrt在PBS中稀釋至100ug/ml，即為pCNCam和 pCNCrt稀釋液。將30條牙鲆（重約12g)隨機(jī)分為3組，每組10條。將這3組分別命名為 A，B和C。將A組的每條魚分別注射IOOul pCNCam稀釋液，將B組的每條魚分別注射IOOul pCNCrt稀釋液，將C組（對(duì)照組）的每條魚分別注射IOOul PBS。
[0023] 所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)：0. 8 % NaCl, 0. 02 % KC1, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0? 024% NaH2PO4,余量為水。
[0024] 步驟2)細(xì)菌懸液制備
[0025] 在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛(ài)德華氏菌TXl至0D_為1，然后離心（5000g， 4°C ) lOmin。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為lxl06cfu/ml。
[0026] 所述菌株TXl保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保 藏編號(hào)為：CGMCC No. 2330,保藏日期為2008年1月9日，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大 屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所；分類命名為遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda)。
[0027] 步驟3)攻毒感染
[0028] 在上述步驟1)注射后第3天，將A，B和C三組的每條魚注射IOOul上述步驟2) 的細(xì)菌懸液。在感染后48h，取魚腎臟和脾臟組織，在2ml PBS中勻漿，將IOOul勻漿液涂布 于LB平板。將平板置于30°C培養(yǎng)48h，計(jì)算出現(xiàn)的菌落數(shù)。結(jié)果表明，A組魚腎臟和脾臟 的細(xì)菌數(shù)為5. 6xl02和6. 5x10 2, B組魚腎臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)為6. 3xl02和7. 3x10 2, C組魚 腎臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)為2. 8xl03和3. 8x10 3。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，A組和B組魚腎臟和脾臟的 細(xì)菌數(shù)皆顯著（P〈〇. 01)低于C組魚。
[0029] 這些結(jié)果表明，表達(dá)鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的質(zhì)粒pCNCam和pCNCrt能夠顯著增強(qiáng) 魚類抵抗細(xì)菌的侵染。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 牙鲆鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述鈣調(diào)蛋白或鈣網(wǎng)蛋白用于制備 抗細(xì)菌感染的制劑。
2. 按權(quán)利要求1所述的牙鲆鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的應(yīng)用，其特征在于：以牙鲆cDNA為 模板，分別用引物F1/R1或F2/R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別與載體pCN3連接，即獲得鈣 調(diào)蛋白質(zhì)粒pCNCam或鈣網(wǎng)蛋白質(zhì)粒pCNCrt;所述Fl為5'-GATATCGCCACCATGGCTGATCAGCT TACAGAAGAGC-3'；R1 為 5' -GATATCCTTCGCTGTCATCATTTGTACGAACT-3'；F2 為 5'-CCCGGGGCCA CCATGAAGGTCCTCGGCGTAGCAG-3' ；R2 為 5' -CCCGGGAAGCTCATCTTTAAGTTTTGCTTCCTCCTC-3'。
3. 按權(quán)利要求1所述的牙鲆鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述表達(dá)鈣調(diào) 蛋白和媽網(wǎng)蛋白的質(zhì)粒pCNCam或pCNCrt在制備增強(qiáng)魚類抗細(xì)菌感染制劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是牙鲆鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)質(zhì)粒的制備和應(yīng)用。所述表達(dá)鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的質(zhì)粒pCNCam和pCNCrt在抗細(xì)菌感染中應(yīng)用。本發(fā)明的鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)質(zhì)粒注射魚類后能夠顯著提高魚類抵抗細(xì)菌感染的能力。CGMCC No.233020080109
【IPC分類】A61K38-17, A61P31-04, A61K48-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104771748
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510080269
【發(fā)明人】孫黎, 王晶晶
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
【公開(kāi)日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日