專利名稱：一種海鞘多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及海鞘多肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
海鞘(Ascidia)是尾索動(dòng)物亞門(Uronordata)綱的尾索動(dòng)物，從海鞘中提取的抗癌成分已有少數(shù)進(jìn)入臨床或臨床前階段。研究發(fā)現(xiàn)海鞘類生物含有生物堿類、肽類、吲哚類、重金屬螯合劑、多硫化物、大環(huán)內(nèi)酯、萜類等數(shù)十種化合物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗病毒、抗菌、誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)釋鈣、抑制鈣調(diào)蛋白活性等多種生理活性，尤其以對(duì)抗腫瘤的研究報(bào)道較多(李志軍，薛長(zhǎng)湖，王長(zhǎng)海.海鞘中的抗腫瘤生物活性物質(zhì)。海洋通報(bào)，2004，23(5)82-86；季宇彬，池文杰.海鞘中抗腫瘤活性物質(zhì)的研究.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，21(1)6-10.)。中國(guó)專利CN03111710.4提及從海鞘中提取具有抑制血小板聚集和抗凝血作用的海鞘脂肪酸，中國(guó)專利CN01812043.1提及從海鞘中提取具有抗腫瘤和抗病毒活性作用的海鞘素，中國(guó)專利CN03807576.8提及海鞘素及其制備方法。目前海鞘類的專利申請(qǐng)?jiān)诤Ｇ仕睾椭舅岬确矫嬗袌?bào)道，而從海鞘中提取海鞘多肽及其在治療乙肝中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種具有抗HBV作用的海鞘多肽。
本發(fā)明另一目的是提供一種具有抗HBV作用的海鞘多肽的制備方法。
本發(fā)明所述的海鞘多肽用下序列式表示Lys-Gly-Lys-Ile-Glu-His(1)。
式中Lys是賴氨酸，Gly是甘氨酸，Ile是異亮氨酸，Glu是谷氨酸，His是組氨酸。
本發(fā)明所述的式(1)表示的海鞘多肽，是淺黃色針狀結(jié)晶，茚三酮反應(yīng)陽性，分子量為711.4。
本發(fā)明所述的海鞘多肽制備方法，含有以下步驟首先用乙醇浸泡海鞘，回收乙醇得到浸膏；將浸膏用水溶解，然后用有機(jī)溶劑萃取得到海鞘粗提物；最后使用色譜法分離提純。
本發(fā)明海鞘多肽制備方法中海鞘粗提物制備方法是，用海鞘等重量的70-90％(體積濃度v/v)乙醇常溫浸泡2周，減壓回收乙醇得浸膏；將浸膏用水溶解，然后用有機(jī)溶劑萃取，濃縮水溶液得到海鞘粗提物。
本發(fā)明所述水的用量為浸膏2～3倍。其中所述倍數(shù)是指水的體積(ml)是浸膏質(zhì)量(g)的倍數(shù)。
本發(fā)明所述有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、環(huán)己烷其中一種或兩種以上。本發(fā)明所述的有機(jī)溶劑較好是二氯甲烷或氯仿其中一種，最好是氯仿。本發(fā)明所述的萃取次數(shù)為2～4次。本發(fā)明每次萃取所用有機(jī)溶劑用量和水的用量比為體積比1∶1。
本發(fā)明所述色譜法可以是大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、Sephadex LH20色譜法其中一種或兩種以上。本發(fā)明所述色譜法最好是依次使用大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、SephadexLH20色譜法。
本發(fā)明所述的大孔樹脂色譜法是本領(lǐng)域常用的大孔樹脂色譜方法。其具體步驟為海鞘粗提物上大孔樹脂色譜柱后，用50％乙醇洗脫至柱無色，濃縮干燥。本發(fā)明所述的大孔樹脂最好是非極性大孔樹脂。本發(fā)明所述的大孔樹脂是非極性或弱極性聚苯乙烯大孔樹脂，例如HPD-100、D-101、AB-8、HP-20、HPD-300。本發(fā)明所述的大孔樹脂最好是D-101大孔吸附樹脂。
本發(fā)明所述的硅膠柱色譜方法，是本領(lǐng)域常用的硅膠色譜方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依據(jù)本領(lǐng)域知識(shí)得到最佳的參數(shù)。本發(fā)明硅膠色譜方法具體步驟為將海鞘多肽粗提物上硅膠色譜柱后，用CHCl3∶MeOH∶H2O比為7∶3∶0.5的洗脫劑梯度洗脫，流速為2～3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，濃縮。其中薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
本發(fā)明所述的Sephadex LH20色譜法，具體步驟為將海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝膠色譜柱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脫劑洗脫，流速為1～2ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf約為0.55的洗脫液，濃縮。其中薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
本發(fā)明所述的Sephadex LH20為羥丙基葡聚糖凝膠。
本發(fā)明所述的海鞘(Ascidian)可以是尾索動(dòng)物亞門(Uronordata)海鞘綱的尾索動(dòng)物皺瘤海鞘[Styela plicata(lesueur)]。
本發(fā)明所述的海鞘多肽制備方法，還可以對(duì)海鞘進(jìn)行預(yù)處理，具體步驟是將新鮮海鞘清洗、瀝干、干燥、粉碎；干燥溫度低于80度；干燥包括風(fēng)干、烘干、真空干燥等。
本發(fā)明所述的海鞘多肽的制備方法最好是，首先將海鞘用等重量的70～90％(體積濃度)乙醇常溫浸泡2周，減壓回收乙醇得浸膏；將浸膏用2～3倍的水溶解，然后用和水體積相同的氯仿萃取2～4次，濃縮得到海鞘粗提物；將海鞘粗提物上大孔樹脂色譜柱后，用50％乙醇洗脫至柱無色，濃縮干燥得到海鞘多肽粗提取物；將上述海鞘多肽粗提物上硅膠色譜柱后，用CHCl3∶MeOH∶H2O比為7∶3∶0.5的洗脫劑梯度洗脫，流速為2～3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，濃縮得到海鞘多肽粗提取物；將上述海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝膠色譜柱后，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脫劑洗脫，流速為1～2ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf約為0.55的洗脫液，濃縮得到海鞘多肽。
本發(fā)明海鞘多肽有抗HBV作用。為了更好的理解本發(fā)明，下面用本發(fā)明的相關(guān)藥理試驗(yàn)及結(jié)果來說明其用途。
本發(fā)明所述的抗HBV細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法用0.25％胰蛋白酶將2.2.15細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按3×104細(xì)胞/孔分種于96孔板，2天后換用含藥培養(yǎng)液，每個(gè)濃度加4孔。樣品用細(xì)胞培養(yǎng)液分別稀釋成16、8、4mg/ml 3個(gè)濃度，與細(xì)胞作用12天后，吸取細(xì)胞上清液，用ELISA法測(cè)定HBsAg、HBeAg滴度。余下細(xì)胞用MTT法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)以拉米呋定作為陽性對(duì)照藥物，以未加任何藥物的細(xì)胞作為細(xì)胞對(duì)照組。
1.1 ELISA法測(cè)HBsAg、HBeAg滴度。
1.1.1每孔加入待測(cè)標(biāo)本50μl，設(shè)陰性、陽性對(duì)照各2孔，并設(shè)空白對(duì)照1孔。
1.1.2每孔加入酶結(jié)合物50μl(除空白對(duì)照外)，充分混勻后封板，置37℃孵育8小時(shí)。
1.1.3手工洗板棄去孔內(nèi)液體，洗滌液儲(chǔ)滿各孔，靜置5秒后甩干，重復(fù)5次后拍干。
1.1.4每孔加入顯色劑A液、B液各50μl，充分混勻，封板，置37℃孵育15分鐘；1.1.5每孔加入終止液50μl，混勻；1.1.6用酶標(biāo)儀測(cè)定。取波長(zhǎng)450nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值，陰性對(duì)照OD值低于0.05作為0.05計(jì)算，高于0.05按照實(shí)際OD計(jì)算。
1.2 MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)毒性濃度。
向細(xì)胞中加入400μg/ml MTT液0.1ml/孔，37℃ 5％CO2孵育4h，可見黃黑色甲瓚顆粒，棄去MTT液，加入100％DMSO 0.1ml/孔，待甲瓚顆粒完全溶解(約10min)后，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度A值，以4孔未加細(xì)胞的100％DMSO為空白對(duì)照。
1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算。
半數(shù)抑制濃度(IC50)是HBsAg或HBeAg抑制率為50％時(shí)的藥物濃度，半數(shù)毒性濃度(TC50)是實(shí)驗(yàn)孔存活細(xì)胞為細(xì)胞對(duì)照孔50％時(shí)的濃度。



海鞘多肽的抗HBV效果如表1所示，海鞘多肽對(duì)細(xì)胞的毒性作用如表2所示。根據(jù)計(jì)算，本發(fā)明所述的海鞘多肽抑制HBsAg的半數(shù)有效濃度分別3.65mg/ml，抑制HBeAg的半數(shù)有效濃度分別為4.40mg/ml。該多肽在高濃度時(shí)均表現(xiàn)出一定的毒性，但在所測(cè)濃度中，細(xì)胞破壞率均未達(dá)到50％，故其半數(shù)毒性濃度TC50大于64mg/ml，其抑制HBsAg治療指數(shù)TI大于17.53，抑制HBeAg治療指數(shù)TI大于14.54。
表1 海鞘多肽的抗HBV效果

*與細(xì)胞對(duì)照相比，p＜0.05。
表2 海鞘多肽對(duì)細(xì)胞的毒性作用

*與細(xì)胞對(duì)照相比，p＜0.05。
本發(fā)明所述的海鞘多肽及其制備方法中，海鞘廣泛分布于南海海域，產(chǎn)量豐富，便于采集，提取方法工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備投資少，生產(chǎn)過程便于控制。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1新鮮皺瘤海鞘50Kg，去內(nèi)臟，洗凈，在室溫下用75％乙醇50kg浸泡2周，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收酒精，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸餾水溶解，用500ml的二氯甲烷萃取，收干溶劑取得水溶性部分825g；再用500ml蒸餾水盡量溶解，以相同體積的正丁醇萃取，收干溶劑得水溶性部分712g；接著取水溶性部分100g，上D-101大孔樹脂柱色譜，用50％乙醇500ml洗脫，流速為3ml/分鐘，收干溶劑得產(chǎn)物14g；以此進(jìn)行硅膠柱色譜，用CHCl3∶MeOH∶H2O比為7∶3∶0.5的洗脫劑梯度洗脫，流速為3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，收干溶劑得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝膠柱色譜，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脫劑洗脫，流速為1ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf約為0.55的洗脫液，收干溶劑得到海鞘多肽146mg。上述薄層層洗條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑用5％硫酸乙醇液。
實(shí)施例2
新鮮皺瘤海鞘50Kg，去內(nèi)臟，洗凈，在室溫下用75％乙醇50kg浸泡2周，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器60℃回收酒精至無味，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸餾水盡量溶解，以相同體積的氯仿萃取，收干溶劑取得水溶性部分805g；再用500ml蒸餾水盡量溶解，以相同體積的正丁醇萃取，收干溶劑得水溶性部分683g；接著取水溶性部分100g，上D-101大孔樹脂柱色譜，用50％乙醇500ml洗脫，流速為2.5ml/分鐘，收干溶劑得產(chǎn)物10g；以此進(jìn)行硅膠柱色譜，用CHCl3∶MeOH∶H2O比為7∶3∶0.5的洗脫劑梯度洗脫，流速為2.5ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，收干溶劑得粗產(chǎn)物，最后以此分別上Sephadex LH20凝膠柱色譜，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脫劑洗脫，流速為1.5ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf約為0.55的洗脫液，收干溶劑得到海鞘多肽102mg。上述薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑用5％硫酸乙醇液。
實(shí)施例3新鮮皺瘤海鞘50Kg，去內(nèi)臟，洗凈，在室溫下用90％乙醇50kg浸泡2周，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器60℃回收酒精至無味，得提取物1300g。取提取物200g用600ml蒸餾水溶解，用相同體積的氯仿萃取，收干溶劑取得水溶性部分830g；上述萃取方法重復(fù)3次，收干溶劑得水溶性部分730g；接著取水溶性部分100g，上AB-8大孔樹脂柱色譜，用50％乙醇500ml洗脫，流速為2ml/分鐘，收干溶劑得產(chǎn)物15g；以此進(jìn)行硅膠柱色譜，用CHCl3∶MeOH∶H2O比為7∶3∶0.5的洗脫劑梯度洗脫，流速為3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，收干溶劑得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝膠柱色譜，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脫劑洗脫，流速為2ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf約為0.55的洗脫液，收干溶劑得到海鞘多肽126mg。上述薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑用5％硫酸乙醇液。
實(shí)施例4新鮮皺瘤海鞘50Kg，去內(nèi)臟，洗凈，在室溫下用80％乙醇50kg浸泡2周，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器60℃回收酒精至無味，得提取物1300g。取提取物200g用400ml蒸餾水溶解，用相同體積的氯仿萃取，收干溶劑取得水溶性部分825g；用600ml蒸餾水溶解，用相同體積的乙酸乙酯萃取，收干溶劑取得水溶性部分725g；用600ml蒸餾水溶解，用相同體積的正己烷萃取，收干溶劑取得水溶性部分605g，收干溶劑得水溶性部分512g；接著取水溶性部分100g，上D-101大孔樹脂柱色譜，用50％乙醇500ml洗脫，流速為2ml/分鐘，收干溶劑得產(chǎn)物13g；以此進(jìn)行硅膠柱色譜，用CHCl3∶MeOH∶H2O比為7∶3∶0.5的洗脫劑梯度洗脫，流速為3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5-0.6的洗脫液，收干溶劑得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝膠柱色譜，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脫劑洗脫，流速為2ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf約為0.55的洗脫液，收干溶劑得到海鞘多肽146mg。薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑用5%硫酸乙醇液。
實(shí)施例5新鮮皺瘤海鞘50Kg，去內(nèi)臟，洗凈，在室溫下用75％乙醇50kg浸泡2周，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器60℃回收酒精至無味，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸餾水溶解，用相同體積的二氯甲烷萃取，再用相同體積的乙酸乙酯萃取，收干溶劑得水溶性部分712g；接著取水溶性部分100g，上HDP-100大孔樹脂柱色譜，用50％乙醇500ml洗脫，流速為3ml/分鐘，收干溶劑得產(chǎn)物14g；以此進(jìn)行硅膠柱色譜，用CHCl3∶MeOH∶H2O比為7∶3∶0.5的洗脫劑梯度洗脫，流速為3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5-0.6的洗脫液，收干溶劑得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝膠柱色譜，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脫劑洗脫，流速為2ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf約為0.55的洗脫液，收干溶劑得到海鞘多肽146mg。薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑用5％硫酸乙醇液。
權(quán)利要求
1.一種海鞘多肽，其特征在于具有如下序列Lys-Gly-Lys-Ile-Glu-His，式中Lys是賴氨酸，Gly是甘氨酸，Ile是異亮氨酸，Glu是谷氨酸，His是組氨酸。
2.權(quán)利要求1所述的海鞘多肽，其特征是分子量為711.4。
3.一種權(quán)利要求1或2所述的海鞘多肽的制備方法，首先用海鞘等重量的70～90％體積濃度的乙醇常溫浸泡2周，減壓回收乙醇得浸膏；將浸膏用2～3倍水溶解，然后用和水同體積的有機(jī)溶劑萃取2～4次，濃縮水溶液得到海鞘粗提物；最后依次用大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、Sephadex LH20色譜法分離提純得到，其中硅膠色譜法是將海鞘多肽粗提物上硅膠色譜柱后，用CHCl3∶MeOH∶H2O比為7∶3∶0.5的洗脫劑梯度洗脫，流速為2～3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，濃縮，其中薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
4.權(quán)利要求3所述的海鞘多肽制備方法，其特征在于有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、環(huán)己烷其中一種或兩種以上。
5.權(quán)利要求4所述的海鞘多肽制備方法，其特征在于有機(jī)溶劑是氯仿。
6.權(quán)利要求3所述的海鞘多肽制備方法，其特征在于大孔樹脂色譜法具體步驟為海鞘粗提物上D-101大孔樹脂色譜柱后，用50％乙醇洗脫至柱無色，濃縮干燥。
7.權(quán)利要求3所述的海鞘多肽制備方法，其特征在于所述的Sephadex LH20色譜法，具體步驟為將海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝膠色譜柱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脫劑洗脫，流速為1～2ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf約為0.55的洗脫液，濃縮，其中薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
全文摘要
本發(fā)明海鞘多肽及其制備方法屬于生化與生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明海鞘多肽具有式(I)所示序列，分子量是711.4。其制備方法首先用乙醇常溫浸泡減壓回收乙醇得浸膏；將浸膏用有機(jī)溶劑萃取，濃縮；依次使用大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、Sephadex LH20色譜法分離提純得到，其中硅膠色譜法用CHCl
文檔編號(hào)C07K1/00GK1817899SQ20061003306
公開日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2006年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者萬新祥, 胡文軍, 曾凡林, 王瑞 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)