專利名稱：一種玻璃海鞘多肽的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生化與生物醫(yī)藥領域，具體的說是一種玻璃海鞘多肽的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是人類健康的第一殺手，其發(fā)病率和致死率均居各中疾病之首?？拱┧幬锏难芯亢烷_發(fā)已成為本世紀新藥研究的重大課題。從海洋中分離純化抗腫瘤活性物質已經(jīng)成為抗癌藥物研究的熱點之一。我們在篩選抗腫瘤藥物過程中發(fā)現(xiàn)從玻璃海鞘中分離純化的一種多肽(PI5931)具有很強的抑制腫瘤細胞生長的作用，對發(fā)展成為新的抗癌藥物具有很大潛力。海鞘(Ascidian)屬于脊索動物門(Chordates)，尾索動物亞門(Urochordata)，海鞘綱(Ascidiacea)，全世界大約有1600種。從中發(fā)現(xiàn)了許多具有新的結構和生物學功能的環(huán)肽、線性肽及desip印tides。Didemnins (膜海鞘素)最早是從加勒比海鞘中分離的，是 desipeptides的家族，具有抗腫瘤，抗病毒和免疫抑制作用，其中Didemnins B是抗腫瘤活性最強的環(huán)肽(體外對L1210的IC50為2. 5ng/ml)，也是第一種進入臨床試驗的海洋天然產(chǎn)物。由兩種海鞘 Didemnum cuculiferum 禾口 Polysyncranton Iithostrotum 中發(fā)現(xiàn)的一種13個氨基酸的環(huán)肽可顯著抑制微管聚合，并能延長小鼠p388淋巴細胞白血病的生存期； 但由玻璃海鞘(Ciona intestinalis)中分離出抗腫瘤蛋白一直未見報道。玻璃海鞘屬于內(nèi)性目、玻璃海鞘科，為我國北方海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主要生物污染物， 國內(nèi)有關玻璃海鞘的研究僅僅局限于胚胎發(fā)育，生理生化，脂肪酸提取上。董平原等從玻璃海鞘中分離得到了一種具有抗新生血管生成活性和抗腫瘤作用的玻璃海鞘多肽BLF-2，對斑馬魚胚胎血管生成具有顯著的抑制活性，對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移和管腔形成具有顯著的抑制作用。由玻璃海鞘中提取分離出抗腫瘤多肽一直未見報道，本發(fā)明采用多種分離純化手段從玻璃海鞘中分離得到一種新的具有抗腫瘤作用的多肽PI10，實驗證實，該多肽在體外具有誘導人肝癌細胞株BEL-7402凋亡的活性，并對多種腫瘤細胞均具有良好的細胞毒活性。與現(xiàn)有的化療藥物相比，抗腫瘤多肽類藥物具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點， 有望成為新型的抗腫瘤藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種玻璃海鞘多肽的應用。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術方案為玻璃海鞘多肽的應用玻璃海鞘多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述玻璃海鞘多肽在制備抗人肺癌細胞、人宮頸癌上皮細胞、人肝癌細胞、人結腸癌細胞、人乳腺癌細胞和人神經(jīng)膠質瘤細胞藥物中的應用。所述玻璃海鞘多肽按如下方法制備1)將新鮮的海鞘通過有機溶劑以4-20°C進行沉淀提取1-3次，沉淀物通過濾膜進行超濾截留大于5KDa物質，待用； 2)將上述截留大于5KDa物質，以0. 05-0. 5M的NaCl緩沖液作為洗脫液進行DEAE 陰離子交換柱層析，收集0. 15M NaCl緩沖液洗脫組分，待用；3)將上述收集的洗脫組分經(jīng)SuperdeX75分子篩凝膠層析，用超純水做洗脫液，流速為0. 8-1. 2ml/min，收集洗脫組分，待用；4)將上述洗脫組分經(jīng)HPLC C-18反相柱分離純化，洗脫液為A液和B液，進行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的90%，B液占總洗脫液體積的10%，B液每分鐘
的速率上升，流速為0. 5-0. 8ml/min,當B液占總洗脫液體積的28. 4%時出現(xiàn)活性組分， 即得到N-末端序列為YQPDKFMLRGELRNN，分子量為5931Da的單一組分玻璃海鞘多肽；其中 A液為A液總體積0. 1 %的TFA和A液總體積99. 9 %的超純水，B液為B液總體積0. 1 %的 TFA和B液總體積99. 9 %的乙腈。所述步驟1)通過有機溶劑沉淀時采用體積百分含量為10% -90%的丙酮水溶液， 并且每次沉淀時間為12小時。所述步驟1)通過有機溶劑沉淀時采用體積百分含量為60% -80%的丙酮水溶液。本發(fā)明所具有的優(yōu)點1.本發(fā)明中涉及的多肽是一種海洋來源的物質，由于海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性，使得海洋生物具有某些陸上生物所沒有的活性物質，這些活性物質往往具有結構新穎、高活性、耐藥性低等特點，可以為新藥研究和開發(fā)提供模式結構和醫(yī)藥前體。2.該多肽在提取過程中經(jīng)過了 70°C高溫加熱，加熱后仍保持活性不變說明該多肽具有熱穩(wěn)定性，將來制成藥后能延長藥品的貨架壽命。3.本發(fā)明將玻璃海鞘多肽經(jīng)MTT測定、掃描電鏡觀察、細胞核染色觀察、線粒體膜電位變化等體內(nèi)外方法證明了該多肽對多種腫瘤細胞具有顯著的抗腫瘤作用，可引起腫瘤細胞凋亡，其誘導機理系通過細胞凋亡途徑，說明了此玻璃海鞘多肽在預防和治療腫瘤方面的作用和新途徑。具體地說，就是通過體外實驗闡明了玻璃海鞘多肽誘導細胞凋亡的途徑，確定此多肽在惡性腫瘤的預防和治療方面的用途。


圖1為本發(fā)明實施例提取的多肽PI5931用ABI公司的Q Trap離子噴霧質譜儀 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)以增強的方式測定其分子量。質譜儀配以 TurbolonSpray source并以陽離子模式操作圖2為本發(fā)明實施例提取的多肽PI5931的Tricine-SDS-Page電泳分析圖。圖3為本發(fā)明實施例提取的多肽PI5931處理BEL-7402癌細胞，掃描電鏡下正常細胞與細胞凋亡形態(tài)變化。(其中圖3A為正常細胞，圖3B為處理12小時后細胞)圖4為抗腫瘤多肽PI5931處理BEL-7402癌細胞，DAPI染色，觀察凋亡小體的出現(xiàn)。(其中1.正常細胞2. PI5931處理12小時3、PI5931處理18小時，4. PI5931處理24 小時(可清晰看見凋亡小體))圖5為抗腫瘤多肽PI5931處理BEL-7402癌細胞，Α0/ΕΒ染色觀察凋亡細胞細胞核顏色變化圖。
具體實施例方式實施例1玻璃海鞘多肽的制備方法1)丙酮沉淀制備粗提物取新鮮海鞘洗凈、粉碎、分散勻漿機勻漿，在70°C下加熱 30min，而后以IOOOOrpm，離心20min，得上清，上清液中加入清液體積三倍的體積百分含量為70%的丙酮，在4°C靜置過夜；靜置過夜后以IOOOrpm離心20min，取沉淀。沉淀重新溶解后通過5KDa的濾膜進行超濾截留，保留大于5KDa的部分，待用。2)DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱層析首先，將粗提物裝入分子截留量為3. 5kD的透析袋，采用純水進行初步透析，而后將其對起始緩沖溶液充分透析；將透析好的樣品取出，IOOOOrpm離心去除不溶物，準備上柱；起始緩沖溶液為0. 02M Tris-Cl, ρΗ8· 0。 其次，取適量的DEAE Sepharose Fast Flow填料(GE公司生產(chǎn))，加入超純水中， 用玻璃棒輕微攪拌均勻后，玻璃棒引流，裝入16X26規(guī)格的層析柱，用起始緩沖溶液平衡 3-4個柱體積，基線穩(wěn)定后方可使用。再次，將樣品上柱后，用起始緩沖溶液沖洗，待不掛柱蛋白完全穿透后，開始洗脫， 洗脫液為Tris-Cl, NaCl溶液，即在起始緩沖液的基礎上，分別配制0. 05Μ、0. 1Μ、0· 15Μ、 0. 2Μ、0. 3Μ和0. 5MNaCl溶液，而后進行分步洗脫，流速為5ml/分鐘，整個層析過程采用 280nm檢測蛋白質洗脫峰。最后，將由六個不同濃度濃度NaCl洗脫所得到的組分用純水充分透析后凍干，用純水溶解；每個組分質量濃度為200ug/ml，MTT試驗檢測各組份活性，0. 15M NaCl洗脫組分為活性組分，將活性組份置于-20°C保存，待用。3) superdex 75分子篩凝膠層析首先，取適量的superdex 75分子篩凝膠填料(GE公司生產(chǎn))，清水浸泡24小時， 用玻璃棒輕微攪拌均勻后，玻璃棒引流，裝入1. 6 X 80cm規(guī)格的層析柱，用純水平衡3-4個柱體積，基線穩(wěn)定后方可使用。其次，將上述0. 15M NaCl洗脫組分上柱，用清水以lml/min的速度沖洗層析柱，整個層析過程采用280nm檢測蛋白質洗脫峰，共得四個洗脫峰，每個洗脫峰為一個組分，將各個組分冷凍干燥，采用BCA法測定蛋白濃度后，MTT試驗檢測各組份活性，第四個洗脫組分為活性組分，即截取1小時40分鐘至1小時55分鐘的洗脫液。將活性組份置于-20°C保存。4)將上述洗脫組分經(jīng)HPLC C-18反相柱(4. 6 X 250mm規(guī)格的層析柱)分離純化， 洗脫液為A液和B液，進行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的90%，B液占總洗脫液體積的10%，B液每分鐘的速率上升，流速為0. 5ml/min,當B液占總洗脫液體積的28. 4%時出現(xiàn)活性組分，經(jīng)質譜鑒定即得到N-末端序列為YQPDKFMLRGELRNN，分子量為 5931Da的單一組分玻璃海鞘多肽(參見圖1)；活性組分由等電聚焦電泳測定等電點為PI =7. 25。其中A液為A液總體積0. 1 %的TFA和A液總體積99. 9%的超純水，B液為B液總體積0. 1 %的TFA和B液總體積99. 9 %的乙腈。5)海鞘多肽的Tricine-SDS-Page電泳分析鑒定配置4 %的濃縮膠和 16. 5%的分離膠。取過C-18反相柱組分點樣，用低分子量蛋白Marker為對照，進行Tricine-SDS-Page蛋白電泳，濃縮膠采用50V電壓，分離膠采用60V電壓進行電泳，電泳后用考馬斯亮藍染色液進行染色，在樣品泳道能夠發(fā)現(xiàn)6KD左右大小的一條亮帶，說明該多肽的分子量在6KD左右(參見圖2)。 實施例2 抗瘤譜的測定細胞人宮頸癌上皮細胞(Hela)、人肝癌細胞(BEL-7402)、人結腸癌細胞 (HCT-116)、人乳腺癌細胞(MCF-7)、人肺癌細胞(A549)、人神經(jīng)膠質瘤細胞(U8T)。以上細胞均為中科院海洋所海洋藥物實驗室提供。藥品及試劑玻璃海鞘多肽中科院海洋所海洋藥物實驗室提供；5-氟脲嘧啶 (5-FU)江蘇南通精華制藥有限公司產(chǎn)品，批號為100402 ；MTT(SIGMA, USA) ；DMSO(SIGMA, USA)；胰蛋白酶(SIGMA, USA) ；RPMI1640(GIBCO, Invitragen Co.，USA) ；DMEM(GIBC0, Invitragen Co. ,USA)；優(yōu)級胎牛血清(GIBCO, Invitragen Co. ,USA)；特級胎牛血清 Fetal BovineSerum(Hyclone)。儀器超低溫冰箱(Nature，USA)，細胞培養(yǎng)箱(SANYO，Japan)，倒置顯微鏡 (NIKON, Japan)，示ft (Bio-Tek Instruments, Inooski, VT,USA)，PH if (Thermo orion, USA)，超凈工作臺(FLC-哈爾濱東聯(lián)儀器廠)。而后通過MTT法進行檢測抗腫瘤效果，取各種人的腫瘤細胞株按照常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，收集對數(shù)生長期細胞，調節(jié)細胞懸液濃度5 X IO4個/ml左右。將細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每個孔加入180μ 1。置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，實驗組加入各濃度上述實施例所得多肽提取物20 μ 1/孔，并以5-FU作為陽性對照組，每組各設4個平行孔，并分別設清水對照以調零。在培養(yǎng)箱37°C，培養(yǎng)48h后，用移液槍將96孔板中液體洗凈后每孔加入MTT(lmg/ml)30l·! 1，置CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)4h，棄去上清，每孔加入DMSO 150 μ 1， 置搖床搖勻30min，用酶標儀在492nm下檢測，利用SPSS統(tǒng)計軟件，計算細胞死亡率，求取 IC5 (參見表1)0。實驗結果表明，經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計，玻璃海鞘多肽對用于試驗的6種腫瘤細胞，均有不同程度的抑制作用，并且呈一定的劑量依賴關系，不同濃度的玻璃海鞘多肽對各種腫瘤細胞的抑制率、IC50值詳見表1。表1不同濃度的玻璃海鞘多肽對5種腫瘤細胞的抑制率
\抑制作用濃度(pg/ml)船彡ΤΓ “
直線方程相/系瓜。(μ
7βΑ\ 25. O 50. O 100.0且A刀狂數(shù) R g/ml )
細胞\_！_
A54926. 2%49. 1%86. 1%y = 9Ux2^98951· 8
Hela35. 2%59. 9%89. Thy= 0. 89x27. 50. 99146. 3
BEL-740231. 9%66. 8%92. Tky= 0. 97x39. 60. 97244. 6
HCT-11635. 7%64. 9%88. 1%y= 1. 022x36.20.95245.4
MCF-738.2%76. 3%93. 6%y= 0. 86x26.30. 97842.1
U8T29. 3%65. 5%86.8%y= 0. 83x33.10.88244.9實驗結果顯示，活性組分在50ug/ml濃度時能夠強烈抑制人肝癌細胞 (BEL-7402)、人宮頸癌上皮細胞(Hela)、人結腸癌細胞(HCT-116)、人乳腺癌細胞(MCF-7)、人神經(jīng)膠質瘤細胞(U8T)、人肺癌細胞(A549)生長，抑制率達到50 % _75%，說明本發(fā)明實施例所得物質能夠抑制癌細胞的增值。實施例3 掃描電鏡觀察凋亡現(xiàn)象用六孔板做細胞爬片一37°C培養(yǎng)24小時一加入上述實施例制備所得終濃度 100ug/ml的玻璃海鞘蛋白提取物一37°C培養(yǎng)20小時一PBS沖洗一2. 5%戊二醛固定 -30%,50%,70%,80%,90%,100%乙醇梯度脫水一掃描電子顯微鏡下觀察。掃描電鏡觀察凋亡細胞的外部形態(tài)掃描電鏡下觀察BEL-7402處理細胞，與正常細胞相比，經(jīng)過上述實施例制備所得海鞘多肽處理細胞表面微絨毛減少或者消失，細胞變圓皺縮，細胞表面出現(xiàn)蜂窩狀空洞，少數(shù)細胞能發(fā)現(xiàn)凋亡小體存在(參見圖3)。實施例4 細胞核染色觀察DDAP I染色，觀察凋亡小體的出現(xiàn)，DAPI染色用六孔板做細胞爬片一37°C培養(yǎng) 24小時一加入上述實施例制備所得終濃度lOOug/ml的玻璃海鞘蛋白提取物一37°C培養(yǎng)20 小時一PBS沖洗一多聚甲醛固定一PBS沖洗一Triton-IOO破膜一PBS沖洗一DAPI染色 20min —熒光顯微鏡下觀察。經(jīng)DAPI染色后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常細胞細胞核內(nèi)染色質均勻，經(jīng)過上述實施例制備所得海鞘多肽處理細胞核內(nèi)染色質發(fā)生固縮，可見細胞核分成大小不同的圓形，是凋亡小體的典型形狀(參見圖4)。2) A0/EB染色觀察凋亡細胞細胞核顏色變化用六孔板做細胞爬片一37°C培養(yǎng)24 小時一加入上述實施例制備所得終濃度lOOug/ml的玻璃海鞘蛋白提取物一37°C培養(yǎng)20小時一PBS沖洗一多聚甲醛固定一PBS沖洗一Triton-IOO破膜一PBS沖洗一A0/EB混合液染色一熒光顯微鏡下觀察。經(jīng)A0/EB染色后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常細胞發(fā)出綠色熒光，經(jīng)過上述實施例制備所得海鞘多肽處理細胞發(fā)出橙紅色熒光。正常細胞細胞核內(nèi)染色質均勻，藥物處理細胞核內(nèi)染色質發(fā)生固縮，可見細胞核分成大小不同的圓形，是凋亡小體的典型形狀 (參見圖5)。實施例5線粒體膜電位檢測(JC-I)A細胞培養(yǎng)瓶細胞傳代37°C培養(yǎng)24小時B加入上述實施例制備所得終濃度50ug/ml的玻璃海鞘蛋白提取物，37°C培養(yǎng)20 小時C收集細胞，取10-60萬細胞重懸于0. 5ml細胞培養(yǎng)液中D加入JC-I染色工作液，混勻，37°C培養(yǎng)20分鐘。E 600g離心4分鐘，棄上清F用JC-I染色緩沖液洗滌2次G再用JC-I染色緩沖液重懸后，用熒光分光光度計檢測(激發(fā)波長490nm)。經(jīng)玻璃海鞘多肽處理過的細胞在熒光分光光度計激發(fā)波長為490nm時，在530nm 處出現(xiàn)強烈激發(fā)光，在590nm處激發(fā)光很弱或者沒有。而正常細胞相比在激發(fā)波長為490nm 時，在530nm出現(xiàn)的激發(fā)光弱于590nm出現(xiàn)的激發(fā)光。由此可見玻璃海鞘多肽處理過的細胞，線粒體膜電位明顯下降，說明玻璃海鞘誘導腫瘤細胞凋亡走的是線粒體途徑。
權利要求
1.一種玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于玻璃海鞘多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
2.按權利要求1所述的玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于所述玻璃海鞘多肽在制備抗人肺癌細胞、人宮頸癌上皮細胞、人肝癌細胞、人結腸癌細胞、人乳腺癌細胞和人神經(jīng)膠質瘤細胞藥物中的應用。
3.按權利要求1所述的玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于所述玻璃海鞘多肽按如下步驟制備，1)將新鮮的海鞘通過60% -80%有機溶劑丙酮以4-20°C進行沉淀提取1-3次， 沉淀物通過濾膜進行超濾截留大于5KDa物質，待用；2)將上述截留大于5KDa物質，以0.05-0. 5M的NaCl緩沖液作為洗脫液進行DEAE陰離子交換柱層析，收集0. 15M NaCl緩沖液洗脫組分，待用；3)將上述收集的洗脫組分經(jīng)SuperdeX75分子篩凝膠層析，用超純水做洗脫液，流速為 0. 8-1. 2ml/min,收集洗脫組分，待用；4)將上述洗脫組分經(jīng)HPLCC-18反相柱分離純化，洗脫液為A液和B液，進行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的90 %，B液占總洗脫液體積的10 %，B液每分鐘1 % 的速率上升，流速為0. 5-0. 8ml/min,當B液占總洗脫液體積的28. 4%時出現(xiàn)活性組分，即得到N-末端序列為YQPDKFMLRGELRNN，分子量為5931Da的單一組分玻璃海鞘多肽；其中A 液為A液總體積0. 1 %的TFA和A液總體積99. 9 %的超純水，B液為B液總體積0. 1 %的 TFA和B液總體積99. 9 %的乙腈。
4.按權利要求3所述的玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于所述步驟1)通過有機溶劑沉淀時采用體積百分含量為10% -90%的丙酮水溶液，并且每次沉淀時間為12小時。
5.按權利要求3所述的玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于所述步驟1)通過有機溶劑沉淀時采用體積百分含量為60% -80%的丙酮水溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生化與生物醫(yī)藥領域，具體的說是一種玻璃海鞘多肽的應用。玻璃海鞘多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。將玻璃海鞘多肽經(jīng)MTT測定、掃描電鏡觀察、細胞核染色觀察、線粒體膜電位變化等體外方法證明了該多肽對多種腫瘤細胞具有顯著的抗腫瘤作用，可引起腫瘤細胞凋亡，其誘導機理系通過細胞凋亡途徑，說明了此玻璃海鞘多肽在預防和治療腫瘤方面的作用和新途徑。
文檔編號A61P35/00GK102172394SQ20101062066
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權日2010年12月24日
發(fā)明者劉明, 吳寧, 林秀坤, 程林友 申請人:中國科學院海洋研究所