加入硫酸 銨沉淀毒素蛋白，離心收集沉淀，超濾去除毒素中的硫酸銨后加入甲醛，置35~37°C脫毒 30天，除菌過濾即為破傷風(fēng)類毒素原液；
513.無細(xì)胞百日咳疫苗原液：開啟百日咳桿菌，接種于改良包-姜培養(yǎng)基或活性炭半 綜合培養(yǎng)基，于35~37°C培養(yǎng)不超過48小時，再接種于CPB培養(yǎng)基中傳兩代，每代培養(yǎng)時 間18~26小時，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)以制備足夠的生產(chǎn)用種子，然后接種到發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)， 培養(yǎng)基采用CPB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)兩天，培養(yǎng)結(jié)束后在培養(yǎng)物中加入0. 01%硫柳汞進(jìn)行殺菌 處理，將收獲的培養(yǎng)物離心，離心收獲的菌體和上清液2~8°C保存待下一步純化； 百日咳黏附素的分離純化：將菌體采用60°C熱釋放，超濾濃縮后，上樣于Capto adhere層析柱，以醋酸緩沖液為流動相，收集含百日咳黏附素的洗脫組份，再上樣于Capto SP層析柱，以醋酸緩沖液為流動相，以氯化鈉梯度洗脫，收集洗脫峰，即為分離純化的百日 咳黏附素； 百日咳毒素和絲狀血凝素的純化：將上清液超濾濃縮后上樣于Capto SP層析柱，流動 相采用含尿素的磷酸鹽緩沖液，以氯化鈉梯度洗脫，分別收集含百日咳毒素和絲狀血凝素 的洗脫組份，將含百日咳毒素的洗脫組份上樣于CaptoMMC層析柱，緩沖液采用Tris-HCl緩 沖液，以氯化鈉梯度洗脫，收集百日咳毒素洗脫峰；將含絲狀血凝素的洗脫峰上樣于羥基磷 灰石層析柱純化，收集洗脫峰； 制備無細(xì)胞百日咳原液：將百日咳毒素采用戊二醛、絲狀血凝素和百日咳黏附素采用 甲醛進(jìn)行脫毒，除菌過濾后即為無細(xì)胞百日咳原液； S2.合并及稀釋：將百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳黏附素、白喉類毒素原液、破傷風(fēng) 類毒素原液加入用氯化鈉稀釋的氫氧化鋁佐劑內(nèi)，調(diào)PH至5. 8~7. 2，即為無細(xì)胞百白破疫 苗半成品。
4.如權(quán)利要求2所述的一種聯(lián)合疫苗的制備方法，其特征在于，B組分由以下步驟制備 而成： SI.制備各單價疫苗原液 SI I. A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液：開啟A群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至流 腦半綜合培養(yǎng)基，溫度35~37°C，培養(yǎng)16~24小時，然后經(jīng)過三代擴(kuò)增培養(yǎng)，制備生產(chǎn)用 種子，將其接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度35~37°C，培養(yǎng)時間6~12小時后加入甲醛殺菌；將已 殺菌的培養(yǎng)液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度I. 〇g/L，充分?jǐn)嚢?后靜置過夜，離心收集多糖，沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離，離心 收集上清,上清加入乙醇至終濃度為25%，2~8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇 至終濃度為75~80%，充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水 乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，按 1:1 (v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提1~3次至上清液澄清，收 集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸，超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl 溶液，至NaCl終濃度為0. 3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75% (v/v)，充分混勻 后2~8°C靜置過夜，沉淀精糖，離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干 燥后即為精糖； 將精糖溶解于注射用水中，按多糖：溴化氰=1:0. 5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，維持 溫度23 ±3°C，pH10. 8 ±0. 2反應(yīng)30分鐘進(jìn)行活化，活化完成后，按多糖：己二酰肼=1:3. 5 (w/w)的比例加入2. 8%己二酰肼溶液，維持溫度23±3°C，pH8. 5±0. 2反應(yīng)15分鐘進(jìn)行 衍生，澄清過濾后，用0. 05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為 多糖衍生物，按多糖：蛋白=1:0. 8~I. 2 (w/w)的比例計算破傷風(fēng)類毒素用量，加入多糖 衍生物溶液中，按多糖：碳二亞胺=1:10 (w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應(yīng)溫5±3°C、 pH5. 7±0. 2,反應(yīng)60分鐘，然后調(diào)節(jié)pH至6.9±0. 1終止反應(yīng)，經(jīng)澄清過濾后，用0. 15mol/ L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺，然后將多糖蛋白結(jié)合物溶液用S印harose4FF凝膠層析柱純化，以0? 15mol/LNaCl溶液為流動相，監(jiān)測0D280nm的吸收 值，收集VO附近的洗脫峰，合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結(jié)合物，經(jīng)除菌過濾 后，即為A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液； 512. C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液：開啟C群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至流 腦半綜合培養(yǎng)基，溫度35~37°C，培養(yǎng)16~24小時，然后經(jīng)過三代擴(kuò)增培養(yǎng)，制備生產(chǎn)用 種子，將其接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度35~37°C，培養(yǎng)時間6~12小時后加入甲醛殺菌；將 已殺菌的培養(yǎng)液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度I. 〇g/L，充分?jǐn)?拌后靜置過夜，離心收集多糖，沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和十六烷基三 甲基溴化銨解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%(v/v)，2~8°C靜置過夜，離 心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75~80%(v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時 以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；將粗糖溶解 于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按1:1 (v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集 上清液，抽提1~3次至上清液澄清，收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸， 超濾后的多糖溶液中加入4mol/LNaCl溶液，至NaCl終濃度為0. 3mol/L，然后加入95%乙 醇至乙醇終濃度為75% (v/v)，充分混勻后2~8°C靜置過夜，沉淀精糖，離心收集沉淀，然 后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖； 將精糖溶解于注射用水中，按多糖：溴化氰=1:0. 5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，維持 溫度23 ±3°C，pH10. 8 ±0. 2反應(yīng)30分鐘進(jìn)行活化，活化完成后，按多糖：己二酰肼=1:3. 5 (w/w)的比例加入2. 8%己二酰肼溶液，維持溫度23±3°C，pH8. 5±0. 2反應(yīng)15分鐘進(jìn)行衍 生，澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多 糖衍生物； 按多糖：蛋白=1:0. 8~I. 2 (w/w)的比例計算破傷風(fēng)類毒素用量，加入多糖衍生 物溶液中，按多糖：碳二亞胺=1:10 (w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應(yīng)溫度5±3°C、 pH5. 7±0. 2,反應(yīng)60分鐘，然后調(diào)節(jié)pH至6. 9±0. 1終止反應(yīng)，經(jīng)澄清過濾后，用0. 15mol/ L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺，然后將多糖蛋白結(jié)合物溶液用 S印harose4FF凝膠層析柱純化，以0? 15mol/LNaCl溶液為流動相，監(jiān)測0D280nm的吸收 值，收集VO附近的洗脫峰，合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結(jié)合物，經(jīng)除菌過濾 后，即為C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液； 513. b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液：開啟b型流感嗜血桿菌工作種子批菌種，接種 至Hib綜合培養(yǎng)基，溫度35~37°C，5~8%CO2環(huán)境中，培養(yǎng)16~24小時，然后經(jīng)過三代 擴(kuò)增培養(yǎng)，制備生產(chǎn)用種子，接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度35~37°C，培養(yǎng)時間6~12小時后 加入甲醛殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃 度I. 〇g/L，充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜，離心收集多糖，沉淀的多糖用氯化鈉溶液攪拌3小時使多 糖和十六烷基三甲基溴化銨解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25% (v/v)，2~ 8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75~80%(v/v)，充分振搖使多糖沉 淀，靜置過夜，離心收集沉淀，用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；將粗糖溶 解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按1:1 (v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收 集上清液，抽提1~3次至上清液澄清，收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核 酸，超濾后的多糖溶液中加入4mol/LNaCl溶液，至NaCl終濃度為0. 3mol/L，然后加入95% 乙醇至乙醇終濃度為75% (v/v)，充分混勻后2~8°C靜置過夜，沉淀精糖，離心收集沉淀， 然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖； 將精糖溶解于注射用水中，按多糖：溴化氰=1:0. 5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，維持 溫度23±3°C，pH10.8±0. 2反應(yīng)30分鐘進(jìn)行活化，活化完成后，按多糖：己二酰肼=1:3. 5 (w/w)的比例加入2. 8%己二酰肼溶液，維持溫度23±3°C，pH8. 5±0. 2反應(yīng)15分鐘進(jìn)行衍 生，澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多 糖衍生物； 按多糖：蛋白=1:0. 8~I. 2 (w/w)的比例計算破傷風(fēng)類毒素用量，加入多糖衍生 物溶液中，按多糖：碳二亞胺=1:10 (w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應(yīng)溫度5±3°C、 pH5. 7±0. 2,反應(yīng)60分鐘，然后調(diào)節(jié)pH至6. 9±0. 1終止反應(yīng)，經(jīng)澄清過濾后，用0. 15mol/ L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺，然后將多糖蛋白結(jié)合物溶液用 S印harose4FF凝膠層析柱純化，以0? 15mol/LNaCl溶液為流動相，監(jiān)測0D280nm的吸收 值，收集VO附近的洗脫峰，合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結(jié)合物，經(jīng)除菌過濾 后，即為b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液； S2.疫苗配制：將A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、b型 流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液按照1:1:1 (w/w)合并混勻，加入乳糖，用注射用水稀釋，即為 AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品。
5.如權(quán)利要求2所述的一種聯(lián)合疫苗的制備方法，其特征在于，吸附無細(xì)胞百白破聯(lián) 合疫苗半成品分裝于西林瓶或者預(yù)灌裝注射器中，每瓶〇. 5ml，AC群腦膜炎球菌-b型流感 嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品按照0. 5ml/瓶分裝于西林瓶中。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聯(lián)合疫苗及其制備方法，聯(lián)合疫苗由A組分和B組分組成，A組分為液體制劑，它由百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳黏附素、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、氫氧化鋁和氯化鈉組成；B組分為凍干制劑，它由A群腦膜炎多糖結(jié)合物、C群腦膜炎多糖結(jié)合物、b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合物和乳糖組成。疫苗的制備方法包括制備無細(xì)胞百白破疫苗半成品、AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品、分裝和包裝。本發(fā)明提供的疫苗具有安全、有效、可控及一針防多病的特點，制備方法操作簡單、制備方便、成本低，適宜于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【IPC分類】A61K39-10, A61K39-095, A61K39-05, A61K39-102, A61K39-08, A61P31-04, C12N1-20
【公開號】CN104689309
【申請?zhí)枴緾N201510141590
【發(fā)明人】陳道遠(yuǎn), 李洪光, 吳強(qiáng), 馬禮耕, 陳元芬, 羅力心, 李靖
【申請人】成都?xì)W林生物科技股份有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月27日